건강기능식품의 기준 및 규격 전면 개정

1. 개정이유

식품공전, 식품첨가물공전 및 국제규격과 조화를 이루고 기준․규격의 합리적 개선 및 안전성․기능성을 확보하고자 함.

2. 주요골자

가. 식품공전, 식품첨가물공전 및 국제규격과 조화

나. 건강기능식품 재평가 결과 반영

다. 건강기능식품공전 총칙, 공통 기준 및 규격, 원료 구성 체계 재구축

라. 건강기능식품의 원료를 대분류(기능성내용별), 중분류(기능성분(또는 지표성분)의 특성별), 소분류(원료별)로 체계적으로 분류함

마. 개별 기준 및 규격을 제조기준, 규격, 제품의 요건, 시험법 순으로 재구성

바. 섭취량을 규정함으로써 다양한 제품의 제조․생산 기반 마련

사. 개별인정 품목의 공전 등재 원칙 마련 및 품목 확대

아. 혼재되어 있는 시험법을 별도로 분리하여 편리하게 사용하도록 편집

3. 참고사항

가. 관계법령 : 건강기능식품에 관한 법률 제14조, 제15조, 제19조

나. 예산조치 : 별도조치 필요없음

다. 합    의 : 규제개혁위원회 규제심사 통과

라. 기    타 : (1) 입안예고(2007.10.1 ~ 11.30)

(2) 규제심사 : 자체규제심사

규제개혁위원회 규제심사

식품의약품안전청고시 제2008-12호

건강기능식품에 관한 법률 제14조, 제15조, 제19조에 의거 건강기능식품의 기준 및 규격을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2008년 2월 27일

식품의약품안전청장

건강기능식품의 기준 및 규격 전면 개정

건강기능식품의 기준 및 규격을 다음과 같이 전부 개정한다.

목 차

총칙

Ⅰ. 공통기준 및 규격

Ⅰ.1 건강기능식품의 제조에 사용되는 원료

Ⅰ.2 공통제조기준

Ⅰ.3 공통규격

Ⅰ.4 건강기능식품의 기준 및 규격 적용

Ⅰ.5 기준 및 규격의 적부 판정

Ⅰ.6 보존 및 유통기준

Ⅰ.7 검체의 채취 및 취급

Ⅱ. 개별 기준 및 규격

Ⅱ.1 영양소

Ⅱ.1.1 비타민 및 무기질(또는 미네랄)

Ⅱ.1.1.1 비타민 A	Ⅱ.1.1.2 베타카로틴
Ⅱ.1.1.3 비타민 D	Ⅱ.1.1.4 비타민 E
Ⅱ.1.1.5 비타민 K	Ⅱ.1.1.6 비타민 B1
Ⅱ.1.1.7 비타민 B2	Ⅱ.1.1.8 나이아신
Ⅱ.1.1.9 판토텐산	Ⅱ.1.1.10 비타민 B6
Ⅱ.1.1.11 엽산	Ⅱ.1.1.12 비타민 B12
Ⅱ.1.1.13 비오틴	Ⅱ.1.1.14 비타민 C
Ⅱ.1.1.15 칼슘	Ⅱ.1.1.16 마그네슘
Ⅱ.1.1.17 철	Ⅱ.1.1.18 아연
Ⅱ.1.1.19 구리	Ⅱ.1.1.20 셀레늄(또는 셀렌)
Ⅱ.1.1.21 요오드	Ⅱ.1.1.22 망간
Ⅱ.1.1.23 몰리브덴	Ⅱ.1.1.24 칼륨
Ⅱ.1.1.25 크롬

Ⅱ.1.2 식이섬유

Ⅱ.1.3 단백질

Ⅱ.1.4 필수 지방산

Ⅱ.2 기능성 원료

Ⅱ.2.1 터핀류

Ⅱ.2.1.1 인삼

Ⅱ.2.1.2 홍삼

Ⅱ.2.1.3 엽록소 함유 식물

Ⅱ.2.1.4 스피루리나/클로렐라

Ⅱ.2.2 페놀류

Ⅱ.2.2.1 녹차추출물

Ⅱ.2.2.2 알로에 전잎

Ⅱ.2.2.3 프로폴리스추출물

Ⅱ.2.3 지방산 및 지질류

Ⅱ.2.3.1 오메가-3 지방산 함유 유지

Ⅱ.2.3.2 감마리놀렌산 함유 유지

Ⅱ.2.3.3 레시틴

Ⅱ.2.3.4 스쿠알렌

Ⅱ.2.3.5 식물스테롤/식물스테롤에스테르

Ⅱ.2.3.6 알콕시글리세롤 함유 상어간유

Ⅱ.2.3.7 옥타코사놀 함유 유지

Ⅱ.2.3.8 매실추출물

Ⅱ.2.4 당 및 탄수화물류

Ⅱ.2.4.1 글루코사민

Ⅱ.2.4.2 N-아세틸글루코사민

Ⅱ.2.4.3 뮤코다당․단백

Ⅱ.2.4.4 식이섬유

구아검/구아검가수분해물	글루코만난(곤약,곤약만난)
귀리	난소화성말토덱스트린
대두식이섬유	목이버섯
밀식이섬유	보리식이섬유
아라비아검(아카시아검)	옥수수
이눌린/치커리추출물	차전자피
폴리덱스트로스	호로파종자

Ⅱ.2.4.5 알로에 겔

Ⅱ.2.4.6 영지버섯 자실체 추출물

Ⅱ.2.4.7 키토산/키토올리고당

Ⅱ.2.4.8 프락토올리고당

Ⅱ.2.5 발효미생물류

Ⅱ.2.5.1 프로바이오틱스

Ⅱ.2.5.2 홍국

Ⅱ.2.6 아미노산 및 단백질류

Ⅱ.2.6.1 대두단백

Ⅱ.2.7 일반원료

Ⅱ.2.7.1 로얄젤리

Ⅱ.2.7.2 버섯

Ⅱ.2.7.3 식물추출물발효

Ⅱ.2.7.4 자라

Ⅱ.2.7.5 효모

Ⅱ.2.7.6 효소

Ⅱ.2.7.7 화분

A. [별표 1] 난수표 및 사용방법

B. [별표 2] 영양소 기준치

C. [별표 3] 한국인 영양섭취기준

D. [별표 4] 시험법 적용표

Ⅲ. 건강기능식품 시험법

Ⅲ.1 일반원칙

Ⅲ.2 일반시험법

Ⅲ.2.1 붕해시험법

Ⅲ.2.2 내용량 시험법

Ⅲ.2.3. 입도시험법

Ⅲ.2.4. 산도 시험법

Ⅲ.2.4.1. 산도

Ⅲ.2.4.2. 유기산 산도

Ⅲ.2.5. 유해물질 시험법

Ⅲ.2.5.1. 시안화합물

Ⅲ.2.5.2. 카페인

Ⅲ.2.5.3. 디에틸렌글리콜

Ⅲ.2.5.4. 시트리닌

Ⅲ.3 개별 성분별 시험법

Ⅲ.3.1 비타민

Ⅲ.3.1.1 비타민 A	Ⅲ.3.1.2 베타카로틴
Ⅲ.3.1.3 비타민 D	Ⅲ.3.1.4 비타민 E
Ⅲ.3.1.5 비타민 K	Ⅲ.3.1.6 비타민 B1
Ⅲ.3.1.7 비타민 B2	Ⅲ.3.1.8 나이아신
Ⅲ.3.1.9 비타민 B6	Ⅲ.3.1.10 판토텐산
Ⅲ.3.1.11 엽산	Ⅲ.3.1.12 비타민 B12
Ⅲ.3.1.13 비오틴	Ⅲ.3.1.14 비타민 C

Ⅲ.3.2. 무기질

Ⅲ.3.2.1. 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

Ⅲ.3.2.2. 칼슘

Ⅲ.3.2.3. 요오드

Ⅲ.3.2.4. 철

Ⅲ.3.2.5. 아연

Ⅲ.3.2.6. 칼륨

Ⅲ.3.3. 아미노산 및 단백질류

Ⅲ.3.3.1. 조단백질

Ⅲ.3.3.2. 아미노산

Ⅲ.3.4. 당 및 탄수화물류

Ⅲ.3.4.1. 글루코사민

Ⅲ.3.4.2. N-아세틸글루코사민

Ⅲ.3.4.3. 베타글루칸

Ⅲ.3.4.4. 식이섬유

Ⅲ.3.4.5. 총 다당체

Ⅲ.3.4.6. 콘드로이친황산

Ⅲ.3.4.7. 키토산(총글루코사민으로서)

Ⅲ.3.4.8. 키토올리고당

Ⅲ.3.4.9. 프락토올리고당

Ⅲ.3.5. 지방산 및 지질류

Ⅲ.3.5.1. 지방산

Ⅲ.3.5.2. 인지질(아세톤불용물로서)

Ⅲ.3.5.3. 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

Ⅲ.3.5.4. 콜레스테롤

Ⅲ.3.5.5. 구연산

Ⅲ.3.5.6. 스쿠알렌

Ⅲ.3.5.7. 식물스테롤

Ⅲ.3.5.8. 유리식물스테롤

Ⅲ.3.5.9. 알콕시글리세롤

Ⅲ.3.5.10. 바틸알콜 확인

Ⅲ.3.5.11. 옥타코사놀

Ⅲ.3.5.12. 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

Ⅲ.3.6. 페놀류

Ⅲ.3.6.1 카테킨

Ⅲ.3.6.2 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)

Ⅲ.3.6.3 총 플라보노이드

Ⅲ.3.6.4 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인

Ⅲ.3.6.5 다이드제인 및 제니스테인 확인

Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린 K

Ⅲ.3.7. 터핀류

Ⅲ.3.7.1 진세노사이드 Rb1과 Rg1

Ⅲ.3.7.2 총 엽록소

Ⅲ.3.7.3 총페오포르바이드

Ⅲ.3.8. 발효미생물류

Ⅲ.3.8.1 유산간균 및 구균

Ⅲ.3.8.2 비피더스균(Bifidobacterium)

Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인

Ⅲ.3.8.4 효모수

Ⅲ.3.9. 효소활성

Ⅲ.3.9.1 α-아밀라아제

Ⅲ.3.9.2 프로테아제

총 칙

1. 이 공전의 목적

1) 이 공전은 판매를 목적으로 하는 건강기능식품의 제조․가공, 생산, 수입, 유통 및 보존 등에 관한 기준 및 규격을 정하기 위한 것이다.

2) 건강기능식품에 사용되는 기능성 원료와 제품의 기준 및 규격을 정함으로써 표준화된 건강기능식품의 유통을 도모하고 소비자 안전을 확보하고자 한다.

3) 또한 관계 공무원에게 건강기능식품의 관리에 관한 지침을 제공하여 국내 건강기능식품 관리를 체계적이고 과학적으로 구축하고자 한다.

2. 이 공전의 수록 범위

1)「건강기능식품에 관한 법률」제14조의 규정에 의한 건강기능식품의 제조․가공, 생산, 수입, 유통 및 보존 등에 관한 기준 및 규격

2)「건강기능식품에 관한 법률」제15조의 규정에 따른 건강기능식품의 원료 또는 성분

3)「건강기능식품에 관한 법률」제17조의 규정에 따른 건강기능식품의 표시기준

3. 이 공전의 구성

1) 이 공전은 총칙, 공통 기준 및 규격, 개별 기준 및 규격, 시험법으로 나눈다.

2) 개별 기준 및 규격은 아래와 같이 기능성표시의 구분에 따라(대분류), 기능성분(또는 지표성분)의 특성에 따라(중분류), 기능성 원료별(소분류)로 구분한다.

(1) 대분류는 영양소보충을 목적으로 하는 영양소를 별도로 제시하기 위하여 영양소기능을 가지는 영양소와 기능성 원료로 구분한다.

(2) 중분류는 기능성 원료의 특성에 따라 터핀류, 페놀류, 지방산 및 지질류 등으로 구분한다.

(3) 소분류는 대분류 또는 중분류에서 정하는 원료로서 비타민 및 무기질, 감마리놀렌산 함유 유지, 글루코사민 등으로 구분한다.

3) 개별 기준 및 규격은 제조기준, 규격, 제품의 요건 및 시험법으로 구성한다.

(1) 제조기준은 원재료, 제조방법, 기능성분(또는 지표성분)의 함량, 제조 시 유의사항으로 구성한다. 특히 제조 시 유의사항에는 제조과정 중 관리해야 할 유해성분의 기준 등이 제시되어 있다.

(2) 규격은 기능성 원료 및 이를 사용하여 제조․가공한 제품의 규격을 의미한다.

(3) 제품의 요건은 기능성내용, 일일 섭취량, 섭취 시 주의사항 등으로 구성한다.

(4) 시험법은 각 규격에 대한 시험방법으로 구성한다.

4) 시험법은 일반원칙, 일반시험법, 개별 성분별 시험법으로 구성한다.

4. 기능성 원료의 안전성․기능성 평가 및 기준․규격 설정 방법

이 공전에 등재된 기능성 원료의 안전성․기능성 평가와 기준․규격의 설정 방법은「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」을 따른다.

5. 기능성 원료별 기준 및 규격의 추가 등재

「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 기능성 원료는 다음 각 호의 어느 하나를 충족하면 이 공전 Ⅱ. 개별 기준 및 규격에 추가로 등재할 수 있다. 다만 당해 영업자가 자료의 보호가 필요하다고 요청한 경우 그 타당성을 검토하여 추가등재를 인정된 날로부터 5년 이내에서 유예할 수 있다.

1) 건강기능식품의 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 2년이 경과하였거나 3개 이상의 영업자가 제조․가공․생산․수입하는 경우

2)「건강기능식품에 관한 법률」제14조제2항의 규정에 의하여 인정받은 자가 등재를 요청하는 경우(다만 인정받은 자가 2명 이상인 경우에는 3분의 2가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우)

6. 이 공전에서 따로 정한 것 이외에는 총칙 및 공통 기준 및 규격에 의한다.

Ⅰ. 공통 기준 및 규격

Ⅰ.1 건강기능식품의 제조에 사용되는 원료는 다음과 같다.

1) 기능성 원료

(1) “기능성 원료”라 함은 건강기능식품의 제조에 사용되는 기능성을 가진 물질로서 다음 각 호에 해당되어야 한다.

Ⅰ.1-1

(가) 동물․식물․미생물 기원의 원재료를 그대로 가공한 것

(나) (가)의 추출물․정제물

(다) (나) 정제물의 합성물

(라) (가) 내지 (다)의 복합물

(2) 기능성 원료의 범위는 다음과 같다.

(가) 이 공전의 개별 기준 및 규격에서 정한 것

(나)「건강기능식품에 관한 법률」제15조와「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 것. 다만 이 경우는 인정서가 발급된 영업자에 한하여 사용할 수 있음

2) 영양소

“영양소”라 함은 비타민․무기질, 식이섬유, 단백질, 필수지방산 등을 말한다.

3) 기타원료

(1) “기타원료”라 함은 별도의 규격을 설정하지 않고 건강기능식품의 제조에 사용할 수 있는 원료 또는 성분을 말한다.

(2) 기타원료의 범위는 다음과 같다.

(가) 식품의 기준 및 규격에 적합한 것

(나) 식품첨가물의 기준 및 규격에 적합한 것

(다) 1) 기능성 원료, 2) 영양소. 다만 이 때에는 섭취 시 주의사항을 반드시 고려하고, 식품의약품안전청장이 정한 일일섭취량 미만으로 사용하여야 한다. 또한 1. 1). (2). (나)에 해당하는 기능성 원료는 인정서가 발급된 영업자에 한하여 사용할 수 있음

4) 원재료

(1) “원재료”라 함은 원료를 제조하기 위하여 사용되는 기원물질을 말한다.

(2) 원재료의 구비요건은 다음과 같아야 한다.

(가) 품질과 선도가 양호하고 부패․변질되지 아니한 것

(나) 중금속, 식중독균, 곰팡이독소, 방사능 등의 유해한 오염물질과 농약, 동물용의약품 등의 잔류물질은 식품공전 제2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격, 5. 식품일반의 기준 및 규격 따라 안전성이 확보되어야 함

(다) 사용되는 원재료는 흙, 모래, 티끌 등과 같은 이물을 충분히 제거하고 먹는물로 깨끗이 씻어야 하며, 비가식 부분은 충분히 제거하여야 함

(라) 건강기능식품용수에 사용하는 수처리제 등은「먹는물관리법」에, 주정은「주세법」에, 원료소금은「염관리법」에, 축산물은「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 함

Ⅰ.1-2

Ⅰ.2 공통 제조기준

1) 건강기능식품의 제조는 가능한 「우수 건강기능식품 제조기준」을 따를 것을 권장한다.

2) 건강기능식품은 기능성 원료를 섭취하기 위한 목적으로 제조되어야 하며 기능성 원료의 사용기준은 다음과 같다.

(1) 기능성 원료는 이 공전 Ⅱ. 개별 기준 및 규격 또는「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」에서 정한 제조기준 및 규격에 적합한 것을 사용하여야 한다.

(2) 허가(신고)대상인 건강기능식품의 원료 등을 구입하여 사용할 때에는 제조업허가를 받았거나 수입신고를 마친 것으로서 해당 기준 및 규격에 적합한 것이어야 하며 유통기한이 경과된 제품 등 부정․불량한 것을 사용하여서는 아니 된다.

(3) 기능성 원료별로 정해진 일일섭취량 및 제조 시 유의사항에 적합하게 사용하여야 한다.

(4) 두 가지 이상의 기능성 원료를 혼합하여 사용할 수 있으며 이 경우 안전성과 기능성이 유지됨을 확인하여야 한다.

3) 비타민과 무기질은 Ⅱ. 개별 기준 및 규격 Ⅱ.1 영양소 Ⅱ.1.1 비타민 및 무기질(또는 미네랄)에서 정한 최대함량기준에 따라 사용하여야 한다.

4) 기타원료를 사용할 때에는 기능성 원료의 안전성과 기능성유지를 우선적으로 고려하여 다음과 같은 사용기준을 따라야 한다.

(1) 식품공전, 식품첨가물공전, 건강기능식품공전 중 해당 공전의 기준 및 규격에 적합하여야 한다.

(2) 지방, 콜레스테롤, 나트륨, 포화지방, 트랜스지방 등의 유해 영양소의 함량이 가능한 한 적게 들어가도록 제조되어야 한다.

5) 기능성 원료의 추출에 사용되는 용매는 이 공전 Ⅱ. 개별 기준 및 규격 또는「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」에 따라 사용하여야 한다. 다만 이 공전에서 정해지지 않은 용매, 효소 등은 식품첨가물의 기준 및 규격에 적합한 것을 사용하여야 한다.

6) 어떤 제품에 사용할 수 없는 식품첨가물이 그 식품첨가물을 사용할 수 있는 원료에서 유래된 것이라면 원료로부터 이행된 범위 안에서 식품첨가물의 사용기준의 제한을 받지 아니할 수 있다.

7) 건강기능식품의 농약, 동물용의약품 등의 잔류물질은 식품공전 제2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격 5. 식품일반의 기준 및 규격에서 정한 원재료의 기준에 따르며 식품공전에 가공제품에 관한 기준이 별도로 정해진 경우(예: 농축액, 분말 등) 그 기준을 우선한다.

Ⅰ.2-1

8) 건강기능식품에 방사선을 사용하는 경우에는 사용 방사선의 선원 및 선종은 Co-60의 감마선으로 하며 다음 기준에 적합하여야 한다.

(1) 허용대상 건강기능식품별 흡수선량

허용대상	흡수선량
알로에분말	7kGy이하
인삼, 홍삼	7kGy이하
클로렐라, 스피루리나	7kGy이하

(2) 일단 조사한 방사선을 다시 조사하여서는 아니 되며 조사된 기능성 원료를 사용하여 제조‧가공한 건강기능식품도 다시 조사하여서는 아니 된다.

(3) 조사한 제품은 용기에 넣거나 또는 포장한 후 판매하여야 한다.

9) 기타 제조기준은 아래와 같으며 이 공전에서 정하지 않은 사항은 식품공전을 따른다.

(1) 건강기능식품의 제조에 사용되는 기계‧기구류와 부대시설물은 항시 위생적으로 유지‧관리하여야 한다.

(2) 건강기능식품의 용기․포장에 관한 규격은「식품위생법」에서 정하는 식품공전에 적합하여야 한다.

(3) 건강기능식품의 제조에 사용하는 물은「먹는물 관리법」에 적합한 것이어야 한다.

(4) 냉동된 원료의 해동은 위생적으로 실시하여야 한다.

(5) 건강기능식품은 제품의 특성에 따라 냉장, 냉동하거나 적정한 방법으로 살균 또는 멸균 처리하여야 한다.

(6) 건강기능식품의 제조 중 열처리, 냉각 또는 냉동 공정은 제품의 기능성, 안전성을 고려하여 적정한 방법으로 실시하여야 한다.

(7) 건강기능식품의 용기를 회수하여 재사용하고자 하는 때에는 깨끗이 세척하고 세제, 세척제 등이 잔류하지 아니하여야 한다.

(8) 건강기능식품은 미생물의 오염이 방지되도록 위생적으로 포장하여야 한다.

Ⅰ.2-2

Ⅰ.3 공통규격

1) 제품의 형태에 관한 정의 및 이에 따른 규격은 다음과 같다.

(1) 제품의 형태에 관한 정의

(가) 정제(tablet)란 일정한 형상으로 압축된 것을 말함

(나) 캅셀(capsule)이란 캅셀기제에 충전 또는 피포한 것을 말하며, 경질캅셀과 연질캅셀 두 종류가 있음

(다) 환(pill)이란 구상(球狀)으로 만든 것을 말함

(라) 과립(granule)이란 입상(粒狀)으로 만든 것을 말함.

(마) 액상(liquid)이란 유동성이 있는 액체상태의 것 또는 액체상태의 것을 그대로 농축한 것을 말함

(바) 분말(powder)이란 입자의 크기가 과립제품보다 작은 것을 말함

(2) 정제제품, 캅셀제품, 환제품, 과립제품에 한하여 붕해시험규격을 적용하며, 시험법은 이 공전 Ⅲ.2.1. 붕해시험을 따른다. 다만 다음에 해당하는 경우에는 예외로 한다.

(가) 씹어 먹거나 녹여 먹는 경우

(나) 35호(500μm)체에 잔류하는 것이 5%이하인 과립제품

(3) 액상제품에 한하여 세균수 규격(1mL당 100이하)을 적용하며, 시험법은 식품공전 제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 2) 세균수(일반세균수)를 따른다. 다만 다음에 해당하는 경우에는 예외로 한다.

(가) 프로바이오틱스를 기능성 원료로 사용한 경우

(나) 멸균공정을 거친 제품. 이 때에는 ‘세균수 음성’을 적용함

2) 비타민 및 무기질이 Ⅱ. 개별 기준 및 규격에서 정한 최소함량기준 이상으로 첨가된 제품은「건강기능식품의 표시기준」에 따라 영양소의 함량과 영양소기준치에 대한 비율(%)을 모두 표시하고 이 공전 Ⅱ. 개별 기준 및 규격에서 정한 비타민 및 무기질의 규격을 적용하여야 한다.

Ⅰ.3

Ⅰ.4 건강기능식품의 기준 및 규격 적용

1) 기능성 원료 및 이를 사용하여 제조․가공한 제품의 규격은 Ⅰ. 공통 기준 및 규격과 Ⅱ. 개별 기준 및 규격 또는「건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 기준 및 규격을 함께 적용하는 것을 원칙으로 한다(표1 참조).

2) Ⅱ. 개별 기준 및 규격에 제시된 각 기능성분의 규격은 소비자에게 직접 판매되지 아니하는 원료성 제품과 이를 사용하여 제조․가공한 최종제품으로 구분하여 적용한다. 다만, 기능성 원료에 과당, 전분, 포도당, 유당, 말토덱스트린 등을 혼합하여 원료성 제품으로 사용하는 경우, 기능성분(또는 지표성분)의 함량은 배합비를 고려하여 환산하였을 때 해당 기능성 원료의 제조기준에 적합하여야 한다.

3) 두 가지 이상의 기능성 원료를 사용하는 경우에는 해당하는 기능성 원료의 규격을 모두 적용하며, 규격이 중복되는 경우에는 강화된 규격을 적용한다.

4) 수출을 목적으로 하는 건강기능식품의 기준 및 규격은 이 공전의 기준 및 규격에도 불구하고「건강기능식품에 관한 법률」제14조제3항의 규정에 의해 수입자가 요구하는 기준과 규격에 의할 수 있다.

[표1] 건강기능식품의 기준 및 규격 적용 절차

						<적용해야할 규격> 해당하는 경우 ∨ 표시하여 규격을 적용함
1. 공통규격 중 제형별 규격 적용		캅셀, 정제, 환, 과립인 경우 씹어 먹는 것 또는 물에 녹여 먹는 것은 제외함			→	∘붕해도
		액상인 경우 프로바이오틱스를 기능성 원료로 사용한 경우에는 제외함			→	∘세균수
↓
2. 비타민․무기질 표시량 규격 적용 ※Ⅱ. 개별 기준 및 규격에서 정한 최소함량기준 이상으로 첨가된 경우					→	∘영양소 함량
↓
3. “제3장 개별 기준 및 규격” 중 2) 규격 적용					→	∘성상
						∘기능성분 함량
						∘중금속
						∘잔류용매
						∘대장균군
						∘기타(곰팡이독소 등)
↓
4. 기타(보존방법 등)					→	∘세균발육(통․병조림류 및 레토르트류)

Ⅰ.5 기준 및 규격의 적부 판정

1) 건강기능식품은 식품의약품안전청장이 인정한 기준 및 규격에 따라 적합과 부적합(이하 적부라 한다)으로 판정하며, 규격은 최종제품에 대하여 적용한다.

2) 기준 및 규격이 정하여지지 아니한 유해물질(유해중금속 잔류농약 등)에 관한 적부 판정은 식품공전, 식품첨가물공전의 규정을 준용하며, 관련 공전에서도 기준 및 규격이 없는 경우에는 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC 이하 “CAC”) 규정을 준용할 수 있다. 관련 공전 및 CAC에도 없는 경우에는 식품의약품안전청장이 외국의 기준 및 규격, 일일섭취허용량(ADI) 및 건강기능식품의 섭취량 등 해당 물질별 관련 자료를 종합적으로 검토하여 기준 및 규격을 적용할 수 있다.

3) 기준 및 규격의 판정은 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법으로 실시하는 것을 원칙으로 하나, 이보다 더 정밀하고 정확하다고 인정되는 경우에는 새로운 방법을 사용할 수 있다. 특히, 미생물 및 독소 등에 대한 시험에는 상품화된 kit 또는 자동화된 분석기기를 사용할 수 있다. 다만, 그 결과가 서로 상이하여 판정이 어려운 경우에는 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법을 우선으로 한다.

4) 식품의약품안전청장이 인정한 시험방법이 없거나 적용할 수 없는 경우에는 관련 공전, CAC규정, AOAC(Association of Official Analytical Chemists), PAM(Pesticide Analytical Manual)에 따라 시험할 수 있으며, 다른 법령에 정해져 있거나 국제적으로 통용되는 공인 시험방법도 사용할 수 있다. 다만, 이 경우에는 그 시험방법 및 출처가 함께 제시되어야 한다.

5) 시험방법에 의한 결과에 따른 적부 판정은 실험치(시험에서 얻은 값)를 규격치(기준 및 규격에서 정한 값, n 자리수)보다 한자리수(n+1)까지 더 구한 후 이를 반올림하고 규격치와 비교하여 판정한다.

6) 기준 및 규격은 캅셀기제를 제외한 내용물에 대하여 적용한다. 단, 미생물 및 붕해시험은 제외한다.

7) 건강기능식품에 배합한 원료(캅셀기제 포함)에서 유래되는 사용할 수 없는 식품첨가물(보존료 등)의 검출은 규격을 적용하지 않는다.

8) “검출되어서는 아니 된다”라 함은 이 공전에 규정된 방법에 의하여 시험하여 검출되지 않는 것을 말한다.

Ⅰ.5

Ⅰ.6 보존 및 유통기준

1) 모든 건강기능식품은 위생적으로 취급 판매하여야 하며, 그 보관 및 판매장소가 불결한 곳에 위치하여서는 아니 된다. 또한 방서 및 방충관리를 철저히 하여야 한다.

2) 건강기능식품의 취급 장소는 비‧눈 등으로부터 보호될 수 있어야 하며, 인체에 유해한 화공약품, 농약, 독극물 등과 같은 것을 함께 보관하지 말아야 한다.

3) 이물이 혼입되지 않도록 주의하여야 하며 제품의 풍미에 영향을 줄 수 있는 다른 제품과는 분리 보관하여야 한다.

4) 제품은 서늘한 곳에서 보관 유통하여야 하며 상온에서 7일 이상 보존성이 없는 건강기능식품은 가능한 한 냉장 또는 냉동시설에서 보관 유통하여야 한다.

5) 냉동제품은 품질변화가 최소화할 수 있도록 냉동시켜야 한다. 녹은 냉동제품을 재냉동 시켜서는 아니 된다.

6) 냉동 또는 냉장제품의 운반은 적절한 온도를 유지할 수 있는 냉동 또는 냉장차량이거나 이와 동등 이상의 효력이 있는 방법으로 한다.

7) 흡습의 우려가 있는 제품은 흡습되지 않도록 주의하여야 한다.

8) 제품의 운반 및 포장과정에서 용기‧포장이 파손되지 않도록 주의하여야 하며 가능한 한 심한 충격을 주지 않도록 하여야 한다.

9) 포장된 건강기능식품은 소분 판매하지 말아야 하며,「건강기능식품의 표시기준」(식품의약품안전청 고시)에 적합하지 않거나 표시가 없는 것을 구입하거나 판매하지 말아야 한다.

10) 보관과정 중의 부주의로 인하여 부패‧변질 또는 파손된 제품은 판매하여서는 아니 된다.

11) 냉동건강기능식품을 해동시켜 실온 또는 냉장건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 되며, 실온 또는 냉장건강기능식품을 냉동시켜 냉동건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 된다. 또한, 냉장건강기능식품을 실온에서 유통시켜서는 아니 된다.

12) 이 공전에서 정하지 않은 보존 및 유통기준은 식품공전을 따른다.

Ⅰ.6

Ⅰ.7 검체의 채취 및 취급

1) 검체의 채취 및 취급의 의의

「건강기능식품에 관한 법률」제20조에 따라서 관계공무원이 검사대상으로부터 일부의 검체를 별표 1.에 의거 채취한 후, 기준‧규격의 적부, 오염물질 등에 대한 안전성 검사의 결과에 따라 행정조치 등이 이루어지게 되므로 검사대상의 선정, 검체의 채취‧취급‧운반 등은 효율성을 확보하면서 과학적인 방법으로 수행하여야 한다. 따라서 검체를 채취하여 건강기능식품검사기관에 검사 의뢰하는 것은 중요한 의의를 가지므로 관계공무원은 검체채취 및 취급방법 등에 대하여 충분한 지식을 가지고 그 직무를 수행하여야 한다.

2) 용어의 정의

(1) 검체∶검사대상으로부터 채취된 시료를 말한다.

(2) 검체단위∶검체를 구성한 단위로서 한 번에 채취되는 건강기능식품의 양을 말한다.

(3) 검사대상∶동일조건에서 생산‧제조‧가공․포장된 건강기능식품으로 검체가 채취되는 하나의 대상을 말한다.

3) 검체채취의 일반원칙

(1) 검체의 채취는「건강기능식품에 관한 법률」제20조 및 같은 법 시행규칙 제22조에서 규정하는 자가 수행하여야 한다.

(2) 검체는 검사목적, 검사항목 등을 참작하여 검사대상 전체를 대표할 수 있는 최소한도의 양을 채취하여야 한다.

(3) 일반적으로 검체는 제조번호, 제조년월일, 유통기한이 동일한 것을 검사대상으로 하나, 품종, 건강기능식품유형, 제조회사, 기호, 수출국, 수출년월일, 도착 년월일, 적재선, 수송차량, 화차, 포장형태 및 외관 등의 상태를 잘 파악하여 그 건강기능식품의 특성 및 검사목적을 고려하여 채취하도록 하여야 한다.

(4) 채취된 검체가 손상되지 않도록 주의하여야 하고, 건강기능식품을 포장하기 전 또는 포장된 것을 개봉하여 검체로 채취하는 경우에는 이물질의 혼입, 미생물의 오염 등이 되지 않도록 주의하여야 한다.

(5) 채취한 검체는 봉인하여야 하며 봉인을 파손하지 않고는 봉인을 열 수 없도록 하여야 한다.

4) 검체의 채취 및 취급요령

검체채취 시에는 검사목적, 대상 건강기능식품의 종류와 물량, 오염 가능성, 균질 여부 등 검체의 물리‧화학‧생물학적 상태를 고려하여야 한다.

(1) 검체의 채취 요령

(가) 검사대상 건강기능식품이 불균질할 때

① 검체가 불균질할 때에는 일반적으로 다량의 검체가 필요하나 검사의 효율성, 경제성 등으로 부득이 소량의 검체를 채취할 수 밖에 없는 경우에는 외관, 보관상태 등을 종합적으로 판단하여 의심스러운 것을 대상으로 검체를 채취할 수 있다.

Ⅰ.7-1

② 특성상 침전․부유 등으로 균질하지 않은 제품은 전체를 가능한 한 균일하게 처리한 후 대표성이 있도록 채취하여야 한다.

(나) 검사항목에 따른 균질 여부 판단

검체의 균질 여부는 검사항목에 따라 달라질 수 있다. 어떤 검사대상 건강기능식품이 불균질하더라도 이에 함유된 중금속 등의 성분은 균질한 것으로 보아 검체를 채취할 수 있다.

(다) 포장된 검체의 채취

① 깡통, 병, 상자 등 용기‧포장에 넣어 유통되는 건강기능식품은 가능한 한 개봉하지 않고 그대로 채취한다.

② 대형 용기‧포장에 넣은 건강기능식품은 검사대상 전체를 대표할 수 있는 일부를 채취 할 수 있다.

(라) 냉장, 냉동 검체의 채취

냉장 또는 냉동 건강기능식품을 검체로 채취하는 경우에는 그 상태를 유지하면서 채취하여야 한다.

(마) 미생물 검사를 요하는 검체의 채취

① 검체를 채취‧운송‧보관하는 때에는 채취당시의 상태를 유지할 수 있도록 밀봉되는 용기‧포장 등을 사용하여야 한다.

② 검체를 소분 채취할 경우에는 멸균된 기구‧용기 등을 사용하여 무균적으로 행하여야 한다.

③ 검체는 부득이한 경우를 제외하고는 정상적인 방법으로 보관‧유통 중에 있는 것을 채취하여야 한다.

④ 검체는 관련정보 및 특별수거계획에 의한 경우를 제외하고는 완전 포장된 것에서 채취하여야 한다.

(바) 기체를 발생하는 검체의 채취

① 검체가 상온에서 쉽게 기체를 발산하여 검사결과에 영향을 미치는 경우는 포장을 개봉하지 않고 하나의 포장을 그대로 검체단위로 채취하여야 한다.

② 다만, 소분 채취하여야 하는 경우에는 가능한 한 채취된 검체를 즉시 밀봉․냉각시키는 등 검사결과에 영향을 미치지 않는 방법으로 채취하여야 한다.

(사) 페이스트상 또는 시럽상 건강기능식품

① 검체의 점도가 높아 채취하기 어려운 경우에는 검사결과에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 가온 등 적절한 방법으로 점도를 낮추어 채취할 수 있다.

Ⅰ.7-2

② 검체의 점도가 높고 불균질하여 일상적인 방법으로 균질하게 만들 수 없을 경우에는 검사결과에 영향을 주지 아니하는 방법으로 균질하게 처리할 수 있는 기구 등을 이용하여 처리한 후 검체를 채취할 수 있다.

(2) 검체채취내역서의 기재

관계공무원은 검체 채취 시 당해 검체와 함께 검체채취내역서를 첨부하여야 한다. 다만, 검체채취내역서를 생략하여도 기준‧규격검사에 지장이 없다고 인정되는 때에는 그러하지 아니할 수 있다.

(3) 검체의 운반 요령

(가) 채취된 검체는 오염, 파손, 손상, 해동, 변형 등이 되지 않도록 주의하여 검사실로 운반하여야 한다.

(나) 검체가 장거리로 운송되거나 대중교통으로 운송되는 경우에는 손상되지 않도록 특히 주의하여 포장한다.

(다) 냉동 검체의 운반

① 냉동 검체는 냉동 상태에서 운반하여야 한다.

② 냉동 장비를 이용할 수 없는 경우에는 드라이아이스 등으로 냉동상태를 유지하여 운반할 수 있다.

(라) 냉장 검체의 운반

냉장 검체는 온도를 유지하면서 운반하여야 한다. 얼음 등을 사용하여 냉장온도를 유지하는 때에는 얼음 녹은 물이 검체에 오염되지 않도록 주의하여야 하며 드라이아이스 사용 시 검체가 냉동되지 않도록 주의하여야 한다.

(마) 미생물 검사용 검체의 운반

① 부패‧변질 우려가 있는 검체

미생물학적인 검사를 요하는 검체는 멸균용기에 무균적으로 채취하여 당해 건강기능식품의 냉장보존 온도를 유지하고 검사기관에 운반하여 36시간 이내에 검사하여야 한다. 부득이한 사정으로 냉장온도를 유지할 수 없거나 조속히 운반하지 못하였을 때에는 재수거하거나 채취일시 및 그 상태를 기록하여 검사기관에 검사 의뢰한다.

Ⅰ.7-3

② 부패‧변질의 우려가 없는 검체

미생물 검사용 검체일지라도 운반과정 중 부패‧변질우려가 없는 검체는 반드시 냉장온도에서 운반할 필요는 없으나 오염, 검체 및 포장의 파손 등에 주의하여야 한다.

③ 얼음 등을 사용할 때의 주의사항

얼음 등을 사용할 때에는 얼음 녹은 물이 검체에 오염되지 않도록 주의하여야 한다.

(바) 기체를 발생하는 검체의 운반

소분 채취한 검체의 경우에는 적절하게 냉장 또는 냉동한 상태로 운반하여야 한다.

5) 검체채취 기구 및 용기

(1) 검체채취 기구 및 용기는 검체의 종류, 형상, 용기‧포장 등이 다양하므로 검체의 수거 목적에 적절한 기구 및 용기를 준비하여야 한다.

(2) 식품공전 제6. 기구 및 용기․포장의 기준․규격에 적합한 것이어야 한다.

(3) 기구 및 용기는 운반, 세척, 멸균에 편리한 것이어야 하며 미생물 검사를 위한 검체 채취의 기구‧용기 중 검체와 직접 접촉하는 부분은 반드시 멸균 처리하여야 한다.

(4) 검체와 직접 접촉하는 기구 및 용기는 검사결과에 영향을 미치지 않는 것이어야 한다.

(5) 검체채취 및 기구‧용기의 종류

(가) 채취용 기구

핀셋, 가위, 칼, 캔따개, 나무망치, 전기톱 또는 톱, 곡물검체채취기, 드라이어, 피펫, 커터, 액체검체채취용 펌프 또는 튜브, 국자, 깔때기 등

(나) 채취용 용기‧포장

검체봉투(대, 중, 소), 검체채취병(광구병) 등

(다) 소독용구

알코올램프, 알코올, 솜 등

(라) 기타

테이프, 아이스박스, 사진기, 필기구 등

Ⅰ.7-4

Ⅱ. 개별 기준 및 규격

Ⅱ.1 영양소

Ⅱ.1.1 비타민 및 무기질(또는 미네랄)

1) 비타민과 무기질 제품은 일상식사에서 부족 될 수 있는 비타민과 무기질을 보충하는 것이 목적이므로 식사를 대용하거나 다른 성분의 섭취가 목적이 되어서는 아니 되며, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환 등으로 한번에 섭취하기 편한 형태로 제조되어야 한다.

2) 각각의 비타민과 무기질 개별 또는 혼합된 형태로 제조․가공할 수 있다.

3) 비타민과 무기질의 최소함량은 영양소기준치(별표2)의 30% 이상으로 한다. 다만 섭취 대상을 특별히 정하는 경우에는 한국인 영양섭취기준(별표3)에서 정한 대상 연령군의 권장섭취량의 30% 이상이어야 하며, 대상 연령군에 해당하는 권장섭취량이 2개 이상인 경우 그 중 높은 값을 사용한다.

4) 비타민과 무기질의 과잉섭취로부터 안전성을 확보하기 위해 설정된 최대함량기준은 최종제품의 표시량에 대한 임의기준으로 적용한다.

5) 영양소기준치의 30% 이상을 함유하고 있는 영양소의 경우에는 영양정보란에 모두 표시하여야하나 표시한 영양소의 기능성내용을 모두 표시할 필요는 없다.

6) 이 공전은 비타민과 무기질 제품의 제조․가공에 사용할 수 있는 각 원료의 목록을 제시하며, 해당 원료의 기준 및 규격은 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격을 적용한다.

Ⅱ.1.1

Ⅱ.1.1.1 비타민 A

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 레티닐 팔미트산염(Retinyl Palmitate)

(나) 레티닐 아세트산염(Retinyl Acetate)

※ 식품첨가물공전에 등재되어 있는 분말비타민 A(Dry Formed Vitamin A) 또는 유성비타민 A 지방산에스테르(Vitamin A in Oil)의 형태로 사용

(다) 식품원료를 사용하여 비타민 A를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

(2) 비타민 A 보충의 목적으로 비타민 A 원료와 베타카로틴 원료를 혼합하여 사용할 수 있음. 이 때 최소함량기준은 비타민 A와 베타카로틴의 합으로 적용하며, 최대함량기준은 각각 별도로 적용함

(3) 베타카로틴의 비타민 A 전환계수는 1/2을 적용함(다만, 1.2. 1). (1). (다) 식품원료를 분말화 하거나 물 또는 주정으로 단순히 추출하여 베타카로틴을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것의 경우 1/6을 적용함)

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 A : 표시량의 80 ~ 150%

Ⅱ.1.1.1

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 어두운 곳에서 시각 적응을 위해 필요

(나) 피부와 점막을 형성하고 기능을 유지하는데 필요

(다) 상피세포의 성장과 발달에 필요

(2) 일일 섭취량 : 210 ~ 1,000μg RE

4) 시험법

(1) 비타민 A : Ⅲ.3.1.1 비타민 A

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.2 베타카로틴

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 식용조류(藻類)(두나리엘라, 클로렐라, 스피루리나 등), 녹엽식물(종자, 과실포함), 당근으로부터 베타카로틴을 추출하여 식용에 적합하게 유(oil)상으로 가공한 것

Ⅱ.1.1.2

(나) 합성 베타카로틴

(다) 식품원료를 분말화 하거나 물 또는 주정으로 단순히 추출하여 베타카로틴을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 베타카로틴 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 어두운 곳에서 시각 적응을 위해 필요

(나) 피부와 점막을 형성하고 기능을 유지하는데 필요

(다) 상피세포의 성장과 발달에 필요

(2) 일일 섭취량 :

(가) 1). (1). (가) 및 (나)의 경우 : 0.42 ~ 7mg

(나) 1). (1). (다)의 경우 : 1.26mg 이상

4) 시험법

(1) 베타카로틴 : Ⅲ.3.1.2 베타카로틴

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.3 비타민 D

Ⅱ.1.1.3

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비타민 D2(Ergocalciferol)

(나) 비타민 D3(Cholecalciferol)

(다) 식품원료를 사용하여 비타민 D를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 D : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 칼슘과 인이 흡수되고 이용되는데 필요

(나) 뼈의 형성과 유지에 필요

(2) 일일 섭취량 : 1.5 ~ 10μg

4) 시험법

(1) 비타민 D : Ⅲ.3.1.3 비타민 D

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.4 비타민 E

1) 제조기준

(1) 원료

(가) D-알파-토코페롤(D-α-Tocopherol)

※ 식품첨가물공전에 등재되어 있는 D-알파-토코페롤 (D-α-Tocopherol Concentrate)과 D-토코페롤 Concentrate (D-Tocopherol Concentrate, Mixed)의 형태로 사용

(나) DL-알파-토코페롤(DL-α-Tocopherol)

(다) D-알파-토코페릴 에시드 호박산(D-α-Tocopheryl Acid Succinate)

(라) D-알파-토코페릴 초산염(D-α-Tocopheryl Acetate)

(마) DL-알파-토코페릴 초산염(DL-α-Tocopheryl Acetate)

(바) 식품원료를 사용하여 비타민 E를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

(2) 전환계수

(가) DL-로 표시되는 합성 토코페롤은 절반의 활성을 가지므로 1). (1). (나) 및 (마)의 경우 1/2 전환계수를 적용함

(나) 식품에 함유되어 있는 비타민 E는 활성이 각각 다른 α, β, γ, δ의 4가지 형태로 존재하므로 1). (1). (바)의 경우 다음 식에 따라 전환계수를 적용하여 비타민 E 함량을 산출함

※비타민 E 함량(mg α-TE) = 1.0×(α-tocopherol) + 0.5×(mg β-tocopherol) + 0.1×(mg γ-tocopherol) + 0.03×(mg δ-tocopherol)

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 E : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

유해산소로부터 세포를 보호하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 3 ~ 400mg α-TE

4) 시험법

(1) 비타민 E : Ⅲ.3.1.4 비타민 E

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.4

Ⅱ.1.1.5 비타민 K

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비타민 K1(Phylloquinone, Phytonadione)

(나) 식품원료를 사용하여 비타민 K를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 K : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 정상적인 혈액응고에 필요

(나) 뼈의 구성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 16.5 ~ 1000μg

4) 시험법

(1) 비타민 K : Ⅲ.3.1.5 비타민 K

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.5

Ⅱ.1.1.6 비타민 B1

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 디벤조일티아민(Dibenzoyl Thiamine)

(나) 디벤조일티아민염산염(Dibenzoyl Thiamine Hydrochloride)

(다) 비타민 B1나프탈린-1,5-디설폰산염 (Thiamine Naphthalene-1,5-Disulfonate)

(라) 비타민 B1나프탈린-2,6-디설폰산염(Thiamine Naphthalene-2,6-Disulfonate)

(마) 비타민 B1라우릴황산염(Thiamine Dilaurylsulfate)

(바) 비타민 B1로단산염(Thiamine Thiocyanate)

(사) 비타민 B1염산염(Thiamine Hydrochloride)

(아) 비타민 B1질산염(Thiamine Mononitrate)

(자) 비타민 B1프탈린염(Thiamine Phenolphthalinate)

(차) 식품원료를 사용하여 비타민 B1을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 B1 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

Ⅱ.1.1.6

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

탄수화물과 에너지 대사에 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.3 ~ 100mg

4) 시험법

(1) 비타민 B1 : Ⅲ.3.1.6 비타민 B1

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.7 비타민 B2

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비타민 B2(Riboflavin)

(나) 비타민 B2인산에스테르나트륨 (리보플라빈 5‘-인산에스테르나트륨, Riboflavin 5'-Phosphate Sodium)

(다) 식품원료를 사용하여 비타민 B2를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 B2 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

체내 에너지 생성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.36 ~ 40mg

4) 시험법

(1) 비타민 B2 : Ⅲ.3.1.7 비타민 B2

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.7

Ⅱ.1.1.8 나이아신

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 니코틴산(Nicotinic Acid, Niacin)

(나) 니코틴산아미드(Nicotinamide, Niacinamide)

(다) 식품원료를 사용하여 나이아신을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 나이아신 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

체내 에너지 생성에 필요

(2) 일일 섭취량

(가) 니코틴산인 경우 : 3.9 ~ 23mg

(나) 니코틴산아미드인 경우 : 3.9 ~ 670mg

4) 시험법

(1) 나이아신 : Ⅲ.3.1.8 나이아신

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.8

Ⅱ.1.1.9 판토텐산

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 판토텐산나트륨(Sodium Pantothenate)

(나) 판토텐산칼슘(Calcium Pantothenate)

(다) 식품원료를 사용하여 판토텐산을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 판토텐산 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

지방, 탄수화물, 단백질 대사와 에너지 생성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 1.5 ~ 200mg

4) 시험법

(1) 판토텐산 : Ⅲ.3.1.10 판토텐산

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.9

Ⅱ.1.1.10 비타민 B6

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 피리독신염산염(Pyridoxine Hydrochloride)

(나) 식품원료를 사용하여 비타민 B6를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 B6 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 단백질 및 아미노산 이용에 필요

(나) 혈액의 호모시스테인 수준을 정상으로 유지하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.45 ~ 67mg

4) 시험법

(1) 비타민 B6 : Ⅲ.3.1.9 비타민 B6

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.10

Ⅱ.1.1.11 엽산

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 엽산(Pteroylmonoglutamic Acid, Folic Acid)

(나) 식품원료를 사용하여 엽산을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 엽산 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 세포와 혈액생성에 필요

(나) 태아 신경관의 정상 발달에 필요

(다) 혈액의 호모시스테인 수준을 정상으로 유지하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 75 ~ 400μg

4) 시험법

(1) 엽산 : Ⅲ.3.1.11 엽산

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.11

Ⅱ.1.1.12 비타민 B12

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비타민 B12(Cyanocobalamin)

(나) 식품원료를 사용하여 비타민 B12를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 B12 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

정상적인 엽산 대사에 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.3 ~ 2000μg

4) 시험법

(1) 비타민 B12 : Ⅲ.3.1.12 비타민 B12

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.12

Ⅱ.1.1.13 비오틴

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비오틴(Biotin)

(나) 식품원료를 사용하여 비오틴을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비오틴 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

지방, 탄수화물, 단백질 대사와 에너지 생성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 9 ~ 900μg

4) 시험법

(1) 비오틴 : Ⅲ.3.1.13 비오틴

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.13

Ⅱ.1.1.14 비타민 C

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 비타민 C(L-Ascorbic acid)

(나) L-아스코르빈산나트륨(Sodium L-Ascorbate)

(다) L-아스코르빈산스테아레이트(L-Ascorbyl Stearate)

(라) 아스코르빈산칼슘(Calcium Ascorbate)

(마) 아스코르빈산팔미테이트(Ascorbyl Palmitate)

(바) 식품원료를 사용하여 비타민 C를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 비타민 C : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 결합조직 형성과 기능유지에 필요

(나) 철의 흡수에 필요

(다) 유해산소로부터 세포를 보호하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 30 ~ 1000mg

4) 시험법

(1) 비타민 C : Ⅲ.3.1.14 비타민 C

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.14

Ⅱ.1.1.15 칼슘

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 구연산칼슘(Calcium Citrate)

(나) 글루콘산칼슘(Calcium Gluconate)

(다) 글리세로인산칼슘(Calcium Glycerophosphate)

(라) 산화칼슘(Calcium Oxide)

(마) 수산화칼슘(Calcium Hydroxide)

(바) 염화칼슘(Calcium Chloride)

(사) 젖산칼슘(Calcium Lactate)

(아) 제삼인산칼슘(Calcium Phosphate, Tribasic)

(자) 제이인산칼슘(Calcium Phosphate, Dibasic)

(차) 제일인산칼슘(Calcium Phosphate, Monobasic)

(카) 탄산칼슘(Calcium Carbonate)

(타) 황산칼슘(Calcium Sulfate)

(파) 식품원료를 사용하여 칼슘을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 칼슘 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 납(mg/kg): 3.0 이하(우골분, 패각분 등 소성칼슘을 사용한 경우)

(4) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 뼈와 치아 형성에 필요

(나) 신경과 근육 기능 유지에 필요

(다) 정상적인 혈액응고에 필요

(라) 청년기 이전에 적절한 운동과 건강한 식습관을 유지하면서 충분한 칼슘을 섭취하면 향후 골다공증발생의 위험을 감소시킬 수 있음

(2) 일일 섭취량 : 210 ~ 800mg

Ⅱ.1.1.15-1

4) 시험법

(1) 칼슘 : Ⅲ.3.2.2 칼슘

(2) 납 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.15-2

Ⅱ.1.1.16 마그네슘

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 글루콘산마그네슘(Magnesium Gluconate)

(나) 산화마그네슘(Magnesium Oxide)

(다) 수산화마그네슘(Magnesium Hydroxide)

(라) 염화마그네슘(Magnesium Chloride)

(마) 탄산마그네슘(Magnesium Carbonate)

(바) 황산마그네슘(Magnesium Sulphate)

(사) 식품원료를 사용하여 마그네슘을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 마그네슘 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 에너지 이용에 필요

(나) 신경과 근육 기능 유지에 필요

(2) 일일 섭취량 : 66 ~ 250mg

4) 시험법

(1) 마그네슘 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.16

Ⅱ.1.1.17 철

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 구연산철(Ferric Citrate)

(나) 구연산철암모늄(Ferric Ammonium Citrate)

(다) 글루콘산철(Ferrous Gluconate)

(라) 인산철(Ferric Phosphate)

(마) 젖산철(Ferrous Lactate)

(바) 푸마르산제일철(Ferrous Fumarate)

(사) 피로인산제이철(Ferric Pyrophosphate)

(아) 피로인산철나트륨(Sodium Ferric Pyrophosphate)

(자) 황산제일철(Ferrous Sulphate)

(차) 헴철(Heme Iron)

(카) 염화제이철(Ferric Chloride)

(타) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 철 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 체내 산소운반과 혈액생성에 필요

(나) 에너지 생성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 4.5 ~ 15mg

(3) 섭취 시 주의사항

특히 6세 이하는 과량섭취하지 않도록 주의

4) 시험법

(1) 철 : Ⅲ.3.2.4 철

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.17

Ⅱ.1.1.18 아연

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 글루콘산아연(Zinc Gluconate)

(나) 산화아연(Zinc Oxide)

(다) 황산아연(Zinc Sulphate)

(라) 식품원료를 사용하여 아연을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 아연 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 정상적인 면역기능에 필요

(나) 정상적인 세포분열에 필요

(2) 일일 섭취량 : 3.6 ~ 12mg

4) 시험법

(1) 아연 : Ⅲ.3.2.5 아연

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.18

Ⅱ.1.1.19 구리

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 글루콘산동(Cupric Gluconate)

(나) 황산동(Cupric Sulphate)

(다) 식품원료를 사용하여 구리를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 구리 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 철의 운반과 이용에 필요

(나) 유해산소로부터 세포를 보호하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.45 ~ 7.0mg

4) 시험법

(1) 구리 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.19

Ⅱ.1.1.20 셀레늄(또는 셀렌)

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 아셀렌산나트륨(Sodium Selenite)

(나) 식품원료를 사용하여 셀레늄을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 셀레늄 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

유해산소로부터 세포를 보호하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 15 ~ 135μg

4) 시험법

(1) 셀렌 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.20

Ⅱ.1.1.21 요오드

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 요오드칼륨(Potassium Iodide)

(나) 식품원료를 사용하여 요오드를 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 요오드 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 갑상선 호르몬의 합성에 필요

(나) 에너지 생성에 필요

(다) 신경발달에 필요

(2) 일일 섭취량 : 22.5 ~ 150μg

4) 시험법

(1) 요오드 : Ⅲ.3.2.3 요오드

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.21

Ⅱ.1.1.22 망간

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 글루콘산망간(Manganese Gluconate)

(나) 염화망간(Manganese Chloride)

(다) 황산망간(Manganese Sulphate)

(라) 구연산망간(Manganese Citrate)

(마) 식품원료를 사용하여 망간을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 망간 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 뼈 형성에 필요

(나) 에너지 이용에 필요

(다) 유해산소로부터 세포를 보호하는데 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.6 ~ 3.5mg

4) 시험법

(1) 망간 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.22

Ⅱ.1.1.23 몰리브덴

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 몰리브덴산암모늄(Ammonium Molybdate)

(나) 식품원료를 사용하여 몰리브덴을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 몰리브덴 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

산화․환원 효소의 활성에 필요

(2) 일일 섭취량 : 7.5 ~ 230μg

4) 시험법

(1) 몰리브덴 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.23

Ⅱ.1.1.24 칼륨

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 구연산칼륨(Potassium Citrate)

(나) 글루콘산칼륨(Potassium Gluconate)

(다) 글리세로인산칼륨(Potassium Glycerophosphate)

(라) 염화칼륨(Potassium Chloride)

(마) 젖산칼륨(Potassium Lactate)

(바) 탄산수소칼륨(Potassium Bicarbonate)

(사) 탄산칼륨(Potassium Carbonate)

(아) 식품원료를 사용하여 칼륨을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 칼륨 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

체내 물과 전해질 균형에 필요

(2) 일일 섭취량 : 1.05 ~ 3.7g

4) 시험법

(1) 칼륨 : Ⅲ.3.2.6 칼륨

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.24

Ⅱ.1.1.25 크롬

1) 제조기준

(1) 원료

(가) 염화크롬(Chromic Chloride)

(나) 식품원료를 사용하여 크롬을 보충할 수 있도록 제조․가공한 것

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 크롬 : 표시량의 80 ~ 180%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 기능성 내용

체내 물과 전해질 균형에 필요

(2) 일일 섭취량 : 0.015 ~ 9mg

4) 시험법

(1) 크롬 : Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.1.25

Ⅱ.1.2 식이섬유

1) 제조기준

(1) 원재료 및 제조방법 : 사람의 소화 효소로 분해하기 어려운 난소화성 고분자 섬유성분인 식이섬유를 함유하고 있는 식품원료를 사용하여 식용에 적합하도록 함

(2) 식이섬유 제품은 일상식사에서 부족 될 수 있는 식이섬유의 보충을 목적으로 하며, 사용되는 원료는 건강기능식품, 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격에 적합하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 영양소 기능

식이섬유 보충

(2) 일일 섭취량

식이섬유로서 5g 이상

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.2

Ⅱ.1.3 단백질

1) 제조기준

(1) 원재료 : 두류, 유류, 난류, 어패류, 육류, 견과류, 곡류

(2) 제조방법 : 상기 원재료에서 단백질을 분리하여 정제하거나, 단백분해효소나 자가분해효소로 분해하여 식용에 적합하도록 함

(3) 단백질 제품은 일상식사에서 부족 될 수 있는 단백질의 보충을 목적으로 하며, 사용되는 원료는 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격에 적합하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 조단백질 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 영양소 기능

(가) 근육, 결합조직 등 신체조직의 구성성분

(나) 효소, 호르몬, 항체의 구성에 필요

(다) 체내 필수 영양성분이나 활성물질의 운반과 저장에 필요

(라) 체액, 산-염기의 균형 유지에 필요

(마) 에너지, 포도당, 지질의 합성에 필요

(2) 일일 섭취량

단백질로서 12.0g 이상

(3) 최종제품의 아미노산스코아가 85이상 되어야 하며 아미노산스코아를 맞추기 위하여 최종제품에 단일 아미노산을 첨가할 수 있음

(4) 섭취 시 주의사항

특정 단백질에 알레르기를 나타내는 경우에는 섭취 주의

4) 시험법

(1) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.3-1

[아미노산스코아 환산을 위한 기준 필수아미노산 조성표]

(단위 : mg/g 조단백질)

구 분	히스티딘	이 소 로이신	로이신	라이신	메티오닌 ＋시스틴	페닐알라닌＋티로신	트레오닌	트립토판	발린
조성	19	28	66	58	25	63	34	11	35

※ 아미노산 스코아

제품에 함유되어 있는 단백질의 아미노산 종류 및 함량을 분석한 후 위의 기준 필수아미노산 조성표의 아미노산 함량과 단위를 맞추어 백분율로 환산함.

환산된 백분율 중 가장 적은 아미노산의 비율을 아미노산 스코아라 하며 이때 스코아가 85 이상 되어야 함

Ⅱ.1.3-2

Ⅱ.1.4 필수 지방산

1) 제조기준

(1) 원재료 및 제조방법 : 리놀레산(Linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid) 또는 이들을 함유하는 원료를 사용하여 식용에 적합하도록 함

(2) 필수 지방산 제품은 일상식사에서 부족 될 수 있는 필수 지방산의 보충을 목적으로 하며, 사용되는 원료는 건강기능식품, 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격에 적합하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 리놀레산과 리놀렌산의 합 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 잔류용매(mg/kg) : 5.0이하(헥산을 사용한 경우)

(4) 대장균군 : 음성

3) 제품의 요건

(1) 영양소 기능

필수지방산의 보충

(2) 일일 섭취량

리놀레산은 4.0g 이상 또는 리놀렌산은 0.6g 이상

4) 시험법

(1) 리놀레산과 리놀렌산의 합 : Ⅲ.3.5.1 지방산

(2) 잔류용매 :

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.1.4

Ⅱ.2 기능성 원료

Ⅱ.2.1.1-1

Ⅱ.2.1 터핀류

Ⅱ.2.1.1 인삼

1) 제조기준

(1) 원재료 : 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)

※ 말리지 아니한 수삼, 수삼을 햇볕․열풍 또는 기타 방법으로 익히지 아니하고 말린 백삼, 수삼을 물로 익혀 말린 태극삼

(2) 제조방법

(가) 상기 (1)의 원재료를 그대로 분말화하거나 수분을 제거한 후 분말화 하여 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1)의 원재료를 물이나 주정(물․주정 혼합물 포함)으로 추출하여 여과하거나, 여과한 후 농축 또는 발효하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 진세노사이드 Rg1과 Rb1을 합하여 0.8 ~ 34mg/g 함유하고 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 원재료인 인삼근은 ‘인삼산업법’에 적합하여야 하며 4년근 이상의 것으로 춘미삼, 묘삼, 삼피, 인삼박은 사용할 수 없으며 병삼인 경우에는 병든 부분을 제거하고 사용할 수 있음

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 합

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 세균수 : 1mL 당 3,000 이하(농축액에 한함)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 면역력 증진, 피로회복

(2) 일일 섭취량

면역력 증진, 피로회복 : 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 합계로서 3 ~ 80mg

Ⅱ.1.1-1

4) 시험법

(1) 진세노사이드 Rg1, Rb1 : Ⅲ.3.7.1 진세노사이드 Rg1과 Rb1

(2) 세균수 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.1.1-2

Ⅱ.2.1.2 홍삼

1) 제조기준

(1) 원재료 : 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)

※ 수삼을 증기 또는 기타방법으로 쪄서 익혀 말린 홍삼

(2) 제조방법

(가) 상기 (1)의 원재료를 분말화 하여 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1)의 원재료를 물이나 주정(물․주정 혼합물 포함)으로 추출하여 여과하거나, 여과한 후 농축 또는 발효하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 진세노사이드 Rg1과 Rb1을 합하여 0.8 ~ 34mg/g 함유하고 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 원재료인 인삼근은 ‘인삼산업법’에 적합하여야 하며 4년근 이상의 것으로 춘미삼, 묘삼, 삼피, 인삼박은 사용할 수 없으며 병삼인 경우에는 병든 부분을 제거하고 사용할 수 있음

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 합

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 150%

(3) 세균수 : 1mL 당 3,000 이하(농축액에 한함)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 면역력 증진, 피로회복, 혈소판 응집 억제를 통한 혈액흐름에 도움

(2) 일일 섭취량

(가) 면역력 증진, 피로회복 : 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 합계로서 3 ~ 80mg

(나) 혈소판 응집억제를 통한 혈액 흐름에 도움 : 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 합계로서 2.4 ~ 23mg

4) 시험법

(1) 진세노사이드 Rg1, Rb1 : Ⅲ.3.7.1 진세노사이드 Rg1과 Rb1

Ⅱ.2.1.2-1

(2) 세균수 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.1.3 엽록소 함유 식물

1) 제조기준

(1) 원재료

(가) 맥류약엽(보리, 밀, 귀리의 어린 싹) 또는 어린 이삭 형성 전의 잎의 전부 또는 일부

(나) 알팔파의 성숙한 잎, 잎꼭지, 줄기의 전부 또는 일부

(다) 엽록소를 함유한 식용해조류의 전부 또는 일부

(라) 맥류약엽, 알팔파, 해조류 이외의 식용식물류로서 단일 식물 전부 또는 일부

(2) 제조방법

(가) 상기 (가)~(라)의 원재료의 경우에는 원재료를 그대로 또는 착즙․건조하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총엽록소를 맥류약엽은 2.4mg/g 이상, 알팔파는 0.6mg/g 이상, 해조류 및 기타식물은 1.2mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 엽록소

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 총 페오포르바이드(mg/kg) : 1,000 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피부건강에 도움, 항산화 작용

(2) 일일 섭취량

총엽록소로서 8 ~ 150mg

4) 시험법

(1) 총 엽록소 : Ⅲ.3.7.2 총 엽록소

(2) 총 페오포르바이드 : Ⅲ.3.7.3 총 페오포르바이드

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.1.3

Ⅱ.2.1.4 스피루리나/클로렐라

1) 제조기준

(1) 원재료

(가) 스피루리나속 조류(藻類)

(나) 클로렐라속 조류(藻類)

(2) 제조방법

(가) 스피루리나속 조류(藻類)는 인공적으로 배양하고 건조하여 식용에 적합하도록 함

(나) 클로렐라속 조류(藻類)는 인공적으로 배양하고 건조하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총엽록소를 스피루리나는 5mg/g 이상, 클로렐라는 10mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 엽록소

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 3.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(4) 총 페오포르바이드(mg/kg) : 1,000 이하

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피부건강에 도움, 항산화 작용

(2) 일일 섭취량

총엽록소로서 8 ~ 150mg

4) 시험법

(1) 총 엽록소 : Ⅲ.3.7.2 총 엽록소

(2) 납, 카드뮴, 총수은 : [별표 4] 참조

(3) 총 페오포르바이드 : Ⅲ.3.7.3 총 페오포르바이드

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2 페놀류

Ⅱ.2.2.1 녹차추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 녹차(Camellia sinensis, Thea sinensis) 잎

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 물 또는 주정(물․주정 혼합물 포함)으로 추출 후 여과하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 카테킨을 200mg/g 이상 함유하고 있어야 함. 카테킨은 에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin, EGC), 에피갈로카테킨갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG), 에피카테킨((-)-epicatechin, EC) 및 에피카테킨갈레이트((-)-epicatechin gallate, ECG) 합계량으로 환산하며 4가지 카테킨이 모두 확인되어야 함. 다만, 최종제품의 경우 4가지 카테킨을 모두 확인할 필요는 없음

(4) 제조 시 유의 사항 : 카페인 함량이 50,000mg/kg 이하이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 카테킨

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 카페인(mg/kg) : 50,000 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 항산화 작용

(2) 일일 섭취량

카테킨으로서 0.3 ~ 1g

(3) 섭취 시 주의사항

카페인이 함유되어 있어 초조감, 불면 등을 나타낼 수 있음

4) 시험법

(1) 카테킨 : Ⅲ.3.6.1 카테킨

(2) 카페인 : Ⅲ.2.5.2 카페인

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2.2 알로에 전잎

Ⅱ.2.2.1

1) 제조기준

(1) 원재료 : 알로에(Aloe vera, Aloe arborescence, Aloe saponaria)의 잎

(2) 제조방법

(가) 상기 (1)의 원재료에서 비가식 부분을 제거한 후 건조, 분말화하여 식용에 적합하도록 함.

(나) 상기 (1)의 원재료에서 비가식 부분을 제거한 후 분쇄하거나 분쇄한 후 농축하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)을 2.0 ~ 50.0mg/g 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

무수바바로인으로서 20 ~ 30mg

4) 시험법

(1) 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서) :

Ⅲ.3.6.2 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2.2

Ⅱ.2.2.3 프로폴리스추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 꿀벌이 식물에서 채취한 수지에 자신의 분비물을 혼합하여 만든 프로폴리스

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 왁스를 제거하고 물, 주정(물 주정 혼합물 포함)추출하거나 이산화탄소(초임계추출)을 이용하여 추출한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총 플라보노이드를 10mg/g 이상 함유하고 있어야 하며, 파라(ρ)-쿠마르산 및 계피산이 확인되어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 디에틸렌글리콜을 사용하여서는 아니됨

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 플라보노이드

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 파라(ρ)-쿠마르산 : 확인

(4) 계피산 : 확인

(5) 납(mg/kg) : 5.0 이하

(6) 디에틸렌글리콜 : 불검출

(7) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 항산화 작용, 구강에서의 항균작용

※ 구강에서의 항균작용은 구강에 직접 접촉할 수 있는 형태(스프레이 또는 팅크제)에 한하며, 섭취량을 적용하지 않음

(2) 일일 섭취량

총 플라보노이드로서 16 ~ 17mg

(3) 섭취 시 주의사항

프로폴리스에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

(1) 총 플라보노이드 : Ⅲ.3.6.3 총 플라보노이드

Ⅱ.2.2.3-1

(2) 파라(ρ)-쿠마르산, 계피산 :

Ⅲ.3.6.4. 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인

(3) 납 : [별표 4] 참조

(4) 디에틸렌글리콜 : Ⅲ.2.5.3 디에틸렌글리콜

(5) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2.3-2

Ⅱ.2.3. 지방산 및 지질류

Ⅱ.2.3.1 오메가-3 지방산 함유 유지

1) 제조기준

(1) 원재료 : 식용 가능한 어류, 바닷물범(Pagophilus groenlandicus), 조류(藻類)

(2) 제조방법

상기 (1)의 원재료에서 가열, 압착, 헥산을 이용한 추출, 이산화탄소(초임계추출)의 방법으로 유지를 추출하고 여과하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : EPA와 DHA의 합으로서 식용 가능한 어류 유래 원료는 180mg/g 이상, 바닷물범 유래 원료는 120mg/g 이상, 조류 유래 원료는 300mg/g 이상 함유되어 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 에이코사펜타엔산이나 도코사헥사엔산의 함량을 높이기 위한 목적으로 인위적으로 에스테르화시키는 공정을 사용한 것은 제외함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) EPA와 DHA의 합

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 잔류용매(mg/kg) : 5.0 이하(헥산을 사용한 경우)

(4) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 3.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 혈중 중성지질 개선, 혈행개선

(2) 일일 섭취량

DHA와 EPA의 합으로서 0.5 ~ 2g

4) 시험법

(1) EPA와 DHA : Ⅲ.3.5.1 지방산

Ⅱ.2.3.1-1

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.1-2

Ⅱ.2.3.2 감마리놀렌산 함유 유지

1) 제조기준

(1) 원재료 : 달맞이 꽃(Evening primrose, Oenothera biennis, Oenothera caespitesa, Oenothera hookeri, Oenothera odorata) 종자, 보라지(Borage, Borago officinalis L.) 종자, 까막까치밥(Black currant, Ribes grossulalis, Ribes ussuriense, Ribes nigrum) 종자

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 압착, 헥산추출, 또는 이산화탄소(초임계추출)의 방법으로 유지를 추출하고 여과하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 감마리놀렌산이 70mg/g 이상이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 감마리놀렌산

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 잔류용매(mg/kg) : 5.0이하(헥산을 사용한 경우)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 혈행개선

(2) 일일 섭취량

감마리놀렌산으로서 240 ~ 300mg

4) 시험법

(1) 감마리놀렌산 : Ⅲ.3.5.1 지방산(표준품은 감마리놀렌산을 사용함)

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.2

Ⅱ.2.3.3 레시틴

1) 제조기준

(1) 원재료 : 대두, 난황

(2) 제조방법

(가) 대두레시틴 : 대두유를 여과하고 수소화한 후 분리하여 얻은 레시틴 검화물에서 유지를 추출한 후 식용에 적합하도록 함

(나) 난황레시틴 : 난황을 물 또는 주정(물․주정 혼합물 포함)을 사용하여 추출․여과하고 용매를 제거하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 인지질(아세톤불용물로서)이 360mg/g 이상 함유되어 있어야 하며 인지질 중 포스파티딜콜린은 대두레시틴은 100mg/g 이상, 난황레시틴은 600mg/g 이상 함유되어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 난황레시틴을 사용한 경우 콜레스테롤이 10,000mg/kg 이하이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 인지질(아세톤불용물로서)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 인지질 중 포스파티딜콜린

(가) 원료성 최종제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(4) 콜레스테롤(mg/kg) : 10,000 이하(난황레시틴을 사용하는 경우)

(5) 잔류용매(mg/kg) : 5.0이하(헥산을 사용한 경우)

(6) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성내용 : 콜레스테롤 개선

(2) 일일 섭취량

레시틴으로서 1.2 ~ 18g

(3) 섭취 시 주의사항

대두나 난황에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

(1) 인지질 : Ⅲ.3.5.2 인지질(아세톤불용물로서)

Ⅱ.2.3.3-1

(2) 인지질 중 포스파티딜콜린 : Ⅲ.3.5.3 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

(3) 콜레스테롤 : Ⅲ.3.5.4 콜레스테롤

(4) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(5) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.3-2

Ⅱ.2.3.4 스쿠알렌

1) 제조기준

(1) 원재료 : 상어 간

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 추출한 유지에 증류와 검화 과정을 반복한 후 불검화물을 물 또는 주정(물․주정 혼합물 포함)을 사용하여 세척하고 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 스쿠알렌이 980mg/g 이상 함유되어 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 스쿠알렌

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 항산화 작용

(2) 일일 섭취량

스쿠알렌으로서 10g

(3) 최종제품 중 비타민 A 및 D의 함량이 Ⅱ.1.1.1 비타민 A 및 Ⅱ.1.1.3 비타민 D 일일섭취량의 최대함량을 넘지 않도록 하여야 함(비타민 A 및 D의 함량이 반드시 표시되어야 함)

4) 시험법

(1) 스쿠알렌 : Ⅲ.3.5.6 스쿠알렌

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.4

Ⅱ.2.3.5 식물스테롤/식물스테롤에스테르

1) 제조기준

(1) 원재료 및 제조방법

(가) 대두유, 옥수수유, 채종유를 생산하는 공정 중 탈취공정 중에 생긴 증류물인 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol)의 혼합물을 추출 및 정제하여 식용에 적합하도록 제조․가공함

(나) 상기(가)의 추출 및 정제물을 식용유지 유래 지방산으로 에스테르화하여 식용에 적합하도록 함

(2) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식물스테롤 함량이 900mg/g 이상이어야 함. 다만 식물스테롤에스테르를 원료로 사용한 경우에는 식물스테롤과 유리식물스테롤의 합이 800mg/g 이상, 유리식물스테롤 함량이 100mg/g 이하이어야 함

(3) 제조 시 유의사항 : 식물스테롤 분석 시 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol)이 모두 검출되어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야함

(2) 식물스테롤(식물스테롤을 원료로 사용한 경우)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 식물스테롤에스테르 함량(식물스테롤에스테르를 원료로 사용한 경우)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선

(2) 일일 섭취량

식물스테롤로서 0.8 ~ 3g

(3) 섭취 시 주의사항

베타-카로틴(β-carotene)의 흡수를 저해할 수 있음

Ⅱ.2.3.5-1

4) 시험법

(1) 식물스테롤 : Ⅲ.3.5.7 식물스테롤

(2) 식물스테롤에스테르 :

(가) 총 식물스테롤 함량 : Ⅲ.3.5.7 식물스테롤

(나) 유리식물스테롤 : Ⅲ.3.5.8 유리식물스테롤

(다) 식물스테롤에스테롤 함량 = (총식물스테롤 함량 - 유리식물스테롤함량) × 1.6

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.5-2

Ⅱ.2.3.6 알콕시글리세롤 함유 상어간유

1) 제조기준

(1) 원재료 : 상어 간

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 추출한 유지에 스쿠알렌 및 검화물을 제거한 후 불검화물 부분을 물로 세척하고 탈취․가열․여과하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 알콕시글리세롤이 180mg/g 이상 함유되어 있어야 하며 바틸알콜이 확인되어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 알콕시글리세롤

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 바틸알콜 : 확인

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 면역력 증진

(2) 일일 섭취량

알콕시글리세롤로서 0.6 ~ 2.7g

(3) 최종제품 중 비타민 A 및 D의 함량이 Ⅱ.1.1.1 비타민 A 및 Ⅱ.1.1.3 비타민 D 일일섭취량의 최대함량을 넘지 않도록 하여야 함(비타민 A 및 D의 함량이 반드시 표시되어야 함)

4) 시험법

(1) 알콕시글리세롤 : Ⅲ.3.5.9 알콕시글리세롤

(2) 바틸알콜 : Ⅲ.3.5.10 바틸알콜 확인

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.6

Ⅱ.2.3.7 옥타코사놀 함유 유지

1) 제조기준

(1) 원재료

(가) 미강

(나) 사탕수수

(2) 제조방법 : 상기(1)의 원재료에서 추출한 옥타코사놀 함유 유지를 비누화한 후 주정 또는 헥산을 사용하여 재결정화를 거쳐 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 옥타코사놀이 미강유래 왁스에서 제조한 원료의 경우 100mg/g 이상 함유되어 있어야 하며, 사탕수수유래 왁스에서 제조한 원료의 경우 540mg/g 이상 함유되어 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야함

(2) 옥타코사놀

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 잔류용매(mg/kg) : 5.0 이하(헥산을 사용한 경우)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 지구력 증진

(2) 일일 섭취량

옥타코사놀로서 10mg

4) 시험법

(1) 옥타코사놀 : Ⅲ.3.5.11 옥타코사놀

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.7

Ⅱ.2.3.8 매실추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 매실(Prunus mune Sieb. et Zucc)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 열수로 추출한 후 여과․농축하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 구연산이 300 ~ 400mg/g 함유되어 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 시안화합물이 제거되어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 구연산

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 시안화합물 : 불검출

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피로 개선

(2) 일일 섭취량

구연산으로서 1 ~ 1.3g

4) 시험법

(1) 구연산 : Ⅲ.3.5.5 구연산

(2) 시안화합물 : Ⅲ.2.5.1 시안화합물

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.8

Ⅱ.2.4. 당 및 탄수화물류

Ⅱ.2.4.1 글루코사민

1) 제조기준

(1) 원재료 : 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈,  Aspergillus niger

(2) 제조방법

(가) 글루코사민 염산염 : 상기 (1)의 원재료를 탈단백, 탈칼슘화하여 얻은 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1,4 결합 중합체) 또는 키토산(위에서 얻은 키틴을 탈아세틸화하여 얻은 원료)에 염산 또는 키토사나아제로 가수분해 한 후 결정화시키고 물 또는 주정을 이용하여 충분히 세척하여 중화시켜 식용에 적합하도록 함

(나) 글루코사민 황산염 : 상기 (1)의 원재료를 탈단백, 탈칼슘화하여 얻은 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1,4 결합 중합체) 또는 키토산(위에서 얻은 키틴을 탈아세틸화하여 얻은 원료)에 염산을 사용하여 가수분해한 후 황산으로 치환하여 NaCl이나 KCl을 단독 또는 복합으로 결합, 결정화 등의 공정 이후 물 또는 주정을 이용하여 충분히 세척하고 중화시켜 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 글루코사민 황산염 또는 염산염이 980mg/g 이상 함유되어 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 중화 시 물 또는 주정을 사용하여 충분히 세척하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 글루코사민염산염 또는 황산염

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 5.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.5 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

Ⅱ.2.4.1-1

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 관절 및 연골 건강에 도움

(2) 일일 섭취량

글루코사민염산염 또는 황산염으로서 1.5 ~ 2g

(3) 섭취 시 주의사항

게에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의(게를 원재료로 사용한 경우에 한함)

새우에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의(새우를 원재료로 사용한 경우에 한함)

4) 시험법

(1) 글루코사민 : Ⅲ.3.4.1 글루코사민

(2) 납, 카드뮴, 총수은 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.1-2

Ⅱ.2.4.2 N-아세틸글루코사민

1) 제조기준

(1) 원재료 : 갑각류(게, 새우 등)의 껍질

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 탈단백, 탈칼슘화한 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1,4 결합 중합체)을 팽윤시켜 키토사나아제로 효소분해하여 탈염, 농축, 여과, 건조하여 얻은 탈아세틸화되지 않은 단당류로 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : N-아세틸글루코사민이 950mg/g 이상 함유되어 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) N-아세틸글루코사민

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 90 ~ 110%

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 관절 및 연골 건강에 도움

(2) 일일 섭취량

N-아세틸글루코사민으로서 0.5 ~ 1g

(3) 섭취 시 주의사항

게에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의(게를 원재료로 사용한 경우에 한함)

새우에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의(새우를 원재료로 사용한 경우에 한함)

4) 시험법

(1) N-아세틸글루코사민 : Ⅲ.3.4.2 N-아세틸글루코사민

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.2

Ⅱ.2.4.3 뮤코다당․단백

1) 제조기준

(1) 원재료 : 소, 돼지, 양, 사슴, 상어, 가금류, 오징어, 게, 어패류의 연골조직

(2) 제조방법 : 소, 돼지, 양, 사슴, 상어, 가금류, 오징어, 게, 어패류의 연골조직을 열수 추출 또는 효소분해한 후 여과, 농축, 건조 등의 공정을 거쳐 식용에 적합하도록 정제하여 건조함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 뮤코다당․단백이 770mg/g 이상 함유되어 있어야 하며, 단백질과 콘드로이친황산의 비율이 1.0 ~ 9.0이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 뮤코다당․단백

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 단백질과 콘드로이친 황산 비율 : 1.0 이상 9.0 미만

(4) 살모넬라 : 음성

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 관절 및 연골건강에 도움

(2) 일일 섭취량

뮤코다당․단백으로서 1.2 ~ 1.5g

4) 시험법

(1) 뮤코다당․단백

(가) 콘드로이친황산 : Ⅲ.3.4.6 콘드로이친황산

(나) 단백질 : 시료 약 10g을 수분이 흡수되지 않도록 빨리 분쇄하여 혼합하고 약 30㎎을 정확히 달아 Ⅲ.3.3.1 조단백질

※ 원료 중에 함유되어 있는 젤라틴단백질(질소함량 18%)을 근거로 질소환산계수 5.56 적용.

Ⅱ.2.4.3-1

(다) 뮤코다당․단백 함량 : (가)와 (나)에서 구한 콘드로이친황산과 단백질 함량의 합계로 구함

(2) 단백질과 콘드로이친 황산 비율 : (1)의 시험법에서 얻어진 단백질과 콘드로이친황산의 비율

(3) 살모넬라 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.3-2

Ⅱ.2.4.4 식이섬유

Ⅱ.2.4.4.1 구아검/구아검가수분해물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 콩과 구아(Cyamopsis tetragonolobus TAUB.)

(2) 제조방법 :

(가) 상기 (1) 원재료의 종자 배유부분을 분쇄하거나 온수나 열수로 추출하여 고분자 다당류인 갈락토만난을 얻은 후 식용에 적합하도록 함

(나) (가)의 방법으로 얻은 갈락토만난을 가수분해한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 660mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 식후혈당상승억제, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 조절 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 15 ~ 27g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 15 ~ 27g

(다) 배변활동 원활 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 5 ~ 12g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.1

Ⅱ.2.4.4.2 글루코만난(곤약, 곤약만난)

1) 제조기준

(1) 원재료 : 천남성과 곤약(Amorphophallus konjq)의 뿌리줄기

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 이소프로필알콜로 추출하고 정제하여 다당류 부분을 얻은 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 690mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 잔류용매(mg/kg) : 50.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 조절 : 글루코만난으로서 4 ~ 17g

(나) 배변활동 원활 : 글루코만난으로서 4 ~ 6g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.2

Ⅱ.2.4.4.3 귀리

1) 제조기준

(1) 원재료 : 귀리(Avena sativa, Avena sterilisand, Avena strigosa) 겨

(2) 제조방법 : 상기 (1) 원재료를 세정, 건조, 분쇄, 추출 등의 방법으로 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 200mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 식후혈당상승억제

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 조절 : 귀리식이섬유로서 3g 이상

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 귀리식이섬유로서 0.8 ~ 8g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.3

Ⅱ.2.4.4.4 난소화성말토덱스트린

1) 제조기준

(1) 원재료 : 옥수수전분

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 가열하여 얻은 배소덱스트린을 α-amylase (Bacillus subtilis 또는 Bacillus licheniformis 유래) 및 amyloglucosidase (Aspergillus niger 유래)로 효소분해하고 정제한  덱스트린 중에 난소화성 성분을 분획하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 850mg/g 이상 함유하고 있어야 함(액상인 경우 580mg/g 이상)

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 포도당 당량(D.E.) : 8.0 ~ 18.0(원료성 제품에 한함)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 식후혈당상승억제, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량(난소화성말토덱스트린으로서)

(가) 식후혈당상승억제 : 14 ~ 29g(액상원료는 20 ~ 43g)

(나) 배변활동 원활 : 3 ~ 29g(액상원료는 4 ~ 43g)

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유 (제2법)

(2) 포도당 당량(D.E.) : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.4

Ⅱ.2.4.4.5 대두식이섬유

1) 제조기준

(1) 원재료 : 대두(Glycine max L.N)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 탈지, 탈단백 등의 방법으로 처리하여 식이섬유를 분리한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 600mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 식후혈당상승억제, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 조절 : 대두식이섬유로서 20 ~ 25g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 대두식이섬유로서 10 ~ 25g

(다) 배변활동 원활 : 대두식이섬유로서 20 ~ 60g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.5

Ⅱ.2.4.4.6 목이버섯

1) 제조기준

(1) 원재료 : 목이버섯(Auricularia auricula judae)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 건조, 분말화한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 450mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

목이버섯식이섬유로서 12g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.6

Ⅱ.2.4.4.7 밀식이섬유

1) 제조기준

(1) 원재료 : 밀(Triticum turgidum durum, 또는 T. spp )

(2) 제조방법

(가) 밀가루 제조공정 중 부산물에서 식이섬유를 분리한 후 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1) 원재료의 외피 또는 줄기를 세정, 건조, 분쇄시킨 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 700mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 식후혈당상승억제, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 식후혈당상승 억제에 도움 : 밀식이섬유로서 6 ~ 12g

(나) 배변활동 원활 : 밀식이섬유로서 36g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.7

Ⅱ.2.4.4.8 보리식이섬유

1) 제조기준

(1) 원재료 : 보리(Hordeum vulgare)

(2) 제조방법

(가) 상기 (1)의 원재료를 탈지, 탈단백 방법으로 처리하여 얻은 식이섬유를 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1) 원재료의 외피 또는 낱알을 건조한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 500mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

보리식이섬유로서 20 ~ 25g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.8

Ⅱ.2.4.4.9 아라비아검(아카시아검)

1) 제조기준

(1) 원재료 : 콩과 아라비아고무나무(Acacia senegal WILLDENOW) 또는 그 밖의 동속식물

(2) 제조방법

(가) 상기 (1) 원재료의 분비액을 건조, 탈염한 후 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1) 원재료의 분비액을 기계적으로 착즙한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 800mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

아라비아검으로서 25g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.9

Ⅱ.2.4.4.10 옥수수겨

1) 제조기준

(1) 원재료 : 옥수수(Zea mays) 겨

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 800mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 식후혈당상승억제

(2) 일일 섭취량

옥수수겨식이섬유로서 10g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.10

Ⅱ.2.4.4.11 이눌린/치커리추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 치커리 또는 기타 국화과 식물(Chicorium intybus)

(2) 제조방법 : 상기 (1) 원재료의 뿌리를 열수로 추출, 정제한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 800mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 식후혈당상승억제, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 조절 : 이눌린으로서 9 ~ 10g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 이눌린으로서 9 ~ 10g

(다) 배변활동 원활 : 이눌린으로서 8 ~ 20g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.11

Ⅱ.2.4.4.12 차전자피

1) 제조기준

(1) 원재료 : 차전자(Plantago ovata 또는 Plantago spp.) 껍질

(2) 제조방법 : 상기 (1) 원재료를 분쇄한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 790mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선, 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 차전자피로서 7g 이상

(나) 배변활동 원활 : 차전자피로서 5 ~ 25g

(3) 섭취 시 주의사항

충분한 물로 내용물을 완전히 부풀린 후 섭취할 것

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.12

Ⅱ.2.4.4.13 폴리덱스트로스

1) 제조기준

(1) 원재료 및 제조방법 : 구연산과 같은 유기산을 사용하여 글루코스와 솔비톨로부터 합성하여 평균 중합도가 12 정도가 되도록 제조함

(2) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 650mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동 원활

(2) 일일 섭취량

폴리덱스트로스로서 7 ~ 12g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유 (제2법)

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ2..4.4.13

Ⅱ.2.4.4.14 호로파종자

1) 제조기준

(1) 원재료 : 호로파(Trigonella foenum-graecum) 종자

(2) 제조방법 : (1)의 원재료를 분쇄하거나 탈지하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 식이섬유를 450mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택․향미를 가지고 이미․이취가 없어야 함

(2) 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 식후혈당상승억제

(2) 일일 섭취량

호로파종자식이섬유로서 12 ~ 50g

4) 시험법

(1) 식이섬유 : Ⅲ.3.4.4 식이섬유

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.14

Ⅱ.2.4.5 알로에 겔

1) 제조기준

(1) 원재료 : 알로에(Aloe vera)의 잎

(2) 제조방법

(가) 상기 (1) 원재료의 비가식 부위 및 외피를 제거한 후 겔 부분을 분리하여 건조․분말화하여 식용에 적합하도록 함

(나) 상기 (1) 원재료의 비가식 부위 및 외피를 제거 한 후 겔 부분을 분리하여 분쇄하거나 착즙한 것 또는 분쇄․착즙한 후 농축하거나 농축한 것을 건조분말화 하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 고형분 중에서 총 다당체를 30mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 다당체(기타원료에서 유래하는 다당체를 구분하여 표시하여야 함)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80% 이상

(3) 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)(%) : 0.005 이하(알로에 베라 겔 100% 기준, 원료의 농축배수 및 알로에 겔 환산 함량에 따라 환산 적용함)

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피부건강에 도움, 장 건강에 도움, 면역력 증진

(2) 일일 섭취량 : 총다당체 함량으로서

(가) 피부건강에 도움 : 100 ~ 420mg

(나) 장 건강에 도움 : 110 ~ 125mg

(다) 면역력 증진에 도움 : 100 ~ 290mg

4) 시험법

(1) 총다당체 : Ⅲ.3.4.5 총 다당체

(2) 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서) :

Ⅲ.3.6.2 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.5

Ⅱ.2.4.6 영지버섯 자실체 추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 영지버섯(Ganoderma lucidum 또는 Ganoderma tsugae) 자실체

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 열수로 추출한 후 여과․농축하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 베타글루칸을 10mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 베타글루칸

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 혈행개선

(2) 일일 섭취량

베타글루칸으로서 24 ~ 42mg

4) 시험법

(1) 베타글루칸 : Ⅲ.3.4.3 베타글루칸

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.6

Ⅱ.2.4.7 키토산/키토올리고당

1) 제조기준

(1) 원재료 : 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈

(2) 제조방법 :

(가) 키토산 : 상기 (1)의 원료를 탈단백, 탈칼슘화하여 얻은 키틴(N-아세틸글루코사민의 β-1.4 결합 중합체)에 탈아세틸화 한 후 식용에 적합하도록 함

(나) 키토올리고당 : (가)의 제조방법으로 얻은 키토산에 효소를 처리하여 가수분해한 후 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 키토산은 탈아세틸화도(당 사슬 중에 글루코사민 잔기 비율)가 80% 이상이어야 하며, 키토산(글루코사민으로서)을 800mg/g 이상 함유하고 있어야 함. 키토올리고당은 키토올리고당을 200mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 키토산 또는 키토올리고당

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 3.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선

(2) 일일 섭취량

키토산과 키토올리고당의 합으로서 1.2 ~ 4.5g

4) 시험법

(1) 키토산 : Ⅲ.3.4.7 키토산(총 글루코사민으로서)

Ⅱ.2.4.7-1

(2) 키토올리고당 : Ⅲ.3.4.8 키토올리고당

(3) 납, 카드뮴 총수은 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.7-2

Ⅱ.2.4.8 프락토올리고당

1) 제조기준

(1) 원재료 및 제조방법

(가) 설탕분자에 1개에서 3개의 과당분자가 β-1,2 결합된 올리고당류로서 설탕을 녹여서 당액을 만든 후 전이효소 또는 전이효소를 가진 미생물을 사용하여 제조․가공함

(나) 이눌린(inulin)을 효소로 가수분해하여 제조․가공함

(2) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 프락토올리고당을 900mg/g 이상 함유하고 있어야 하며, 프락토올리고당은 1-케이스토즈(GF2), 니스토즈(GF3), 프락토퓨라노실니스토즈(GF4)를 합한 량으로 계산함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 프락토올리고당

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 유익균 증식, 유해균 억제, 배별활동 원활, 칼슘 흡수에 도움

(2) 일일 섭취량

프락토올리고당으로서 3 ~ 8g

4) 시험법

(1) 프락토올리고당 : Ⅲ.3.4.9 프락토올리고당

(2) 납 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.8

Ⅱ.2.5 발효미생물류

Ⅱ.2.5.1 프로바이오틱스

1) 제조기준

(1) 원재료 : 다음의 미생물 또는 이를 혼합한 균과 균 또는 배양체를 배양시키기 위한 배지 및 보호제

	종류
Lactobacillus	L.acidophilus, L.casei, L.gasseri, L.delbrueckii ssp. bulgaricus, L.helveticus, L.fermentum, L.paracasei, L.plantarum, L.reuteri, L.rhamnosus, L.salivarius
Lactococcus	Lc. lactis
Enterococcus	E.faecium, E.faecalis
Streptococcus	S.thermophilus
Bifidobacterium	B.bifidum, B.breve, B.longum, B.animalis spp. lactis

(2) 제조방법 : 상기 미생물을 배양․건조하여 식용에 적합하도록 함.

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 생균을 100,000,000 CFU/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 프로바이오틱스 수 : 표시량 이상

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 유익한 유산균 증식, 유해균 억제 또는 배변활동 원활

(2) 일일 권장섭취량

100,000,000 ~ 10,000,000,000 CFU

4) 시험법

(1) 프로바이오틱스 수

(가) 유산간균 및 구균 : Ⅲ.3.8.1 유산간균 및 구균

Ⅱ.2.5.1-1

(나) 비피더스균(Bifidobacterium) : Ⅲ.3.8.2 비피더스균(Bifidobacterium)

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.5.1-2

Ⅱ.2.5.2 홍국

1) 제조기준

(1) 원재료 : 쌀, 홍국균(Monascus anka, Monascus purpures, Monascus pilosus, Monascus ruber)

(2) 제조방법 : 쌀(찐쌀을 제외)에 홍국균을 접종하여 고체발효시킨 후 분말화하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총 모나콜린 K를 0.5mg/g 이상 함유하고 있어야 하며, 활성형 모나콜린 K가 확인되어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 시트리닌이 50μg/kg 이하이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 총 모나콜린 K

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 활성형 모나콜린 K : 확인

(4) 시트리닌(μg/kg) : 50 이하

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선

(2) 일일 섭취량

총 모나콜린 K으로서 4 ~ 8mg

4) 시험법

(1) 총 모나콜린 K : Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린 K

(2) 활성형 모나콜린 K : 상기 (1)의 총 모나콜린 K의 시험법에 따라 확인함

(3) 시트리닌 : Ⅲ.2.5.4 시트리닌

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.5.2

Ⅱ.2.6. 아미노산 및 단백질류

Ⅱ.2.6.1 대두단백

1) 제조기준

(1) 원재료 : 대두(Glycine max L.N)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 지질을 제거한 후 단백질을 분리․정제하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 조단백질을 건고물 기준으로 600mg/g 이상 함유하고 있어야 하며, 다이드제인 및 제니스테인이 확인되어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 조단백질

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ~ 120%

(3) 다이드제인 : 확인

(4) 제니스테인 : 확인

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 콜레스테롤 개선

(2) 일일 섭취량

대두단백으로서 15g 이상

(3) 섭취 시 주의사항

대두단백에 알레르기를 나타내는 경우에는 섭취 주의

4) 시험법

(1) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(2) 다이드제인, 제니스테인 : Ⅲ.3.6.5 다이드제인 및 제니스테인 확인

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.6.1

Ⅱ.2.7 일반원료

Ⅱ.2.7.1 로얄젤리

1) 제조기준

(1) 원재료 : 일벌의 인두선에서 분비되는 분비물인 로얄젤리

(2) 제조방법

(가) 생로얄젤리 : 일벌의 인두선에서 분비되는 분비물인 로얄젤리를 식용에 적합하도록 이물을 제거한 것

(나) 동결건조로얄젤리 : 생로얄젤리를 동결건조 한 것

(다) 로얄젤리제품 : 로얄젤리(생로얄젤리 35.0% 이상, 동결건조로얄젤리 14.0% 이상)로 하여 제조․가공한 것

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)이 생로얄젤리는 1.6% 이상, 동결건조로얄젤리는 4.0% 이상, 로얄젤리제품은 0.56% 이상이어야 함

Ⅱ.2.7.1-1

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)(%) : 표시량 이상

(3) 조단백질(%)

(가) 생로얄젤리 : 11.0 ~ 14.5

(나) 동결건조로얄젤리 : 30.0 ~ 41.0

(4) 수분(%)

(가) 생로얄젤리 : 65.5 ~ 68.5

(나) 동결건조로얄젤리 : 5.0 이하

(5) 산도(1N NaOH ml/100g) : 32 ~ 53(생로얄젤리에 한함)

(6) 대장균 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 영양보급, 건강증진 및 유지, 고단백식품

(2) 섭취 시 주의사항

벌꿀에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

(1) 10-히드록시-2-데센산(10-HDA) : Ⅲ.3.5.12 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

(2) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(3) 수분 : [별표 4] 참조

(4) 산도 : 제4장. 시험법 Ⅱ. 일반시험법 4. 산도 시험법 4.1. 산도

(5) 대장균 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.1-2

Ⅱ.2.7.2 버섯

1) 제조기준

(1) 원재료 : 영지버섯, 운지버섯, 표고버섯

(2) 제조방법

(가) 운지, 표고버섯 자실체의 건조물을 분말화 하거나 물이나 주정(물․주정 혼합물 포함)으로 추출하여 식용에 적합하도록 함

(나) 영지버섯 자실체의 건조물을 분말화 하거나 주정(물․주정 혼합물 포함, 다만 열수제외)으로 추출하여 식용에 적합하도록 함

(다) 영지, 운지, 표고버섯 균사체 배양물을 물이나 주정(물․주정 혼합물 포함)으로 추출하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 자실체는 30.0% 이상, 균사체는 50.0% 이상이어야 함. 자실체추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산하여 제품 전체중량의 30.0% 이상이 되어야하며, 균사체배양물의 경우에는 배양물의 건조물로 환산하여 제품 전체중량의 50.0% 이상이어야 함

(4) 제조 시 유의사항

(가) 자실체분말을 직접 식용으로 하는 경우 소화기 내에서 유효성분의 용출이 용이하도록 미세하게 분말로 하여야 함

(나) 추출에 사용되는 주정은 농축과정에서 충분히 제거되어야 함

(다) 배양에 사용된 배지성분의 잔존량은 건조배양물의 10% 이하이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 자실체(%) : 표시량 이상(버섯자실체제품에 한하며, 추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)

(3) 균사체(%) : 표시량 이상(버섯균사체제품에 한하며, 추출물의 경우 균사체 배양물의 건조물로 환산)

(4) 확인시험 : 자실체 또는 균사체가 확인되어야 함

Ⅱ.2.7.2-1

(5) 수분(%) : 7.0 이하이어야 함(액상제품은 제외함)

(6) 타르색소 : 불검출

(7) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 생리활성물질 함유, 건강증진 및 유지

4) 시험법

(1) 자실체 : Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인

(2) 균사체 : Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인

(3) 확인시험 : Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인

(4) 수분 : [별표 4] 참조

(5) 타르색소 : [별표 4] 참조

(6) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.2-2

Ⅱ.2.7.3 식물추출물발효

1) 제조기준

(1) 원재료 : 채소류, 과일류, 종실류, 해조류 등 식용식물

(2) 제조방법 : 채소류, 과일류, 종실류, 해조류 등 식용식물을 압착 또는 당류(설탕, 맥아당, 포도당, 과당 등)의 삼투압에 의해 얻은 추출물을 자체발효 또는 유산균․효모균 등의 접종에 의하여 발효시켜 식용유래성분과 발효생성물을 섭취에 적합하도록 제조․가공함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 유기산 산도(%)∶0.3 이상(젖산으로서)이어야 하며 다음 중 세 항목 이상 적합하여야 함

(가) 환원당(%)∶50.0 이상

(나) 효모수∶1g당 1,000,000 이상

(다) 유산균수∶1g당 1,000,000 이상

(라) 비타민 B1(mg/100g)∶0.2 이상

(마) 비타민 B2(mg/100g)∶0.05 이상

Ⅱ.2.7.3-1

(4) 제조 시 유의사항

발효에 사용되는 미생물은 안전성이 인정된 것이어야 하며, 원료에서 유래한 것(종균 포함) 이외의 물, 효모, 유산균, 비타민 등을 첨가하여서는 아니됨

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 유기산 산도(%)∶0.3 이상(젖산으로서)

(3) 환원당(%)∶50.0 이상(표시된 경우)

(4) 효모수∶1g당 1,000,000 이상(표시된 경우)

(5) 유산균수∶1g당 1,000,000 이상(표시된 경우)

(6) 비타민 B1(mg/100g)∶0.2 이상(표시된 경우)

(7) 비타민 B2(mg/100g)∶0.05 이상(표시된 경우)

(8) 대장균군∶음성

(9) 메탄올(%)∶0.01 이하

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 건강증진 및 유지, 체질개선, 영양공급원

4) 시험법

(1) 유기산 산도∶Ⅲ.2.4.2 유기산 산도

(2) 환원당∶[별표 4] 참조

(3) 효모수∶Ⅲ.3.8.4 효모수

(4) 유산균수∶Ⅲ.3.8.1 유산간균 및 구균

(5) 비타민 B1∶Ⅲ.3.1.6 비타민 B1

(6) 비타민 B2∶Ⅲ.3.1.7 비타민 B2

(7) 대장균군∶[별표 4] 참조

(8) 메탄올∶[별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.3-2

Ⅱ.2.7.4 자라

1) 제조기준

(1) 원재료 : 양식 자라

(2) 제조방법

(가) 동결건조자라분말 : 식용 양식 자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 후 동결건조하여 분말화한 것을 말함

(나) 열풍건조자라분말 : 식용양식자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 것을 열풍건조하여 분말화한 것을 말함

Ⅱ.2.7.4-1

(다) 자라유 : 식용양식자라에서 채취한 기름을 정제한 것을 말함

(라) 자라분말제품 : 동결건조자라분말 또는 열풍건조자라분말을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조․가공한 것을 말함

(마) 자라유최종제품 : 자라유를 주원료(98.0% 이상)로 하여 제조․가공한 것을 말함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 히드록시프롤린이 동결건조자라분말의 경우 1.0% 이상, 열풍건조자라분말의 경우 2.0% 이상, 동결건조자라분말 사용최종제품의 경우 0.3% 이상, 열풍건조자라분말 사용최종제품의 경우 0.6% 이상 되어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 히드록시프롤린(%) : 표시량 이상

(3) 조단백질(%)

(가) 자라분말

① 동결건조품 : 48.0 ~ 58.0

② 열풍건조품 : 50.0 ~ 70.0

(나) 자라분말최종제품

① 동결건조품 : 14.0 이상

② 열풍건조품 : 15.0 이상

(4) 회분(%)

(가) 자라분말

① 동결건조품 : 16.0 ~ 40.0

② 열풍건조품 : 20.0 ~ 40.0

(나) 자라분말최종제품

① 동결건조품 : 4.8 이상

② 열풍건조품 : 6.0 이상

(5) 수분(%)

(가) 자라분말 : 5.0 이하

(나) 자라분말최종제품 : 10.0 이하

(6) 팔밑올레산(%) : 8.0 ~ 18.0(자라유, 자라유제품에 한함)

(7) 아라키돈산+에이코사펜타엔산(%) : 2.0 ~ 8.0(자라유, 자라유제품에 한함)

(8) 조지방(%) : 95.0 이상(자라유, 자라유제품에 한함)

(9) 산가 : 1.0 이하(자라유, 자라유제품에 한함)

(10) 과산화물가 : 15.0 이하(자라유, 자라유제품에 한함)

(11) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 건강증진 및 유지, 영양보급, 단백질 공급원, 신체기능의 활성화, 체력증진, 체력보강

4) 시험법

(1) 히드록시프롤린 : Ⅲ.3.3.2 아미노산

(2) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(3) 회분 : [별표 4] 참조

(4) 수분 : [별표 4] 참조

(5) 팔밑올레산 : Ⅲ.3.5.1 지방산

(6) 아라키돈산+에이코사펜타엔산 : Ⅲ.3.5.1 지방산

(7) 조지방 : [별표 4] 참조

(8) 산가 : [별표 4] 참조

(9) 과산화물가 : [별표 4] 참조

(10) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.4-2

Ⅱ.2.7.5 효모

1) 제조기준

(1) 원재료 : 식용효모

(2) 제조방법

(가) 건조효모 : 식용 효모균주를 분리, 정제하여 건조함

Ⅱ.2.7.5

(나) 건조효모최종제품 : 건조효모를 주원료(60.0% 이상)로 하여 제조․가공한 것을 말함

(다) 효모추출물최종제품 : 식용 효모균주를 분리, 정제한 후 자가소화, 효소분해, 열수추출 등의 방법에 의해 추출한 식용효모추출물을 주원료(고형분함량으로 30.0% 이상)로 하여 제조한 것을 말함(단, 액상제품은 고형분 함량으로 15.0% 이상)

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 조단백질(%)이 건조효모의 경우 40.0% 이상, 건조효모최종제품의 경우 24.0% 이상, 효모추출물최종제품의 경우 10.0% 이상이어야 함. 다만 효모추출물최종제품 중 액상제품은 5.0% 이상이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 조단백질(%) : 표시량 이상

(3) 수분(%)

(가) 건조효모 : 8.0 이하

(나) 건조효모제품, 효모추출물제품 : 10.0 이하(액상제품 제외)

(4) 대장균 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 영양의 불균형 개선, 영양공급원, 건강증진 및 유지, 신진대사 기능

4) 시험법

(1) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(2) 수분 : [별표 4] 참조

(3) 대장균 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.6 효소

1) 제조기준

(1) 원재료 : 곡류, 곡물의 배아, 과채류에 식용미생물을 배양시킨 것

(2) 제조방법 :

(가) 곡류효소함유최종제품 : 곡류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조․가공함

(나) 배아효소함유최종제품 : 곡물의 배아(40.0% 이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조․가공함

Ⅱ.2.7.6

(다) 과․채류효소함유최종제품 : 과채류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조․가공함

(라) 기타식물효소함유최종제품 : 곡류, 곡물배아 또는 과․채류 이외의 식물성 원료(60.0% 이상)에 미생물을 배양시킨 것을 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조․가공함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 조단백질이 10.0% 이상이며 α-아밀라아제와 프로테아제가 양성이어야 함

(4) 제조 시 유의사항

배양에 사용되는 미생물은 안전성이 인정되는 것이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 조단백질(%)∶표시량 이상

(3) α-아밀라아제∶양성

(4) 프로테아제∶양성

(5) 수분(%) : 10.0 이하(단, 액상제품은 제외함)

(6) 대장균∶음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 신진대사 기능, 건강증진 및 유지, 체질개선

4) 시험법

(1) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(2) α-아밀라아제 : Ⅲ.3.9.1 α-아밀라아제

(3) 프로테아제 : Ⅲ.3.9.2 프로테아제

(4) 수분 : [별표 4] 참조

(5) 대장균 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.7 화분

1) 제조기준

(1) 원재료 : 벌 또는 인공적으로 채취한 화분

(2) 제조방법

(가) 화분 : 벌 또는 인공적으로 채취한 화분에서 이물을 제거하고 껍질을 파쇄함

(나) 화분추출물 : 화분을 기계적으로 파쇄 또는 효소처리하여 추출한 것을 농축하거나 분말화 함

(다) 화분최종제품 : 화분을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조․가공함

(라) 화분추출물최종제품 : 화분추출물을 주원료(고형분으로서 10.0% 이상)로 하여 제조․가공함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 조단백질이 화분의 경우 18.0% 이상, 화분추출물의 경우 건조물로 환산하여 20.0% 이상, 화분최종제품의 경우 5.0% 이상, 화분추출물최종제품의 경우 2.0% 이상이어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 조단백질(%) : 표시량 이상

(3) 수분(%)

(가) 화분 : 8.0 이하

(나) 화분추출물 : 8.0 이하(단, 액상제품은 제외함)

(다) 화분최종제품, 화분추출물최종제품 : 10.0 이하(단, 액상제품은 제외함)

(4) 타르색소 : 불검출

(5) 대장균 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 영양보급, 피부건강에 도움, 건강증진 및 유지, 신진대사 기능

(2) 섭취 시 주의사항

꽃가루에 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

Ⅱ.2.7.7-1

(1) 조단백질 : Ⅲ.3.3.1 조단백질

(2) 수분 : [별표 4] 참조

(3) 타르색소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.7.7-2

[별표 1] 난수표 및 사용방법

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25	95767 81934 64959 88488 22306 01436 35962 80319 32141 99197 04030 99835 26400 64363 82878 19485 72762 53747 84760 42365 44336 52930 50436 24980 94186	26878 99378 10235 81729 61346 13553 90832 01462 01977 78637 88194 54210 63946 11259 87304 82792 47963 17433 29591 42338 05322 61970 54490 54548 95540	94971 73901 55441 60733 09026 53487 21604 60338 57874 67636 08580 80413 83204 59066 33618 88195 14380 51614 96142 66105 04540 05808 50650 49428 75071	75204 46997 87439 84690 66275 19706 29620 69763 25052 35765 86080 82015 36388 92948 19490 31877 96130 97763 02207 03782 75989 22807 59386 91704 10076	64775 11173 04966 94315 78204 30740 01151 32812 11567 36871 76119 07459 30497 72291 88779 74902 74633 90426 79847 83727 51385 85460 25572 86913 10263	52647 80744 96170 10841 11563 83272 81945 84076 35505 22555 62260 93910 24021 31804 38883 13212 21388 47833 89559 14200 52279 22723 23267 92940 27664	35672 51957 22582 99296 67457 69602 61894 10555 04797 94013 81248 93694 93962 82029 14481 02514 22096 58245 66803 57263 16661 61318 44039 86923 98534	97456 50801 13512 47844 69438 99251 91583 88707 21900 15118 51732 41184 25555 15789 77089 47152 24987 14890 15461 85617 91446 23281 08759 22428 81171	89815 25785 60227 87998 98753 81599 41133 92309 81703 81620 89078 65698 00357 04683 58544 17292 50056 77303 39639 95577 48811 63426 33702 47877 61507	16767 40475 81391 01066 23478 79264 83955 34505 11848 76730 21940 31977 93441 34455 22761 62081 26487 35338 23187 88654 25346 69030 34580 20510 74976	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

A.1-1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
26 27 28 29 30	12359 57132 71239 03935 72801	46569 49387 49511 83975 73777	11050 74792 07466 28893 79101	90529 50937 15364 66615 26592	49289 62339 86050 14015 45424	94545 43401 31093 22410 00899	02258 82825 16730 90938 78462	20678 03692 73587 35961 74336	18898 37836 79875 36373 60478	50931 68752 43576 84810 13852	26 27 28 29 30
31 32 33 34 35	80252 69388 40225 59925 31172	11587 92356 60304 62338 89780	10862 81282 13526 78784 95384	11627 33832 47601 63228 51947	89857 56676 12751 82603 13841	07788 35132 19233 31755 74371	46817 07119 02057 72733 81016	55863 27613 28447 80303 39798	35713 01304 46676 91066 26690	44712 70032 29541 52537 00978	31 32 33 34 35
36 37 38 39 40	45587 37819 51402 93873 97645	42590 60911 74213 99143 51836	08443 94740 01105 82254 11835	20404 05536 15098 53647 99276	15100 94042 61470 11010 86466	74747 17969 23047 68668 67647	50642 36747 28521 25888 60834	34480 92151 58559 36209 30704	68080 07501 59305 65412 06711	23169 67660 08761 00066 11128	36 37 38 39 40
41 42 43 44 45	13123 72110 13751 83809 46264	15323 70217 40714 98109 57933	24885 23475 99330 48292 37607	74046 48152 05232 06947 58926	49145 83457 97056 15924 60772	99982 01585 40788 08787 62523	48231 90915 70005 03919 66260	26711 69308 36274 72577 95270	87670 89090 78649 12906 46469	22062 77158 50897 80694 45110	41 42 43 44 45
46 47 48 49 50	97426 74715 92481 40176 90176	78630 09140 55828 70724 19360	06115 90315 20144 99476 74015	44047 03927 77853 34567 89080	42350 82118 18100 10214 36337	88455 00800 13196 97743 40242	61426 14314 12279 15770 39621	08812 06984 20903 78474 71369	04255 88951 01252 75691 72350	87718 10983 00731 59930 73430	46 47 48 49 50

A.1-2

※ 난수표 사용방법

아래의 그림과 같이 농산물이 든 상자가 가로, 세로, 높이 각 10개씩 1,000상자가 쌓여 있다고 할 때 난수표를 사용하여 시료를 채취할 상자를 선정하는 것을 설명하면 다음과 같다.

① 임의로 한 상자를 선택한다.

예：임의로 왼쪽 끝의 위에서 두 번째 상자를 선택하였다면 위 그림의 “가”에 해당된다.

② 난수표의 한 지점을 임의로 선택한다.

예：임의로 난수표의 한 지점을 선택한 결과 3번 칸, 25번 줄 위치에 있는 다섯 숫자(7 5 0 7 1)중에서 네번째 숫자인 7을 선택하였다.

③ 난수표에서 선택한 숫자로부터 임의로 가로, 세로 또는 위, 아래 방향으로 세 개 숫자를 읽는다.

예：선택된 숫자인 7로부터 가로 방향으로 읽기로 했다면 7, 1, 1로 읽혀진다.

④ 읽혀진 숫자에 따라 세 방향으로 상자를 세어 시료채취할 상자를 선정한다.

예：오른쪽, 위의, 안쪽으로 숫자를 세기로 하였다면 위 그림에서 오른쪽으로 7번째, 윗쪽으로 1번째, 안쪽으로 1번째에 있는 상자 즉, 위 그림의 “나”가 시료를 채취할 상자가 된다.

A.1-3

[별표 2] 영양소 기준치

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	328	철분(mg)	15	판토텐산(mg)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(μg)	5	인(mg)	700
단백질(g)	60	비타민E(mgα-TE)	10	요오드(μg)	75
지방(g)	50	비타민K(μg)	55	마그네슘(mg)	220
포화지방(g)	15	비타민B1(mg)	1.0	아연(mg)	12
콜레스테롤(mg)	300	비타민B2(mg)	1.2	셀렌(μg)	50
나트륨(mg)	2,000	나이아신(mg NE)	13	구리(mg)	1.5
칼륨(mg)	3,500	비타민B6(mg)	1.5	망간(mg)	2.0
비타민A(μg RE)	700	엽산(μg)	250	크롬(μg)	50
비타민C(mg)	100	비타민B12(μg)	1.0	몰리브덴(μg)	25
칼슘(mg)	700	비오틴(μg)	30

B.1

[별표 3] 한국인 영양섭취기준

연 령	탄수화물 (g)		지방 (g)		n-6불포화지방산(g)		n-3불포화지방산(g)		단백질 (g)		식이섬유 (g)		수분 (ml)		비타민C (mg)		티아민 (mg)		리보플라민 (mg)		니아신 (mg NE)		비타민B6 (mg)		엽산 (μg DFE)		비타민B12 (mg)		판토텐산 (mg)		비오틴 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		55 90		25 25		2.0 4.5		0.3 0.8	13.5	9.5				700 800		35 40		0.2 0.3		0.3 0.4		2 3		0.1 0.3		65 80		0.2 0.5		1.7 1.8		5 6
소아 1～2(세) 3～5									15 20			12 17		1,100 1,400	40 40		0.5 0.5		0.6 0.7		6 7		0.6 0.7		150 180		0.9 1.1			2 2		8 10
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～19 20～29 30～49 50～64 65～74 75 이상									25 35 50 60 55 55 50 50 50			19 23 29 32 31 29 26 26 26		1,700 2,000 2,400 2,700 2,700 2,500 2,300 2,100 2,100	60 70 100 110 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.2 1.4 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		0.9 1.1 1.5 1.8 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		9 12 15 18 16 16 16 16 16		0.9 1.1 1.5 1.8 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.8 2.2 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4			3 4 5 6 5 5 5 5 5		15 20 25 25 30 30 30 30 30
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～19 20～29 30～49 50～64 65～74 75이상									25 35 45 45 45 45 45 45 45			18 20 24 24 25 23 22 22 22		1,600 1,800 2,000 2,100 2,100 2,000 1,800 1,700 1,700	60 70 90 100 100 100 100 100 100		0.6 0.8 1.0 1.0 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1		0.7 0.9 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		9 10 13 13 14 14 14 14 14		0.8 1.0 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.8 2.2 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4			3 4 5 6 5 5 5 5 5		15 20 25 25 30 30 30 30 30
임신부									+25			+5		+200	+10		+0.5		+0.4		+4		+0.8		+200		+0.2			+1		+0
수유부									+25			+4		+700	+35		+0.4		+0.5		+4		+0.7		+150		+0.2			+2		+5

[사단법인 한국영양학회 : 한국인 영양섭취기준 (2005년)

* 권장섭취량 : 1일 연령별로 권장되는 영양소 섭취량으로서 평균 필요량을 근거로 하여 산출

C.1-1

연 령	비타민A (μg RE)		비타민D (μg)		비타민E (mg α-TE)		비타민K (μg)		칼슘 (mg)		인 (mg)		나트륨 (g)		염소 (g)		칼륨 (g)		마그네슘 (mg)		철 (mg)		아연 (mg)		구리 (μg)		불소 (mg)		망간 (mg)		요오드 (μg)		셀레늄 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		350 400		5 5		3 4		4 7		200 300		100 300		0.12 0.37		0.18 0.56		0.4 0.7		30 55	7	0.26	2.5	1.73		225 290		0.01 0.5		0.008 0.8		130 170		8.5 11
소아 1～2(세) 3～5	300 300			10 10		5 6		25 30	500 600		500 500			0.8 1.0		1.2 1.5		2.5 3.0	75 100		7 7		3 4		300 380			0.6 0.8		1.2 2.0	80 90		20 25
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～19 20～29 30～49 50～64 65～74 75 이상	400 550 700 850 750 750 700 700 700			10 10 10 10 5 5 10 10 10		7 9 10 10 10 10 10 10 10		45 55 70 80 75 75 75 75 75	700 800 1,000 1,000 700 700 700 700 700		700 1,000 1,000 1,000 700 700 700 700 700			1.2 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.2 1.1		1.9 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.8 1.6		3.8 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7	140 200 300 400 340 350 350 350 350		9 12 12 16 10 10 10 10 10		5 7 8 10 10 9 9 9 8		440 570 750 870 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 3.5 3.0 3.0 3.0		2.5 3.0 3.3 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	100 120 130 140 150 150 150 150 150		30 40 50 60 50 50 50 50 50
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～19 20～29 30～49 50～64 65～74 75이상	400 500 650 700 650 650 600 600 600			10 10 10 10 5 5 10 10 10		7 9 10 10 10 10 10 10 10		45 55 65 65 65 65 65 65 65	700 800 900 900 700 700 800 800 800		600 900 900 800 700 700 700 700 700			1.2 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.2 1.1		1.9 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.8 1.6		3.8 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7	140 200 280 340 280 280 280 280 280		9 12 12 16 14 14 9 9 9		5 7 7 9 8 8 8 7 7		440 570 750 870 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5		2.3 2.5 2.8 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0	100 120 130 140 150 150 150 150 150		30 40 50 60 50 50 50 50 50
임신부	+70			+5		+0		+0	+300		+0			+0		+0		+0	+40		+10		+2.5		+130			+0		+0	+90		+4
수유부	+500			+5		+3		+0	+400		+0			+0		+0.4		+0.4	+0		+0		+5.0		+450			+0		+0	+180		+11

* 충분섭취량 : 권장섭취량을 산출할 수 없는 경우 역학조사 결과를 토대로 건강인의 영양소 섭취수준을 기준으로 산출

C.1-2

[별표 4] 시험법 적용표

D.1

시험항목	시험방법	비고
수분	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 1) 수분 ※ Ⅱ.2.7.1 로얄젤리는 (3) 칼핏샤법에 따름	식품공전
회분	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 2) 회분
조지방	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 4) 지질 (1) 조지방
산가	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 4) 지질 (3) 화학적시험 ① 산가
과산화물가	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 4) 지질 (3) 화학적시험 ⑤ 과산화물가
환원당	제10. 일반시험법 1. 일반성분시험법 5) 탄수화물 (1) 당질 ② 환원당
타르색소	제10. 일반시험법 5. 착색료시험법
납, 카드뮴	제10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 1) 시험용액의 조제 2) 측정 (1) 원자흡광광도법 또는 (2) ICP
총수은	제10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (5) 수은
세균수	제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 2) 세균수(일반세균수)
대장균군	제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 5) 대장균군
대장균	제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 6) 대장균
살모넬라	제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 13) 살모넬라
세균발육	제10. 일반시험법 8. 미생물시험법 16) 세균(세균발육시험)
포도당당량(D.E.)	제5. 식품별 기준 빛 규격 6. 포도당 6) 시험방법 (1) 포도당당량(D.E.)
메탄올	제5. 식품별 기준 및 규격 27-1 탁주 6) 시험방법 (3) 메탄올
잔류용매	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 80. 파프리카추출색소	식품첨가물공전
잔류용매 (이소프로필알콜)	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 108. 글루코만난

Ⅲ. 건강기능식품 시험법

Ⅲ.1 일반원칙

1. 시료채취 방법

1) 시료는 채취된 검체에서 시험에 직접 사용되는 물질을 말한다.

2) 시료채취는 시험의 대표성을 가질 수 있도록 균질하여 해당 시험항목에서 기재된 필요한 량을 정확히 채취한다.

Ⅲ.1-1

3) 시험에 사용된 시료는 규격항목에 따라 채취 방법을 달리한다.

(1) 미생물

(가) 캅셀은 외피를 포함하여 시험의 시료로 사용한다.

(2) (1)항을 제외한 규격항목

(가) 캅셀은 외피는 제거하고 내용량을 취하여 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다.

(나) 과립, 정제 및 환은 분쇄하여 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다.

(다) 분말 및 액상은 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다.

2. 용어의 정의 및 단위

1) 이 공전에서 계량의 단위는 다음의 기호를 사용한다.

(1) 길이 : m, cm, mm, μm, nm

(2) 용량 : L, mL, μL

(3) 질량 : kg, g, mg, μg, ng, pg

(4) 넓이 : cm2, m2, mm2

(5) 열량 : kcal, kj

(6) 온도 : ℃

2) 원자량은 최신 국제원자량표에 의하고, 분자량은 국제원자량표에 의하여 계산한다.

3) 질량백분율을 표시할 때에는 %의 기호를 쓰며, 용액 100mL중의 물질함량(g)을 표시할 때에는 w/v%로, 용액 100mL중의 물질함량(mL)을 표시할 때에는 v/v%의 기호를 쓴다. 질량백만분율을 표시할 때에는 mg/kg을 사용하며, mg/L도 사용할 수 있다.

4) 표준온도는 20℃, 상온은 15～25℃, 실온은 1～35℃, 미온은 30～40℃로 한다.

5) “찬 곳(냉소)”이라 함은 따로 규정이 없는 한 0～15℃  의 장소를 말한다.

6) 시험은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작 후 30초 이내에 관찰한다. 다만, 온도의 영향이 있는 것에 대하여는 표준온도에서 행한다.

7) 시험에 쓰는 물은 따로 규정이 없는 한 증류수 또는 정제수로 한다.

8) 액성을 산성, 알카리성 또는 중성으로 표시한 것은 따로 규정이 없는 한 pH미터기 또는 리트머스지를 써서 시험한다. 액성을 상세히 나타낼 때에는 pH값을 쓴다. 또한, 강산성은 pH 약 3.0이하, 약산성은 pH 약 3.0～5.0, 미산성은 pH 약 5.0～6.5, 중성은 pH 약 6.5～7.5, 미알카리성은 pH 약 7.5～9.0, 약알카리성은 pH 약 9.0～11.0, 강알카리성은 pH 약 11.0이상을 말한다.

9) 혼액을 (1∶1), (4∶2∶1) 등으로 나타낸 것은 액체시약의 혼합 용량비 또는 고체시약의 혼합 무게비를 말한다.

10) 무게를 “정밀히 단다”라 함은 달아야 할 최소단위를 고려하여 0.1mg, 0.01mg 또는 0.001mg까지 다는 것을 말한다. 또 무게를 “정확히 단다”라 함은 규정된 수치의 무게를 그 자리수 까지 다는 것을 말한다.

11) 검체를 취하는 양에 “약”이라고 한 것은 따로 규정이 없는 한 기재량의 90～110%의 범위 내에서 취하는 것을 말한다.

12) 건조 혹은 강열할 때 “항량”이라고 기재한 것은 다시 계속하여 1시간 더 건조 혹은 강열할 때에 전후의 칭량차가 전회 측정한 무게의 0.1%이하임을 말한다. 다만, 칭량차가 화학천칭을 썼을 때 0.5mg이하, 마이크로 화학천칭을 썼을 때 0.01mg이하인 경우에는 항량으로 본다.

13) 데시케이터의 건조제는 따로 규정이 없는 한 실리카겔로 한다.

14) 감압은 따로 규정이 없는 한 15mmHg이하로 한다.

15) 시약, 시액, 표준용액을 보존하는 유리용기는 용해도 및 알카리도가 매우 낮고 납 및 비소를 될 수 있는 대로 함유하지 아니하는 것을 사용한다.

16) 용매는 특별한 규격이 없는 한 “HPLC용”을 사용한다.

17) 따로 규정이 없는 한 시약, 표준품은 최순품을 사용한다.

18) 따로 규정이 없는 한 시험에 사용되는 물은 증류수 또는 이와 동등한 것을 말한다.

19) 따로 규정이 없는 한 표준용액을 이용하여 검량선을 작성할 경우 3가지 이상의 농도로 검량선을 작성하여야 하고 시험용액 중 분석하고자 하는 농도가 검량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액 농도를 조절하여 사용한다.

20) 따로 규정이 없는 한 시험용액 시험 시 반드시 공시험을 함께 한다.

21) 영양정보에 표시된 열량, 탄수화물, 단백질, 지방 및 나트륨의 시험법은 식품공전 제10. 일반시험법에 따른다.

Ⅲ.1-2

22) 이 공전에 별도로 규정이 없는 시험법에 대해서는 식품공전 시험법을 따른다.

Ⅲ.2 일반시험법

Ⅲ.2.1 붕해시험법

붕해시험법은 내용고형제품의 시험액에 대한 붕해성 또는 저항성을 시험하는 방법이다. 따로 규정이 없는 한 정제제품, 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품, 환제품, 캅셀제품, 과립제품, 장용성 제품은 각각 다음의 시험에 적합하여야 한다.

1) 장치

이 시험에 쓰는 장치는 시험기, 안지름 약 110mm이고 높이 약 155mm인 비커, 적당한 가열기 및 전동기로 되어 있으며, 따로 조작법에 따라 보조판 또는 보조통을 쓴다.

그림1-1

그림1-2

그림 1-3

A : 플라스틱판

B : 체눈의 간격 2.0mm,

Ⅲ.2.1-1

선재의 지름 6.0mm의 내산성 망

C : 내산성 금속판

D : 유리관                      J 및 M : 플라스틱통

E : 나사                        K : 체눈의 간격 0.42mm

F : 지주 및 나사                    선재의 지름 0.29mm의 내산성 망

G : 매다는 축                   L : 내산성 철사 손잡이

H : 온도계 삽입구

(1) 시험기

시험기는 그림 1-1과 같이 지름 90mm, 두께 6mm의 상하 2장의 플라스틱판 A가 있고 여기에 각각 지름 24mm의 구멍이 같은 간격으로 6개 뚫어져 있다. 아래의 플라스틱판의 아랫면에는 체눈의 간격 2.0mm, 선재(線材)의 지름 0.6mm의 내산성 망 B를 달고 위의 플라스틱판의 윗면과 아래의 플라스틱판 망의 아랫면에는 각각의 구멍에 해당하는 부분에 지름 22～23mm의 구멍을 6개 뚫은 지름 90mm, 두께 1mm의 내산성 금속판 C를 단다. 상하의 플라스틱판의 구멍에 안지름 21.5±0.5mm, 바깥지름 23.5mm, 길이 77.5±2.5mm의 유리관 D 6개를 끼우고 지주(支柱) 3개를 써서 내산성 금속판 위에 나사로 유리관을 고정한다. 중심에 매단 축(軸) G는 길이 80mm로 하고 그 위 끝은 전동기를 써서 부드럽게 상하운동을 할 수 있도록 한 수축(受軸)에 단다. 다만, 시험기는 유리관 및 망에 관한 규정을 제외하고는 그 구조를 다소 변경할 수도 있다.

(2) 보조판

보조판은 그림 1-1에 표시한 것과 같이 높이 9.50±0.15mm, 지름 20.70±0.15mm의 투명하고 매끄러운 플라스틱제의 원주로 비중은 1.18～1.20이다. 이 윗면에서 아랫면까지에 지름 2mm의 구멍이 5개가 뚫어져 있으며 그 1개는 중심을 통하고 다른 4개는 중심에서 6mm의 거리에 같은 간격으로 위치하고 있다. 보조판의 측면에는 V자형으로 자른 것이 4개 같은 간격으로 있고 각각 자른 부분의 폭은 윗면이 9.5mm, 아랫면이 1.6mm, 깊이는 윗면 2.55mm, 아랫면 1.6mm이다.

(3) 보조통

보조통은 그림 1-3에 표시한 것과 같이 안지름 12mm, 바깥지름 17mm, 길이 20mm의 플라스틱통 M의 양단 바깥쪽의 나사를 풀고 안지름 12mm, 바깥지름 17mm, 길이 2.5mm의 플라스틱통 J의 안쪽나사를 풀고 체눈 간격 0.42mm, 선재의 지름 0.29mm의 내산성의 망을 놓고 먼저의 원통의 양단에 밀착시킨 것이다. 보조통의 상하 망의 간격은 20±1mm로 하고 바깥쪽 중앙부에 지름 1mm의 내산성 철사를 써서 높이 80mm의 손잡이를 단다.

2) 시험액

(1) 제1액 : 염화나트륨 2.0g에 염산 7.0mL 및 물을 넣어 녹여 1L로 한다.

이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 1.2이다.

(2) 제2액 : 0.2mol/L 인산이수소칼륨시액 250mL에 0.2 mol/L 수산화나트륨시액 118mL및 물을 넣어 1L로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 pH는 약 6.8이다.

Ⅲ.2.1-2

(3) 물

3) 조작법

시험기를 수축에 달고 비커 속에 넣어 1분간 29～32회 왕복, 진폭 53～57mm로 부드럽게 상하운동을 하도록 조절한다. 시험기가 최하로 내려갔을 때 아래의 망 면이 비커의 바닥으로부터 25mm가 되도록 하고 비커에 넣는 시험액의 양은 시험기가 최하로 내려갔을 때 시험기의 윗면이 액의 표면에 일치하도록 한다. 시험하는 동안의 액의 온도는 37±2℃로 유지한다.

과립제품 이외는 시료 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣고 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한 다음 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관내의 시료상태를 관찰한다. 보조판을 쓰도록 지정되어 있을 경우에는 시험기의 유리관에 시료를 넣고 다음에 보조판 윗면을 위로 하여 1개씩 가만히 넣은 다음 앞에서와 같은 조작을 한다. 다만, 판정이 곤란할 때에는 보조판을 쓰지 않을 수 있다.

Ⅲ.2.1-3

(1) 정제제품

물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 30분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상(海綿狀)의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

시료 6개중 시료가 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 파편상태로 있는 것이 1개가 있을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 위의 시험을 되풀이하여 시료의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(2) 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품

물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

시료 6개중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 개구(開口) 또는 박리(剝離)되었더라도 내용물의 방출이 인정되지 않는 것 1개가 남았을 때에는 시료 6개를 다시 취하여 이 시험을 반복하여 시료의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(3) 환제품

정제식품의 시험법에 따른다. 다만, 시험은 제 1액에서 60분간 하고 시료의 잔류물이 유리관내에 남아 있을 때에는 계속하여 제 2액에서 60분간 시험한다.

(4) 캅셀제품

물을 시험액으로 쓰고 보조판을 넣어 20분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

시료 6개중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 개구 또는 박리되었더라도 내용물의 방출이 되지 않은 것이 1개 남았을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀이하여 시료의 잔류물이 유리관에 없든가 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

(5) 과립제품

과립제품을 35호(500μm) 체로 쳐서 35호 체위에 잔류한 시료 0.10g씩을 각각 보조통 6 개에 넣고 보조통을 시험기 유리관속에 각각 1개씩 넣어 아래쪽에 고정시키고 따로 규정이 없는 한 시험액으로 물을 써서 30분간 상하운동을 시킨 다음, 보조통을 꺼내어 관찰할 때 시료의 잔류물이 보조통내에 없든가 있더라도 원형상태로 머무르는 것이 보조통 1 개에만 있을 때 또는 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상(泥狀)의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 다만, 제피를 한 과립에 대하여는 시험액으로 물을 써서 60분간 상하운동을 시킨다.

(6) 장용성제품

(가) 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캅셀제품

다음의 ① 제 1액에 의한 시험 및 ② 제 2액에 의한 시험의 두 시험을 한다.

① 제 1액에 의한 시험

과립제품 또는 캅셀제품 속에서 빼낸 내용물을 35호(500μm) 체로 쳐서 35호 체위의 잔류물 0.10g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 밑에 고정하고 제 1액을 시험액으로 하여 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시험기의 망목으로부터 떨어지는 입자가 15알갱이 이내일 때에는 적합한 것으로 한다.

② 제 2액에 의한 시험

따로 제 1액에 의한 시험과 동일한 방법에 따라 시료 0.10g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 아래에 고정하고 제 2액을 시험액으로 하여 30분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 보조통내에 없거나 있더라도 원형대로 있는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

Ⅲ.2.1-4

(나) 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캅셀제 이외의 장용성 제제

다음의 ① 제 1액에 의한 시험 및 ② 제 2액에 의한 시험의 두 시험을 한다.

① 제 1액에 의한 시험

시험액으로 제 1액을 써서 120분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 시료 6개중 붕해, 장용성피막의 개구, 박리 또는 파손 등으로 내용물이 방출되는 것이 1개 이하일 때에는 제 1액에 의한 시험에 적합한 것으로 하고 2개일 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀이한다. 이 때 6개 모두가 앞에서 말한 이상이 없을 때에는 적합한 것으로 한다.

② 제 2액에 의한 시험

따로 시료 6개를 취하여 제 2액을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관내에 없든가 있더라도 피막이거나 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다.

Ⅲ.2.1-5

Ⅲ.2.2 내용량 시험법

1) 용량표시제품

시료의 내용물을 메스실린더에 완전히 옮겨 측정한다. 다만, 점성 등이 있어 내용물을 완전히 옮기기 어려운 시료에 대해서는 내용물이 들어 있는 용기에 물을 적가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하고, 용기의 내용물을 제거하여 물 또는 적당한 용매로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 물을 적가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하여 전후의 용량차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다).

2) 중량표시제품

내용물이 들어있는 용기 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 측정 후, 내용물을 완전히 제거하고 물 또는 용매 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 용기의 무게를 달아 전후의 무게차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값 내용량으로 한다). 다만, 내용량에 포함된 흡습제 등 비가식 대상은 제외한다.

3) 소포장제품

내용물이 소포장으로 20개 이하일 경우에는 전체를, 20개 이상일 경우에는 20개를 무작위로 취해 위와 같이 실험하여 평균값을 구한 후 전체 개수를 곱하여 총량으로 계산한다.

4) 캅셀제품

(1) 경질캅셀제품

표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캅셀 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캅셀을 열고 내용물을 작은 붓 등을 사용하여 제거하고 빈 캅셀의 무게를 측정한 후 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캅셀 당 무게로 하여 캅셀별로 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다.

(2) 연질캅셀제품

표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캅셀 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캅셀을 절개하여 그 내용물을 에테르 등의 휘발성 용매로 씻은 다음 여과지 등으로 빈 캅셀로부터 용매를 가볍게 제거하고 실온으로 30분 이상 방치하여 캅셀에 묻어 있는 용매를 제거하여(이 때 캅셀이 흡습 또는 건조되는 것을 피한다) 빈 캅셀의 무게를 측정한 후, 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캅셀 당 무게로 하여 캅셀별의 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다.

Ⅲ.2.2-1

5) 정제제품

표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후 20정을 취하여 무게를 측정하고, 20으로 나눈 평균값을 정 당 무게로 하여 정별로 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다.

6) 통조림제품

내용물이 들어있는 관 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 단 후 뚜껑의 일부분이 관에 붙어있게 개관한다. 관(액즙이 응고한 경우에는 20℃로 가온하여 액을 용해한 관)을 비커에 2분간 비스듬히 올려놓아 액즙이 충분히 흘러내리게 한 후 내용물이 든 관의 무게(B)를 단다. 다음에 내용물을 완전히 제거하고 물 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 무게(C)를 달아 (A)와 (C)의 무게 차 및 (B)와 (C)의 무게차를 각각 내용량 및 고형량으로 한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량 및 고형량으로 한다). 다만, 내용량이 관 용적을 기준(예：관용적의 90%이상)으로 하여 관 용적을 계산할 필요가 있을 때에는 원체부의 높이가 변하지 않도록 관의 뚜껑을 제거하여 내용물을 완전히 비운 후 4℃의 물을 관의 최상면에서 수직으로 4.76mm(2중 관체 내면)까지 채운 양을 관용적으로 한다. 이 때 고형량의 계산(예：내용량의 70% 이상 등)은 내용량 기준에 대한 계산을 말한다.

Ⅲ.2.2-2

Ⅲ.2.3 입도시험법

1) 과립제품

12호(1680μm), 14호(1410μm) 및 45호(350μm) 체를 써서 시험한다. 다만 이 시험법에 쓰는 체틀의 안지름은 75mm로 한다. 시료 20.0g을 정확하게 달아 앞에서 지정한 체 및 수기(受器)를 겹쳐놓은 용기의 상단 체에 넣고 뚜껑을 덮은 다음 3분간 수평으로 흔들어 주면서 때때로 가볍게 두드려준 다음 각 체 및 수기 내 잔류물의 질량을 단다. 12호(1680μm) 체를 전량 통과하고 14호(1410μm) 체에 남는 것은 전체량의 5% 이하이고 또 45호 (350μm) 체를 통과하는 것은 전체량의 15% 이하일 때 적합하다.

Ⅲ.2.3

Ⅲ.2.4 산도 시험법

Ⅲ.2.4.1 산도

시료 0.5g에 탄산가스를 함유하지 않은 물 50mL를 가하고 페놀프탈레인 시액 0.5mL를 가하여 0.1N 수산화나트륨용액으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정한다.

산도(1N NaOH mL/100g) ＝ S ×[eqn: rm {f×10} over { 시료채취량(g)}]

S∶0.1N NaOH 용액의 소비 mL수

f∶0.1N NaOH 용액의 역가

Ⅲ.2.4.1

Ⅲ.2.4.2 유기산 산도

시료 10g에 끓여 식힌 물 100mL를 가하고 이에 페놀프탈레인시약 0.5mL를 가하여 0.1N 수산화나트륨으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정하고 다음 식에 따라 산도를 구한다. 시험용액이 착색되어 있는 경우에는 pH측정기를 사용하여 pH 8.3까지 적정한다.

유기산 산도(%)(젖산으로서)＝   S ×[eqn: rm {f×0.009} over { 시료채취량(g)}]×100

S∶0.1N 수산화나트륨액의 소비량(mL)

f∶0.1N 수산화나트륨액의 역가

Ⅲ.2.4.2

Ⅲ.2.5 유해물질 시험법

Ⅲ.2.5.1 시안화합물

1) 시액의 조제

(1) 구연산완충액 : 구연산 128.1g 수산화나트륨 64.4g을 물에 용해시켜 1,000mL로 하고 pH 5.9로 조정한다.

(2) 피크린산지 : 여지를 포화 피크린산용액에 담그고 실온에서 건조한 후 7×40mm의 크기로 잘라서 사용 시 10% 탄산나트륨용액에 담근다.

2) 시험조작

시료 20g을 200mL 삼각플라스크에 취하여 구연산완충액 50mL를 가하여 피크린산지를 매달은 코르크 마개로 밀전하여 25~35℃에서 때때로 조용히 흔들어 혼합시키면서 3시간 방치한 후 주석산 2g을 가하고 위의 코르크 마개를 빨리 밀전하고 때때로 흔들어 혼합시키면서 50~60℃에서 1시간 방치할 때 시안화합물이 존재하면 피크린산지는 밝은 적색으로 변한다.

Ⅲ.2.5.1

Ⅲ.2.5.2 카페인

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액 조제

카페인 표준품을 메탄올에 녹여 표준원액(1,000μg/mL)을 만들고, 표준원액을 메탄올로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액 조제

카페인이 20 ~ 80mg이 함유되도록 적당량의 시료를 용량플라스크에 정밀하게 달아 메탄올을 가하고 초음파를 이용하여 분산 또는 용해시켜 정확하게 100mL로 한다. 이를 0.45μm의 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

Ⅲ.2.5.2-1

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출기(280nm)

주입량

10μL

이동상

시간(분)	0.1% 초산용액	아세토니트릴
0	85	15
10	85	15
15	70	30
20	50	50
21	85	15
30	85	15

0.1% 초산용액 : 아세토니트릴 (gradient)

유 속

1.0mL/min

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 카페인의 피크의 면적에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중 카페인의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 시료 중 카페인의 함량(%)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 카페인`함량(mg/g)=S TIMES {V} over {시료채취량(g)}TIMES { 1} over {1,000 }]

S : 시험용액 중 카페인의 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

Ⅲ.2.5.2-2

Ⅲ.2.5.3 디에틸렌글리콜

1) 표준용액의 조제

DEG(diethylene glycol)표준용액 : DEG 100mg을 메탄올에 녹여 100mL로 하고 그 5mL를 취하여 메탄올로 100mL가 되게 한다. 검량선을 작성할 때는 이 표준용액을 메탄올로 희석하여 사용한다.

2) 시험용액의 조제

분말 또는 페이스트상의 시료는 1g을 취하여 메탄올 10mL를 가하여 녹이고, 액상시료는 5mL를 40℃에서 감압농축시켜 수분을 제거한 후 잔사에 메탄올 10mL를 가하여 녹여 이 액을 알루미나칼럼에 가하여 메탄올 30mL로 용출한다. 용출액을 40℃에서 약 1mL로 감압농축시켜 메탄올을 가하여 5mL로 한 후 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

(제1법 가스크로마토그래프에 의한 정량법)

(1) 가스크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	50% phenyl methyl silicon으로 충전된 내경 0.52mm, 길이 10mm의 컬럼 또는 이와 동등한 것
검출기	수소염이온화검출기(FID)
주입구온도	140℃
칼럼온도	90℃
검출기온도	250℃
캐리어가스 및 유량	질소 6L/min
주입량	2μL

(2) 정량시험

얻어진 DEG의 높이 또는 넓이를 구하여 검량선을 작성한 후 DEG를 정량한다.

Ⅲ.2.5.3-1

(제2법 가스크로마토그래프- 질량분석법에 의한 정량법)

(1) 가스크로마토그래프- 질량(GC-MS)의 측정 조건

항목	조건
칼럼	fused 실리카(methyl silion)로 크로스링크되어 있는 내경 0.20mm, 길이 12.5m의 모세관 칼럼 또는 이와 동등한 것
주입구온도	280℃
칼럼온도	280℃
캐리어가스	헬륨 0.75kg/cm2
주입량	1μL
이온 질량	m/z 45, m/z 75
split ratio	1/30
이온화전류	300μA

(2) 정성 및 정량시험

DEG의 m/z 45 이온과 m/z 75 이온에 의한 크로마토그램과 DEG에 상당하는 피크의 크로마토그램을 비교하여 확인한다. 시험용액을 1/4로 농축하면 5mg/kg까지 확인할 수 있다.

Ⅲ.2.5.3-2

Ⅲ.2.5.4 시트리닌

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

시트리닌 표준품 10mg을 정밀하게 달아 메탄올로 100mL로 하여 표준원액을 만든다(100μg/mL). 표준원액을 메탄올로 희석하여 표준용액을 제조한다(0.01 μg/mL).

3) 시험용액의 조제

홍국 약 2.5g을 정밀하게 달아 에탄올 20mL을 넣은 다음 30분간 초음파 처리한다. 추출액을 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 감압농축한 뒤 메탄올 1mL에 녹여 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	옥타데실실릴화한 실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것
칼럼온도	40℃
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 335nm, 측정파장 502nm)
주입량	10μL
이동상	0.1% 삼불화초산(TFA)용액 : 아세토니트릴 (65 : 35)
유속	1.0mL/min

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 시트리닌의 머무름 시간과 일치하는 시험용액 중 피크를 확인한 후 다음 식에 따라 시료 중의 시트리닌 함량을 구한다.

Ⅲ.2.5.4-1

[계산식]

[eqn: rm 시트리닌~함량( mu g/㎏)=S TIMES {V} over {시료채취량(g)} TIMES 1,000]

S : 시험용액중의 시트리닌 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

Ⅲ.2.5.4-2

Ⅲ.3 개별 성분별 시험법

Ⅲ.3.1 비타민

Ⅲ.3.1.1 비타민 A

<제1법 삼염화안티몬에 의한 비색정량법>

1) 시약

(1) 에테르 : 필요하면 증류한다. 처음 및 마지막 증류액 각각 10%를 버린다.

(2) 벤젠 : 필요하면 증류한다.

(3) 무알데히드에탄올 : 에탄올 1L에 50% 수산화칼륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류냉각기를 달아 가온한 후 증류한다.

단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%를 버린다.

(4) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨을 2시간이상 120℃에서 가열한 것을 실리카겔 데시케이터중에 방냉한다(밀봉해서 보존한다).

(5) 초산 : 빙초산 1L에 대해서 산화크롬 10g을 가해 2회 증류한다. 116℃이상의 증류액을 취한다.

Ⅲ.3.1.1-1

(6) 클로로포름 : 클로로포름 1L를 황산 20～30mL씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수회 씻는다. 수세하여 황산을 제거하고， 15～20% 수산화나트륨용액 20～30mL로 2～3회 씻은 후 수세한다. 여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수시켜 증류한다. 정제한 클로로포름은 갈색병에 넣어 냉동에 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다.

(7) 정색용액 : 삼염화안티몬 20g을 상기의 클로로포름 100mL에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2mL를 가해 콜크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다. 이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제 후 1주간 내에 사용한다.

(8) 표준비타민A : 비타민 A유[1g중 비타민A 10,000국제단위(IU) 함유]를 사용한다.

(9) 불활성가스 : 질소, 이산화탄소를 사용한다.

2) 시험용액의 조제

(1) 비누화 : 시료 채취량은 일반적으로 100～150단위에 상당하는 양을 비누화 플라스크에 취하고 피로갈롤 100mg, 하이드로퀴논 100mg을 가한다. 다음에 적어도 3mL 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히드에탄올을 가해 환류냉각기를 달아 비등 수욕상에서 때때로 플라스크를 흔들어 주면서 30분간 비누화한다.

(2) 추출 : 비누화 후 흐르는 물에 식혀 냉각시키고 실온으로 한 다음 정확히 벤젠 100mL를 가한다. 유리마개를 하고 15초간 격렬하게 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다. 다음에 250～300mL의 분액깔때기에 옮기고 비누화플라스크에 침전물을 남기고 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다. 분액깔때기에 1N 수산화칼륨액 100mL를 가하여 15초간 격렬히 흔든 후 방치하여 분리시킨다. 혼탁된 물층은 버리고 벤젠층에 0.5N 수산화칼륨액 40mL를 가해 진탕 혼합하고 다음에 벤젠층을 적어도 4회 물 40mL씩 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 수세를 반복한다.(수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 행한다)

(3) 탈수 : 분액깔때기를 수분간 방치해서 최후의 물 1방울까지 제거한다. 이 벤젠층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다.

(4) 용제제거 : 상기의 벤젠중 50mL를 100mL 증류플라스크에 정확히 취해 약 45℃의 수욕상에서 수류펌프의 감압하에 재빠르게 증발시킨다. 불활성가스로 플라스크 내부를 건조한다.

(5) 시험용액의 조제 : 잔류물에 직접 클로로포름을 피펫으로 가해서 1mL중에 비타민 A가 10～20단위가 되도록 희석하여 일정용량으로 한다.

3) 시험조작

(1) 시험용액 0.3mL와 클로로포름 0.3mL를 정확히 셀에 취하여 정색용액 3mL를 가한다. 대조셀에 클로로포름 0.6mL를 정확히 취한 다음 정색용액 3mL를 첨가한 후 약 5～20초 사이에 파장 620nm에서 흡광도를 측정한다.

(2) 검량선의 작성: 표준비타민 A를 위의 방법에 따라 처리한다. 클로로포름에 녹여서 1mL중의 비타민의 2, 4, 6 및 10μg을 함유하는 용액을 조제한다. 계속해서 조제한 표준용액마다 시험용액의 비타민A의 측정에 따라 조작한다. 표준용액으로부터 구한 흡광도로 검량선을 작성하고 함량을 구한다.

(3) 계산 : 시험용액의 흡광도와 검량선으로부터 구한 시험용액 1mL중의 비타민A의 양을 Nμg이라고 하면,

Ⅲ.3.1.1-2

[eqn: rm 비타민~A~함량(μg/100g) = N × V × {100}over{시료 채취량(g)} × 2]        [계산식]

V：시험용액 전량(mL)

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약

(1) 무알데히드에탄올 : 에탄올(특급) 1L에 50% 수산화칼륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다.

(2) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨(특급)을 2시간 이상 120℃에서 가열한 후 데시케이터 방냉한 후 보관한다.

2) 표준용액의 조제

비탄민 A 표준용액 : 비타민A아세테이트 결정을 비누화시켜 비타민A 알코올로 하여 국제단위(IU) 또는 μg단위로 환산한다. 이를 이소프로판올(특급)로 희석하여 각각 1.0mL중 5, 25, 50 IU가 함유되도록 한다. 사용 시 조제한다.

3) 시험용액의 조제

일반적으로 비타민 A 20～30IU(6～9μg)에 상당하는 시료를 정밀히 달아 환저플라스크에 넣는다.

에탄올 30mL 및 10% 피로갈롤에탄올용액 1mL를 가하여 잘 섞은 후 수산화칼륨용액(9→10) 3mL를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화시킨다. 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 물 30mL를 가해 갈색분액깔때기에 옮긴다. 플라스크는 물 10mL로 씻고 이어서 석유에테르(특급) 30mL로 씻은 후, 씻은 액은 분액깔때기에 합하여 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 별도의 갈색분액깔때기에 옮긴다. 물층은 석유에테르 30mL씩으로 2회 추출하고, 전 석유에테르추출액을 합하여 물 10mL 1회, 이어 50mL 씩으로(페놀프탈레인시액으로 정색이 되지 않을 때까지) 씻는다. 분액깔때기중에서 물을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈수하고 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 이어 황산나트륨을 석유에테르 10mL씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 앞의 플라스크에 가한다. 석유에테르추출액을 모두 합하여 40～50℃에서 감압건고한 후 잔류물을 이소프로판올(특급)으로 녹여 1.0mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.1-3

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	ODS-2 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 340nm, 측정파장 460nm)
주입량	20μL
이동상	에탄올 : 물(95 : 5)
유속	0.5mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20μL씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 A의 농도(IU/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 시료 중 비타민 A의 함량(IU/g)을 산출한다.

※ 비타민 A 단위환산 : 1μg = 3.33IU

[eqn: rm비타민~A~함량(IU/100g) =S×{a×b}over{시료 채취량(g)}][계산식]

S：시험용액중의 비타민 A의 농도(IU/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.1-4

Ⅲ.3.1.2 베타카로틴

1) 시험용액의 조제

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.1. 비타민 A의 <제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>의 시험용액의 조제에 따라 시험하여 헥산 또는 이소프로판올:클로로포름(1:1)용액으로 베타카로틴 5μg/mL되게 한다.

필요한 경우 마이크로필터링 한다(여과지:FH Type, pore size 0.5μm). 단, 시료가 유지를 함유하지 않는 경우에는 비누화과정을 생략할 수 있다.

2) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	ODS-2, Partisol ODS′-3 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광출기(450nm)
주입량	20μL
이동상	아세토니트릴:디클로로메탄:메탄올(7:3:1)
유속	0.5~1.0mL/min

(2) 정량시험

[계산식]

베타카로틴의 함량(mg/g)＝S×[eqn: rm { a × b} over { 시료채취량(g)}]

S : 시험용액 중의 베타카로틴 농도(mg/g)

a : 시험용액의 양(mL)

b : 시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.2

Ⅲ.3.1.3 비타민 D

<고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약

(1) 무알데히드에탄올 : 에탄올(특급) 1L에 50% 수산화칼륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가하여 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다.

(2) 벤젠, 아세토니트릴 및 헥산 : 특급품을 증류하여 사용한다.

(3) 메탄올 : 고속액체크로마토그래프용

2) 표준용액의 조제

비타민 D 표준용액 : 비타민 D2 또는 D3를 무알데히드에탄올에 녹인 후 적절하게 희석하여 표준용액으로 사용한다.

3) 시험용액의 조제

시료가 고체인 경우에는 초고속마쇄기 등으로 잘게 마쇄하여 비타민 D2 IU(0.05μg)이상 함유한 검체를 비누화 플라스크에 정밀히 취하여 피로갈롤:에탄올(1→10)용액 40mL를 가하여 약하게 진탕 혼합한다. 수산화칼륨(9→10) 10mL를 가하고, 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 가열하여 비누화한다. 즉시 냉각하여 실온으로 되면 벤젠 100mL를 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다. 다음에 250～300mL 분액여두로 옮기고, 비누화용 플라스크의 침전물은 남겨둔다(침전물을 씻어서 옮기지 말 것). 분액여두에 1N 수산화칼륨 100mL를 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 방치하여 분리하고(벤젠층은 투명하지 않아도 된다) 혼탁한 물층을 버린다. 벤젠층에 0.5N 수산화칼륨 40mL를 가하여 진탕 혼합한 후 벤젠층을 적어도 물 40mL씩 4회 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다. 분액여두를 수분간 방치하여 최후의 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다. 이 벤젠용액 80mL를 플라스크에 취하여 40℃이하에서 용매를 감압 농축한다. 잔류물에 벤젠 5mL를 가하여 녹이고 이 액 4.5mL를 10mL의 공전시험관에 취하여 같은 방법으로 감압 농축한다. 잔류물에 아세토니트릴:메탄올(1：1) 500μL를 정확하게 가하여 녹이고 이를 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.3-1

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

(가) 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프

항목	조건
칼럼	역상형칼럼(내경 7.5mm, 길이 300mm) 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(254nm)
이동상	아세토니트릴:메탄올(1:1)
유속	2.0mL/min

(나) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프

항목	조건
칼럼	순상형칼럼(내경 4.6mm, 길이 250mm) 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(254nm)
이동상	0.4% 이소프로판올‧헥산용액
유속	1.6mL/min

(2) 정량시험

(가) 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프

시험용액 200μL를 정확히 취해 제1단계 고속액체크로마토그래프에 주입하여 분획포집기로 비타민 D 획분을 분취한다(비타민 D 표준용액의 크로마토그램으로 비타민 D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 검출기에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조건을 준비한다).

(나) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프

제1단계에서 얻은 비타민 D 분획의 용매를 감압농축하여 잔류물에 0.4% 이소프로판올‧헥산 200μL를 정확히 가하여 녹인다. 이 용액 100μL를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 크로마토그램에 나타난 비타민 D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

(다) 비타민 D 표준용액에 대한 조작

별도로 비타민 D 표준용액 1mL에 대하여 상기의 시험용액의 조제 및 시험조작 제1단계, 제2단계의 조작에 따라 실행한 후 비타민 D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

Ⅲ.3.1.3-2

※ 비타민 D 단위환산 : 1μg = 40IU

[계산식]

비타민 D(IU/100g) ＝	Psa	×	S	× 100
	Pst		시료채취량(g)

S Pst Psa	: 비타민 D 표준용액의 농도(IU/mL) : 비타민 D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적 : 검체에 대한 피크의 높이 또는 면적

Ⅲ.3.1.3-3

Ⅲ.3.1.4 비타민 E

<제1법 α, α＇-디피리딜에 의한 비색정량법>

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시약

(1) 정색용액 : 0.5%, α, α＇-디피리딜에탄올용액

(2) 염화제이철에탄올용액 : 염화제이철 0.2g을 에탄올에 녹여 100mL로 한다.

(3) 석유에테르：석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH 용액 및 물로 수세한다. 세정한 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 증류하여 30～60℃에서 유분을 취한다.

3) 표준용액의 조제

비타민 E 표준용액 : α-토코페롤 약 20mg을 정밀히 달아 에탄올을 가하여 녹여 100mL로 한다.

4) 시험용액의 조제

토코페롤로 0.5～1mg에 해당하는 양의 시료를 환저플라스크에 취하고 에탄올 30mL 및 10% 피로갈롤‧에탄올용액 1mL를 가하고 수산화칼륨용액(9→10) 1mL를 가하여 환류냉각기를 붙이고 수욕상에서 30분간 비누화한다. 비누화 후 신속하게 냉각하여 실온으로 하고 물 30mL를 가하여 갈색 분액깔때기에 옮기고 플라스크는 물 10mL, 석유에테르 30mL로 씻고 씻은 액을 분액깔때기에 옮기고 잘 진탕 혼합하고 방치하여 석유에테르층을 분취한다. 물층은 다음에 석유에테르 30mL씩으로 2회 추출하고 석유에테르 추출액을 합하여 물 10mL로 1회, 50mL씩으로(페놀프탈레인 지시약이 정색되지 않을 때까지) 세척한다. 분액깔때기 중에서 물을 충분히 분리한 후, 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수하고 석유에테르층은 갈색 플라스크에 옮긴다. 남은 무수황산나트륨은 석유에테르 10mL씩으로 2회 씻고 씻은 액은 플라스크에 합한다.

석유에테르추출액을 모두 합하여 60℃에서 감압건조하고 잔류물은 에탄올 5mL로 녹여 25mL의 갈색플라스크에 옮긴다. 플라스크는 추가로 에탄올 5mL씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 가하여 에탄올을 채워 25mL로 하여 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.4-1

5) 시험조작

시험용액 5mL와 비타민 E 표준용액 1mL를 25mL의 플라스크에 취하여 각각에 염화제이철에탄올용액 1mL와 0.5%, α, α＇-디피리딜에탄올용액 1mL를 가하고 다음에 에탄올을 가하여 25mL로 한다. 따로 에탄올 1mL를 취하여 같은 방법으로 조작한 것을 대조로 하여 시험용액과 표준용액을 액층 1cm 파장 520nm에서 흡광도를 측정한다.

[계산식]

[eqn: rm총토코페롤~함량(mg/100g)=C×{T}over{S}×{25}over{5}×{1}over{W}]

C：비타민 표준용액의 토코페롤 농도(mg/mL)

Ｔ：시험용액의 흡광도

Ｓ：표준용액의 흡광도

Ｗ：시료채취량(g)

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약

(1) 에탄올 : 에탄올(특급) 1L에 50% 수산화나트륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다.

(2) 헥산 : 스펙트로분석용

(3) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨(시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시케이터(실리카겔)에서 방냉하고 밀전하여 보존한다.

(4) α-, β-, γ-, δ-토코페롤 : d-α-, d-β-, d-γ-,  d-δ-토코페롤 순품

2) 표준용액의 조제

(1) 토코페롤동족체 표준용액

토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 100mg씩 정밀히 달아 헥산을 가해 녹여 100mL로 한 후, 각각의 5mL를 취하여 헥산을 가하여 25.0mL로 한다. 공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

(2) 토콜표준용액

토콜 약 100mg을 정밀히 달아 헥산을 가해 녹인 후 100mL로 한다. 이 5mL를 취해 헥산을 가해 25.0mL로 한다. 공전 갈색병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

Ⅲ.3.1.4-2

3) 시험용액의 조제

(1) 일반식품의 경우

토코페롤로서 약 0.2mg을 함유하는 시료를 검화플라스크에 정밀히 달아(Wg) 에탄올 30mL 및 10% 피로갈롤‧에탄올 용액 1mL를 가하고 이에 수산화칼륨용액(9→10) 3mL를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화한다. 비누화후 즉시 냉각하여 실온으로 한 후 물 30mL를 가해 갈색분액여두에 옮긴다. 플라스크는 물 10mL, 석유에테르 30mL로 씻어 넣고 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 석유에테르층을 분취한다. 물층은 석유에테르 30mL씩으로 2회 추출하고 석유에테르액을 합하여 물 10mL로 1회, 이어 물 50mL로 페놀프탈레인시액이 분홍색이 되지 않을 때까지 씻는다. 분액여두중에서 물을 충분히 분리한 후 무수황산나트륨을 가해 탈수한 후 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 잔존하는 황산나트륨은 다시 석유에테르 10mL씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 모두 합한 다음 전석유에테르추출액을 40～45℃에서 감압건고한 후 잔류물은 헥산 1.0mL를 가하여 녹여 이를 시험용액으로 한다.

(2) 유지식품의 경우

시료가 유지인 경우에는 위의 조작 중 비누화조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다. 이 경우에는 유지 약 1g을 정밀히 달아(Wg) 헥산으로 녹여 50mL로 한 후, 그 중 일정량(DmL)을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	순상형칼럼
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 298nm, 측정파장 325nm)
주입량	10μL
이동상	헥산‧이소프로판올(98：2)
유속	0.5mL/min

(2) 정량시험

시험용액 1.0mL에 토콜표준용액 1.0mL를 가해(S) 이의 10μL를 고속액체크로마토그래프용 칼럼에 주입하여 얻은 토코페롤동족체의 피크 넓이 또는 높이(Ptoc) 및 토콜의 피크 넓이 또는 높이(Pint)를 구한다. 또한 토코페롤동족체 각각에 대하여 각 토코페롤 표준용액 1.0mL를 취해 이에 토콜표준용액 1.0mL를 가해 이의 10μL를 고속액체크로마토그래프에 주입하여 얻은 각 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)와 토콜의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)를 구하고, 이들의 중량(mg)에서 토코페롤 동족체의 토콜에 대한 환산계수(F)를 구한다. 시료 중 토코페롤 동족체의 함량(mg/100g)은 다음 계산식에서 구한다.

Ⅲ.3.1.4-3

[계산식]

(가)일반시료의 경우

토콜페롤동족체의 양(mg/100g) ＝	S	×	Ptoc	×	F	×	100
			Pint				W

S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(mg)

S ＝ V × C

V : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 양(mL)

C : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 농도(mg/mL)

Ptoc : 시험용액중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이

Pint : 시험용액중 토콜 피크의 넓이 또는 높이

F  : 환산계수

Fα-δ ＝	Cst-toc	×	Pst-int
	Cst-int		Pst-toc

Cst-toc：표준용액중 토코페롤 동족체의 농도

Pst-toc：표준용액중 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이

Cst-int：표준용액중 토콜의 농도

Pst-int：표준용액중 토콜 피크의 높이 또는 넓이

(나) 유지식품의 경우

[eqn: rm토코페롤동족체의~양(mg/100g)=S×{50}over{D}×{P_{{t}oc}}over{P_{{i}{n}{t}}}×F×{100}over{W}]

Ⅲ.3.1.4-4

Ⅲ.3.1.5 비타민 K

<고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약

(1) 용매 : 메탄올, 디클로로메탄, 이소옥탄, 아세톤 및 이소프로판올(고속액체크로마토그래프용)

(2) Conditioning용액 : 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 한다.

(3) 용출용매(이동상) : 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%가 되게 한다.

(4) 암모니아수(36%)

(5) 무수황산나트륨

2) 표준용액의 조제

비타민 K1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다(불활성형 cis형을 ≤20%정도 함유함). 암소에서 보관한다.

(1) 표준원액 : 비타민 K1 표준품을 이소옥탄에 녹여 5μg/mL가 되게 한다.

(2) 표준용액 : 표준원액을 검량선을 작성할 수 있도록 이소옥탄으로 희석하여 사용한다.

3) 시험용액의 조제

(1) 비누화와 추출

시료 일정량(비타민 K1으로서 3.5μg함유)을 정확히 취하여 500mL 분액여두에 넣고 암모니아수 4mL를 가한 후 60초간 흔들어 혼합한다. 여기에 60mL의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한 후 디클로로메탄 100mL와 이소옥탄 50mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다. 층 분리 후 하층액을 1,000mL 공전플라스크에 옮긴다. 다시 디클로로메탄 100mL와 이소옥탄 50mL 혼합액을 가하여 추출한 후 하층액을 합하고 이 액을 75℃ 이하에서 감압 농축한다. 공전플라스크를 아세톤 20mL로 씻고 그 액을 농축시키는 조작을 3회 반복한 후 질소 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

(2) 시험용액의 정제

정제 칼럼에 conditioning 용액 20mL를 주입하고 천천히 용출시켜 그 액을 버린다. 잔류물을 conditioning 용액 10mL로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민K1을 흡착시킨다. 같은 용액으로 5mL씩 2회에 걸쳐 공전플

Ⅲ.3.1.5-1

라스크를 씻고, 씻은 액을 칼럼에 넣은 후 conditioning 용액으로 용출하여 그 액을 버린다. 이어 시료의 지방 함량에 따라 양을 달리하여 용출용매를 칼럼에 통과시킨다(시료의 지방함량이 0.72～0.80g이면 100mL의 용매를, 0.72g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다). 용출액을 250mL 공전플라스크에 받아 75℃ 이하에서 감압 농축한다. 이 농축액을 이소옥탄 1～2mL로 몇 회 나누어 씻어 5mL로 정용한다.

Ⅲ.3.1.5-2

단, 정제칼럼은 60～200 메쉬 실리카 5.0g(100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정제 칼럼(1.0cm id×30cm, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 2.0g(100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 가한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	순상형칼럼(5μm실리카가 충전된 250×4.6mm id) 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(254nm)
주입량	20μL
이동상	디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%, 0.02%가 되게 한다.
유속	0.5mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20μL씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 대해 구한 검량선을 사용하여 시료 중 비타민 K1의 함량을 구한다. 비타민 K1의 함량은 각 이성체의 농도의 합으로 계산하며 옥수수유를 포함하는 조제유류는 trans-비타민 K1만을 계산한다.

[계산식]

비타민 K1 함량(μg/100g)＝Cstd × F ×[eqn: rm {H_s } over {H_std} TIMES {V} over {S} TIMES 100]

Cstd : 준용액의 농도(μg/mL)

F   : 비타민K1 표준용액에서 각각의 이성체의 비율

Hs   : 시료의 비타민K1 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

Hstd  : 비타민K1 표준용액 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

V   : 시험용액의 희석배수,   S    : 시료 채취량(g)

Ⅲ.3.1.5-3

Ⅲ.3.1.6 비타민 B1

<제1법 티오크롬 형광법>

1) 장치 및 기구

(1) 칼럼관

경질 유리제 흡착관의 S부의 밑에 소량의 유리솜을 채워 넣어 물을 가득 넣고 별도로 퍼무티트 1.3～1.5g을 비커에 취한다.

물 약 20mL를 가해 약하게 진탕해서 퍼무티트에 부착하고 있는 기포를 제거한 다음 물과 함께 전부를 흡착관에 유입, 계속해서 3% 초산 10mL 및 물 20mL를 각각 1분간에 1mL의 유속으로 통해서 조정을 해 놓는다.

(2) 추출병 : 50～150mL까지 10mL마다 표선을 그려놓은 것이 쓰기에 편리하다.

(3) 형광광도계 : 분광식의 여기파장을 375nm, 수광부의 형광선택파장을 420nm에 조정해 쓴다.

2) 시약

(1) 효소용액 : 사용 시 다카디아스타제 0.5g에 0.1N 염산 0.5mL 및 물 10mL를 가하여 용해한 후 여기에다 산성백토 0.2g을 첨가하여 30초간 진탕 혼합하여 이것을 여과 또는 원심분리해서 그 상등액을 사용한다.

(2) 25% 염화칼륨 염산용액 : 0.1N 염산에 염화칼륨을 25%의 비율로 녹인다. 결정이 석출하면 가온하여 완전히 녹여 사용한다.

(3) 퍼무티트 : 50～80메쉬의 퍼무티트를 플라스크에 취해 약 4배의 열탕을 가해서 혼합, 정치한다. 상등액을 경사하여 버린다. 이 조작을 수회 반복하여 상등액이 거의 깨끗해질 때까지 행한다. 다음에 3%의 초산 약 4배량으로 전과 동일하게 2회 씻는다. 다시 25% 염화칼륨 염산용액을 약 3배량 가해서 비등수욕중 약 25분간 저어주면서 처리한다. 또 다시 3% 초산으로 2회 씻어내고 수세의 조작을 반복한다. 이 세액에 5% 질산은용액 2～3방울을 가해서 백탁되지 않을 때까지 행한다. 이것을 약 60℃에서 건조해서 보존한다. 다만, 퍼무티트 외에 엠버라이트 IRC 50을 사용할 수 있다.

(4) 산화제

(제1법) 페리시안․수산화나트륨용액 : 1% 페리시안용액 4mL를 15% 수산화나트륨으로 녹여 100mL로 한다. 사용 전 4시간 이내에 제조한다.

Ⅲ.3.1.6-1

(제2법) 브롬시안용액 : 특급의 브롬시안 4% 용액, 본액을 냉장고에 보존하여 그날 사용한다.

(5) 무수황산나트륨 : 형광이 없는 것

(6) 이소부탄올 : 무형광의 시판품을 사용하든가 형광이 인정되면 재증류 정제해서 사용한다.

(7) 비타민 B1 표준용액 : 표준품을 사용한다. 염산산성의 물로 희석해서 1μg/mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

(1) 추출

시료 1～10g을 추출병 또는 100mL의 메스플라스크에 취해 물 약 20mL를 가하여 혼합해 0.1N 염산 또는 0.1N 황산 약 50mL를 가하여 잘 섞은 후 끓는 수욕상에서 30분간 가열 추출한다.

(2) 효소분해

추출액은 약 50℃에 냉각시켜 놓고 4M 초산나트륨액을 적가해서, pH를 약 4.5에 조정한다. 다시 한번 효소용액 약 2mL를 가해서 40～50℃에 2～3시간 보온하든가 또는 톨루엔 5～6방울을 가해 37～40℃의 항온기에 넣어서 하룻밤을 방치한다. 다음에 15분간 비등수욕 중에서 온침한다. 냉각후 물을 가해서 100mL로 하고 원심분리하든가 또는 여과해서 상등액을 취한다. 이것을 시료용액으로 한다.

(3) 흡착

시료용액(pH 4.5)의 일정량(비타민 B1으로서 약 5μg을 함유하는 액량)을 칼럼에 조용히 주입한다. 1분간 1mL의 유속으로 흡착케 한다. 계속해서 pH 4.5의 염산 5mL로 칼럼의 R부의 내면을 씻어버린다.

(4) 수세

흡착이 끝났다고 생각되면 공존하는 형광물질을 제거한다. 칼럼에 끓는 물을 주입하고 1분간 3～4mL(1초간에 약 1방울)의 유속으로 흡착층을 씻는다. 세액을 형광이 나타나지 않을 때까지 물로 계속 씻어준다.

(5) 탈착

수세가 끝나고 칼럼 하부의 수기를 25mL의 메스플라스크에 교환 칼럼이 따뜻할 동안에 비등 25% 염화칼륨염산용액 10mL를 가한다. 1초간 1방울씩 나누어 액이 적하되도록 조절한다. 탈착액을 받아서 용출액이 퍼무티트의 상단까지 달하면 재차 비등용출액 8mL를 주입해 동일하게 조작한다. 최후에 동액 7mL를 주입해서 탈착액의 전량을 약 25mL로 하여 뚜껑을 닫아 놓는다. 뒤이어 메스플라스크를 실온에 방치한다. 냉각후 물을 가해서 정확히 25mL로 하여 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.6-2

4) 시험조작

(제1법 : 페리시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5mL씩 T1, T2 및 T₃3개의 50mL 공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로한다. T1에는 비타민 B1표준액 1mL(비타민 B1 1μg)를, T2 및 T3에는 물 1mL를 가한다. 계속해서 T1 및 T2에는 페리시안․수산화나트륨용액 3mL를 가한 후 혼합한다. 이소부탄올 15mL를 가해 밀전하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3mL를 가한 후 혼합한다. T1, T2와 같이 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

(제2법 : 브롬시안화에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5mL씩 T1, T2 및 T3 3개의 50mL 공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로 한다. T1에는 비타민B1표준액 1mL(비타민B1, 1μg)을, T2 및 T3에는 물 1mL를 가한다. 계속해서 T1 및 T2에는 브롬시안용액 3mL를 가해서 혼합한 후 30% 수산화나트륨용액 3mL를 혼합한다.

이소부탄올 15mL를 가해 밀봉하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3mL를 처음 가한 후 브롬시안용액을 혼합한다. T1, T2와 동일 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

(1) 비형광측정 및 계산 : 전항의 이소부탄올액을 형광셀에 넣어 형광도를 측정한다.

Ⅲ.3.1.6-3

[계산식]

비타민 B1 함량(mg/100g)

＝ D×[eqn: rm { T_2 `-T_3} over { T_1`-T_2} ×{ 25} over {5}×{V_2} over {V_1}×{100} over {시료채취량(g)}×{1} over {1000}]

D ：첨가 비타민 B1(μg)

V1：시료용액의 채취량(mL)

V2：시료용액 전량(mL)

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약

(1) 4M 초산나트륨용액 : 5.44g의 초산나트륨을 물에 녹여 10mL로 한다.

(2) 다카디아스타제용액 : 다카디아스타제를 물에 녹여 2%로 하여 퍼무티트(Purmutit)칼럼에 넣고 다카디아스타제중에 존재하는 비타민B1을 제거한 후 사용한다. 사용 시 제조한다.

(3) 페리시안화칼륨‧수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 30g을 물에 녹여 200mL로 하고 이에 페리시안화칼륨 20mg을 녹인다. 사용 시 제조한다.

2) 표준용액의 조제

비타민 B1 표준용액 : 순도가 보증된 비타민 B1염산염을 비타민B1으로 0.01～1.0mg/mL가 되도록 10% 삼염화초산용액에 녹인다. 이 비타민B1용액(S mg/mL)을 4M 초산나트륨을 2% 다카디아스타제 용액을 각각 20：3：1의 비율로 혼합한 용액을 표준용액으로 한다.

3) 시험용액의 조제

(1) 일반적 시료

시료 1g을 정확히 달아 10% 삼염화초산용액 5mL를 넣고 균질기로 균질화 시킨다.

균질화한 용액을 10% 삼염화초산용액으로 10mL로 한 후 고속원심분리관에 넣고 9,000rpm에서 30분간 원심분리한다. 이 상징액 200μL를 시험관에 취하여 4M 초산나트륨용액 30μL를 가한다(pH 4.5～4.7). 이에 2% 다카디아스타제 용액 10μL를 주입하고 잘 교반하면서 37℃에서 8～10시간 방치하여 시험용액으로 한다.

(2) 난용성 비타민 B1 염류 및 비타민 B1 유도체 강화시료

비타민 B1의 브롬시안에 의한 티오크롬형광법의 시험용액의 조제에 따라 전처리된 시험용액을 사용한다.

Ⅲ.3.1.6-4

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	비타민 B1 분리용(Polyglycerylmethacrylate, 구상, 15μL) 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 : 375nm, 측정파장 : 450nm)
이동상	0.1M 제1인산나트륨용액
유속	0.7mL/min
반응액	페리시안화칼륨‧수산화나트륨용액(유속 : 0.7mL/min)

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 50μL씩 고속액체크로마토그래프에 주입하고, 칼럼에서 분리 용출시킨 비타민 B1을 반응액 송액펌프에서 보내진 반응액과 자동적으로 혼합시켜 형광물질(티오크롬)으로 변환한다. 이 형광물질을 형광분광광도계(Spectrophotometer)로 보내 얻어진 표준용액 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 이용하여 시험용액의 비타민 B1의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 시료 중 비타민 B1의 함량(mg/100g)을 계산한다.

[계산식]

[eqn: rm비타민~B_1{}의~함량(mg/100g)=S×{(a-b)}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 비타민B1의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.6-5

Ⅲ.3.1.7 비타민 B2

<제1법 루미플라빈 형광법>

1) 장치 및 기구

(1) 광분해장치 : 형광등에 반사경을 달아 시험용액을 양측으로부터 조사하든지 또는 상부에 형광등이 붙어 있는 측면에는 광을 난반사하도록 한 상자모양의 것도 좋다.

(2) 용기 : 갈색 유리기구를 쓴다.

(3) 형광광도계 : 여기파장 430nm, 측정파장 530nm

2) 시약

(1) 클로로포름 : 형광이 없는 것 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다.

(2) 비타민 B2 표준용액 : 비타민 B2 표준품을 온탕에 녹여서 40μg/mL로 한다. 그 100mL에 초산 수방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다. 사용 시 희석해서 2μg/mL의 액을 만든다. 밝은 곳에 내놓지 않도록 주의한다.

3) 시험용액의 조제

시료의 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기 또는 막자사발에 넣어 마쇄한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지한다. 이것에 물 수 mL～수십 mL를 가해 수욕중에서 혼합 15～20분간 추출한다. 대부분의 것은 이 추출법으로 충분히 추출된다. 또는 제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.6. 비타민 B1 <제1법 티오크롬 형광법> 3) 시험용액의 조제 (2) 효소분해법까지의 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출액은 냉각 후 1mL중 0.05μg이 되도록 일정 용량으로 하여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 광분해

시험용액 일정량(0.2～1μg 비타민 B2를 함유하는 용액)을 3개의 공전시험관에 취한다. 그 한 개를 첨가시험용으로 해서 비타민 B2의 일정량(0.2～1μg)을 함유하는 용액을 가한다. 다른 두개 T2 및 T3는 T1에 가한 비타민B2용액과 동량의 물을 가해서 T1, T2, T3를 같은 용량으로 한다. 이 시료용액에 1N 수산화나트륨액을 같은 양 가해 혼합한 후 T1(첨가시험) 및 T2(주시험)를 광분해 장치로써 1시간 광분해 한다. T3(공시험)는 1시간 암소에 둔다. 광분해가 끝나면 각 시험관에 초산을 0.5mL씩 가한다.

Ⅲ.3.1.7-1

(2) 산화 및 추출

광분해를 끝낸 산성용액에 4% 과망간산칼륨용액 0.5mL를 가해서 1분간 방치한다(필요하면 초산을 소량 가한다). 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가해서 탈색하고 클로로포름 10mL씩을 가해서 뚜껑을 닫고 격렬히 2분간 진탕 혼합한다. 필요하면 원심분리를 행하고, 클로로포름층을 분취한다.

(3) 측정 및 계산

클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 시료중의 비타민 B2의 함량을 다음 식에 따라 구한다.

[계산식]

[eqn: rm비타민~B_2{}~함량(mg/100g)= D×{{T_2}-{T_3}}over{{T_1}-{T_2}}×{V_2}over{V_1}×{100}over{검체의채취량(g)}×{1}over{1,000}]

D  : 첨가 비타민 B2(μg)

V1 : 시험용액 채취량(mL)

V2 : 시험용액 전량(mL)

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시약 및 시액

(1) 메탄올 : 고속액체크로마토그래프용

(2) 10mM NaH2PO4 용액 : 1N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 조정한다.

2) 표준용액의 조제

(1) 리보플라빈 표준용액 : 비타민B2의 루미플라빈 형광법과 동일하게 조제하고 사용 시 물로 희석하여 0.2μL/mL의 용액으로 만든다.

(2) FMN(Flavin mononucleotide)표준용액 : FMN을 물에 녹여 0.2μL/mL(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

(3) FAD(Flavin adeninedinucleotide)표준용액：FAD를 물에 0.5μL/mL(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

3) 시험용액의 조제

시료 일정량을 달아 소량의 물을 가해 균질기 또는 막자사발에서 가능한 한 미세하게 분쇄하고 지방이 많은 경우에는 미리 탈지한다. 이에 물을 가해 수욕중(70～80℃)에서 잘 혼합하여 12～20분간 추출한다. 추출액은 식힌 후 1mL중 비타민 B2 0.05～0.5μg이 되도록 일정용량으로 하여 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.7-2

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	μ-Bondapak C18, Micropak-CH, Cosmosil 5 C18, Develesil ODS 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 : 445nm, 측정파장 : 530nm)
주입량	10μL
이동상	메탄올:10mM NaH2PO4용액(pH 5.5) (35:65)
유속	0.8mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 각 형의 표준용액을 각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 각 형의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민B2의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 시료중 비타민 B2 함량(mg/100g)을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm비타민B_2{(리보플라빈, FMN, FAD)}(mg/100g)=S×{a×b}over{검체채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 비타민B2의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.7-3

Ⅲ.3.1.8 나이아신

<제1법 케니히 반응에 의한 비색법>

1) 시약 및 시액

(1) 포화황산아연용액 : 황산아연(ZnSO4‧7H2O) 800g을 물에 녹여서 1L로 한다.

(2) 브롬시안용액 : 특급 브롬시안을 물에 녹여 10%로 한다.

(3) 니코틴산 표준용액 : 니코틴산 표준품 약 100mg을 정밀히 달아 100mL 메스플라스크에 넣고 10N 황산액 1mL를 가하여 녹인 후 물로 100mL되게 한다. 이것을 원액으로 해서 차광하여 냉장고에 보존한다. 사용 시 그 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 2.5mL를 각각 취해 물을 가하여 100mL로 희석한다.

(4) 파라아미노 아세토페논용액 : 파라아미노 아세토페논 2g을 소량의 염산에 녹여서 물을 가하여 100mL로 한다.

2) 시험용액의 조제

(1) 가수분해

100mL의 비커에 니코틴산 400μg 상당량의 시료를 취한다. 6N 염산액20mL를 가해 비등수욕중에 60분간 침출하여 가수분해 한다. 이것을 흐르는 물로 냉각시켜 100mL 메스플라스크에 옮겨 넣고 물로 100mL로 하여 여과 또는 원심분리하여 여액 또는 상등액을 시료용액으로 한다.

(2) 중화

시료 용액 25mL를 원심 침전관에 취하고 페놀프탈레인시액 2방울을 가해서 6N 수산화나트륨액 20mL로 미산성이 될 때까지 중화한다.

(3) 탈색

이 중화액에 포화 황산아연용액 2mL를 가해 소포제로서 아밀알콜 수방울을 가하고 다음에 수산화아연의 침전이 생길 때까지 잘 진탕 혼합하여 3M 수산화나트륨액과 1N 수산화나트륨액을 가하여 중화한다. 다음에 pH 6.5가 될 때까지 2N 황산액을 가하고 다시 물을 가하여 50mL로 한다. 때때로 진탕 혼합하여 10분간 방치한 후 원심분리 또는 여과하여 이것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

(1) 발색 : 시험용액 5mL씩을 2개의 시험관에 취하고 여기에 브롬시안용액 2mL씩을 가하여 60～70℃의 수욕중에서 10～15분간 반응시킨다. 얼음물 중에서 냉각시키면서 한쪽에 파라아미노 아세토페논용액 1mL를 가하여 다른 쪽을 대조액으로 하여 2개의 시험관에 물로 10mL로 한다.

Ⅲ.3.1.8-1

(2) 비색 : (1)에서의 발색액은 얼음물 중에 냉각한 대로 암실에 10～15분간 방치한 후 대조액에 대하여 파장 420nm에서 흡광도 A를 측정한다.

(3) 검량선의 작성 : 각 농도의 니코틴산 표준액의 1mL를 취해 물 4mL를 가해서 이하 정량조작 (1), (2)에 따라서 검량선을 작성한다.

(4)  계산 : 시험용액 5mL중에 함유한 니코틴산량을 검량선에 나타난 A에 대응하는 점으로부터 구하여 X(μg)로 한다.

[계산식]

[eqn: rm총~니코틴산~함량(mg/100g)=X×40×{100}over{시료채취량(g)}×{1}over{1,000}]

<제2법 미생물학적 시험법>

1) 시액 및 표준용액의 조제

(1) 니코틴산 보존용액

미리 건조하여 데시케이터 건조한 니코틴산 표준품을 에탄올에 용해하고 그 1mL가 니코틴산 100μg을 함유하게 한다. 이 용액은 냉소에 보존한다.

(2) 니코틴산 표준용액

니코틴산 보존용액을 물로 희석하여 그 1mL가 니코틴산 0.1μg을 함유하도록 한다. 사용할 때 조제한다.

(3) 카제인 산분해용액

배지작성에 대하여 각 비타민, 무기염류, 카제인 산분해물 등은 적당한 농도의 액을 만들어 냉장고 중에 보존하여 두면 편리하다. 이 보존액에 잡균이 혼합되지 않게 하고, 보존액에서 배지를 작성함에 있어 각 비타민의 보존액에 다른 비타민이 혼입되지 않게 특히 주의한다. 배지를 만들 때에는 일반적으로 각 성분을 혼합, 용해한 다음에 10% 염산용액 또는 수산화나트륨용액을 사용하여 pH 3.5로 조정하고 약 20분간 비등수욕상에서 가온하고, 냉각 후 여과하여 물을 가해서 배양시의 2배 농도의 배지를 작성한다. 다음에 공통성분의 염류용액과 카제인 산분해용액의 제법을 참고한다.

(4) 아데닌, 구아닌, 우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% 염산용액 5mL에 가열하면서 용해하고 냉각 후 물을 가하여 100mL로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

Ⅲ.3.1.8-2

(5) 시스틴, 트립토판용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 물 350～400mL에 현탁하고 70～80℃에 가열하여 고형물이 용해할 때까지 20% 염산용액을 적가한다. 냉각 후 물을 가하여 전량을 500mL로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

(6) 비타민 B1, 비타민 B2, 비오틴용액

비타민 B1 염산염, 비타민 B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 녹이고, 그 1mL가 비타민 B1 염산염 10μg, 비타민 B2 20μg 및 비오틴 0.04μg을 함유하게 한다. 이 용액은 톨루엔 소량을 가하여 광을 피해서 냉소에 보존한다.

(7) 파라아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민 B6용액

이 용액의 1mL가 파라아미노 안식향산 10μg, 판토텐산칼슘 20μg 및 피리독신 염산염 40μg을 함유하게 25% 에탄올에 녹인다.

(8) 염류용액 A 및 염류용액 B

(가) 염류용액 A

제1인산칼륨(KH2PO4) 및 제2인산칼륨(K2HPO4) 각 5g을 물에 용해하여 전량을 100mL로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

(나) 염류용액 B

황산마그네슘(MgSO4‧7H2O) 2g, 염화나트륨(NaCl) 0.1g, 황산제1철(FeSO4‧7H2O) 0.1g 및 황산망간(MnSO4‧4H2O) 0.1g을 물에 용해하여 전량을 100mL로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

2) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10mL, 시스틴, 트립토판용액 10mL, 아데닌, 구아닌, 우라실용액 2mL, 비타민B1, 비타민B2, 비오틴용액 2mL, P-아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민B6용액 2mL, 염류용액 A 2mL 및 염류용액 B 2mL를 혼합하고 여기에 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가하여 용해하고, 10% 수산화나트륨용액으로 pH를 6～8로 조정한다. 다음 물을 가하여 전량을 100mL로 한다. 필요하면 여과한다(또는 Niacin Assay Medium, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

3) 접종용액의 조제

(1) Lactobacilllus plantarum의 보존균주

(2) 물 100mL에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH 6.8로 조정한 다음, 수욕상에서 10～20분간 가열하고, 여과 후 한천 1.5g을 가하고 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 흔들어 혼합하면서 가열한다. 가열시 이 용액 약 10mL씩을 시험관에 분주하고, 솜마개를 하고, 1kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하고 시험관을 수직의 위치에 보존하여 냉각한다. Lactobacillus plantarum ATCC, No8014의 보존균주로부터 멸균한 배지 10mL에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양하고, 냉소에 보존한다. 보존균주는 매주 새로 조제한다. 1주 지난 것은 사용하여서는 아니 된다(또는 Lactobacilli agar, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

Ⅲ.3.1.8-3

4) 배지

기초 배지 5mL를 함유하는 시험관에 니코틴산 1μg을 함유하게 하고 물을 가하여 솜마개를 하고 1kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다(또는 Lactobacilli broth AOAC, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

5) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균한 배지 10mL에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양한다. 여기에서 얻은 배양액을 잘 진탕 혼합한 다음 그대로 접종균액으로 하여 사용한다.

6) 시험용액의 조제

시료 일정량을 적당한 크기의 플라스크에 취하고 다음의 어느 방법에 따라서 시험용액을 조제한다.

(1) 염기성 물질 함량이 적은 고체 또는 반고체시료

시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 잘 혼합한다. 이 용액 1mL는 니코틴산 5mg이상을 함유하여서는 아니 된다. 다음에 1N 황산으로 플라스크의 벽에 부착한 시료를 세척하여 떨어뜨린 다음 1kg/cm2에서 30분간 가압 추출하고, 냉각 후 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH 6.5로 조정하고, 다음에 물을 가하여 용액 1mL가 니코틴산 약 0.1μg을 함유하게 희석하고, 필요하면 여과한다.

(2) 염기성물질 함량이 많은 고체 또는 반고체시료

시료에 소량의 물을 가하여 잘 혼합하고, 여기에 1N 황산을 가하여 pH를 약 6으로 하고, 다음에 시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 혼합하고 이하 (1)에 따라서 조제한다.

(3) 액체시료

시료에 1N 황산 또는 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH를 약 6으로 조정하고 이하 (2)에 준하여 조제한다.

Ⅲ.3.1.8-4

7) 시험조작

(제1법 산도적정법에 의한 정량법)

니코틴산 표준용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 2개씩에 니코틴산 표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 및 2mL를 취하고 각 시험관에 기초 배지 5mL 및 물을 가하여 전량을 10mL로 한다. 따로 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.3, 0.6 및 0.9mL를 가하고 다음에 각 시험관에 기초 배지 5mL 및 물을 가하여 전량을 10mL로 한다. 양 계열의 시험관의 내용물은 잘 흔들어 혼합하고 솜마개를 하든가 또는 뚜껑을 한 다음 1kg/cm2에서 10분간 가압 멸균하고, 냉각 후 각 시험관에 접종액 7μL씩을 무균적으로 접종하고 37℃에서 72시간 배양기에 넣어서 배양한다. 배양 후 각 시험관 중에 생긴 산을 0.1N 수산화나트륨액으로 적정한다(지시약: 0.1% 페놀프탈레인시액).

니코틴산 표준계열의 각 단계에 따른 측정치의 평균치를 각 시험관에 가한 니코틴산의 μg수에 대한 검량선을 작성한다. 다음에 이 검량선을 사용하여 내삽법에 따라서 시료 계열의 각관중의 니코틴산 함량을 구한다. 이 때의 측정치가 0.15μg 이상 및 0.025μg 이하의 것이 있으면 제외하고 남은 각 시험관에 대해서 시험용액 1mL에 대한 니코틴산의 함량을 구한다. 6개 이상의 관으로부터 얻어진 각각의 치가 그의 평균치보다 ±10%를 초과하는 것이 없는 것을 확인한 다음에 다시 이것만의 평균치를 구하고, 다음에 시료중의 니코틴산 함량을 산출한다.

(제2법 측정에 의한 정량법)

탁도 측정에 의한 정량법은 산도측정에 비하여 정밀도는 약간 낮지만 결과를 신속히 알게 되는 이점이 있다. 니코틴산의 검량선을 0～0.1μg/4mL로 하고, 시험용액 계열의 니코틴산 함량도 거기에 따라서 감해지면 좋다. 그러나 균의 배양시간은 20～40시간으로 한다. 탁도는 570～650nm에서 흡광도를 측정한다.

Ⅲ.3.1.8-5

Ⅲ.3.1.9 비타민 B6

<제1법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시액조제

50mM NaH2PO4 : NaH2PO4 6.0g을 증류수에 녹이고 염산으로 pH 2.5로 조절한 후 전량을 1L로 한다.

2) 표준용액의 조제

(1) 표준원액 : 비타민 B6(피리독신염산염)을 증류수에 녹여 표준원액(100μg/mL)을 조제한다.

(2) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액의 조제

시료 적당량을 취하여 잘게 부순 후, 증류수 25mL를 가하여 30분 동안 초음파로 추출하고, 3,000rpm에서 원심분리하여 상등액을 여과한다. 잔류물에 증류수 25mL를 다시 가하여 30분 동안 초음파로 추출하고, 원심분리하여 상등액을 여과하여 앞의 여액과 합하여 50mL로 맞춘다. 이액을 0.45μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	C18 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	형광검출기(여기파장 : 290nm, 측정파장 : 396nm)
주입량	10μL
이동상	50mM NaH2PO4(pH 2.5)
유속	1.0mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 B6(피리독신)의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 시료 중 비타민 B6의 함량(mg/100g)을 구한다.

Ⅲ.3.1.9-1

[계산식]

[eqn: rm 비타민~{B_6}~함량(피리독신, mg/100g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S : 시험용액중의 비타민 B6(피리독신)의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

<제2법 미생물학적 분석법>

1) 일반정량조작법

(1) 장치 및 기구

(가) 항온기

(나) 건조기

(다) 멸균기

(라) 무균대

(마) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(2) 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(3) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다.

배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(4) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

Ⅲ.3.1.9-2

(5) 정량용 기초배지

(가) 염류용액 A

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(나) 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1L로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(6) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5mL 또는 10mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5mL일 경우 기초배지는 2.5mL를 사용하고, 10mL일 경우 기초배지는 5mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5mL 또는 10mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

Ⅲ.3.1.9-3

(7) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1mL 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료채취량}]

2) 시약

(1) 비타민 B6 보존용액

H2SO4를 넣은 감압 데시케이터에서 24시간 건조된 비타민 B6 표준품 50mg을 정밀하게 취하여, 500mL의 메스플라스크에 넣고 1N HCl을 가하여 전량을 500mL로 만든 후 갈색병에 넣어 냉소에 보관한다. 이 용액 1mL는 피리독신염산염 100μg을 포함한다.

(2) 비타민 B6 표준용액

비타민 B6 보존용액을 물로 희석해서 1mL에 피리독신염산염 5μg을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

(3) 카제인 산분해용액

① 일반정량조작법 ㉲ 정량용 기초배지에 따른다.

(4) 비타민 B1용액

비타민 B1염산염 10mg을 물에 용해해서 1,000mL로 만든다. 이 용액 1mL는 비타민 B1염산염 10μg을 포함한다.

Ⅲ.3.1.9-4

(5) 이노시톨용액

이노시톨 100mg을 물에 용해해서 100mL로 만든다. 이 용액 1mL는 이노시톨 1mg을 포함한다.

(6) 비오틴용액

비오틴 25mg을 물에 용해해서 1,000mL로 만든 후 이중 40mL를 취해 물을 가하여 1,000mL로 만든다. 이 용액 1mL는 비오틴 1μg을 포함한다.

(7) 판토텐산칼륨용액

판토텐산칼륨 20mg을 물에 용해해서 100mL로 만든다. 이 용액 1mL는 판토텐산칼륨 0.2mg을 포함한다.

(8) 니코틴산용액

니코틴산 100mg을 물에 용해해서 100mL로 만든다. 이 용액 1mL는 니코틴산 1mg을 포함한다.

(9) 염류용액

KH2PO4 2.2g, KCl 1.7g, CaCl2‧2H2O 0.5g, MgSO4‧7H2O 0.5g, MnSO4‧4H2O 0.01g 및 FeCl3 0.01g을 물에 용해해서 전량을 100mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

(10) 구연산완충액

구연산칼륨 10g과 구연산 2g을 물에 녹여 전량을 100mL로 만든다.

3) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10mL, 비타민B1용액 5mL, 이노시톨용액 5mL, 비오틴용액 2mL, 판토텐산칼륨용액 2.5mL, 니코틴산용액 0.5mL, 염류용액 50mL 및 구연산완충액 10mL를 혼합하고 여기에 포도당 10g을 가하여 녹인다. 10% NaCl 용액으로 pH를 5.0～5.2로 조정한 후 물을 가하여 전량을 100mL로 만든다. 용해되지 않은 물질이 있으면 여과한다. Pyridoxine assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

4) 접종균액의 조제

(1) Saccharomyces pastorianus의 보존균주

Saccharomyces pastorianus ATCC 9080을 효모용 한천사면배지 또는 Wort agar(Difco)에 접종하여, 30℃에서 16～24시간 배양 후 냉소에 보관한다. 보관균주는 2주 간격으로 새로 배양한다.

(2) 배지

기초배지 100mL에 피리독신염산염 1μg을 포함한 물 100mL를 가하여 접종균액 조제용 배지로 한다. 이 배지를 소시험관에 2mL씩 분주하여 면전한 후 121℃에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다.

Ⅲ.3.1.9-5

(3) 접종용액

Saccharomyces pastorianus의 보존균주를 멸균된 배지에 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양균을 원심분리하여 취한 후 이를 0.9% NaCl용액으로 2회 세척하고, 0.9% NaCl용액을 이용해서 약 20배로 희석하여 접종용액으로 한다.

5) 시험용액의 조제

시료 2g을 500mL의 삼각플라스크에 취하여, 10N HCl 1mL 및 물 180mL를 가하여 뚜껑을 하고 121℃에서 4시간 가압 추출한다. 식힌 후 10% NaOH용액으로 pH를 4.5로 조정하고, 여기에 물을 가하여 전량을 200mL로 만든다. 필요시 여과한다. 시험용액 1mL가 비타민B6 약 5μg을 포함하도록 여액을 물로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

비타민 B6 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 2개씩의 시험관에 비타민 B6 표준용액 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0mL를 각각 취하고, 각 시험관에 기초배지 5mL 및 물을 가해서 전량을 10mL로 만든다. 특히 시험용액의 계열을 만들기 위해서 2개씩의 시험관에 시험용액 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0mL를 가하고 각 시험관에 기초배지 5mL 및 물을 가해서 전량을 10mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합해서 면전한 후 100℃에서 10분간 멸균하여 식히고, 각 관에 접종용액 한방울씩을 무균적으로 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양후 균의 증식을 정지시키기 위하여 100℃에서 5분간 멸균한 후 탁도법에 의하여 균의 증식을 측정한다.

Ⅲ.3.1.9-6

Ⅲ.3.1.10 판토텐산

<제1법 미생물학적 분석법>

1) 일반정량조작법

(1) 장치 및 기구

(가) 항온기

(나) 건조기

(다) 멸균기

(라) 무균대

(마) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(2) 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(3) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(4) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

(5) 정량용 기초배지

(가) 염류용액 A

Ⅲ.3.1.10-1

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(나) 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1L로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(6) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5mL 또는 10mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5mL일 경우 기초배지는 2.5mL를 사용하고, 10mL일 경우 기초배지는 5mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5mL 또는 10mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

Ⅲ.3.1.10-2

(7) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1mL 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료채취량}]

2) 시액 및 표준용액의 조제

(1) 판토텐산칼륨 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터중에서 건조시킨 판토텐산칼륨 표준품 50mg을 정확하게 취하여, 1L의 메스플라스크에 넣고 약 500mL의 물을 가하여 용해한다. 여기에 0.2N 초산 10mL, 2% 초산나트륨 100mL 및 물을 가해서 1,000mL로 만든다. 톨루엔을 소량 가하여 냉소에 보관한다. 판토텐산칼륨 보존용액 1mL에는 판토텐산칼륨 50μg을 포함한다.

(2) 판토텐산칼륨 표준용액

판토텐산칼륨 보존용액을 희석하여 1mL당 판토텐산칼륨 0.5μg을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

(3) 카제인 산분해용액

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(4) 시스틴-트립토판 용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g을 350～400mL의 물로 녹이고 70～80℃로 가열하여 고형물이 완전히 녹을 때까지 20% HCl을 떨어뜨린다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500mL로 만들고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

(5) 아데닌-구아닌-우라실용액

Ⅲ.3.1.10-3

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5mL로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100mL로 만든다. 톨루엔 소량을 가해서 약 10℃로 보존한다.

(6) 비타민 B1-비타민 B2-비오틴용액

비타민 B1염산염, 비타민 B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 용해하여, 그 1mL에 비타민 B1염산염 10μg, 비타민 B2 20μg 및 비오틴 0.04μg을 포함하도록 한다. 톨루엔을 소량 가하여 빛을 차단하고 냉소에 보관한다.

(7) 염류용액A

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(8) 염류용액B

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(9) 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민 B6용액

보존용액 1mL에 파라아미노안식향산 10μg, 니코틴산 20μg 및 피리독신염산염 40μg을 포함하도록 25% 에탄올로 용해하여 냉소에 보관한다.

3) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10mL, 시스틴-트립토판용액 10mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 2mL, 비타민 B1-비타민 B2-비오틴용액 2mL, 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민 B6용액 2mL, 염류용액A 2mL 및 염류용액B 2mL를 혼합하여 여기에 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가해서 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후 물을 가해서 전량을 100mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다. Pantothenate medium(Difco)을 사용할 수 있다.

4) 접종균액의 조제

(1) Lactobacillus plantarum의 보존균주

물 100mL에 효모엑기스 2g을 녹이고, 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가해 pH를 6.8로 조정한 후 수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한다. 한천 1.5g을 가해 한천이 녹을 때까지 수욕상에서 세게 진탕하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 면전하고, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 똑바로 놓고 식힌다. Lactobacillus plantarum ATCC 8014의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한 후 37℃에 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 조제하고 1주가 넘은 것은 사용하지 않는다.

(2) 배지

Ⅲ.3.1.10-4

기초배지 5mL를 넣은 시험관에 판토텐산칼륨 0.2μg을 포함한 물 5mL를 가하고 면전을 하여, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 식힌다. Bacto micro inoculum broth(Difco)를 사용할 수 있다.

(3) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균된 배지 10mL에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 배양액을 잘 진탕 혼합한 후 그대로 접종균액으로 사용한다.

5) 시험용액의 조제

시료에 10배 용량의 물을 가하여 잘 섞으면서 초산 및 초산나트륨 용액으로 pH를 5.6～5.7로 조정한다. 이를 가압멸균기에 넣고, 121℃에서 약 5분간 가열한 후 식힌다. 필요하면 10% HCl을 가해 pH를 4.0～4.5로 조정하여 단백질 등을 침전, 제거시키고 투명한 액으로 만든다. 다음에 NaOH용액을 가해서 pH를 6.8로 조정하고 물을 가하여 용액 1mL에 판토텐산 약 0.05μg을 포함하도록 희석한다.

6) 시험조작

판토텐산칼륨 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 시험관 2개씩에 판토텐산칼륨 표준용액을 각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 및 2.0mL를 취하고, 각 시험관에 기초배지 2mL 및 물을 가해서 전량을 4mL로 만든다. 시험용액을 만들기 위해서는 시험용액을 각각 0.5, 1.0 및 1.5mL를 취하고 각 시험관에 기초배지 2mL 및 물을 가하여 전량을 4mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합한 후 면전하여 121℃에서 5분간 가압멸균하고 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여, 37℃에서 20～24시간 배양한다. 배양후 각 시험관의 내용물을 잘 진탕 혼합하여 균일한 부유액으로 만든 후 540～660nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

판토텐산칼륨 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 이 검량선을 이용하여 시료계열의 각 시험관의 판토텐산칼륨 함량을 구한다. 이 때 값이 0.09μg이상 또는 0.01μg이하의 것이 있으면 제외하고, 남은 각 관에 대하여 시험용액 1mL에 대한 판토텐산칼륨의 함량을 계산한다. 6개 이상의 시험관으로부터 얻어진 각각의 값이 그들의 평균치보다 10%이상 벗어나지 않는 것을 확인한 다음에 이 값만의 평균치를 구하여 시료중의 판토텐산칼륨의 함량을 산출한다. 그 다음에 여기에서 얻은 값으로 환산계수 0.916을 곱해서 판토텐산 함량을 구한다.

Ⅲ.3.1.10-5

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시액조제

20mM KH2PO4 : KH2PO4  2.7 g을 증류수에 녹이고 인산으로 pH 2.1로 조절한 후 전량을 1 L가 되게 한다.

2) 표준용액의 조제

(1) 표준원액 : 판토텐산((D-pantothenic acid, hemicalcium salt)을 20mM KH2PO4에 녹여 표준원액(100 μg/mL)을 조제한다.

(2) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액의 조제

검체 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순후 적당량의 20mM 인산완충용액을 가하여 30분간 초음파 진탕기로 추출한 후 50 mL로 맞추고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	역상분배형(C18 또는 이와 동등한 것, 1.5 mm×250 mm, 5 μm)
검출기(측정파장)	자외부(UV) 검출기(200nm)
주입량	10μL
이동상	A- 20mM potassium phosphate(pH 2.1) B- 20mM potassium phosphate/ACN(80/20) A : B(96 : 4)의 혼합액으로 37분간 흘려보낸 후 B 용액으로 10분간 세척한다.
유속	120 μL/분

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 피크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 판토텐산의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체중 판토텐산의 함량(mg/100 g)을 구한다.

[계산식]

Ⅲ.3.1.10-6

판토텐산(mg/100 g) =	S ×	a×b	×	100
		검체량(g)		1000

S : 시험용액중의 판토텐산의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.10-7

Ⅲ.3.1.11 엽산

1) 일반정량조작법

(1) 장치 및 기구

(가) 항온기

(나) 건조기

(다) 멸균기

(라) 무균대

(마) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(2) 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(3) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(4) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

(5) 정량용 기초배지

(가) 염류용액 A

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

Ⅲ.3.1.11-1

(나) 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1L로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(6) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5mL 또는 10mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5mL일 경우 기초배지는 2.5mL를 사용하고, 10mL일 경우 기초배지는 5mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5mL 또는 10mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

Ⅲ.3.1.11-2

(7) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1mL 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료채취량}]

2) 시액 및 표준용액의 조제

(1) 엽산 보존용액

P2O5를 넣은 데시케이터에서 건조시킨 엽산 표준품 50mg을 정확하게 취하여 500mL의 메스플라스크에 넣어 0.01N NaOH용액 약 30mL로 녹이고, 물 약 300mL를 가한 후 HCl로 pH를 7～8로 조정하고 물을 가하여 500mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 약 10℃로 보존한다. 이 용액 1mL는 엽산 100μg을 포함한다.

(2) 엽산 표준용액

엽산 보존용액을 물로 희석해서 1mL에 엽산 2μg을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

(3) 시스틴 트립토판 용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 350～400mL의 물로 희석하여 70～80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

(4) 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5mL로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100mL로 만든다. 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

(5) 카제인 산분해용액

Ⅲ.3.1.11-3

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(6) 염류용액 B

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(7) 크산틴 용액

물 약 80mL에 크산틴 0.4g을 가하여 70℃로 가열하면서 10% 암모니아수 12mL를 가하여 크산틴이 녹을 때까지 젓는다. 식힌 후 물을 가하여 400mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

(8) 비타민 용액

파라아미노안식향산 10mg, 피리독신염산염 40mg, 비타민B1염산염 4mg, 판토텐산 칼륨 8mg, 니코틴산 8mg 및 비오틴 0.2mg을 약 300mL의 물로 녹이고, 여기에 비타민B12 10mg을 0.02N 초산으로 녹인 용액 200mL를 가한다. 계속해서 무수초산나트륨 1.9g과 초산 1.6mL를 40mL의 물로 녹인 용액을 가한 후, 물을 가해서 2L로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

(9) 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 8g을 물에 용해해서 800mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

(10) MnSO4 용액

MnSO4‧4H2O 2g을 물에 용해해서 200mL로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

(11) 폴리솔베이트 80 용액

폴리솔베이트 80(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 25g을 에탄올로 녹여 250mL로 만든다.

3) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10mL, 시스틴-트립토판용액 20mL, 아스파라긴용액 3mL, 아데닌-구아닌-우라실용액 1mL, 크산틴용액 2mL, 비타민용액 20mL, 염류용액B 2mL, MnSO4 용액 2mL 및 폴리솔베이트80용액 0.1mL를 잘 섞고, 여기에 포도당 4g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64g 및 구연산나트륨(C6H5O7Na3‧2H2O) 5.2g을 가하여 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100mL로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

Folic acid assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

Ⅲ.3.1.11-4

4) 접종균액의 조제

(1) Streptococcus faecalis의 보존균주

물 100mL에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH를 6.8로 조정한다.

수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한 후 한천 1.5g을 가하여 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 세게 혼합하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10mL씩을 시험관에 분주하여 면전하고 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 수직으로 세워 식힌다.

Streptococcus faecalis ATCC 8043의 보존균주를 멸균된 배지 10mL에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 배양하고 1주를 넘은 것은 사용하지 않는다.

(2) 배지

한천을 제외한 보존배지로 조제한 액체배지 2mL를 소시험관에 분주하여 면전한 후, 121℃에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다.

(3) 접종균액

Streptococcus faecalis의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종하여, 37℃에서 16～24시간 배양 후 증식된 균체를 무균적으로 원심분리하고, 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척한 후, 0.9% NaCl용액 약 2mL를 가해서 접종균액으로 한다.

5) 시험용액의 조제

일정량의 시료를 플라스크에 넣고, 여기에 적어도 시료의 10배량의 물을 가한다. 이 때 이 액 1mL는 엽산 1mg 이상을 포함하여야 한다. 여기에 약 10% 암모니아수를 100mL당 2mL의 비로 가해서 잘 섞고, 가압멸균기에 넣어 121℃에서 약 15분간 가열한 후 식혀, 물을 가해 일정량으로 하여 여과 또는 원심분리하여 투명한 용액으로 만든다. 다음에 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1mL는 엽산 약 2μg을 포함하도록 조제한다.

6) 시험조작

엽산표준용액의 계열을 만들기 위해서 시험관 2개씩에 엽산표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75 및 2.0mL를 취하여 각 시험관에 기초배지 2mL 및 물을 가해서 각각 4mL로 만든다. 시험용액의 계열은 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0 및 1.5mL를 가하고 각 시험관에 기초배지 2mL 및 물을 가하여 4mL로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 섞어 면전하고 121℃에서 5분간 가압 멸균하여 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 20～24시간 배양한다. 탁도법에 의하여 균의 증식도를 측정한다.

Ⅲ.3.1.11-5

Ⅲ.3.1.12 비타민 B12

<제1법 미생물학적 분석법>

1) 일반정량조작법

(1) 장치 및 기구

(가) 항온기

(나) 건조기

(다) 멸균기

(라) 무균대

(마) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(2) 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(3) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(4) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

(5) 정량용 기초배지

(가) 염류용액 A

Ⅲ.3.1.12-1

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(나) 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1L로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(6) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5mL 또는 10mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5mL일 경우 기초배지는 2.5mL를 사용하고, 10mL일 경우 기초배지는 5mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5mL 또는 10mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

Ⅲ.3.1.12-2

(7) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1mL 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료채취량}]

2) 시액 및 표준용액의 조제

(1) 시아노코발아민 보존용액

데시케이터중에서 건조시킨 시아노코발아민 표준품을 시아노코발아민의 양이 50～60μg에 해당되도록 정확히 칭량하여 25% 알코올을 가한 후 mL당 100ng의 농도가 되도록 표준용액 농축액을 만든다. 농축액은 10℃에 보관한다.

(2) 시아노코발아민 표준용액

이 용액에 일정량의 증류수를 가하여 500mL로 희석한다. 이 표준용액의 농도는 mL당 0.01～0.04ng에 해당하는 농도로서, 시료의 농도와 유사하도록 한다. 같은 방법으로 시료중의 비타민B12 농도보다 높은 농도 및 낮은 농도(예：0.010ng/mL와 0.020ng/mL)의 표준용액을 준비한다.

(3) 아데닌-구아닌-우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염, 우라실 1.0g을 50mL의 가온한 HCl로 용해하고(1＋1) 물을 가하여 1L로 만든다.

(4) 아스파라긴 용액

L-아스파라긴 10g을 물로 녹이고 1L로 만든다.

(5) 폴리솔베이트80용액

폴리솔베이트80 25g을 알코올로 녹여 250mL로 만든다.

(6) 염류용액A

Ⅲ.3.1.12-3

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(9) 염류용액B

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(10) 비타민용액 Ⅰ

비타민 B2 25mg, 비타민 B1염산염 25mg, 비오틴 0.25mg, 나이아신 50mg을 0.02N 초산으로 녹이고 1L로 만든다.

(11) 비타민용액 Ⅱ

파라아미노벤조산(PABA) 50mg, 판토텐산 25mg, 피리독신염산염 100mg, 피리독살염산염 100mg, 피리독사민염산염 20mg, 엽산 5mg을 25% 알코올로 녹이고 1L로 만든다.

(12) 부유배지(Suspension medium)

기초배지 5mL를 동량의 물로 희석하여 시험관에 넣고 면전하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 빨리 식힌다. 10℃의 암소에 저장한다.

(13) 크산틴용액

크산틴 1.0g을 150～200mL의 물로 녹이고 약 70℃로 가열하면서, 30mL의 NH4OH(2＋3)를 넣고 완전히 녹을 때까지 저은 후 물을 가하여 1L로 만든다.

(14) 카제인 산분해용액

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

3) 기초배지

비타민 B12가 포함되어 있지 않은 2배농도의 기초배지 1L를 준비하기 위하여 다음의 물질들을 순서대로 첨가한다. 아데닌-구아닌-우라실용액 20mL, 아스파라긴용액 20mL, 염류용액A 20mL, 염류용액B 20mL, 비타민용액Ⅰ40mL, 비타민용액Ⅱ 40mL, 크산틴용액 20mL, 폴리솔베이트80 용액 20mL를 넣은 후 증류수를 가하여 약 800mL로 만든다. 계속해서 다음 물질들을 순서대로 가한다. 산가수분해카제인 10g, L-시스틴 0.4g, DL-트립토판 0.4g을 최소량의 묽은 염산(236mL 진한염산/L)으로 녹인 용액과 포도당 40g, sodium acetate trihydrate 33.2g, 아스코르빈산 4g을 넣는다. 아스코르빈산을 가한 후에는 강하게 교반하지 않아야 한다. 모든 고형분이 완전히 녹을 때까지 가볍게 젓는다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정한다. 지시약을 사용할 때는 지시약이 폴리솔베이트를 흡수하기 때문에 pH를 조정한 후 폴리솔베이트용액을 넣는다. vitamin B12 assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

Ⅲ.3.1.12-4

4) 접종균액의 조제

(1) Lactobacillus leichmannii의 보존균주

Lactobacillus leichmannii ATCC 7830은 배양배지에 천자배양(stab culture)한다. 37℃에서 6～24시간 배양하여 10℃의 암소에 저장한다. 분석하기 전 1～2주 간격으로 계속 배양하고, 최소한 1주일에 1번 정도로 새로 준비한다.

(2) 액체배양배지

Peptonized milk 15g, 효모엑기스 5g, 포도당 10g, KH2PO4 2g을 600mL의 물로 용해한다. 여기에 여과한 tomato juice 100mL를 가한 후 NaOH로 pH를 6.5～6.8로 조정한다. 저으면서 10mL의 폴리솔베이트80을 첨가하고 물로 희석하여 1L로 만든다. Lactobacilli broth AOAC(Difco)를 사용할 수 있다. 1mL당 1ng의 비타민B12를 포함하도록 동량의 물로 희석하여 시험관에 10mL씩 분주한 후, 면전하여 121℃에서 15분간 멸균하여 빨리 식히고 냉장고에 보관한다.

(3) 배양배지

액체배양배지 500mL에 5～7.5g의 agar를 넣고 agar가 녹을 때까지 수욕상에서 젓는다. 뜨거운 상태에서 10mL를 취하여 시험관에 넣고 121℃로 15분간 멸균한 후 똑바로 세워 빨리 식히고 10℃의 암소에 저장한다. Lactobacilli agar AOAC(Difco)를 사용할 수 있다.

(4) 접종균액

L. leichmannii의 보관균주를 2개의 액체배양배지에 접종하여 37℃에서 6～24시간 배양 후 원심분리하여 상등액은 버리고 0.9% NaCl용액 또는 부유배지 10mL로 3회 세척한다. 부유배지를 100% T로 고정하고 이에 대하여 판독할 때, 시험관 당 0.50～0.75의 건조량에 상응되는 T 값이 주어지도록 0.9% NaCl용액 또는 부유배지로 일정량을 희석한다. 이렇게 준비한 것을 접종액으로 한다.

5) 시험용액의 조제

Na2HPO4 1.3g, 구연산 1.2g, sodium metabisulfite(Na2S2O5) 1.0g을 넣은 용액 100mL를 사용 전에 준비한다. 비타민B12의 농도가 50～100ng이 되도록 시료의 양을 취한 후 mL당 0.01에서 0.04ng의 비타민B12 최종분석 농도에서 추출용액을 sodium metabisulfite의 농도가 mL당 0.03mg을 넘지 않도록 첨가한다. 액상으로 시료용액을 완전히 분산시키고 물로 비커의 아랫부분을 세정하여 혼합물을 121℃에서 10분간 멸균하여 식힌다. 만일 덩어리가 생기면 입자가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 젓는다. 세게 흔들면서 pH를 4.5로 조정하고, 비타민B12의 농도가 mL당 0.2ng이 되도록 물로 희석하여 여과한다. pH를 6.0으로 조정한 후 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1mL는 비타민B12 0.014ng을 포함하도록 조제한다.

Ⅲ.3.1.12-5

6) 시험조작

비타민 B12의 표준용액과 분석용액의 계열을 다음과 같이 준비한다. 두 개의 시험관에 표준용액을 0(비접종 blank), 0(접종 blank), 1.0, 2.0, 3.0, 4.0과 5.0mL씩 넣는다.

분석시료는 2개 시험관에 분석용액을 1.0, 2.0, 3.0, 4.0mL씩 넣는다. 표준용액과 분석용액의 각 시험관에 물을 넣어 5mL로 만든 후, 5mL의 기초배지를 넣고 잘 섞는다. 면전하여 121℃에서 10분간 고압 멸균하여 빨리 식힌다. 비접종 공시험용 시험관을 제외한 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다.

각 시험관의 내용물을 완전히 혼합하여 흡수 cell에 옮기고, 비접종 시험관의 투과도를 100%로 고정하여 각 시험관의 투과도를 구한다. 시아노코발아민 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 표준곡선으로부터 분석용액의 각 시험관의 비타민양을 정한다. 표준용액의 T값이 0.5mL이하 또는 4.5mL이상으로 관찰되면 무시한다. 시험에 사용한 분석용액의 농도(비타민함량/mL)를 계산한다. 각 시험관 결과치의 평균을 구하되, 평균으로부터 10%이내의 오차를 보이는 결과만을 취하여 계산한다. 분석용액의 4단계에 사용한 시험관중 2/3미만이 적합한 결과를 보인 경우, 이 결과는 시료의 비타민B12 함량 결정에는 불충분하다. 2/3이상의 시험관의 결과가 적합한 경우라면, 그 평균값으로부터 시료의 역가를 구한다.

<제2법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시액조제

5mM KH2PO4 : KH2PO4 0.68 g을 증류수에 녹이고 전량을 1 L가 되게 한다.

2) 표준용액의 조제

(1) 표준원액 : 비타민 B12(Cyanocobalamin)을 5mM KH2PO4에 녹여 표준원액(100 μg/mL)을 조제한다.

(2) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액의 조제

검체 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 5mM 인산완충용액을 가하여 10분간 초음파 진탕기로 추출한 후 50 mL로 맞추고, 21,000 rpm에서 원심분리한다. 분리후 중간층을 취해서 21,000 rpm에서 다시 원심분리하고, 중간층을 시험관에 옮겨 클로르포름 3 mL을 첨가하여 지방층을 제거(2,000 rpm)한 물층을 다시 21,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 마지막으로 맑은 액층을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.1.12-6

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)의 조건

항목	조건
칼럼	․전처리컬럼 : Capcellpak MF C8 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 ․농축컬럼 : Capcellpak MG C18 (2.0 mm×35 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 ․분석컬럼 : Capcellpak UG C18 (1.5 mm×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부(UV)검출기(550nm)
주입량	10μL
이동상	․전처리컬럼 이동상 : 5mM KH2PO4 ․분석컬럼 이동상 : 5mM KH2PO4/Methanol (80/20)
유속	․전처리컬럼 이동상 : 500 μL/min ․분석컬럼 이동상 : 120 μL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 400 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 피크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 B12의 농도(ng/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체중 비타민 B12의 함량(μg/100 g)을 구한다.

[계산식]

비타민 B12(μg/100 g) =	S ×	a×b	×	100
		검체량(g)		1000

S : 시험용액중의 비타민 B12의 농도(ng/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.12-7

Ⅲ.3.1.13 비오틴

1) 일반정량조작법

(1) 장치 및 기구

(가) 항온기

(나) 건조기

(다) 멸균기

(라) 무균대

(마) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(2) 시약

사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(3) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10mL씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(4) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

(5) 정량용 기초배지

(가) 염류용액 A

KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

Ⅲ.3.1.13-1

(나) 염류용액 B

MgSO4‧7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4‧7H2O 0.1g 및 MnSO4‧4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100mL로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

(다) 카제인 산분해용액

비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200mL를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1L로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(6) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5mL 또는 10mL로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5mL일 경우 기초배지는 2.5mL를 사용하고, 10mL일 경우 기초배지는 5mL를 가한 후, 물을 가해서 각각 5mL 또는 10mL로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

Ⅲ.3.1.13-2

(7) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 mL수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 mL수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1mL 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 비타민함량=시험용액의~비타민함량×{희석농도}over{시료채취량}]

2) 시액 및 표준용액

(1) 비오틴 보존용액

비오틴 표준품을 50% 에탄올에 녹여, 그 1mL에 비오틴 20μg이 함유되도록 한다. 이 용액은 냉소에 보관한다.

(2) 비오틴 표준용액

사용 시 비오틴 보존액을 물로 희석하여, 그 1mL에 비오틴 0.2μg이 함유되도록 한다.

(3) 카제인 산분해용액

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

(4) 아데닌-구아닌-우라실용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5mL로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100mL로 만든다. 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

(5) 시스틴 트립토판 용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 350～400mL의 물로 희석하여 70～80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500mL로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

(6) 비타민 B1․비타민 B2용액

Ⅲ.3.1.13-3

비타민 B1염산염, 비타민 B2를 0.02 N 초산에 녹여, 그 1mL가 비타민 B1염산염 10μg 및 비타민 B2 20μg을 함유하도록 한다. 이 용액은 톨루엔을 소량 가하여, 빛을 차광하여 냉소에 보관한다.

(7) p-아미노안식향산․니코틴산․판토텐산칼슘․비타민 B6 용액

이 용액 1mL가 p-아미노안식향산 10μg, 니코틴산 20μg, 판토텐산 칼슘 20μg, 피리독신염산염 40μg을 함유하도록 25% 에탄올에 녹인다. 이 용액은 냉소에 보관한다.

(8) 염류용액 A 및 B

제4장 시험법 Ⅲ. 개별성분별 시험법 1. 비타민 1.10. 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다.

3) 기초배지

카제인 산분해용액 10mL, 시스틴․트립토판용액 10mL, 아데닌․구아닌․우라실용액 2mL, 비타민 B1․비타민 B2용액 2mL, p-아미노안식향산․니코틴산, 판토텐산 칼슘․비타민 B6 용액 2mL, 염류용액 A 2mL 및 염류용액 B 2mL를 혼합하고, 이것에 무수 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가하여 물에 용해하고, 10% NaOH용액으로 pH 6.8로 조정하고, 물을 가하여 전량 100mL로 한다. 불용물질이 있으면 여과한다. 또는 이와 동등한 합성배지를 사용할 수 있다.

4) 접종균액의 조제

(1) Lactobacillus plantarum 보존균주

효모엑기스 0.5g, 펩톤 1g, 포도당 1g 및 초산나트륨(3H2O) 1g을 물 60～70mL에 녹여, 1～2분 끓인다. 냉각 후, 염류용액 A 및 B 각 0.5mL를 가하고 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정하고, 물을 가하여 100mL로 하고, 이것에 분말한천 2g을 녹여, 10～15mL씩 시험관에 분주하여 1kg/cm2로 15분간 가압 멸균하여, 시험관을 수직으로 보존하여 방냉한다. Lactobacillus plantarum ATCC No. 8014의 순수배양에서 상기의 균주보존용배지에 균을 접종하고, 37℃에서 16～24시간 배양하여, 냉소에 저장하여, 1주간마다 이식한다.

(2) 접종용배지

(1)의 균주보존용배지의 조제법에 따라서, 최후에 분말한천을 가하지 않고 불용잔사를 여과하여 없애고 5mL씩 시험관에 분주하고 1kg/cm2 15분간 가압멸균하여 방냉하여 접종용배지로 한다.

(3) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를 접종용배지에 이식하고, 37℃에서 16～24시간 배양하고, 증식한 균액을 무균적으로 원심분리 한 후, 상등액을 비스듬하게 하여 제거하고, 여기에 멸균생리식염수 약 5mL로 현탁시켜 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이 조작을 2회 반복하여 균을 세정한다. 세정이 끝난 균액을 멸균생리식염수로 10～100배로 희석하여 접종균액으로 한다.

Ⅲ.3.1.13-4

5) 시험용액의 조제

비오틴 약 200μg을 함유하는 시료를 50mL의 삼각플라스크에 취하고 6N 황산용액 25mL를 가하여 1kg/cm2로 1시간 가압한다. 냉각 후, 10% 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조정하고, 원심분리 또는 여과한 후 물을 가하여 용액 1mL 중에 비오틴 약 0.2μg을 함유하도록 희석한다.

6) 시험조작

시험관 각 2개씩에 비오틴 표준용액 0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2.0 및 2.5mL를 넣고, 각 시험관에 기초배지 2.5mL 및 물을 가해 전량을 5mL로 하여 표준용액 계열로 한다.  별도로 시험관 각 3개씩에 시험용액 0.5, 1 및 2mL를 취하고 각 시험관에 기초배지 2.5mL 및 물을 가해 전량을 5mL로 한 것을 시험용액 계열로 한다. 양계열의 시험관의 내용물을 잘 혼합하여, 알루미늄 뚜껑을 씌우고, 1kg/cm2로 10분간 가압 멸균한다. 냉각 후, 각 시험관에 접종균액을 1 방울씩 무균적으로 접종하고, 산도적정에 의한 정량에는 37℃, 72시간, 탁도측정에 의한 정량에는 37℃, 16～24시간 배양한다. 배양 후, 각 시험관에 생긴 산 또는 탁도를 Ⅲ.3.1.8 나이아신 <제2법 미생물학적 시험법> 7) 시험조작에 따라 산도적정 또는 탁도측정에 의해 정량한다.

Ⅲ.3.1.13-5

Ⅲ.3.1.14 비타민 C

<제1법 2.4-디니트로페닐하이드라진(DNP)에 의한 정량법>

1) 시액 및 표준용액

(1) 메타인산-초산용액 : 메타인산 15g을 초산 40mL 및 물 200mL로 잘 진탕 혼합하여 녹여서 물을 가해 250mL로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관하면 1주간 사용할 수 있다.

(2) 묽은메타인산-초산용액 : 메타인산-초산용액을 같은 양의 물로 혼합한다. (사용 시 조제)

(3) 20% 메타인산용액 : 냉장고에 보존한다.

(4) 10% 메타인산용액 : 냉장고에 저장, 2주간 사용할 수 있다.

(5) 5% 메타인산용액 : 사용할 때 조제한다.

(6) 인도페놀용액：2,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 0.2g을 더운물에 녹여 100mL로 한다. 필요하면 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하고 2주간 사용할 수 있다.

(7) 메타인산-티오요소용액 : 10% 메타인산용액 50mL에 티오요소 2g을 녹인다. 물을 가해 100mL로 한다(사용 시 조제).

(8) 디니트로페닐하이드라진용액 : 2, 4-디니트로페닐하이드라진 2g을 9N 황산액 100mL에 녹인다. 유리여과기로 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하면 2주간 사용할 수 있다.

(9) 비타민 C 표준용액

비타민 C 표준품 100mg을 정밀히 단다. 메스플라스크에 넣어 5% 메타인산용액에 녹여서 100mL로 한다.

그 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5mL를 각각 메스플라스크에 취해 5% 메타인산용액을 가해서 100mL로 한다(사용 시 조제).

2) 시험용액의 조제

시료의 일정량을 정밀히 단다. 정확히 같은 양의 메타인산-초산용액을 잘 혼합해서 균등한 죽 상태로 한다. 환원형 비타민C로서 1～5mg 함유되도록 균등한 죽상태의 일정량(W g)을 100mL의 메스플라스크에 옮기고 묽은메타인산-초산용액으로 100mL로 한다. 이 용액을 여과하여 처음의 수 mL를 제거해서 그 후의 여액을 취하거나 또는 원심분리해서 상등액을 취하여 시험용액으로 한다. 다만, 조작은 모두 신속히 행한다.

Ⅲ.3.1.14-1

3) 시험조작

(1) 산화

시험용액 2mL를 시험관 T1, T2 및 T3에 취해 T1에 인도페놀용액 1방울을 혼합해서 이것이 적색을 나타내는지 확인하고, T1, T2 및 T3에 메타인산-티오요소용액 2mL씩 가한다.

(2) 오사존의 생성

시험관 T1 및 T2에 디니트로페닐하이드라진용액 1mL씩을 가해 37℃(±0.5℃) 항온수욕중에서 정확히 3시간 방치하고 T3와 함께 얼음물 중에 침적한다.

(3) 오사존의 용해

얼음물중에서 냉각하면서 T1, T2 및 T3에 85% 황산용액 5mL를 조금씩 적가해서 1분간 얼음물 중에서 내용액을 잘 혼합 냉각한다. 다음에 차가운 상태에서 T3에 디니트로페닐하이드라진용액 1mL를 혼합한다. T1, T2 및 T3의 내용액을 재차 혼합한 후 얼음물로부터 꺼내서 실온에서 30～40분간 방치한다.

(4) 비색

T1 및 T2의 내용액에 대해서 510～540nm에서 흡광도를 측정하고, T1 및 T2 로 한다. 대조액은 T3로 한다.

(5) 검량선의 작성

비타민 C 표준용액의 각 2mL씩을 시험관에 취하고 위의 시험조작 Ⓐ～Ⓓ에 따라서 조작한다. 각각 흡광도를 구하고 검량선을 그린다.

(6) 계산

시험용액 2mL중의 총 비타민 C량 및 산화형 비타민 C량을 각각의 환원형 비타민 C량(μg)으로 나타낸 수치를 검량선에서 찾아서 T1 및 T2에 대응하는 점으로부터 구하여 C1 및 C2로 한다. 시료중의 비타민C함량은 다음 식으로 구한다.

[계산식]

총 비타민 C 함량(mg/100g)	=	C1	×	50	시료채취량(g)×2	×	100
		1,000			W		시료채취량(g)

산화형 비타민 C 함량(mg/100g)	=	C2	×	50	시료채취량(g)×2	×	100
		1,000			W		시료채취량(g)

환원형 비타민 C 함량(mg/100g)=총 비타민C함량(mg/100g)-산화형 비타민C 함량(mg/100g)

Ⅲ.3.1.14-2

<제2법 인도페놀적정법에 의한 정량법>

1) 시액조제

(1) 인도페놀용액

미리 탄산수소나트륨 약 50mg을 더운물 약 150mL에 용해하고 여기에 2, 6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 약 50mg을 용해시키고 냉각 후 물로 200mL로 한다. 여과 후 차광하여 냉소에 저장하면 일주간 사용할 수 있다. 단, 다음 방법에 따라 사용할 때 적정한다.

[적   정]

비타민C 표준품 100mg을 정밀히 달아서 500mL의 메스플라스크에 넣어 묽은 메타인산-초산용액으로 500mL로 한다. 그 5mL를 정밀히 취하여 묽은 메타인산-초산용액 5mL를 가하고 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 여기에 적정된 인도페놀용액의 소비량을 T mL로 한다.

2) 시험조작

조작은 모두 신속히 행한다.

(1) 환원형 비타민 C의 적정

디니트로페닐하이드라진법에서 조제한 시험용액 10mL를 삼각플라스크에 정확히 취하여 즉시 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다.

이때 적정된 인도페놀용액의 소비량을 SmL로 한다.

(2) 계산 : 시료중의 환원형 비타민 C는 다음 식에 의해 구한다.

[계산식]

환원형 비타민 C 함량(mg/100g)	=	A	×	S	×	시료채취량(g)×2	×	100
				T		W		시료채취량(g)

A(mg) : 인도페놀용액 TmL에 대응하는 아스코르빈산량

<제3법 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 시액조제

(1) 10% 메타인산용액：메타인산 10g을 물에 녹여 100mL로 한다. 불용물이 생기는 경우 여과하여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관할 수 있다.

(2) 5% 메타인산용액：10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용시 조제한다.

Ⅲ.3.1.14-3

2) 표준용액의 조제

(1) 표준원액 : 아스코르빈산 10.0mg을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 100mL로 한 것을 표준원액(100ppm)으로 한다.

(2) 표준용액 : 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산용액을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용 시 조제한다.

3) 시험용액의 조제

시료 일정량(비타민 C함량이 50mg/100g 이상인 경우 2g 정도, 10～50mg/100g인 경우 5～10g 정도를 시료로 한다)을 정확히 달아, 동량의 10% 메타인산용액을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% 메타인산을 넣어 균질화한다. 균질화된 시료를 100mL 메스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메타인산용액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100mL로 한다. 그 후 3,000rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 5% 메타인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	Jascopack Fine Sil-NH2, Lichrosorb NH2, Zipax SAX, Vydac SAX. Partisil-10SAX, μ-Bondapak C18, μ- Bondapak/CN, Pormaphase CPS 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(254nm)
주입량	10μL
이동상	0.05M KH2PO4:아세토니트릴(60:40)
유속	1.0mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민C의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 시료 중 아스코르빈산의 함량(mg/100g)을 산출한다. L-아스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다.

Ⅲ.3.1.14-4

[계산식][eqn: rm비타민C의~함량(mg/100g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000}]

S：시험용액중의 아스코르빈산의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

Ⅲ.3.1.14-5

Ⅲ.3.2. 무기질

Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬

1) 시험용액의 조제(건식분해법)

시료(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450～550℃에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산(1+1) 또는 50% 질산마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40g 및 질산칼륨 20g을 물 100mL에 녹인 액 2～5mL로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2～5mL를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2～4mL를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 다음 염산 1～2mL 또는 각 시험법에서 지정한 용매(원자흡광광도법에 의한 직접법의 경우 Sn은 1N 염산, 그 밖의 금속은 0.5N 질산)를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 다만, 회화보조제로서 염산, 산화마그네슘, 탄산나트륨등을 사용해도 좋으나 Sn의 시험에 있어서는 질산염 또는 질산을 사용해서는 아니 되며 그 밖의 금속의 경우에도 시험조작에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다.

2) 시험조작

<제1법 원자흡광광도법>

이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자 증기화하여 생성한 기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정 등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염방식이 있다.

(제1법 직접법)

시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다음 원자흡광 광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

Ⅲ.3.2.1-1

(제2법 용매추출법)

시험용액 및 공시험용액을 각각 10～50mL 취하여 각각에 25% 구연산암모늄용액 2～10mL 및 BTB시액 2방울을 가하여 액의 색이 황색에서 연한 녹색이 될 때까지 암모니아수로 중화하고 이에 40% 황산암모늄시액 2～10mL 및 물을 가하여 일정량으로 한다.

여기에 10% DDTC용액 2～10mL를 넣고 혼합하여 수분간 방치한 다음 MIBK 10～20mL를 가하여 격렬히 흔들어 섞는다.

이를 정치하여 MIBK층을 분취하여 원자흡광광도계에 주입하여 각각의 원소측정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 따로 표준용액 및 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하고 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

<제2법 ICP법>

이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 프라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다.

(1) 표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다.

Ⅲ.3.2.1-2

Ⅲ.3.2.2 칼슘

1) 시험용액의 조제

<제1법 건식분해법>

시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10mL를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10mL를 가해 수분 가열 후 100mL 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2mL를 가해 물 약 5mL로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100mL 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제2법 습식분해법>

시료 적절량을 200～300mL 분해 플라스크에 취하여 질산 5mL를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10mL와 70% 과염소산 10mL를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수mL를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9cm의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10mL를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100mL 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

2) 시험법

<제1법 과망간산칼륨 용량법>

(1) 시약 및 시액

(가) 수산암모늄용액 : 수산암모늄[(NH4)2C2O4] 3.0g을 물을 가하여 100mL로 한다.

(나) 메틸레드지시약 : 0.1% 메틸레드알코올용액

(다) 요소 : 특급요소 70～80℃의 저온으로 건조한 다음 흡습하지 않도록 보존한다.

Ⅲ.3.2.2-1

(라) 세척용암모니아수(1→50)

(마) 황산용액(1→25)

(바) 0.02N 과망간산칼륨용액

(2) 시험조작

1) 시험용액의 조제에서 얻은 시험용액 중에 40mL(Ca 1～12mg에 대응하는 양)를 200mL의 비커에 취하여 메틸레드시액 수 방울 및 수산암모늄용액 10mL를 가한 다음 요소 2～5g을 가해 녹인다. 비커를 시계접시로 덮고 약하게 가열을 계속시킨다. 메틸레드시액을 색이 적색에서 등황색으로 (pH 약 5.6) 되었을 때 가열을 중지하고 방냉한다. 이를 2시간 이상(침전이 적을 때는 하룻밤) 실온으로 방치한다. 이 때의 액량은 약 20～30mL정도이다. 충분히 침전을 형성시킨 후 석출 전 수산칼슘 결정을 유리여과기(15AG-4)로 흡입여과하고 세척용 암모니아수 30～40mL를 수회 나누어 침전과 여지를 잘 씻는다. 세척이 끝나면 침전 생성에 사용한 비커를 앞의 유리여과기의 밑에 놓고 여과에 사용한 유리봉을 유리여과기에 넣어 미리 70℃이상으로 가온한 황산용액(1→25)을 유리여과기에 주입한다. 유리봉으로 교반하여 잠시 방치하고 수산칼슘을 용해한 다음 흡입한다. 다음 흡입을 그치고 가온한 황산용액(1→25) 약 5～7mL를 유리여과기에 주입하고 유리봉으로 교반하여 내벽을 씻고 흡입한다. 이 조작을 2회 반복한다. 비커를 여과장치에서 들어내고 65～80℃로 가열하여 0.02N 과망간산칼륨용액으로 적정한다. 공시험에 대하여도 같은 조작을 한다.

[계  산]

[eqn: rm칼슘~함량(mg/100g)={(b-a)×0.4008×F×V×100}over{시료채취량(g)}]

a：공시험에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비mL 수

b：검액에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비mL 수

F：0.02N 과망간산칼륨용액의 역가

V：시험용액의 희석배수

<제2법 원자흡광광도법>

1) 시험용액의 조제에 따라 처리한 시료를 물 대신 1N 염산용액을 사용하여 칼슘 농도 1～5μg/mL가 되도록 조정하여 2.1. 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 2) 시험조작 <제1법 원자흡광광도법>에 따라 측정한다. 이 때 사용

Ⅲ.3.2.2-2

될 1N 염산용액에는 La으로서 1,000ppm이 되도록 염화란탄(LaCl3)을 첨가하거나 또는 Sr으로서 5,000ppm이 되도록 염화스트론티움(SrCl2)을 첨가하여 사용한다.

Ⅲ.3.2.2-3

Ⅲ.3.2.3 요오드

1) 시험용액의 조제

<제1법 건식분해법>

시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10mL를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10mL를 가해 수분 가열 후 100mL 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2mL를 가해 물 약 5mL로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100mL 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제2법 습식분해법>

시료 적절량을 200～300mL 분해 플라스크에 취하여 질산 5mL를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10mL와 70% 과염소산 10mL를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수mL를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9cm의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10mL를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100mL 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<이온-선택 전극법>

2) 장치 및 기구

(1) 전극 : 요오드 전극, 기준 전극(Ag/AgCl전극)

(2) pH 측정기

(3) 마그네틱바

(4) 여과지(Whatman. 541)

Ⅲ.3.2.3-1

3) 시액

(1) 3%(v/v) 초산 용액 : 빙초산 15mL를 물로 희석하여 500mL가 되게 한다.

(2) 전극 보관 용액 : 요오드 표준원액을 물로 희석하여 0.1mL/L가 되게 한다. 요오드 전극을 이 용액에 담가서 보관하며 매주 새 용액으로 교환한다. 차광보관하며, 3개월간 보존가능하다.

(3) 이온강도 조절액(5M 질산나트륨용액, ISA:ionic strength adjuster) 질산나트륨 42.5g을 물에 녹여 100mL로 한다.

(4) 2M 질산니켈용액 : 질산니켈‧6 수화물 58.2g을 물에 녹여 100mL가 되게 한다.

4) 표준용액

(1) 요오드 표준품(요오드 12.69g/L, 0.1M) : 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 표준품을 사용한다. 실온에서 차광 보관하며, 개봉 후 6개월간 보존 가능하다.

(2) 요오드 표준원액 : 요오드 표준품 8mL를 물로 희석하여 1L가 되게 한다(101.5μg/mL). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

(3) 요오드 표준용액 Ⅰ : 요오드 표준원액 5.0mL를 물로 희석하여 500mL가 되게 한다(1μg/mL). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

(4) 요오드 표준용액 Ⅱ : 요오드 표준용액 I를 물로 10배 희석한다. 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다(0.1μg/mL).

(5) 기지의 첨가 표준용액 : 요오드 표준원액 Ⓑ 10.0mL를 물로 희석하여 1L가 되게 한다. 이 액 100mL에 이온강도조절액(ISA), 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0mL씩 첨가한 후 잘 혼합한다. 사용시 조제한다.

5) 시험용액 조제

시료 100mL(분말의 경우 10% 수용액)를 250mL 메스플라스크에 넣고 3% 초산용액 10mL를 가한 후 물로 정용한다. 이 액을 여과하고 처음 10mL는 버린다.

6) 시험조작

(1) 전극 기울기 체크： 전극을 요오드 표준용액 Ⅱ 100mL에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0mL씩 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E1값을 측정한다.

전극을 물로 씻고 건조시킨 후 요오드 표준용액 Ⅰ 100mL에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0mL씩을 가하고, 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E2 값을 측정한다. 전극을 물로 씻고 건조시킨다. 전극의 기울기(S)는 E2-E1로 계산된다. 매 4시간마다 기울기를 측정하며, 직전에 측정한 기울기를 사용하여 요오드 함량을 계산한다.

Ⅲ.3.2.3-2

(2) 측정 : 시험용액 100.0mL를 비커에 넣고 마그네틱바로 저어주면서 ISA, 2M 질산니켈 용액, 진한 질산을 각각 1.0mL씩 가하고 전극을 담근 후 약 2분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E3 값을 측정한다. 이 액에 즉시 기지의 첨가 표준용액 10.0mL를 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때, E4 값을 측정한다.

[계  산]

요오드 함량(μg/100g) ＝ Q × 0.9854 × V × 100

Q ＝ 0.0885/{antilog[(E4-E3)/S]-0.912}

0.9854：기지의 첨가 표준용액의 요오드 농도(μg/mL)

V : 희석 배수

0.0885 : 표준용액 첨가 mL수/(표준용액 첨가 전 총 mL수＋표준용액 첨가 mL수)＝10/(103+10)

0.912 : 표준용액 첨가 전 총 mL수/(표준용액 첨가 전 총 mL수＋표준용액 첨가 mL수)＝103/(103＋10)

S : E2-E1

Ⅲ.3.2.3-3

Ⅲ.3.2.4 철

1) 시험용액의 조제

<제1법 건식분해법>

시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10mL를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10mL를 가해 수분 가열 후 100mL 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2mL를 가해 물 약 5mL로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100mL 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제2법 습식분해법>

시료 적절량을 200～300mL 분해 플라스크에 취하여 질산 5mL를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10mL와 70% 과염소산 10mL를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수mL를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9cm의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10mL를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100mL 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제1법 올쏘 페난트로린 비색법>

2) 시액

(1) 페난트로린용액 : 올쏘 페난트로린 염산염(C12H8N2‧HCl‧H2O) 0.5g을 물을 가하여 200mL로 하여 냉소에 보존한다.

(2) 하이드로퀴논용액：하이드로퀴논(C2H6O2)을 물에 녹여 쓰며 사용할 때마다 새로 만들어야 한다(희석배수 1%).

(3) 구연산나트륨용액：특급 구연산나트륨(Na3C6H5O7‧H2O) 50g을 물을 가하여 200mL로 한다. 필요하면 여과하여 냉소에 보존한다.

Ⅲ.3.2.4-1

(4) 브롬페놀블루시액：브롬페놀블루 0.1g을 0.05N 수산화나트륨액 3mLl로 녹이고 물을 가하여 250mLl로 한다.

(5) 철표준액：특급 황산제1철 암모늄[Fe(NH4)2(SO4)2‧6H2O] 0.7021g을 약 1%의 염산에 용해하여 1L로 한다. 이 액 1L중에는 철 0.1mg을 함유한다.

3) 시험조작

시험용액의 조제에서 얻은 시험용액중의 10mL를 피펫으로 25mL의 메스플라스크에 취하고 같은 10mL를 시험관(혹은 작은 삼각플라스크)에 취한다.

후자는 pH조절용 대조액으로 쓴다. 시험관쪽에는 브롬페놀블루시액 4방울을 가하고 25mL 메스플라스크 쪽에는 하이드로퀴논용액 1mL와 또 페난트로린용액 2mL를 피펫으로 가한다. 구연산나트륨용액을 뷰렛 또는 5mL 메스피펫으로 취하여 시험관의 액중에 적가하고 액의 pH가 3.5가 되면 지시액을 가한 액의 색이 황색에서 황록색으로 변하는 점에서 적가를 그치고 이때까지 소요된 구연산나트륨용액의 mL수를 기록한다.

이와 같은 용량의 구연산나트륨용액을 메스플라스크쪽에 가하여 물로 25mL의 표선까지 희석하여 20℃이상의 온도에서 1시간이상 방치한다. 하룻밤 방치해도 무방하다.

일단, 완전히 발색된 액은 적어도 48시간은 퇴색하지 않는다. 이를 분광광도계(Spectrophotometer)에서는 510nm의 파장에서, 광전비색계에서는 녹색필터를 이용해서 발색액의 흡광도를 측정하여 비흡광계수를 구한다. 이것을 미리 작성하여 놓은 검량선과 대조하여 철의 양을 구한다.

검량선은 다음과 같이 하여 만든다. 즉, 철표준액을 물로 정확히 10배로 희석한다. 1, 2, 5, 10, 15 및 20mL를 각각 1조씩 25mL의 메스플라스크와 시험관 또는 작은 삼각플라스크에 취한다. 10mL 안되는 것은 물을 추가하여 거의 10mL로 만든다. 상기 발색조작과 동일하게 pH 3.5에서 각 메스플라스크에서 발색시켜 흡광도를 측정하며, 농도 흡광곡선을 작성하고 시료중의 철 함량은 다음 식에 따라 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm철~함량(mg/100g)=S×{a}over{시료채취량(g)}×100]

S：시험용액중의 철의 양(mg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

<제2법 원자흡광광도법>

Ⅲ.3.2.4-2

1) 시험용액의 조제에 따라 처리한 시료를 물 대신 1N 염산용액을 사용하여 철 농도 1～4μg/mL가 되도록 조정하여 Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 2) 시험조작 <제1법 원자흡광광도법> (1) 직접법에 따라 측정한다.

Ⅲ.3.2.4-3

Ⅲ.3.2.5 아연

1) 시험용액의 조제

<제1법 건식분해법>

시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10mL를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10mL를 가해 수분 가열 후 100mL 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2mL를 가해 물 약 5mL로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100mL 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제2법 습식분해법>

시료 적절량을 200～300mL 분해 플라스크에 취하여 질산 5mL를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10mL와 70% 과염소산 10mL를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수mL를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9cm의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10mL를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100mL 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

2) 시험조작

1) 시험용액 <제1법 건식분해법>에 따 라 처리한 시료를 0.5N 질산용액으로 칼륨 농도 1~10μg/mL되게 조정하여 Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 2) 시험조작 <제1법 원자흡광광도법>에 따라 측정한다.

Ⅲ.3.2.5

Ⅲ.3.2.6 칼륨

1) 시험용액의 조제

<제1법 건식분해법>

시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1→2) 약 10mL를 가해 수욕상에서 완전 증발 건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10mL를 가해 수분 가열 후 100mL 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2mL를 가해 물 약 5mL로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100mL 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

<제2법 습식분해법>

시료 적절량을 200～300mL 분해 플라스크에 취하여 질산 5mL를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10mL와 70% 과염소산 10mL를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수mL를 가하여 가열한다. 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9cm의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10mL를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100mL 메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100mL로 하여 시험용액으로 한다.

2) 시험법

1) 시험용액의 조제에 따라 얻어진 시험용액을 칼륨농도 1～10μg/mL되게 조정하여 Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 2) 시험조작 <제1법 원자흡광광도법>에 따라 측정한다.

Ⅲ.3.2.6

Ⅲ.3.3. 아미노산 및 단백질류

Ⅲ.3.3.1 조단백질

<세미마이크로 킬달법>

1) 장치 및 기구

그림 1과 같은 장치를 쓴다. 전체가 경질유리를 사용하여야 하며, 접속부위는 갈아 맞춘 것으로 하여도 좋다. 장치에 쓰는 고무는 수산화나트륨시액 속에서 10～30분간 끓이고, 다음에 물에서 30～60분간 끓인 다음 물로 충분히 씻어서 쓴다. 다만 동 시험법의 원리를 이용한 기타의 장치 또는 자동‧반자동기기를 사용할 수 있다.

그림 1. 세미마이크로킬달장치

A : 킬달플라스크

B  : 수증기 발생기로서 황산 2～3방울을 넣은 물을 넣고 갑자기 끓는 것을 피하기 위하여 비등석을 넣는다.

C : 알칼리용액을 넣는 깔때기

D : 수증기 유도관

E : 내용물이 튀어 올라오는 것을 막는다.

F : 작은 구멍(관의 안지름과 거의 같다.)

G, H : 갈아 맞춘 접속부위

I  : 냉각기(바깥지름 200mm, 안지름 350mm, 아래 끝은 약 5mm)

J  : 흡수용 플라스크

2) 시약 및 시액 조제

(1) 분해 촉진제 : CuSO4 : K2SO4(1：4)

(2) 부런스위크(Brunswik)시액 : 메틸레드 0.2g 및 메틸렌블루 0.1g을 에탄올 300mL에 녹여서 여과하여 사용하고 갈색병에 보존한다.

Ⅲ.3.3.1-1

3) 시험용액 조제

(1) 통상적으로 질소(N) 함량이 2～3mg에 해당하는 양의 시료를 정밀히 취하여 킬달플라스크에 넣고 여기에 분해 촉진제 약 0.5g을 넣은 후 플라스크 내벽을 따라 황산 3～5mL를 넣은 다음 플라스크를 흔들어 주면서 30% 과산화수소 1mL를 조금씩 조심하여 넣는다. 플라스크를 금망상에서 천천히 가열하고 시료의 탄화물이 보이지 않을 때까지 온도를 높여 끓이고 분해액이 투명한 담청색이 되면 다시 1～2시간 가열을 계속한다. 분해액을 냉각시킨 후 물 20mL를 주의하여 가한 후 이 플라스크를 증류장치에 연결한다.

(2) 비교적 많은 시료(예： 건조 된 제품류)를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량이 약 20～30mg에 해당하는 양의 시료를 정밀히 취하여 250～300mL 킬달분해플라스크에 넣고 이에 분해 촉진제 1～2g 및 황산 20～30mL를 가하여 가열분해 시킨다. 분해액을 냉각시킨 후 물 약 100mL를 가하고 200mL 메스플라스크에 옮겨서 냉각 후 물을 가하여 전량을 200mL로 채워 그 20mL를 세미마이크로 킬달분해플라스크에 취하여 증류장치에 연결한다.

(3) 질소(N)함량이 적어서 다량의 시료를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량 2～3mg에 해당되는 시료를 정밀히 취하여 앞의 (2)의 조작과 같이 가열 분해하고 냉각 후 물 20mL를 주의하여 가하고 킬달분해플라스크를 증류장치에 연결한다.

4) 시험조작

(1) 증류 및 적정

증류장치의 흡수플라스크에 0.05N 황산 10.0mL를 취하여 이에 부런스위크시액 2～3방울을 떨어뜨려서 냉각기의 끝부분을 액면 밑에 담그고 작은 깔때기로부터 30% 수산화나트륨용액 25mL를 가한다. 다음에 수증기 발생기로부터 수증기증류를 하여 증류액 약 100mL를 받은 후 냉각기의 끝을 액면에서 조금 떼어 다시 유액 수 mL를 유취하여 다시 냉각기의 끝을 소량의 물로 수기 내에 씻어 넣는다. 수기 내에 들어 있는 유액을 0.05N 수산화나트륨액으로 부런스위크시액이 녹색으로 변할 때까지 적정한다. 따로 같은 방법으로 공시험을 한다.

0.05N 황산 1mL = 0.7003mg N

(2) 정량시험

시료의 분해액을 전부 사용해서 적정했을 때의 식이므로 분해액의 일부를 사용할 때에는 그 계수를 곱한다. 여기서 얻은 질소량에 질소계수(6.25)를 곱하여 조단백질의 양으로 한다.

Ⅲ.3.3.1-2

N(%)	=	0.7003	×	(a -b)	×	100
						시료채취량(mg)

[계산식]

N : 질소

a : 공시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 mL수

b : 본시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 mL수

0.05N 황산 1mL ＝ 0.7003mg N

[계산식]

조단백질(%) = N(%)×질소계수(6.25)

Ⅲ.3.3.1-3

Ⅲ.3.3.2 아미노산

1) 아미노산 자동분석기에 의한 정성 및 정량

(1) 시약

(가) 6N 염산：염산(정밀 분석용 염산 20%)을 사용한다.

(나) 과개미산용액：30% 과산화수소(특), 88% 개미산(특)을 1：9의 비율로 혼합하여 실온에서 한시간 방치 후 0℃로 냉각한다. 사용 시 제조한다.

(다) 4.2N 수산화나트륨용액：사용 시 제조한다.

(라) 가용성전분：아세톤으로 세척‧건조하여 사용한다.

(마) 16%(w/v)트리클로로초산용액：50%(w/v)트리클로로초산을 사용시 희석하여 사용한다. 50% 트리클로로초산용액은 냉암소에 보관한다.

(2) 표준용액의 조제

아미노산 표준용액을 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산용액으로 적당히 희석하여 사용한다.

(3) 장치

(가) 단백질 가수분해 분해장치(그림 2)

(나) 정온가열로：100~150℃의 온도범위에서 ±1℃로 제어 가능한 것이어야 한다.

(4) 시험용액의 조제

(가) 단백질구성 아미노산

시료는 동결건조를 한 후 분말로 하여 균질화한 것을 분석에 사용한다. 또 지방함량이 높은 시료는 동결건조후 에테르에 침출, 탈지하여 사용한다.

① 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액

단백질로서 약 10mg을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣는다. 0.05%(w/v)2-멀캅토에탄올(C2H6SO)을 함유한 6N 염산을 단백질양에 대하여 약 1,000배량 즉, 10mL를 가한다.

드라이아이스‧에탄올로 동결한 후 탈기장치에 장착하여 융해, 동결을 수회 반복하며 충분히 탈기한다. 봉관하여, 정온가열로에서 110℃±1℃, 22~24시간 가수분해한다. 가수분해 종료 후 봉관을 절단하여 즉시 감압하여 40℃에서 농축 건조하여 염산을 제거한다. 염산을 최대한 제거하기 위하여 잔사에 물을 가해 다시 농축 건조한다. 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산용액으로 일정량으로 만들어 시험용액으로 한다. 침전이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한다.

Ⅲ.3.3.2-1

② 시스틴 정량용 시험용액

단백질 약 10mg 함유하는 시료를 정밀히 달아 미리 0℃로 냉각시켜 놓은 과개미산 용액 10mL를 가하여 단백질이 가용성인 경우 0℃에서 4시간, 불용성인 경우 0℃에서 하루밤 방치한다. 방치 후 공기를 흡입하고 소량의 물을 가해 동결 건조한다. 잔사를 0.05%(v/v) 2 머캅토에탄올 함유의 6N 염산 10mL를 사용하여 가수분해 시험관으로 옮긴다. 동결한 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기한 후 봉관하여 110±1℃에서 18시간 분해한다. 이하 방법은 ① 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액에 따라 시험용액을 조제한다.

A：드라이아이스‧에탄올

B：가수분해용 시험관

C：진공코오드

D：트랩

E：마노메타

F：펌프

그림 2. 단백질 가수분해장치

③ 트립토판 정량용 시험용액

단백질 10mg을 함유하는 시료를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣고, 가용성전분 100mg을 가한 다음 4.2N 수산화나트륨용액 3ml를 가한다. 동결시킨 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기하고 밀봉하여 135±1℃에서 22시간 가수분해한다. 가수분해 후 봉관을 잘라 열고 6N 염산으로 중화하여 0.2N 구연산나트륨완충액(pH 4.25)으로 일정량을 만들어 시험용액으로 한다. 용액이 탁한 경우 30,000~40,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취한다.

(나) 유리 아미노산

① 물에 의한 추출

고체 또는 페이스트상의 시료에 적용된다.

Ⅲ.3.3.2-2

균질한 시료 약 1g을 정밀히 달아 약 10배량을 물을 가해 비등 수욕상에서 가열하여 응고시킨 다음 여과하여 물층을 취한다. 잔사는 2~3회 소량의 물로 세정하고, 세액은 앞서의 물과 합한다. 지방이 있는 경우에는 에테르로 추출하여 제거한다.

물층을 감압하에 농축 건조하여 얻은 잔사를 0.2N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02N 염산으로 용해하여 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 불용물질이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과한다.

② 트리클로로초산법

액체상의 시료에 적용한다.

검체 1.0~3.0mL를 시험관에 달아 16% 트리클로로초산용액을 동 용량 가하여 15분간 진탕한다. 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 시험용액으로 한다.

(5) 시험조작

(가) 아미노산 자동분석기 조건

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다. 정성분석을 위하여 표준물질과 시험용액을 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간이 일치하는 성분을 비교 동정한다. 또한 정량분석의 경우에는 미리 구해 놓은  농도의 아미노산표준의 피크 면적과 함량으로부터 검량 곡선을 작성한 다음 시험용액으로부터 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.

(나) 고속액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

상기 (가) 아미노산자동분석기에 의한 정량 및 정성에서와 같이 시험용액을 준비한다. 각각의 고속액체크로마토그래피에서 주어진 조건에 맞추어 유도체를 만든 후 검체와 동일 조건하에 조제한 아미노산표준용액의 피크면적과 함량으로부터 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.

Ⅲ.3.3.2-3

Ⅲ.3.4. 당 및 탄수화물류

Ⅲ.3.4.1 글루코사민

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

글루코사민염산염(또는 글루코사민황산염) 표준품 0.5g을 100mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 채운 것을 표준원액으로 한다. 표준원액을 50%아세토니트릴로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액의 조제

시료 약 2.0g을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물 50mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 정용한다. 이를 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	길이 250mm, 안지름 4.6mm의 NH2-60칼럼, 또는 이와 동등한 것
검출기	시차굴절계(RI)
칼럼온도	40℃
이동상	물 : 아세토니트릴(25:75)
유속	0.8mL/min
주입량	10μL

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10μL를 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 글루코사민염산염(또는 글루코사민황산염)의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 글루코사민염산염(또는 글루코사민황산염)의 함량(g/100g)을 산출한다.

Ⅲ.3.4.1-1

[계산식]

[eqn: rm 글루코사민염산염(황산염)~함량(g/100g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000,000}]

S : 시험용액중의 글루코사민염산염(또는 글루코사민황산염)의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.4.1-2

Ⅲ.3.4.2 N-아세틸글루코사민

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

N-아세틸글루코사민 표준품 0.2g을 정밀히 취하여 100mL용 메스플라스크에 물 50mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 정용한다. 이를 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

3) 시험용액의 조제

시료 0.2g을 정밀히 취하여 100mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 채운다. 이를 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	길이 250mm, 안지름 4.6mm의 NH2-60칼럼 또는 이와 동등한 것
검출기	시차굴절계(RI)
칼럼온도	35~40℃
이동상	물 : 아세토니트릴(25:75)
유속	0.8mL/min
주입량	20μL

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20μL 씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 N-아세틸글루코사민의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 N-아세틸글루코사민의 함량(g/100g)을 산출한다.

Ⅲ.3.4.2-1

[계산식]

[eqn: rm N-아세틸글루코사민~함량(g/100g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000,000}]

S : 시험용액중의 N-아세틸글루코사민의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.4.2-2

Ⅲ.3.4.3 베타글루칸

1) 시약 및 시액조제

(1) 에탄올용액

(2) 내열성 α-아밀라아제용액 : Sigma사 Cat. No. A3306 또는 Termamyl 300L, Novo Cat, No. 361-6282 또는 이와 동등한 것

(3) 셀룰라아제 : Sigma사 Cat. No. C8546 또는 이와 동등한 것

(4) 프로테아제 : Sigma사 Cat. No. P3910 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존) MES/TRIS 완충액으로 50mg/mL되게 조제한다. 사용 시 조제한다.

(5) 아밀로글루코시다제용액 : Sigma사 Cat. No. AMG A9913 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존)

(6) 0.1N 수산화나트륨용액

(7) 0.1N 염산용액

(8) 5% 페놀용액 : 페놀 5g을 취하여 물을 가하여 100mL로 한다.

2) 시료의 전처리 및 시험용액의 조제

(1) 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다.

(2) 시료(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올용액으로 시료 1g당 10mL씩으로 세척한다) 약2~10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100mL을 가한다. 여기에 아밀라아제(20unit) 약 40~200mg을 취하여 넣고 0.1N NaOH로 pH 6.9로 한 후 20℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 이에 0.1N HCl로 pH 5.0으로 하고 셀룰라아제(50unit)를 넣고 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시키고, 프로테아제(10unit) 약 15~80mg을 넣고 0.1N NaOH로 pH 7.5로 한 후 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 이에 아밀로글루코시다제(70unit) 약 20~100mg을 넣고 0.1N HCl로 pH 4.8로 한 후 60℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 효소분해물에 95% 에탄올 400mL을 가하여 4℃에서 12시간 동안 침전시킨 후, 원심분리(10,000rpm, 10분)하여 시료의 침전물을 취하고, 다시 80% 에탄올 500mL을 침전물에 가하여 4℃에서 1시간 동안 침전시킨 후, 원심분리(10,000rpm, 10분)를 한다. 원심분리된 침전물에 물 20mL를 가한 후 침전물을 호모게나이저를 이용하여 균질화하고 물로 100mL가 되도록 한다. 이를 적정농도가 되도록 희석한 것을 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.4.3-1

3) 표준용액의 조제

글루코오스표준품을 증류수에 녹여 표준원액을 만들고(1mg/mL) 표준원액을 증류수로 희석하여 글루코오스 표준용액 0, 25, 50, 75, 100(μg/mL)농도별 표준용액을 만든다.

4) 시험조작

각각의 25mL 시험관에 5% 페놀용액 1mL를 넣고 농도별 표준용액은 각각 1mL를 가하고, 시험용액은 0.1mL와 증류수 0.9mL을 가한 후 10초간 잘 흔들어 섞어 황산 5mL씩을 가하여 혼합하고 20분 동안 실온 반응시켜 470nm에서 측정한다.

[계산식]

[eqn: rm베타글루칸함량(mg/g)=S×{a} over {시료채취량}×{10}over{1,000}× 0.9]

S  ：시험용액중의 글루코오스 농도(μg/mL)

a ：시험용액의 전량(mL)

0.9 : 베타글루칸 전환계수(162/180)

Ⅲ.3.4.3-2

Ⅲ.3.4.4 식이섬유

Ⅲ.3.4.4-1

총식이섬유, 물불용성식이섬유, 수용성식이섬유의 시험에 적용한다. 단, 수용성식이섬유 중 난소화성말토덱스트린 등 일부 수용성 섬유소는 제2법으로 시험한다.

<제1법>

1) 장치

(1) 기공 40～60μm, 용량 60mL의 유리여과기 : 525℃에서 한 시간 처리한 후 식혀 물로 세척한 후 상온 건조하여 셀라이트 0.5g을 가한 후 130℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에 옮겨 보관한다.

(2) 감압펌프：역류방지장치가 부착된 것

(3) 감압건조기 또는 상압가열건조기

(4) 데시케이터

(5) 회화로

(6) 수욕조

(7) pH 측정기 : 표준완충액 pH 4, pH 7, pH 10으로 표준화 시킨 것

2) 시약 및 시액조제

(1) 에탄올용액

(가) 85%용액-95%에탄올 895mL에 물을 가하여 1,000mL로 한다.

(나) 78%용액-95%에탄올 821mL에 물을 가하여 1,000mL로 한다.

(2) 내열성 α-아밀라아제용액 : Sigma사 Cat. No. A3306 또는 Termamyl 300L, Novo Cat, No. 361-6282 또는 이와 동등한 것

(3) 프로테아제 : Sigma사 Cat. No. P3910 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존) MES/TRIS 완충액으로 50mg/mL되게 조제한다. 사용 시 조제한다.

(4) 아밀로글루코시다제용액 : Sigma사 Cat. No. AMG A9913 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존)

(5) 규조토(Diatomaceous earth)：산세척한 것(Sigma사 Celite 545 AW. No. C8656) 또는 이와 동등한 것

(6) 세척용액 : 액상계면활성제(International Products사의 MICRO제품 또는 이와 동등한 것), 물로 2% 용액으로 조제한다.

(7) MES : 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

(8) TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Sigma사 No. T- 1503 또는 이와 동등한 것)

(9) MES/TRIS 완충용액 : MES 19.52g과 TRIS 12.2g을 물 1.7L에 녹이고 6N 수산화나트륨용액으로 pH 8.2로 조절한 후 물을 가하여 2L로 한다. 용액의 온도가 20℃이면 pH 8.1로, 용액의 온도가 28℃이면 pH 8.3으로 조정한다(단, 0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2).

(10) 염산용액(0.561N) : 6N염산 93.5mL에 물을 가하여 1,000mL로 한다.

3) 시험용액 조제

(1) 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다.

(2) 미리 고운분말로 한 시료(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올용액으로 시료 1g당 10mL씩으로 세척한다) 1.0±0.005g 2개를 취하여 (M1, M2) 400mL의 키가 큰 비커에 취하고, 이에 MES/TRIS용액 40mL씩을 가하여 마그네틱 교반으로 충분히 분산시킨다. 이에 내열성 α-아밀라아제용액 50μL를 가하고 서서히 저어 혼합하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후, 95～100℃의 수욕에서 15분간 계속 교반한다.

(3) 계속해서 95℃에서 25분간 유지한다. 반응이 끝난 후 수욕조에서 꺼내어 60℃로 식히고 뚜껑을 열어 비커의 벽 또는 바닥에 내용물이 부착되어 있으면 시약스푼으로 긁어 분산시키고 물 10mL로 스푼과 기벽을 씻는다.

(4) 각각의 비커에 프로테아제용액 100μL씩 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60±1℃에서 계속 교반하면서 30분간 항온 시킨다. 뚜껑을 제거하고 0.561N 염산용액 5mL를 가하고 흔들어 혼합하고 60℃에서 pH를 4.0～4.7로 조정한다. 이에 아밀로글루코시다제용액 300μL를 넣고 흔들어 섞은 후 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60℃에서 30분간 교반을 유지하며 항온 시켜 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 총식이섬유의 정량

(가) 시험용액 각각에 60℃의 95% 에탄올 225mL를 가한다. 에탄올과 시험용액의 용량비율은 4:1로 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 실온에 1시간 방치하여 침전시킨다. 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78% 에탄올 15mL를 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 한다. 이에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어 넣어 준다.

(나) 잔사는 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15mL씩 2회 씻는다. 아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다.

Ⅲ.3.4.4-2

(다) 하나의 여과기 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 하고, 또 다른 하나의 여과기 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분량을 구한다. 시료를 제외한 공시험을 하여 (4)에 따라 총식이섬유의 함량을 구한다.

(2) 물불용성식이섬유의 정량

(가) 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 물 3mL를 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층을 고르게 한다. 이에 검액을 여과하고 잔류물은 70℃의 물 10mL로 2회 씻는다. 여액 및 세척액은 합하여 600mL비커에 모아 (3) 수용성식이섬유 정량용으로 한다.

(나) 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각 15mL씩 2회 세척한다. 여과기 잔사를 (1) 총식이섬유의 정량의 “…105℃의 건조기에서…” 이하에 따라 시험한다.

(3) 수용성식이섬유의 정량

앞의 (2)에서 얻어진 여액 및 세척액에 60℃의 95% 에탄올을 4배량 가하거나 여액을 물로 80g으로 한 후 60℃의 95% 에탄올 320mL를 가한다. 이를 한 시간 방치하여 침전물을 형성시킨다.

이를 (1) 총식이섬유의 정량에 따라 시험하고 (4)에 따라 수용성식이섬유의 함량을 구한다.

(4) 함량계산

(가) 공시험값 B(mg) ＝ 공시험평균잔사무게(mg)-PB-AB

PB : 공시험 단백질량(mg)

AB : 공시험 회분량(mg)

(나) [eqn: rm식이섬유~함량(%)={시료의~평균잔사무게(mg)-P-A-B}over{시료의~평균~무게(mg)}×100]

P  : 단백질량(mg)

A : 회분량(mg)

B  : 공시험값(mg)

총식이섬유함량은 (1) 총식이섬유의 정량에 따라 구하거나 (2) 물불용성식이섬유의 정량 및 (3) 수용성식이섬유의 정량에 따라 구하여 얻어진 값을 합하여 구할 수 있다.

Ⅲ.3.4.4-3

<제2법>

본 시험법은 주로 수용성 섬유소(삼당류 이상)를 함유한 경우에 적용한다.

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 시약

(1) 내열성 α-아밀라아제용액 : Termamyl 용액(Novo사 No. 120L, 냉장보존)

(2) 프로테아제 : Sigma사 No. A-3910(냉장보존)

(3) 아밀로글루코시다아제 : Sigma사 No. A-9913(냉장보존)

(4) 글루코오스정량용시약 : 교화 메덱스사 제품 데타미나-GL-E

(5) 이온교환수지 : Amberlite IRA-68(OH형), Amberlite 200(H형)

3) 시험용액 조제

(1) 효소처리액의 조제

시료 1g(필요한 경우 에테르 등으로 탈지한다)을 200mL 비커에 정확히 취하고 증류수 50mL를 가하여 용해한 후, 0.1N 수산화 나트륨용액으로 pH 6.0으로 조정한다. 여기에 텀아밀용액 0.1mL를 가하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 끓는 수욕에서 30분간 놓아둔다(5분 간격으로 교반). 실온에서 냉각 후 0.1N 수산화나트륨용액으로 pH 7.5±0.1로 조정한다. 다음 프로테아제 5mg을 가하고 다시 알루미늄박으로 뚜껑을 해서 60℃수용액에서 30분간 진탕한다.

실온으로 냉각한 후 0.1N 염산용액으로 pH 4.5± 0.2로 조정한다. 여기에 아밀로글루코시다아제 0.1mL를 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 60℃ 수용액 중에서 30분간 진탕한 후 수용액 중에서 10분간 가열하여 효소를 실활 시킨다. 실온에서 냉각하고 100mL용 메스플라스크에 옮겨 물로 정용한 액을 효소처리액으로 한다.

(2) 효소처리액중의 포도당 정량

(제1법)

데타미나-GL-E로써 효소처리액중의 포도당량을 측정한다.

(제2법 고속액체크로마토그래프의 정량법)

(가) 표준용액

과당, 포도당, 설탕의 표준품을 각각 100mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50mL로 녹인 후 아세토니트릴로 100mL로 채운다.

(나) 시험용액의 조제

시료 약 5g을 50mL 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50mL까지 채운다. 이를 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.4.4-4

(다) 시험조작

① 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	μ-BondapaK 또는 이와 동등한 것
검출기	시차굴절계(RI)
칼럼온도	실온
주입량	10μL
이동상	물 : 아세토니트릴(17 : 83)
유속	1.0mL/min

② 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10μL씩 주입하여 얻은 피크 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 당질의 농도 (μg/mL)를 구하고 다음식에 의해 검체 중 당의 함량(mg/100g)을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 당함량(mg/g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}× 100over1,000]

S : 시험용액 중 당질의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

(3) 시험용액의 조제

효소처리액 50mL를 취하여 다음과 같은 조건을 갖춘 이온교환수지칼럼에 SV1.0으로 통과시켜 탈염한 후 칼럼용출액 200mL를 감압농축하여 20mL용 메스플라스크에 옮기고 정용한다. 이 액을 0.20μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

주) SV 1.0은 공간속도로 충전제부피(cm3)로 시간단위당 용출액을 나누어 준 값

[탈염조건]

항목	조건
이온교환수지	Amberlite IRA-98(OH형) Amberlite-200(H형)을 1：1의 비율로 혼합한 것
칼럼크기	유리관, 20mm×300mm
용리액	물
수지량	50mL

Ⅲ.3.4.4-5

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	Ion-exchange column (Ultron PS-80N, Aminex HPX-87C, Aminex HPX-87P, Sugar-PaK 1 또는 이와 동등한 것)
검출기	시차굴절계(RI)
이동상	물
유속	0.4mL/min
주입량	20μL

(2) 정량시험

앞의 3) 시험용액의 조제 (2)에 의하여 측정된 효소처리액 중의 3) 시험용액의 조제 (3)의 시험용액 20μL를 주입하여 얻은 포도당과 난소화부의 머무름 시간과 피크 면적을 이용하여 다음 [계산식 1]로 효소처리액중의 난소화부 중량을 구하고 [계산식 2]로 난소화부 중량(식이섬유소)을 산출한다.

[계산식 1]

[eqn: rm난소화부~중량(mg)={난소화부의~피크면적}over{포도당의~피크면적}×{포도당중량(mg)}]

[계산식 2]

[eqn: rm난소화부~중량(%)={난소화부~중량(mg)}over{시료~채취량(mg)}×100]

Ⅲ.3.4.4-6

Ⅲ.3.4.5 총 다당체

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시료의 전처리

(1) 알로에겔분말

시료 0.5~10g을 정밀히 달아 증류수로 100mL가 되게 용해시킨다. 불용성물질이 있는 경우 원심분리하여 상등액을 취한다.(알로에 생겔의 경우 분쇄한 시료 약 200g을 정밀히 달아 원심분리(8000rpm, 30min) 후 상등액을 취한다.) 용해액을 투석용튜브(분자량 3,500)에 옮긴다.

(2) 알로에겔 액상제품

시료 약 10g을 정밀히 달아 증류수로 10mL이 되게 채운 후 용해시킨다. 불용성물질이 있는 경우 원심분리 후 상등액만을 취하여 투석용 튜브에 옮긴다.

(3) 알로에겔 정제

곱게 갈은 시료 약 1~2g을 정밀히 달아 증류수로 10mL이 되게 채운 후 용해시킨다. 불용성물질이 있는 경우 원심분리 후 상등액만을 취하여 투석용 튜브에 옮긴다.

(4) 알로에겔 캅셀

시료 700~800mg을 취하여 증류수로 10mL이 되게 채운 후 용해시킨 후 헥산을 이용하여 지용성 성분을 제거한다. 불용성물질이 있는 경우 원심분리 후 상등액만을 취하여 투석용 튜브에 옮긴다.

3) 표준용액의 조제

만노오스표준품을 증류수에 녹여 표준원액을 만들고(1mg/mL) 표준원액을 증류수로 희석하여 농도별 표준용액을 만든다.

4) 시험용액의 조제

전처리한 시료를 투석용 튜브(분자량 3,500)에 넣고 튜브의 끝을 밀봉한다. 튜브를 증류수에 담그고 24시간동안 투석 후 투석된 시료전체의 부피(B)를 측정하고 이중 일부를 총다당체 함량 측정을 위한 시험용액으로 한다.

5) 시험조작

표준용액 및 시험용액 200uL를 각각 시험관에 넣고 5% 페놀용액 1mL씩을 넣어 혼합한다. 혼합액에 진한 황산 5mL을 넣어 20분간 반응시킨 후 490nm흡광도를 측정한다. 이 때 대조액은 시험용액 대신 증류수를 사용하여 동일한 조작을 한다.

Ⅲ.3.4.5-1

[계산식]

[eqn: rm총~다당체~함량(%) =S×{{a×b}} over 시료채취량(mg)×{100 } over {1,000 }]

S∶검량선으로부터 얻은 시료의 농도(μg/mL)

a : 투석된 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.4.5-2

Ⅲ.3.4.6 콘드로이친황산

<제1법 흡광도법>

1) 시액조제

(1) 글루쿠론산 표준용액 : δ-글루쿠로노락톤(표준품) 약 0.04g을 정확히 달아 물을 가해 용해하여 100mL로 한다. 이 액 1mL를 정확히 취하여 물을 가해 20mL로 한다.

(2) 카바졸시액 : 카바졸(C12H9N, 1급) 0.125g에 무수에탄올 100mL를 가해 용해한다(냉암소에 보관).

(3) 붕산나트륨황산시액 : 붕산나트륨(특급) 1.0g에 정밀분석용 황산을 가해 200mL로 한다.

2) 시험조작

시료 약 10g을 수분이 흡수되지 않도록 빨리 분쇄 혼합하고 0.3g을 정밀히 달아 물을 가하여 혼합한 것을 정확히 100mL로 한다. 이 액 4mL를 정확히 취하여 물을 가해 정확히 20mL로 하고 정량분석용 여지(5종 C)를 사용하여 여과한 것을 검액으로 한다.

별도 두 개의 비색관에 붕산나트륨 황산시액 5mL씩을 정밀히 달아 취하여 얼음물로 충분히 냉각한다.

각각의 검액과 표준용액을 정확히 1mL씩을 취해 시액위에 주의하여 가하고 냉각하면서 혼합하고, 수욕상에서 10분간 가열한 후 즉시 얼음물로 냉각한다. 각각에 카바졸시액 0.2mL를 정확히 가하여 혼합하고 수욕상에서 15분간 가열하고 얼음물로 실온까지 냉각한다. 이들의 액에 대하여 물 1.0mL를 사용하여 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여, 파장 530nm에서 흡광도를 분광광도계로 측정하고 다음 식에 따라 콘드로이친황산의 함량을 구한다.

[계산식]

(1) 콘드로이친황산의 함량 = 글루쿠론산(%) × 2.593

(2) [eqn: 글루쿠론산(%)=rm {{{검액의흡광도}over{표준용액의" "흡광도}×"표준품(g)"×1.1023} over { 검체채취량(g)}}×100]

* 2.593 : 콘드로이친황산의 분자량/글루쿠론산의 분자량

** 1.1023 : 글루쿠론산의 분자량/δ-글루쿠로노락톤의 분자량

Ⅲ.3.4.6-1

<제2법 고속액체크로마토그래프법>

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

콘드로이친황산 나트륨염 표준품 일정량을 정밀히 취하여 물에 녹이고 (1.0mg/mL), 이 용액을 물로 적당히 희석하여 각각의 농도용액을 만든 후, 0.45μm로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

3) 시험용액의 조제

콘드로이친황산 약 100mg에 해당하는 시료를 정밀히 취하여 100mL용 메스플라스크에 물을 가하여 100mL까지 정용한다. 이를 잘 흔들어 녹인 후 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	길이 250mm, 안지름 8.0mm의 size exclusion gel (Shodex KW801, KW804)칼럼, 또는 이와 동등한 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(210nm)
칼럼온도	30℃
이동상	아세토니트릴 : 10mM Phosphate buffer(pH6.0) (2:98 v/v)
유속	1.0mL/min
주입량	20μL

(2) 정량시험

표준용액을 20μL 씩 주입하여 얻은 피크의 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액을 20μL 주입하여 얻은 피크의 면적을 구하여 농도     (μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 의 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 콘드로이친황산나트륨함량(g/100g)=S×{a×b}over{검체의채취량(g)}×{1 } over {10,000 }]

S : 시험용액중의 콘드로이친황산 나트륨 농도(μg/mL),

a : 시험용액의 전량(mL), b : 희석배수

Ⅲ.3.4.6-2

<제3법 고속액체크로마토그래프법>

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 시액

50 mM Tris-buffer (pH 8.0) : Tris[hydroxymethyl]aminomethane 6.06g과 Sodium acetate 4.92g을 각각 취하여 900mL 물에 녹인 후 pH를 8.0으로 조절한 후 1L로 정용한다.

3) 표준용액의 조제

콘드로이친황산A 나트륨염 표준품 일정량을 정밀히 취하여 물에 녹이고 (1.5mg/mL), 이 용액을 물로 적당히 희석하여 각각의 농도용액을 만든다. 각각의 농도용액 50μL에 0.001 Unit/μL 콘드로이티나아제 ABC 50μL와 50 mM Tris-buffer (pH 8.0) 400μL를 넣어 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 100℃에서 5분간 열을 가하고, 0.2μm로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

콘드로이친황산 약 50mg에 해당하는 시료를 정밀히 취하여 물50mL를 가하여 60℃에서 1시간 동안 초음파 추출하고, 100℃에서 1시간동안 환류냉각 한다. 이 용액 50μL를 취하여 0.001 Unit/μL 콘드로이티나아제 ABC 50μL와 50 mM Tris-buffer (pH 8.0) 400μL를 넣어 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 100℃에서 5분간 열을 가하고, 0.2μm로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5) 기기분석

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

Ⅲ.3.4.6-3

항목

조건

칼럼

길이 250mm, 안지름 4.6mm의 강염기성의 암모늄 음이온교환수지로 코팅된 실리카겔이 충진된(Hypercil-SAX)칼럼, 또는 이와 동등한 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출기(232nm)

칼럼온도

30℃

이동상

Distilled water(pH 3.5) : 1M-NaCl(pH 3.5) (gradient)

시간	Distilled water(pH 3.5)	1M-NaCl(pH 3.5)
0	100%	0%
5	100%	0%
15	50%	50%
20	50%	50%
21	100%	0%

유속

1.0mL/min

주입량

10μL

(2) 정량시험

표준용액을 10μL 씩 주입하여 얻은 Di-0S, Di-6S, Di-4S의 각각의 피크의 면적을 구하여 면적의 합계로 검량선을 작성한 후 시험용액을 10μL 주입하여 얻은 Di-0S, Di-6S, Di-4S의 각각의 피크의 면적을 구하여 면적의 합계로 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 의 함량을 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 콘드로이친황산나트륨함량(g/100g)=S×{a×b}over{검체의채취량(g)}×{1 } over {10,000 }]

S : 시험용액중의 콘드로이친황산 나트륨 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.4.6-4

Ⅲ.3.4.7 키토산(총글루코사민으로서)

1) 시액 조제

(1) 아세틸아세톤용액 : 증류 정제한 무색 아세틸아세톤(BP 138~140℃) 1.5mL에 1.2N 탄산나트륨용액을 가하여 50mL로 한다.

(2) p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-Dimethylaminobenzaldehyde)시액 : p-디메틸아미노벤즈알데히드 1.6g에 염산 30mL를 가하여 녹이고 96%(v/v) 에탄올 30mL를 가하여 혼합한다.

2) 시험용액의 조제

시료 0.04g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물에 녹여 액성이 산성인 경우 중화(pH7.0)시켜 물을 가하여 100mL로 하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 검액으로 한다.

3) 시험조작

(1) 검액 10mL를 취하여 염산 7mL 및 물을 가하여 20mL로 하고, 이 액 5mL를 시험관에 취하고 탈기 밀봉하여 105℃에서 24시간 분해한 후 뚜껑을 열어 감압하에 염산 및 물을 제거한 다음 잔류물을 물 5mL로 녹이고 불용물이 있으면 여과한다. 이 여액 1mL를 마개 있는 시험관에 취하고 아세틸 아세톤시액 2mL 를 가하여 혼합한 후 96℃에서 1시간 가열한 후 흐르는 물에서 냉각시키고 이에 96%(v/v) 에탄올 20mL를 가하고 p-디메틸아미노벤즈알데히드시액 2mL를 가하여 혼합하고 실온에서 2시간 방치 후 파장 530nm에서 흡광도를 측정한다.

(2) 따로, D-글루코사민 또는 N-아세틸 D-글루코사민을 100~500μg(D-글루코사민으로)/mL 함유한 용액 10mL를 취하여 앞의 (1)이하에 따라 동일하게 조작하여 다음과 같이 총글루코사민의 함량을 구한다.

[계산식]

총글루코사민(%) =

[eqn: rm 표준용액의~농도(글루코사민으로, mu g/10㎖) TIMES {Sa} over {St} TIMES {10} over {검체의채취량(g)} TIMES {100} over {10 ^{6}}]

Sa : 검액의 흡광도

St : 표준용액의 흡광도

Ⅲ.3.4.7

Ⅲ.3.4.8 키토올리고당

1. 총 글루코사민

시료 0.04g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물에 녹여 액성이 산성인 중화(pH 7.0)시켜 물을 가하여 100mL로 하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 검액으로 한다. 7-1. 키토산(총글루코사민으로서) 3) 시험조작에 따라 시험한다.

2. 유리 D-글루코사민

1) 표준용액의 조제

D-글루코사민 표준품 0.5g을 100mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 채운다.

2) 시험용액의 조제

시료 약 5g을 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50mL까지 채운다. 이를 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	길이 250mm, 안지름 4.6mm의 NH2-60칼럼 또는 이와 동등한 것
검출기	시차굴절계(RI)
칼럼온도	40℃
이동상	물 : 아세토니트릴(25:75)
유 속	0.8mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10μL 씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 글루코사민의 농도     (μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 글루코사민의 함량(g/100g)을 산출한다.

Ⅲ.3.4.8-1

[계산식]

[eqn: rm 유리 D-글루코사민~함량(g/100g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{1}over{10,000}]

S : 시험용액중의 당질의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

3. 키토올리고당

키토올리고당 = 총 글루코사민 함량 - 유리 D-글루코사민 함량

Ⅲ.3.4.8-2

Ⅲ.3.4.9 프락토올리고당

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

(1) 1-케스토즈(GF2), 니스토즈(GF3), 1-F 프락토퓨라노실니스토즈(GF4)를 0.4g씩 달아 각각 20mL의 용량플라스크에 넣고 약 10mL의 물을 넣어 용해시킨 후 증류수로 표선까지 채운 것을 표준원액으로 한다. 표준원액 1, 2, 3, 4, 및 5mL를 정확히 취하여 각각 10mL의 용량플라스크에 옮겨 넣고, 이에 내부표준용액 1mL를 넣은 뒤 물로 표선까지 채운 것을 표준용액으로 한다.

(2) 내부표준용액 : 글리세롤 5g을 달아 100mL 용량플라스크에 넣고 에탄올 50mL를 넣어 용해시킨 후 물로 표선까지 채운 것을 내부표준용액으로 한다(글리세롤외에 아라비노스도 내부표준물질로서 사용할 수 있다).

3) 시험용액 조제

프락토올리고당으로서 0.2g∼2g이 함유되도록 적당량의 시료를 정밀하게 달아 100mL의 용량플라스크에 넣고 이에 물 20mL를 가하여 용해 또는 추출한다(산성인 채로 실험을 진행할 경우 가수분해의 우려가 있으므로 필요하면 중화하고, 가열하면서 혼합하든지 초음파처리를 한다).

용해되지 않는 물질이 거의 없을 때에는 내부표준용액 20mL를 넣은 후 증류수로 표선까지 채운다. 필요하면 여과(No.5B 또는 10,000 Da cut off 원심분리필터)하여 사용한다. 얻어진 여과액에 동량의 에탄올을 첨가하여 희석한다. 침전 또는 탁한 것이 생겼을 경우에는 여과하고 여과액을 시험용액으로 한다.

주1) 용해되지 않는 물질이 많을 때에는 추출액을 여과(No.5B)하면서 100mL 용량플라스크에 전가용물을 옮겨 넣고 이하 똑같이 처리한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

Ⅲ.3.4.9-1

항목	조건
칼럼	아미노칼럼, 당분석칼럼 또는 이와 동등 이상인 것
검출기	시차굴절계(RI)
칼럼온도	40℃
이동상	아세토니트릴 : 물(65 : 35)
유속	1.0mL/min
주입량	10μL

주2) 칼럼의 종류나 상태에 따라 조성을 달리 할 수 있다. 아세토니트릴과 물의 비율을 65 : 35에서 70 : 30정도의 차이로 조정한다. 소량의 에틸알코올을 넣어 조정할 수도 있다)

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 각 프락토올리고당과 내부표준물질의 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중 각 프락토올리고당의 농도(mg/mL)를 구하고, 다음 식에 의하여 시료 중 프락토올리고당 (GF2＋GF3＋GF4)의 함량(%)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 프락토올리고당~함량(%)=(A+B+C)×{100×b}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000}]

A : 시험용액 중 GF2의 농도(mg/mL)

B : 시험용액 중 GF3의 농도(mg/mL)

C : 시험용액 중 GF4의 농도(mg/mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.4.9-2

Ⅲ.3.5. 지방산 및 지질류

Ⅲ.3.5.1 지방산

<제1법 가스크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 장치

가스크로마토그래프

2) 시약 및 시액 조제

(1) 14% 트리폴루오로보란메탄올(125g BF3/L MeOH)

(2) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N)

(3) 수산화나트륨 2g을 메탄올 100mL에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

(4) 헵탄

(5) 내부표준용액 : C11:0 triundecanoin 0.01g을 헵탄에 녹여 10mL로 한다.

3) 표준용액의 조제

(1) 지방산 표준품 약 100mg을 100mL 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올성수산화나트륨용액을 약 4mL 가한다.

(2) 플라스크 위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕 상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3 약 5mL를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속하여 가열한다.

(3) 마지막으로 헵탄 5mL를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다.

(4) 욕조와 냉각기를 제거하고 수 mL의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목 부분까지 올라오게 한다.

(5) 상층에서 약 1mL의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

(1) 지방 및 유지

(가) 시료를 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액을 가한다. 플라스크위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕 상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속하여 가열한다.

Ⅲ.3.5.1-1

(나) 마지막으로 헵탄 2～5mL를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다. 수욕조과 냉각기를 제거하고 수 mL의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목 부분까지 올라오게 한다.

(다) 상층에서 약 1mL의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 시험용액으로 한다.

(2) 지방산

시료를 환저플라스크에 정밀히 취하고 14% BF3를 넣은 후 상기 “가. 지방 및 유지”의 “2분 동안 계속하여 가열한다.” 이후의 과정과 동일하게 조작한 것을 시험용액으로 한다.

주1) 이중결합이 2개 이상인 지방산을 분석하는 경우에는 질소가스를 사용하여 메탄올과 플라스크의 공기를 제거한 후 사용하며, 시험용액은 가능한 한 빨리 분석한다. 장기간 보관할 경우에는 앰플에 넣어 냉동보관하거나 0.005% BHT를 첨가한다.

주2) 시료의 양은 정확히 채취하여야 하며, 시료의 크기에 따라 플라스크의 크기와 시약의 양을 달리하여야 한다.

시료(mg)	플라스크(mL)	메탄올성수산화나트륨(mL)	BF3시약(mL)
100～250 250～500 500～500 750～1,000	50 50 100 100	4 6 8 10	5 7 9 12

※ 가스크로마토그래피 분석의 경우 약 350mg 정도가 적당하다.

5) 시험조작

(1) 가스크로마토그래피의 측정조건

항목	조건
칼럼	5% DEGS/크로모솔브 W(AW)
검출기	수소염이온화검출기(FID)
주입부온도	230℃～ 240℃
칼럼온도	190℃～ 195℃
검출기온도	230℃～ 240℃
캐리어가스(유량)	질소(40mL/min)

주1) HP-1, Omegawax 등과 같은 캐필러릴 칼럼(capillay column)을 사용할 수도 있다. 이 때 전 처리 방법은 위와 동일하며 다만, 시료의 양, 시약의 양, 첨가하는 내부표준물질의 양 및 희석배수를 분석에 맞도록 조절한다. 기기 조건은 <제2법>의 기기조건을 따른다.

Ⅲ.3.5.1-2

주2) 탄소수가 12이하인 경우에는 칼럼온도가 더 낮아야 하며, 탄소수가 20 이상인 경우에는 주입부, 칼럼, 검출기의 온도가 더 높아야 한다. 다양한 탄소수의 지방산을 한번에 분석할 경우에는 칼럼온도의 승온조작이 필요하다.

(2) 정량시험

시험용액 및 지방산표준용액에 대하여 각각 1～5μL를 주입하여 가스크로마토그래피를 행하고 이의 머무름 시간을 비교하여 정성을 한다. 정성의 경우와 동일한 조건에서 가스크로마토그래피를 행하여 얻은 각 지방산의 피크면적, 내부표준물질의 피크면적을 얻고 <제2>법에 따라 정량을 한다.

<제2법 가스크로마토그래프에 의한 정량법>

1) 장치

가스크로마토그래프

2) 시약 및 시액조제

(1) 14% 트리플루오로보란메탄올(125g BF3/L MeOH)

(2) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N)

(3) 수산화나트륨 2g을 메탄올 100mL에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

(4) 이소옥탄： 가스크로마토그래피용

(5) 내부표준용액 : C11:0 triundecanoin 0.01g을 이소옥탄용액에 녹여 10mL가 되게 한다(1,000μg/mL).

3) 표준용액의 조제

지방산 표준물질 0.01g을 이소옥탄에 녹여 1,000μg/mL가 되게 한다. 내부표준물질 triundecanoic acid methyl ester 0.01g을 이소옥탄에 녹여 1,000μg/mL가 되게 한 후 이를 각각 혼합하여 (1:1) 각각이 500μg/mL가 되게 하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

(1) 지방 및 유지

Ⅲ.3.5.1-3

(가) 시료 약 25mg을 유리 튜브에 정밀히 취하고 내부표준용액 1mL를 첨가한다. 이어 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다. 이어 100℃ heating block에서 약 5분간 가온한다.

(나) 이를 냉각한 후 14% 트리플루오르보란메탄올용액 2mL를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃에서 30분간 가온한다.

(다) 이어 30～40℃로 냉각하여 이소옥탄용액 1mL를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다. 다음 즉시 포화 염화나트륨용액 5mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다.

(라) 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 새 유리 튜브에 넣고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮는다. 수층에 이소옥탄 1mL를  추가로 넣고 위와 같은 방법으로 추출한 후 이소옥탄층을 전의 이소옥탄액과 합한다. 이 액을 무수황산나트륨으로 탈수하고 질소를 불어넣은 후 분석 전까지 밀봉한다.

5) 시험조작

(1) 가스크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	SP-Omegawax 320 (Capillary column ; polyethyleneglycol 100% ; 30m × 0.32 mm × 0.52 μm) 또는 이와 등등한 것
검출기	수소염이온화검출기(FID)
주입부온도	250℃
칼럼온도	200℃
검출기온도	260℃
유량	1.0mL/min
split ratio	10 : 1

(2) 정성시험

시험용액 및 지방산표준용액을 각각 1~2μL를 주입하여 RRT(Relative Retention Time : 내부표준물질에 대한 각 지방산들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 각각의 지방산을 확인한다.

Ⅲ.3.5.1-4

(3) 정량시험

정성시험법에 의해 얻은 각 지방산의 피크면적, 내부표준물질의 피크면적으로부터 다음과 같이 정량을 한다.

[계산식]

지방산(mg/100g)

＝	STc×(SAfa/STfa)×fFAi ×(STis/SAis)×(최종희석용액(mL))
	SA취한양(g))×1.0067×(100/1,000)

STc   : 표준물질용액의 농도

SAfa  : 시험용액내 표준물질의 피크면적

STfa  : 표준물질의 피크면적

fFAi   : 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수 (표1-2)

STis  : 표준물질용액내 내부표준물질 피크면적

SAis  : 시험용액내 내부표준물질 표준면적

1.0067 : 내부표준물질(C11:0) 트리글리세라이드로부터 지방산으로의 전환계수

[표3] 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수

지방산명	fFAi
12:0	0.9346
14:0	0.9421
14:1	0.9417
16:0	0.9481
16:1	0.9477
18:0	0.9530
18:1	0.9521
18:2	0.9524
18:3	0.9520
18:4	0.9517
20:5	0.9557
22:5	0.9593
22:6	0.9590

Ⅲ.3.5.1-5

Ⅲ.3.5.2 인지질(아세톤불용물로서)

1) 시험용 시료의 조제

시료(W1)(수분을 함유한 경우 미리 80℃ 전후로 가온하여 감압 조건에서 탈수 건조한다.)를 석유에테르, 헥산 등으로 용해한 후 여과하여 지질 이외의 성분은 제거하고, 이 여과액을 환저플라스크에 넣어 잔존하는 용제를 감압 조건에서 제거한 후 시험용 시료(W2)로 한다.

주1) 지질이외의 성분이 완전히 제거되도록 조작한다. 대두레시틴 이외의 원료를 제거하기 위해 클로로포름/메탄올 혼합액, 클로로포름/헥산 혼합액 등의 용제를 사용하는 것이 좋은 경우 또는 환류를 행한 경우가 좋은 경우가 있다.

주2) 캡슐제품에서 내용물이 균일하지 않은 것에 대해서는 캡슐기제 접착부위에 따라 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40mL를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시킨다. 추출액을 따라내어 모으고 다시 에틸에테르 40mL를 넣어 5분간 진탕시킨 후, 캡슐기제를 제거하고 추출액을 앞의 추출액에 합하고 수욕 중 감압 조건하에서 용제를 완전히 날려 보낸 것을 분석 시료(W1)로 한다.

2) 시험조작

시험용 시료(W2) 2g을 50mL 눈금의 공전원심분리관에 넣어 석유에테르 3mL에 녹여 아세톤 15mL를 가해 잘 혼합하고 얼음물 중에 15 분간 방치한다. 이에 미리 0~5℃로 냉각한 아세톤을 가해 50mL로 하여 다시 얼음물중에 15분간 방치한 다음 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 미리 무게를 구한 플라스크에 취한다.

또 공전원심간의 침전물에 0~5℃의 아세톤을 가해 50mL로 하고, 얼음물 중에서 냉각시키면서 잘 혼합한 후 앞에서와 동일하게 원심 분리하여 상층액을 먼저 플라스크에 합하여 수욕상에서 증류하고 잔류물은 105℃에서 1시간 건조 후 항량으로 무게를 단다(W3).

[계산식]

[eqn: rm 인지질 함량(%)＝{ W sub2 —W sub3 } over { W sub1 } ×100]

W1 : 시료 채취량(g)

W2 : 시험용 시료채취량(g)

W3 : 아세톤 가용물 중량(g)

Ⅲ.3.5.2

Ⅲ.3.5.3 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

1) 시액의 조제

몰리브덴산암모늄용액 : 7 몰리브덴산(6-) 암모늄염4수화물 6g과 타트라산 칼륨 0.24g을 물 300mL에 녹이고, 이에 황산(2+1) 120mL를 가한 후 아마이드 황산암모늄 5g을 녹인 후 물을 가해 500mL로 한다.

2) 표준용액의 조제

표준인산용액 : 1.0982g의 인산2수소칼륨(KH2PO4)을 물에 용해하여250mL로 하고 이 용액 5.0mL를 1,000mL로 희석하고, 검량선 작성용 표준인산용액으로 한다(인으로서 5.0μg/mL).

3) 시험조작

(1) 인지질의 분리

시료 0.2~0.5g을 정확히 달아 헥산에 녹여 50mL로 하여 시험용액으로 한다. 이중 100μL를 취하여 박층판의 우하단 및 우변에서 2cm위치에 점적하여 클로로포름 : 메탄올 : 7N 암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액을 전개용매로 하여 2차 전개시킨다. 전개 후 박층판을 건조하고 요오드 증기를 사용하여 인지질의 반점을 발색시켜 포스파티딜콜린의 반점을 확인한다.

(2) 포스파티딜콜린 중 인의 정량

(제1법 흡광도법)

박층판에서 포스파티딜콜린의 반점을 긁어 100mL의 원추형플라스크에 취하고, 과염소산 2mL 및 질산 2~3방울을 가하고 시계접시로 뚜껑을 덮개로 하여 가열분해한다. 식힌 후 비커 및 시계접시를 물로 씻어 여과한다. 여액 및 세액을 합하여 물로 50mL가 되게 한다. 인으로서 1~10μg을 함유하는 일정량을 100mL 분액여두에 정확히 취한 후, 4% 수산화나트륨용액으로 중화한다(지시약 : 0.1% P-니트로페놀 용액). 물로 전체량을 약 40mL로 하고 몰리브덴산 암모늄용액 5mL를 가해 진탕혼합하고 이어 1% 아스코르빈산용액 1mL를 넣어 흔들어 혼합한 후 약 15분간 방치한다. 디이소부틸케톤 5mL를 가해 5분간 진탕 혼합한다. 정치 후 용매층을 취해 파장 640nm에서 디이소부틸케톤을 대조액으로 하여 흡광도를 측정한다. 별도로 작성한 검량선에서 인의 양을 구한다.

Ⅲ.3.5.3-1

(제2법 ICP법)

박층판에서 포스파티딜콜린의 반점을 긁어 100mL의 원추형플라스크에 취하고, 과염소산 2mL 및 질산 2~3방울을 가하고 시계접시로 뚜껑을 덮개로 하여 가열분해한다. 식힌 후 비커 및 시계접시를 물로 씻어 여과한다. 여액 및 세액을 합하여 물로 50mL가 되게 한다. 이액을 ICP로 분석하여 인의 함량을 구한다.

(3) 인지질 중 인의 정량

시험용액에서 100μL를 비커에 취하고 헥산을 날려 보내고 앞의 (2)와 동일한 조작으로 인지질의 인 함량을 구한다.

[계산식]

포스파티딜콜린 함량(mg/g)＝[eqn: rm { A} over { B}]

A : 포스파티딜콜린 중 인 함량(mg/g)

B : 인지질 중 인 함량(mg/g)

Ⅲ.3.5.3-2

Ⅲ.3.5.4 콜레스테롤

1) 장치

가스크로마토그래피

2) 시약

(1) 2N 수산화칼륨 에탄올용액 : 수산화칼륨 13.2g을 소량의 물로 녹이고 에탄올을 가하여 100mL로 한다.

(2) 5α 콜레스탄 내부표준물질용액 : 5α 콜레스탄 20.0mg을 헥산에 녹여 10mg으로 한다.

(3) 콜레스테롤 표준용액 : 콜레스테롤 20.0mg을 헥산에 녹여 10mL로 한다.

(4) 가스크로마토그래피용 칼럼 충전제 : 2% SE-30/Gas chrom Q(60～80메쉬) 또는 2% OV-17/Gas chrom Q(60～80메쉬) 또는 이와 동등한 것

3) 시험용액의 조제

시료 약 1～10g(콜레스테롤함량 20～1,000mg/100g)에 물 약 8mL와 5α 콜레스탄 1ml를 가하여 혼화 균질화한다. 이것을 분액여두에 옮겨 클로로포름:메탄올(2:1) 200mL를 가하여 약 5분간 진탕혼합 추출하여 방치한 후 클로로포름층을 취하고 검액잔류물에 다시 클로로포름:메탄올(2:1) 100mL씩 2회 추출한다. 추출한 클로로포름층을 합하여 0.5% 수산화나트륨용액 100mL로 세척하고 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 40℃이하에서 클로로포름층을 감압농축한다. 감압농축한 잔류물에 2N 수산화칼륨 에탄올용액 20mL를 가하여 환류냉각기를 붙여 85℃에서 1시간 비누화한 후 냉각하여 물 약 20mL를 분액여두에 옮기고 에테르 약 20mL씩 3회 추출한다. 에테르추출액을 모두 합하여 물 20mL씩으로 세척하여 페놀프탈레인 지시약으로 홍색이 나타나지 않을 때까지 세척한다. 에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압농축한다. 잔류물을 헥산 1mL에 녹여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 가스크로마토그래피의 측정 조건

Ⅲ.3.5.4-1

항목	조건
칼럼	안지름 2～3mm, 길이 2m의 유리관, 2% SE-30/Gas chrom Q(60～80메쉬) 또는 2% OV-17/Gas chrom(70～80메쉬) 또는 이와 동등한 것
검출기	수소염이온화 검출기(FID)
캐리어 가스 및 유량	산소, 50mL/min
칼럼 온도	260～270℃
주입부 온도	280～300℃
검출기 온도	280～300℃

주) HP-1, Omegawax 또는 이와 동등한 캐필럴리 칼럼(capillay column)을 사용할 수도 있다. 이 때 전 처리 방법은 위와 동일하며 단, 시료의 양, 시약의 양, 첨가하는 내부표준물질의 양 및 희석배수를 분석에 맞도록 조절하고 기기측정조건도 조절하여 사용한다

(2) 정량시험

시험용액 1～5μL를 가스크로마토그래프 내에 주입하여 시험용액 중 콜레스테롤의 피크면적 또는 높이와 내부표준물질의 피크면적 또는 높이를 구하고 다음 식에 따라 시료중의 콜레스테롤함량을 계산한다.

[ 환산계수 작성 ]

콜레스테롤 표준용액 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0mL를 각각의 시험관에 취하여 5α 콜레스탄 내부표준물질 용액 0.4mL씩 가하여 헥산으로 정확하게 2mL로 되게 한다. 각각 2μL를 가스크로마토그래프 내에 주입한다. 그래프의 횡축에 내부표준물질에 대한 표준물질의 중량비를 구하고 종축에 면적비 또는 높이비를 구하여 작성한다. 피크면적비 또는 높이비가 1.0의 중량비를 표로부터 구하여 환산계수(중량비/피크 면적비 또는 높이비)로 한다.

[계산식]

콜레스테롤 함량(mg/100g)＝[eqn: rm { 2×K×P sub1 ×100} over {검체 채취량(g)×P sub2 }]

P1 : 콜레스테롤의 피크면적 또는 높이

P2 : 5α 콜레스탄의 피크면적 또는 높이

K  : 환산계수

Ⅲ.3.5.4-2

Ⅲ.3.5.5 구연산

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

구연산 표준품 0.2g을 정확히 취하여 증류수로 녹여 100mL로 정용한 후 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

3) 시험용액의 조제

C18 카트리지에 미리 아세토니트릴/증류수(1:1) 용액 10mL로 유출시킨 후 카트리지내 용액을 제거한다. 이어서 시료 10mL을 가하여 초기 용출액 4-5mL을 제거한 후 나머지 용출액을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(214nm)
주입량	20μL
이동상	0.2M Phosphate buffer, pH 2.4 Phosphate buffer (KH2PO4 27.2g을 증류수 950mL에 용해시킨 후 인산으로 pH 2.4로 조절한다)
유속	0.8mL/min

(2) 정량시험

표준용액 및 시험용액을 각각 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 농도를 구한다.

Ⅲ.3.5.5

Ⅲ.3.5.6 스쿠알렌

1) 장치

가스크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

스쿠알렌 표준품 약 50mg을 정밀히 달아 내부표준용액을 넣고 소량의 헥산으로 녹인 다음 헥산으로 정밀히 50mL로 한 것을 표준원액(1,000mg/mL)으로 하여, 희석하여 표준용액으로 사용한다. 다만, 검량선을 작성하기 위하여 최소3개 이상의 농도로 표준용액을 조제한다.

주) 시험용액의 기능성분(또는 지표성분) 농도가 검량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액 농도를 조제한다.

3) 내부표준용액의 조제

콜레스테롤 200mg을 정밀히 달아 클로로포름으로 녹여 정확히 200mL가 되게 한 것을 내부표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

시료 50mg을 정밀히 달아 내부 표준용액과 헥산을 넣어 녹이고 정확히 50mL가 되게 하여 시험용액으로 한다. 필요한 경우 원심분리 또는 여과하여 사용한다.

5) 시험조작

(1) 가스크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	HP-1(30m×0.32mm×0.53μm) 또는 이와 동등한 것
검출기	수소염이온화검출기(FID)
주입부 온도	250℃
검출기 온도	300℃
칼럼 온도	190℃(1min)-15℃-260℃(5min)-15℃
캐리어가스 및 유량	질소, 3.0mL/min

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액 각각 1~5μL씩을 가스크로마토그래피내에 주입하여 크로마토그램을 얻은 후, 피크의 면적 또는 높이를 구하여 내부표준법에 따라 함량을 구한다.

Ⅲ.3.5.6

Ⅲ.3.5.7 식물스테롤

1) 표준용액의 조제

(1) 베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 표준품 25mg을 각각 정밀하게 달아 내부표준용액 25mL에 녹여 표준용액으로 한다(1mg/mL).

(2) 내부표준용액 : 디히드로콜레스테롤(dihydrocholesterol)을 클로로포름에 녹여 농도가 5mg/mL이 되도록 한다.

2) 시험용액의 조제

베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤의 합계량으로서 25 ~ 100mg이 함유되도록 적당량의 시료를 환저플라스크에 정밀하게 달아 에탄올 40mL와 0.1N 에탄올성 수산화칼륨 용액 10mL를 넣고 1시간 동안 검화시킨다. 검화 후 냉각하고 염화나트륨 포화용액 50mL를 넣어 잘 혼합한 후 분액여두로 옮겨 헥산 100mL씩으로 4회 추출한다. 이 헥산층을 감압 농축시킨 다음 내부표준용액 25mL를 넣은 후 가스크로마토그래피 분석에 적합하도록 여과한다.

3) 시험조작

(1) 가스크로마토그래피의 측정 조건

항목	조건
칼럼	디메틸폴리실록산(100% dimethylpolysiloxane)을 충전한 칼럼(50m×0.32mm×0.52μm) 또는 이와 동등 이상인 것
검출기	수소염이온화 검출기(FID)
주입부 온도	270℃
칼럼 온도	200℃(1min)-5℃/min-300℃(14min)
검출기 온도	320℃
주입량	1μL
캐리어 가스 및 유량	질소, 1mL/min

주) 시료 내 방해물질에 의해 표준물질의 피크가 잘 분리되지 않을 경우 칼럼온도를 조정하여 충분히 분리되도록 하여 시험한다.

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 1μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 상대머무름시간(Relative Retention Time, 내부표준물질에 대한 각 식물스테롤들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 각 식물스테롤을 확인한다. 각 식물스테롤의 피크면적과 내부표준물질의 피크면적을 구하여 다음 식으로부터 개별 식물스테롤 함량을 구하고, 개별 식물스테롤의 함량을 합하여 식물스테롤의 함량을 구한다.

Ⅲ.3.5.7-1

[계산식1]

[eqn: rm 개별식물스테롤~함량(%)=C×{Psa}over{Pst}×{Pstis}over{Psais}×{V}over{W}×{1}over{10}]

C : 표준용액의 농도(mg/mL)

Psa : 시험용액 중 식물스테롤의 피크 면적

Pst : 표준용액 중 식물스테롤의 피크면적

Pstis : 표준용액 중 내부표준물질의 피크 면적

Psais : 시험용액 중 내부표준물질의 피크 면적

V : 시험용액의 전량(mL)

W : 시료채취량(g)

[계산식2]

식물스테롤 함량(%) = 베타시토스테롤(%)+브라시카스테롤(%)+스티그마스테롤(%)+캄페스테롤(%)

Ⅲ.3.5.7-2

Ⅲ.3.5.8 유리식물스테롤

시료를 환저플라스크에 정밀하게 달아 100mL 헥산과 잘 혼합한 후 이 헥산층을 감압 농축시킨 다음 내부표준용액을 5mL를 넣은 후 가스크로마토그래피 분석에 적합하도록 여과하여 분석한다.

Ⅲ.3.5.8

Ⅲ.3.5.9 알콕시글리세롤

1) 시험조작

(1) 비비누화량

시료 약 5g을 환류냉각기를 장치하여 100℃에서 에탄올성 1N 수산화나트륨용액 50mL를 가하여 1시간 30분 동안 혼합한 후 에탄올을 증발시키고 열수를 가한 다음 에테르로 수회 세척하여 에테르층을 합한다.

알콕시글리세롤을 함유한 비비누화성분은 에테르층으로 이행한다. 이 에테르층에 물 30mL를 가해 교반 후 물층을 제거한다. 이 조작을 물층이 페놀프탈레인 시액으로 붉은 색이 나타나지 않을 때까지 반복한 후 에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수시켜 증발건조한 후 중량을 칭량하여 비비누화량으로 한다.

(2) 스쿠알렌량(지방산 및 지질류 중 “스쿠알렌 시험법” 참조)

스쿠알렌 표준품 약 50mg을 정밀히 달아 내부표준용액을 넣고 소량의 헥산으로 녹인 다음 헥산으로 정밀히 50mL로 한 것을 표준원액(1,000mg/mL)으로 하여, 희석하여 표준용액으로 사용한다. 다만, 검량선을 작성하기 위하여 최소3개 이상의 농도로 표준용액을 조제한다.

주) 시험용액의 기능성분(또는 지표성분) 농도가 검량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액 농도를 조제한다.

콜레스테롤 200mg을 정밀히 달아 클로로포름으로 녹여 정확히 200mL가 되게 한 것을 내부표준용액으로 한다.

앞의 (1) 비비누화량에서 만들어진 비비누화 50mg을 정밀히 달아 내부 표준용액과 헥산을 넣어 녹이고 정확히 50mL가 되게 하여 시험용액으로 한다. 필요한 경우 원심분리 또는 여과하여 사용한다.

2) 시험조작

(1) 가스액체크로마토그래프의 측정 조건

Ⅲ.3.5.9-1

항목	조건
칼럼	HP-1(30m×0.32mm×0.53μm) 또는 이와 동등한 것
검출기	수소염이온화형 검출기(FID)
주입부 온도	250℃
검출기 온도	300℃
칼럼 온도	190℃(1min)-15℃-260℃(5min)-15℃
캐리어가스 및 유량	질소, 3.0mL/min
주입량	1~5μL

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액 각각 1~5μL씩을 가스크로마토그래피내에 주입하여 크로마토그램을 얻은 후, 피크의 면적 또는 높이를 구하여 내부표준법에 따라 함량을 구한다.

주) 토코페롤을 첨가한 경우 토코페롤량도 함께 분석한다.

[계산식]

알콕시글리세롤 함량(g) =[eqn: rm { "비비누화의 양(g)—스쿠알렌의 양(g)"} over { 시료채취량(g)}]

단, 토코페롤 첨가제품은 토코페롤양을 추가로 빼준다.

Ⅲ.3.5.9-2

Ⅲ.3.5.10 바틸알콜 확인

1) 장치 및 기구

박층크로마토그래피(TLC)

2) 표준용액의 조제

DL-바틸알콜(DL-Batyl alcohol) 표준품을 50mg을 취하여 에테르에 녹여 10mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

알콕시글리세롤 함량을 측정한 비비누화물을 에테르 10mL에 녹여 시험용액으로 한다. 다음의 박층크로마토그래피 조건에 따라 시험할 때 표준품과 동일한 위치에서 반점이 확인되어야 한다.

4) 박층크로마토그래피 조건

항목	조건
흡착제	실리카겔 60F 254
전개용매	헥산․초산에틸․에탄올(10:8:1)
점적량	5μL
발색제	0.1% 로다민B 에탄올용액

Ⅲ.3.5.10

Ⅲ.3.5.11 옥타코사놀

1) 장치

가스크로마토그래피

2) 표준용액의 조제

옥타코사놀 표준품 25mg을 정확히 취하여 에테르에 녹여 50mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

가. 시료 약 5g을 비누화용 플라스크에 정확히 취해서 1N 에탄올․수산화칼륨액 50mL를 넣고 냉각기를 부착하여 수욕상 또는 열판에서 자주 흔들어주면서 천천히 가열하여 1시간동안 비등 비누화시킨다.

나. 비누화가 끝나면 가열을 중지하고 소량의 온수로 냉각기를 씻어 내리고 냉각기를 떼어낸 후 온수 100mL로 비누화용 플라스크를 씻으면서 비누화액을 분액여두에 옮기고 물 50mL를 가하여 혼합한 후 상온으로 식힌다.

다. 다음 에테르 100mL로 비누화용 플라스크를 씻어서 분액여두에 넣고 마개를 한 후 처음 몇 번 흔들어 마개를 열어 생성된 에테르 가스를 배출시키고 다시 마개를 한 후 1분간 격렬히 진탕한 후 두 층으로 확실히 분리될 때까지 방치한다.

라. 분리된 하층은 제2의 분액여두에 옮겨 그것에 에테르 50mL를 넣고 제1의 분액여두와 동일하게 조작하여 분리된 하층은 제3의 분액여두에 옮겨 그것에 에테르 50mL를 넣고 제1의 분액여두와 동일하게 조작 후 하층은 버리고 제2, 제3의 분액여두의 에테르는 제1의 분액여두에 옮긴다. 에테르 소량씩으로 분액여두를 수회 씻어 합한다.

마. 이에 물 30mL씩을 가하여 흔들어 충분히 방치하여 씻은 액이 페놀프탈레인 시액으로 착색이 되지 않을 때까지 씻어준다. 에테르층은 무수황산나트륨을 사용 탈수한 후 500mL 증류플라스크에 옮기고, 수기 등은 에테르로 씻어 합한다. 에테르의 대부분을 증류시킨 후 아세톤으로 증류플라스크의 내면을 충분히 씻어 50mL로 하여 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 가스크로마토그래피의 측정 조건

Ⅲ.3.5.11-1

항목	조건
칼럼	3% Silicon OV-17을 크로모솔브 W(HP) 60~80메쉬에 코팅한 것(3mm×1m)
검출기	수소염이온화검출기(FID)
주입부 온도	360℃
검출기 온도	360℃
칼럼 온도	100℃-10℃/min-330℃
캐리어 가스 및 유량	질소, 60mL/min
주입량	1~5μL

주) 단, 시료 내 방해물질에 의해 표준물질의 피크가 잘 분리되지 않을 경우 칼럼종류, 캐리어가스 및 유량, 칼럼온도, 주입부 온도, 검출기 온도를 조정하여 충분히 분리되도록 하여 시험한다.

(2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 1~5μL 씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 옥타코사놀의 농도     (μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 시료 중 옥타코사놀의 함량(g/100g)을 산출한다. 피크의 면적 또는 높이 비교로 옥타코사놀의 함량(g/100g)을 계산한다.

Ⅲ.3.5.11-2

Ⅲ.3.5.12 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

1) 표준용액의 조제

10-HDA 표준품을 황산데시케이터에서 건조시킨 후 약 50mg을 정밀히 취하여 넣고 메탄올로 녹여 500mL로 한 것을 표준원액(100mg/kg)으로 하여 필요시 희석하여 사용한다.

2) 시험용액의 조제

10-HDA로서 48mg에 해당하는 양의 시료(연질캡슐 제품은 내용물과 피막을 함께 취한다)를 취하여 500mL 용량 플라스크에 넣고, 물 약 50mL를 넣어 50℃로 가온하고 진탕 혼합하고, 연질캡슐은 피막과 내용물을 균질하게 혼합시킨 후 메탄올 약 350mL를 넣어 약 30분간 초음파 진탕 추출하고 메탄올을 넣어 500mL로 한다. 이 액을 여과하여 검액으로 한다.

캡슐 제품의 경우에는 20캡슐 이상을 취하여, 캡슐을 절개하고 개개의 내용물의 무게를 정밀하게 달아 평균무게를 구하여 1캡슐의 평균무게로 한다.

3) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목	조건
칼럼	μ-Bondapak C18 또는 이와 동등한 칼럼
검출기(측정파장)	자외부흡광광도검출기(214nm)
이동상	0.02M (NH4)2HPO4․메탄올(7 : 3) 혼합액 (단, 인산을 가하여 pH 7.0으로 조정한다.)
유속	1.4 mL/min (유속은 10-HDA 주피크의 유지시간이 7~10분 되도록 적절히 조정한다.)
주입량	10μL

(2) 정량시험

검액 및 표준액 10μL를 액체크로마토그래프내에 주입하여  10-HDA의 그래프를 얻는다. 이 그래프를 표준 그래프와 비교하여 10-HDA에 해당하는 피크를 확인한다. 10-HDA의 함량은 피크의 면적 또는 높이로 다음 계산식에 따라 산출한다.

[계산식]

[eqn: rm 10-HDA 함량(%)={ "검액 중의 10ꠀHDA의 피크면적"} over { "표준액중의 10ꠀHDA의 피크면적" } × {" 표준품 취한 량(mg) "} over {" 시료채취량(mg)"}×100]

Ⅲ.3.5.12

Ⅲ.3.6 페놀류

Ⅲ.3.6.1 카테킨

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액 조제

에피갈로카테킨(EGC), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC), 에피카테킨갈레이트(ECG) 표준품 각각을 메탄올에 녹여 각각 표준원액(1,000    μg/mL)을 만들고, 표준원액을 메탄올로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험용액 조제

에피갈로카테킨(EGC), 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨(EC) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)의 합계량으로서 20 ~ 80mg이 함유되도록 적당량의 시료를 용량플라스크에 정밀하게 달아 메탄올을 가하고 초음파를 이용하여 분산 또는 용해시켜 정확하게 100mL로 한다. 이를 0.45μm의 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출기(280nm)

주입량

10μL

이동상

시간(분)	0.1% 초산용액	아세토니트릴
0	85	15
10	85	15
15	70	30
20	50	50
21	85	15
30	85	15

0.1% 초산용액 : 아세토니트릴 (gradient)

유 속

1.0mL/min

Ⅲ.3.6.1-1

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 카테킨의 피크의 면적에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액중 카테킨의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 시료 중 카테킨의 함량(%)을 구한다.

[계산식 1]

[eqn: rm 개별~카테킨`함량(mg/g)=S TIMES {V} over {시료채취량(g)}TIMES{ 1} over {1,000 }]

S : 시험용액 중 개별 카테킨의 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

[계산식 2]

카테킨 함량(mg/g)= EGC(mg/g)+EGCG(mg/g)+EC(mg/g)+ECG(mg/g)

Ⅲ.3.6.1-2

Ⅲ.3.6.2 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시험용액의 조제

알로에건조분말의 경우 약 1g을 취하여 메탄올 5～10mL를 취하여 적신 다음 약 60℃의 물 10mL를 가하여 혼합한 후 다시 약 60℃의 물 75mL를 가하여 30분간 진탕한다. 냉각, 여과하여 여액은 물로 200mL가 되게 한다.

이 여액 10mL를 60% 염화제2철용액 1mL와 진한 염산 6mL가 들어있는 용기에 가한 후 환류냉각기를 설치하여 끓는 수욕조에서 4시간동안 역류시킨다.

이를 식힌 후 분액여두에 옮기고 냉각기 및 수기는 물 4～5mL씩으로 세척하고 세액은 먼저의 분액여두에 합하고, 이에 1N 수산화나트륨 4mL, 사염화탄소 20mL씩으로 3회 추출한 후 사염화탄소층을 물 10mL로 세척한 다음 사염화탄소로서 100mL로 하고 이 액 20mL를 수욕상에서 증발건조한 후 그 잔류물에 0.5% 메탄올초산마그네슘용액 10mL를 가하여 용해한 것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

시험용액은 액층 1cm, 파장 512nm에서 메탄올을 대조액으로 하여 흡광도를 측정하고 다음식에 따라 hydroxyanthracene유도체 성분을 무수바바로인(barbaloin)으로 계산한다.

주1) 시료가 기름을 다량 함유한 경우 에테르 등 용매를 사용하여 기름을 제거하는 것이 필요하다.

주2) 혼합된 다른 성분이 결과에 영향을 미치는 경우 이를 보정하여 시험한다.

[eqn: rm ={{A} over {240}}×10×{100} over {20}×{200}over{10}×{1}over{시료채취량(g)}]    [계산식]

무수바바로인 (mg/g)

A∶시험용액의 흡광도

Ⅲ.3.6.2

Ⅲ.3.6.3 총 플라보노이드

1) 장치 및 기구

분광광도계(Spectrophotometer), 원심분리기, 50mL용 메스플라스크, 50mL원심관, 시험관(∮18mm×180mm)

2)시약 및 시액조제

(1) 쿼세친(Quercetin) : 시약특급

(2) 에탄올 : 시약특급

(3) 10% 질산알루미늄용액 : 질산알루미늄[Al(NO3)3.‧9H2O](시약특급) 17.6g을 정확히 달아 물로 용해하여 100mL로 한다.

(4) 1M-초산칼륨액 : 초산칼륨(CH3COOK) 9.815g을 칭량하여 물로 용해하여 100mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

과립상, 정제상의 제품은 우선 시료를 충분히 분쇄하여 사용한다. 또한 젤라틴 등을 피포한 제품은 내용물을 꺼내어 사용한다.

(1) 프로폴리스추출물

시료 60 ~ 100mg을 칭량하고 90% 에탄올 20mL를 가하여 용해, 원심분리(3,000rpm, 10min)한다.

상등액을 취하고 잔류물을 80% 에탄올 8mL로 3회 추출하고 전추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50mL로 해서 시험용액으로 한다.

(2) 프로폴리스추출물 기능성 원료인 최종제품

시료 1~6g(mL)(프로폴리스추출물로 60~100mg에 상당하는 양)을 칭량하고 90% 에탄올 20mL를 가하여 용해, 원심분리(3,000rpm, 10min)한다. 다만, 당을 포함한 경우는 시료(프로폴리스추출물 60~100mg에 상당하는 양)를 정평하고 물 10mL로 용해하고 에탄올 10mL를 가하여, 원심분리(3,000rpm, 10min)를 행한다.

상등액을 취하고 잔류물을 80%에탄올 8mL로 3회 조작하고 전 추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50mL로 해서 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

(1) 시험용액 0.5mL를 시험관에 취하고 에탄올 1.5mL, 10% 질산알루미늄용액 0.1mL, 1M 초산칼륨용액 0.1mL, 물 2.8mL를 가하여 충분히 교반을 한다. 실온에서 40분간 정치 후 액층을 10mm 셀(cell)을 사용하여 물을 대조액으로 하여 415nm에서 흡광도를 측정한다.

Ⅲ.3.6.3-1

시료의 흡광도로부터 별도로 상기 조작 중 질산알루미늄용액 대신 물 0.1mL를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 아래 (2)에서 작성한 검량선에 의하여 총 플라보노이드 S mg/mL를 산출한다.

(2) 검량선의 작성

쿼세친을 무수물로 혼합하여 50mg을 정확히 달아 에탄올을 넣어 용해하고 정확히 50mL가 되게 한다. 이 용액에 에탄올을 가하여 100, 20, 10배로 희석하고 0.01, 0.05, 0.1mg/mL의 각 표준용액을 조제하고 상기 조작에 준하여 흡광도를 구하여 검량선을 작성한다. 각각의 농도마다 공시험을 한다.

[계산식]

[eqn: rm 총~플라보노이드~함량(mg/g) = S TIMES {a×b} over {시료채취량(g)}]

S : 시험용액중의 총 플라보노이드 함량(mg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.6.3-2

Ⅲ.3.6.4 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 시액조제

(1) 파라(ρ)-쿠마르산용액 : 파라(ρ)-쿠마르산(시약특급) 100mg을 정확히 달아 80% 에탄올로 용해하고 100mL로 정용한다.

(2) 계피산용액 : 계피산(시약특급) 100mg을 정확히 달아, 80%에탄올로 용해하고 100mL로 정용한다.

3) 시험용액 조제

프로폴리스추출물 또는 프로폴리스추출물을 기능성 원료로 한 최종제품을 2g(mL)을 정확히 달아 80% 에탄올로 희석하고 용해하여 20mL로 정용한다. 그 용액을 0.5μm의 멤브레인 필터로 여과하여 여과액 10μL를 시험용액으로 한다(필요하면 소량의 물로 용해한 후 99.5%의 에탄올을 가하여 전체용량을 20mL로 한다).

4) 시험조작

(1) 고속액체 크로마토그래피의 측정 조건

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것

칼럼온도

40℃

검출기

(측정파장)

자외부흡광광도검출기

(파라쿠마르산 : 310nm, 계피산 : 280nm)

주입량

10μL

이동상

0.5%초산 : 메탄올 (gradient)

시간	0.5% 초산	메탄올	Flow
0	70	30	1 mL/min
10	53	47	1 mL/min
30	40	60	1 mL/min
30.01	0	100	1 mL/min
40	0	100	1 mL/min
40.01	70	30	1 mL/min
45	70	30	1 mL/min

유량

1mL/min

Ⅲ.3.6.4-1

(2) 정성시험

시험한 크로마토그램에서 표준 쿠마르산 또는 계피산과 동일한 유지시간의 피크를 확인한다.

Ⅲ.3.6.4-2

Ⅲ.3.6.5 다이드제인 및 제니스테인 확인

1) 표준용액의 조제

다이드제인, 제니스테인 표준품을 각 20mg씩 정밀하게 취하여 메탄올 50mL에 녹여 표준용액으로 한다.

2) 시험용액의 조제

시료 약10g을 달아 250mL 삼각플라스크에 넣고 80% 메탄올 40mL를 넣은 후 호일을 씌우고 65℃ 항온 수욕조에서 2시간 추출한다. 냉각시킨 후 2M 수산화나트륨용액 3mL를 넣고 상온에서 10분간 회전 교반하여 반응시킨 다음 빙초산 1mL를 넣는다. 80% 메탄올을 사용하여 50mL로 한 다음 잘 혼합하고 여과한다. 여액 5mL에 물 4mL를 넣고 메탄올을 사용하여 10mL로 한다. 5분간 원심분리한 상징액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한 실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등한 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출기(260nm)

이동상

물:메탄올:초산(88:10:2) / 메탄올:초산(98:2)(gradient)

시간(분)	물:메탄올:초산(88:10:2)	메탄올:초산(98:2)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10
50	90	10

유속

1.0mL/min

주입량

10μL

(2) 확인

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 제니스테인, 다이드제인과 머무름 시간이 일치하는 시험용액 중의 피크를 확인한다.

Ⅲ.3.6.5

Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린 K

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

(1) 비활성형 모나콜린 K 표준용액의 조제

메비놀린(mevinolin, monacolin K) 표준품 10mg을 정밀하게 달아 75% 에탄올로 50mL에 녹여 표준용액으로 한다(0.200mg/mL).

(2) 활성형 모나콜린 K 표준용액의 조제

메비놀린(mevinolin, monacolin K) 표준품 10mg을 정밀하게 달아 75% 에탄올로 50mL에 녹인다. 완전히 용해시킨 후 2.0mL를 취하여 4mL 바이알에 넣고 0.05N 수산화나트륨에탄올용액 0.5mL를 넣고 혼합한 후 실온에서 최소 30분 방치하여 표준용액으로 한다(0.167mg/mL).

3) 시험용액의 조제

총 모나콜린 K로서 1 ~ 4mg이 함유되도록 적당량의 시료를 정밀하게 달아 10mL 원심분리관에 넣고 75% 에탄올 10mL를 넣은 후 잘 흔들어 혼합한 다음 60분간 초음파 처리한다. 실온으로 냉각한 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 상징액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출기(237nm)

주입량

10μL

이동상

아세트니트릴 : 0.2% 인산용액(gradient)

시간(분)	아세트니트릴	0.2% 인산용액
0.0	20.0	80.0
10.0	40.0	60.0
15.0	60.0	40.0
20.0	80.0	20.0
24.0	80.0	20.0
25.0	20.0	80.0

유속

1.0 mL/min

Ⅲ.3.6.6-1

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 10μL씩 주입한 후 상위 고속크로마토그래피 측정 시험 조건에서 시험한다. 표준용액 중 모나콜린 K와 머무름시간이 일치하는 시험용액 중의 피크를 확인한 후 활성형 모나콜린 K의 함량과 비활성형 모나콜린 K의 함량을 각각 구하고, 각 모나콜린 K의 함량을 합하여 총 모나콜린 K의 함량을 구한다.

[계산식1]

[eqn: rm (비)활성형~모나콜린K(%)=S×{Psa}over{Pst}×{a}over{시료채취량(g)}×{100}over{1,000}]      S  : 표준용액의 농도(mg/mL)

Psa : 시험용액 중 모나콜린 K의 피크 면적

Pst : 표준용액 중 모나콜린 K의 피크 면적

a  : 시험용액의 전량(mL)

[계산식2]

총 모나콜린 K(%) = 활성형 모나콜린 K(%) +비활성형 모나콜린 K(%)

Ⅲ.3.6.6-2

Ⅲ.3.7. 터핀류

Ⅲ.3.7.1 진세노사이드 Rb1과 Rg1

1) 시험용액의 조제

(1) 분말의 시험용액

시료 약 1g을 정밀히 달아 250mL의 환류용 플라스크에 취한다. 50% 메탄올 용액 50mL를 가하여 70~80℃의 수욕에서 1시간 환류냉각한 후 식히고 원심분리한 다음 상징액을 농축플라스크에 취한다. 잔류물에 대하여 위의 조작을 1회 더 반복한다. 농축플라스크에 옮긴 상징액을 수욕중에서 60℃이하에서 감압농축한다. 농축물을 물-아세토니트릴 혼합용매(80:20) 2mL에 용해한 다음 여과(0.45μm)하여 시험용액으로 한다.

(2) 농축액 및 농축액 분말의 시험용액

시료 약 2g을 정밀히 달아 물 50mL에 완전히 용해한 다음 여과(0.45μm)하여 시험용액으로 한다.

(3) 인삼성분함유제품의 시험용액

시료 약 3~4g을 정밀히 달아 물 50mL에 완전히 용해한 다음 여과(0.45  μm)하여 시험용액으로 한다. 시료에 지용성물질이 포함된 경우, 시료 약 3~4g을 분액여두에 취하고 n-hexane 100mL 및 70% 메탄올 100mL를 가하여 3시간 동안 진탕 추출한다. 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 다음 하층을 농축플라스크에 취하여 수욕중에서 감압농축하고 농축물을 물 10mL에 용해한 후 여과(0.45μm)하여 시험용액으로 한다.

2) 표준용액의 조제

진세노사이드 Rb1 및 Rg1 표준품 각각을 메탄올에 녹여 여과(0.45μm)하여 각각 표준원액을(1mg/mL)만들고, 표준원액을 메탄올로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.

3) 시험조작

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

Ⅲ.3.7.1-1

항목

조건

칼럼

옥타데실실릴화한실리카겔을 충전한 칼럼(ODS 칼럼, 4.6mm×250mm) 또는 이와 동등 이상의 것

검출기(측정파장)

자외부흡광광도검출출기(203nm)

주입량

20μL

이동상

아세토니트릴 : 물 (gradient)

시간	물	Acetonitrile
Int	80%	20%
10	80%	20%
40	68%	32%
48	58%	42%
50	0%	100%
60	0%	100%
62	80%	20%
70	80%	20%

유량

1.6mL/min

주) 피크의 분리능 등 최적조건을 주기 위해 이동상 비율 및 유속을 변경할 수 있다.

(2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 20μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크의 면적에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 시료 중 진세노사이드 Rb1 및 Rg1 함량(mg/g)을 구한다.

[계산식]

[eqn: rm 진세노사이드~ Rb1~함량(mg/g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}×{1over1,000 }]

[eqn: rm 진세노사이드~Rg1~함량(mg/g)=S×{a×b}over{시료채취량(g)}× 1over1,000]

S : 시험용액 중 개별 진세노사이드 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

Ⅲ.3.7.1-2

Ⅲ.3.7.2 총 엽록소

<에테르 추출법>

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시험용액 조제

총엽록소 약 7mg에 상당하는 시료를 정밀히 달아, 이에 85% 아세톤 50mL를 가하고 해사 일정량을 추가하여 잘 분쇄한 후 냉암소에서 하룻밤 방치한 후 3G-2 유리여과기를 사용하여 여과한다.

갈색플라스크내의 잔류물은 85% 아세톤 25mL를 가하여 10분간 유리봉으로 저어 다시 여과한다. 아세톤액이 착색되지 않을 때까지 반복 조작한 후 여액을 아세톤에 가하여 200mL로 한다.

이 액 20mL를 갈색분액깔때기에 취하여 넣고 에테르 50mL 및 5% 황산나트륨 50mL를 가해 완만히 흔들어 진탕한 후 마개를 열어 에테르가스를 방출한 후 마개를 하여 1분간 진탕한다.

정치 후 물층(하층)을 분리하여 여기에 에틸에테르 10mL를 가하여 추출하는 과정을 2회 반복한 후 에테르층을 합하여 5% 황산나트륨용액 50mL씩으로 3회 세척한다.

세척된 에테르층은 무수황산나트륨을 통과 탈수시켜 여과한 후 갈색분액깔때기 및 여과지를 에테르로 씻어 먼저의 액에 합하고 이에 에테르를 가해 100mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

시험용액은 에테르를 대조액으로 하여 액층 1cm셀을 사용하여 파장 642.5nm 및 660nm에 대하여 흡광도 A1 및 A2를 측정하고 다음 식에 의해 총엽록소의 함량을 구한다.

[계산식]

엽록소(mg%)＝S ×[eqn: rm { 100} over {1,000 } × { 200} over {20 } × { 100} over {시료채취량(g)}]

S (총엽록소 mg/L)∶7.12×A2＋16.8×A1

<피리딘 추출법>

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

Ⅲ.3.7.2-1

2) 시약

알칼리성피리딘용액∶특급 수산화나트륨 1.4g을 물 40～60mL에 용해하고 특급 피리딘 16.6g을 가한 다음 물을 가하여 100mL로 한다.

3) 시험용액 조제

검체 5～10mg(건조물로서)을 차광한 공전시험관에 취하고 물 10mL를 가하여 때때로 흔들어 주면서 30분간 방치한다. 이 현탁액 2.0mL를 원심분리관에 취하고 알칼리성피리딘용액 5mL를 가하여 혼합하고 알루미늄호일로 차광하여 60℃수욕중에서 때때로 혼합하여 주면서 15분간 방치한 다음 바로 원심분리(3,000rpm, 3분)하여 상등액을 10mL의 갈색 메스플라스크에 옮겨 차가운 곳에 보관한다. 잔사는 알칼리성피리딘용액 3mL를 가하여 위의 조작과 똑같이 한 다음 그 상등액을 최초의 상등액에 합하여 알칼리성피리딘용액으로 전량을 10mL로 맞춘 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

시험용액을 알칼리성피리딘용액을 대조로 하여 액층 1cm 파장 419nm와 454nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식으로 검체 중 엽록소함유량을 구한다. 알칼리성피리딘용액을 가한 후 1시간이내에 조작을 끝낸다.

엽록소(mg/100g)＝[eqn: rm { 8.970(7.19E sub 419nm ＋3.33E sub 454nm )} over { S}]×100

S∶원심분리관에서 취한 검체의 중량(mg)

Ⅲ.3.7.2-2

Ⅲ.3.7.3 총 페오포르바이드

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시험용액의 조제

시료 100mg을 정밀히 달아 여기에 차가운 1/15M 인산완충용액(pH 8.0):아세톤 혼합(7:3) 10mL를 가하고 37℃에서 3시간 항온시킨다.

이어 10%염산으로 약산성화하고 유발에 넣어 약 0.5g의 해사 및 85%(v/v) 아세톤 20mL를 가하여 마쇄 후 상등액을 원심분리관으로옮긴다. 다시 잔사에 아세톤 10mL씩을 넣어 2회 되풀이하여 조작하고 원심분리관에 합한 다음 원심분리(3,000rpm, 5분)하고, 그 상등액을 에틸에테르 30mL를 넣은 분액여두로 옮긴다.

에틸에테르와 아세톤 혼합액에 5% 황산나트륨용액 50mL를 가하여 약하게 흔들어 주고 황산나트륨층을 버린다. 이와 같은 이 세척 조작을 3회 반복한 후 무수황산나트륨을 가하여 탈수하여 에틸에테르층을 취한 다음 에틸에테르로 전량을 50mL로 하여 이를 색소원액으로 한다. 이 색소원액 20mL를 취하여 17% 염산 20mL, 10mL씩을 넣고 차례로 흔들어 추출한 후  에틸에테르층을 분취하고 여기에 에틸에테르를 가하여 전량을 20mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

3) 시험조작

에틸에테르를 사용하여 시험용액을 필요한 농도로 정확하게 희석하여 667nm의 파장에서 흡광도를  측정한다. 총페오포르바이드의 함량을 페오포르바이드의 667nm 비흡광계수 70.2(0.1% 용액 1cm)로 하여 계산하다.

[계산식]

[eqn: rm 총페오포르바이드(mg/100g)={A}over{70.2}×{100}over{시료채취량(g)}×{50}over{20}×b]

A : 흡광도

b : 희석배수

Ⅲ.3.7.3

Ⅲ.3.8. 발효미생물류

Ⅲ.3.8.1 유산간균 및 구균

1) 시액 및 배지 조제

(1) 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

Peptone 10g, Sodium Chloride 5g, Disodium Phosphate 3.5g, Mono-potassium Phosphate 1.5g을 증류수에 가하여 1,000mL로 하고 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서15분간 고압 멸균한다.

(2) BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)

Yeast Extract 2.5g, Peptone 5.0g, Dextrose	1.0g, Tween 80 1.0g L-Cysteine 0.1g, Agar 15.0g을(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함) 증류수 1,000mL에 녹여 pH 6.8～7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004～0.006%가 되도록 가하고 121℃에 서  15분간 멸균한다.

(3) BL 한천배지(BL Agar)

Beef Extract 3g, Liver Extract 5g, Yeast Extract 5g, Proteose Peptone 10g, Tryptone  5g, Soypeptone	3g, Soluble Starch 0.5g, Glucose  10g, Dipotassium Phosphate  1g, Monopotassium Phosphate 1g, Magnesium Sulfate 0.2g, Sodium Chloride	0.01g, Manganese Sulfate 0.00674g, L-Cysteine‧HCl‧H2O 0.5g, Ferrous Sulfate  0.01g, Polysorbate 80(Tween 80)  1g, Agar  15g을 증류수 1,000ml에 녹여 pH 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각시킨 후 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5% 되도록 첨가한다.

(4) BS 한천배지(Bifidobacterium selective Agar)

BL한천배지(BL Agar) 1,000mL 에 Sodium Propionate 15g, Paromomycin Sulfate 50mg,	Neomycin 100mg, Lithium Chloride 3g을 첨가하여 조제한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

2) 시험용액의 조제

(1) 액상시료 : 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

(2) 반유동상시료 : 채취된 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10～25mL)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

Ⅲ.3.8.1-1

(3) 고체시료 : 채취된 시료의 일정량(10～25g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른 후 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다. 여기에 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)를 가해서 일정량(100～250mL)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

(4) 분말상시료 : 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

(5) 캡슐제품류 : 캡슐을 포함하여 시료의 일정량(10～25g)을 취한 후 9배 양의 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

이와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)를 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1,000배… 희석액을 만들어 사용한다.

시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10cm의 부근까지 70% 알콜탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.

(6) 냉동제품은 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올솜으로 잘 닦은 후 상기 가～마의 방법으로 시험용액을 조제한다.

3) 시험의 조작

앞의 시험용액 1mL와 각 단계 희석액(멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)) 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하여 약 43～45℃로 유지한 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 약 15mL를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 냉각응고 시킨다. 이 경우 시료를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분이상 경과하여서는 안된다. 냉각 응고시킨 페트리접시는 거꾸로 하여 35～37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다. 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다. 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판 당 30～300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9cm의 페트리접시인 경우에는 1cm2내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

Ⅲ.3.8.1-2

4) 유산균수의 기재보고

시료 1mL 중의 유산균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1mL 중(1g 중)의 유산균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

Ⅲ.3.8.1-3

Ⅲ.3.8.2 비피더스균(Bifidobacterium)

1) 시료 1mL에 펩톤식염완충액을 가하여 10mL가 되게 한 다음 잘 혼합한다.

2) 1) 의 검액(10-1용액) 1mL에 희석액을 가하여 10mL가 되게 하고 10-2 검액을 만든 후 동일하게 조작하여 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 검액을 조제한다.

3) 각 희석검액 0.1mL씩을 각각 BL한천배지(배지 15)상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다.

4) 이때 대조시험으로 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1mL을 배지에 가한 것을 대조로 하여 페트리접시, 희석용액, 배지 및 조작이 무균적이었는지 여부를 확인한다.

5) 배지를 혐기성 상자에 넣고 37℃에서 48～72시간 배양한다. 배양 후 집락을 계수하고 희석배수(×10)를 곱하여 시료 mL당 생균수를 산출한다. 생균수 산출방법은 (1) 유산구균 및 간균에 따른다.

6) 배양후 BL한천평판상의 균의 성장

(1) Bifidobacterium longum

유갈색～황갈색의 반구상으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 약 1.0～2.0mm의 집락을 형성한다.

(2) Bifidobacterium bifidum

유갈색～회색으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 0.5～1.5mm정도의 원형집락을 형성한다.

(3) Bifidobacterium breve

유백색～유갈색의 반구형으로 중심부가 융기된 직경 1.0～2.0mm의 원형 집락을 형성한다.

Ⅲ.3.8.2

Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인

1. 영지버섯제품

<산성클로로포름 가용분에 의한 확인 및 정량>

1) 시험용액조제

제품 약 10g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후 추출물은 가온하여 녹인다. 이에 에탄올 100mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압농축하여 전량을 10mL이하로 한다.

농축물을 물 200mL에 분산하여 2N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 조제시료로 한다.

2) 표준물질의 조제

해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건조물 약 10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100mL를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10ml이하로 한다. 농축물을 물 200mL에 분산하여 2N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구한다.

3) 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 시료 3～10mg을 정확히 달아 내부 표준용액 1mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3～10mg을 정확히 달아 내부표준용액 1mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다. 검액 및 표준용액 10μL씩을 다음의 조건하에서 고속액체크로마토그래프하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

Ⅲ.3.8.3-1

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

(가) 자실체 가공제품의 경우

- 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1mg/ml)

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254nm)

- 칼럼∶내경 4mm, 길이 25～30cm의 스테인레스관에 5～10μm의 옥타데실화 실리카겔(μ-Bondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶40℃

- 이동상∶2% 초산수용액‧아세토니트릴(2∶1)

- 유량∶티몰의 머무름 시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

- 칼럼의 선택∶표준용액 10μl에 대해 상기 조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 2.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 A(Ganoderic acid A)>과 내부표준물질의 분리도가 2.0 이상의 것을 사용한다.

(나) 배양물을 가공한 제품의 경우

- 내부표준용액∶파이렌의 에탄올 용액(10μg/ml )

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장∶210nm)

- 칼럼∶내경 4mm, 길이 25～30cm의 스테인레스관에 5～10μm의 옥타데실화 실리카겔(μ-Bondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶실온

- 이동상∶(pH 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액)‧에탄올의 혼액(9:20)

- 유량∶파이렌의 머무름 시간이 약 30분이 되도록 조정한다.

- 칼럼의 선택∶표준용액 10μL에 대해 상기조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 1.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 S(Ganoderic acid S)>과 내부표준물질의 분리도가 6.0 이상의 것을 사용한다.

Ⅲ.3.8.3-2

4) 정량시험

(1) 자실체 또는 배양물을 가공한 제품의 경우

시료 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음 식에 의거하여 구한다.

시료의 산성클로로포름 가용분(mg)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

시료채취량(g)

영지함유율(건조물환산율 %)＝ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ×100

표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

표준자실체 또는 표준배양물의 건조물량(g)

(2) 자실체와 배양물을 혼합하여 가공한 제품의 경우

확인시험에 의해 얻은 시료 및 표준물질의 액체크로마토그램의 내부표준물질이 피크 면적에 대한 지표물질(자실체에 있어서는 가노데린산 A배양물에 있어서는 가노데린산 S)의 피크 면적비와 QtA, QsA 및 QtS, QsS를 구하여 다음 식에 의거 계산한다.

영지의 함유율(건조물 환산율)(%)

＝ <영지자실체 함유율(M)>＋<영지배양물함유율(N)>

M＝[eqn: rm { Q sub t A(조제검체)/(검체 채취량(g)} over {Q subs A(표준물질)/표준자실체 건조물량(g)} ×100]

N＝[eqn: rm { Q sub t S(조제검체)/(검체채취량(g)} over { Q subs S(표준물질)/"표준배양물의 건조물량(g)"}]×100(%)

2. 운지버섯

<산성클로로포름가용분에 의한 확인 및 정량>

1) 시료의 조제

제품 약 10g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고, 물 100mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10mL 이하로 한다. 농축물을 물 200mL에 분산하여 2N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50mL씩으로 3회 추출한다.  물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 이를 조제시료로 한다.

Ⅲ.3.8.3-3

2) 표준물질의 조제

해당 제품의 원료 자실체 건조물의 분말 또는 배양물의 건조물 약 10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100mL를 가하여 냉각판을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10mL이하로 한다. 농축물을 물 200mL에 분산하여 2N 염산으로 pH3으로 한 후 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하여 이를 조제표준물질로 한다.

3) 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제시료 3～10mg을 정밀히 달아 내부표준용액 1mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료운지버섯의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제표준물질 3～10mg을 정확히 달아 내부표준용액 1mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10μL씩을 다음의 조건하에 고속액체크로마토그래프를 할 때 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

(1) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

- 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1mg/mL)

- 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254nm)

- 칼럼∶내경 4mm, 길이 25～30cm의 스테인레스관에 5～10μm의 옥타데실화실리카겔(μ-Bondapak C18 상당품)을 충전한 것

- 칼럼온도∶40℃

- 이동상∶2% 초산수용액∶아세토니트릴(2∶1)

- 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

Ⅲ.3.8.3-4

4) 정량시험

시료 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음 식에 의거 함량을 구한다.

운지자실체 또는 균사체(건조물환산율)(%)

시료의 산성클로로포름 가용분(mg)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

시료의 채취량(g)

＝  ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ × 100

표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

표준자실체 또는 표준 배양추출물의 건조물량(g)

3. 표고버섯

1) 장치 및 기구

(1) 전개조∶200mm×200mm 유리판의 사용이 가능한 유리재질로 기밀한 것

(2) 실리카겔박층판 : 박층크로마토그래피용 실리카겔 30g에 물 50mL를 가하여 섞은 후 유리판(200mm×200mm)에 0.3～0.5mm의 두께로 도포한다. 풍건 후 105～110℃에서 3시간 건조하고 데시케이타중에서 방냉하여 보존한다.

(3) 자외선등(365nm) : 탁상형 또는 휴대형

2) 시약 및 시액조제

(1) 무수에탄올(특급)

(2) 1N 암모니아용액 : 농암모니아수(28%) 67ml를 취하여 물을 가해 1L로 한다.

(3) 0.5N 초산용액 : 초산(특급) 29mL를 취해 물을 가해 1L로 한다.

(4) 전개용매:nꠀ부탄올(특급), 초산(특급), 증류수를 4:1:2(용량비)로 혼합한다.

(5) 이온교환수지 : Amberlite IRꠀ120B(H형), Amberlite IRAꠀ45(OH형)

(6) 닌히드린용액 : 물로 포화시킨 nꠀ부탄올에 닌히드린(특급)을 용해하여 0.2%로 한 용액

3) 표준용액의 조제

(1) 표준물질의 조제∶원료인 건조표고버섯 및 관리배양한 표고균사 10g을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액을 모아 감압농축하여 액량을 20mL로 한다.

Ⅲ.3.8.3-5

(2) 표준용액의 조제∶표준물질에 4배량의 무수에탄올을 가해 80% 에탄올용액으로 하고 생성한 침전을 원심분리하여 제거한다. 상등액을 감압농축하여 에탄올을 제거하고, 분액여두에 옮겨 동량의 에테르로 2회 추출하고 그 에테르층을 제거한다. 에테르를 완전히 제거한 후 물층에 10g의 Amberlite IRꠀ120B(H형)을 가해 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착된 수지를 물로 세척한 후 1N NH4OH를 20ml 가하여 30분간 진탕하여 용출시킨다. 용출 후 10g의 Amberlite IRAꠀ45(OH형)을 가하고 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착시킨 수지를 물로 씻어낸 후 0.5N CH3COOH 20mㅣ로 30분간 흔들어서 용출시킨 후 이것을 2～3회 반복하여 용출액을 모아 감압농축하여 전량을 1mL로 하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

(1) 시료의 조제 : 원료표고버섯 자실체 또는 인공적으로 관리배양한 균사의 가공분말 또는 이들을 가공한 제품의 경우에는 원료의 10g에 해당하는 제품을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관이 부착된 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액은 합하여 감압농축하여 액량을 20mL로 한다. 단, 원료가 표고버섯의 자실체 및 인공적으로 관리배양한 균사의 추출물인 경우에는 원료 10g 상당의 제품에 20mL의 물을 가해 용해 또는 현탁한다.

(2) 시험용액의 조제 : 앞의 3) 표준용액의 조제 (2) 표준용액의 조제와 동일한 방법으로 실험하여 시험용액을 준비한다.

5) 시험조작

표준용액 및 시험용액을 실리카겔박층판(200mm×200mm)에 각각 20μl씩 직경 3～5mm로 점적한 후 전개조에서 전개시킨다. 전개된 실리카겔박층판은 풍건한 후 닌히드린용액을 분무하여 90～100℃에서 수분간 가열하여 발색한 후 발색부에 자외선(365nm)를 조사하여 형광의 반점(Elidadenin)을 비교 확인한다. 별도로 조작하여 얻은 박층판의 동일 반점부위를 긁어모아 에탄올 일정량을 가하여 추출하고 원심분리하여 액층 1cm, 파장 253.6nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 구한다.

Ⅲ.3.8.3-6

Ⅲ.3.8.4 효모수

시료 일정량을 취하여 멸균생리식염수로 최소 구획 중의 세포수가 5개 전‧후가 되도록 희석하여 혈구계산판(BürkeiꠀTürk형)에 일정량을 주입하고 검경하여 일정 구간내의 효모수를 측정하고 이 값에서 시료 1mL 중의 효모수를 산출한다.

※ 혈구계산판을 이용한 계수법 : 용액 중의 효모 및 사상균 포자수의 측정에 적용한다.

1) 장치 및 기구

혈구계산판 Bürkei형으로 Türk의 분획을 가지는 것(BürkeiꠀTürk형)

2) 시험용액의 조제

다음의 검경을 행할 때 최소구획 중의 세포수가 5개 전‧후가 되도록 생리식염수를 희석한다.

3) 시험조작

시료를 혈구계산판에 주입하고 검경하여 일정 구간내의 진균수를 측정한다. 이 값에서 시료 1mL 중의 진균수를 산출한다.

Ⅲ.3.8.4

Ⅲ.3.9. 효소활성

Ⅲ.3.9.1 α-아밀라아제

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2)시액조제

(1) 1% 가용성전분용액 : 가용성전분(최순품) 1g을 물에 녹이고 호화하여 100mL로 한다.

(2) 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0)∶0.1N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1N 구연산액을 넣어 pH 6.0 및 7.0으로 각각 만든다.

(3) 0.1% 염화칼슘용액 : 염화칼슘(순품) 1g을 물에 녹여 1L로 한다.

(4) 요오드시액 : 요오드 0.2g과 요오드칼륨 2g을 물에 녹여 100mL로 하고 그 1mL에 1N 염산 1mL를 넣고 물로 100mL로 한다.

3) 시험용액의 조제

시료 5.0g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20mL 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성전분용액 5mL, 맥바인완충액(pH 6.0 또는 7.0으로서) 13mL와 0.1% 염화칼슘용액 1mL를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1mL를 넣은 후 37℃에서 30분간 방치한다. 별도로 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1mL를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용 반응액 0.2mL에 요오드시액 10mL를 넣은 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1cm 파장 660nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

Ⅲ.3.9.1

Ⅲ.3.9.2 프로테아제

1) 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

2) 시액조제

(1) 0.6% 카제인용액 : 카제인(최순품)을 건조하여 0.6g을 달아 0.1N 수산화나트륨액 20mL에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20mL를 넣어 100mL로 한다.

(2) 0.4M 삼염화초산액 : 삼염화초산(순품) 65.4g을 물에 녹여 1L로 한다.

(3) 0.4M 탄산나트륨액 : 탄산나트륨(순품) 42.5g을 물에 녹여 1L로 한다.

(4) 포린시액 : 식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.

(5) 완충액 : 0.1M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0)

3) 시험용액의 조제

시료 약 5.0g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1mL를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1mL를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4M 삼염화초산액 2mL를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1mL를 시험관에 정확히 취하여 0.4M 탄산나트륨용액 5mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4M 삼염화초산액 2mL를 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인용액 1mL를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.

3) 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 660nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

Ⅲ.3.9.2

부  칙

제1조(시행일)이 고시는 2008년 6월 1일부터 시행한다.

제2조(경과조치)①이 고시 시행 전인 2008.5.31까지「건강기능식품에 관한 법률」에 따라 건강기능식품 제조업 영업허가를 받은 자가 동법 제7조에 따른 품목제조신고를 할 경우 2009.12.31까지 종전고시의 기준 및 규격에 따를 수 있으며 해당제품의 유통기간까지 판매할 수 있다.

②이 고시 시행 전인 2008.5.31까지「건강기능식품에 관한 법률」에 따라 건강기능식품 수입업 영업신고를 필한 자가 동법 제8조에 따른 수입신고를 할 경우 2009.12.31까지 종전고시의 기준 및 규격에 따를 수 있으며 해당제품의 유통기간까지 판매할 수 있다.

③이 고시 시행전 품목제조신고를 필한 품목이 이 고시에 부합되지 않는 때에는 2009년 12월 31일까지「건강기능식품에 관한 법률 시행규칙」제8조에 따라 새로이 품목제조신고를 하거나 동법 시행규칙 제9조에 해당하는 경우에는 품목제조신고사항변경신고를 하여야 한다.

제3조(유효기간)이 고시 제3장 개별 기준 및 규격, 7. 일반원료는 2009년 12월 31일까지 유효하다. 다만, 기능성 내용을 입증할 수 있는 자료를 제출하여 인정받은 것은 제외한다.