식품의약품안전청 고시 제2008-51호

식품의 기준 및 규격 개정 고시

2008. 8. 13

식품의약품안전청

식품의약품안전청 고시 제2008-51호

식품의 기준 및 규격 일부개정 고시

1. 개정이유

식품 중 동물용의약품의 잔류기준적용 원칙, 조미건어포류에 대한 황색포도상구균 정량규격, 농산물의 안전성 확보를 위한 농약잔류허용기준, 정제형태 식품제조가능 범위 확대, 농산물에 대한 보존 및 유통기준 완화 및 이물시험법, MCPD 시험법, GMO 시험법 등을 제․개정하여 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함

2. 주요내용

가. 동물용의약품 기준적용 대상식품 명확화 및 적용기준 원칙 신설

〔제2. 5. 11). (1)〕

(1) 동물용의약품에 대한 적용원칙 및 범위를 명확히 하고자 함

(2) 식품 중 검출되어서는 아니 되는 물질의 적용범위를 축산물 및 동물성 수산물과 그 가공품으로 한정하고, 잔류기준이 없는 동물용의약품의 기준적용원칙 신설

(3) 합리적이고 과학적인 안전관리

나. 식품 중 의약품성분(비만치료제, 당뇨병치료제 등) 불검출 기준 마련

〔제2. 5. 12)〕

(1) 식품 중 의약품성분 및 의약품유사성분의 식품 혼입 금지함

(2) 발기부전치료제유사물질, 비만치료제, 당뇨병치료제 등을 식품 중 불검출 기준을 신설함

(3) 부정불량식품의 안전관리

다. 냉장 과일 및 채소류에 대한 보존 및 유통기준 완화 〔제 2. 6. 8)〕

(1) 수입과일(오렌지, 키위 등) 및 채소류(브로콜리, 당근 등) 중 보존기간 연장을 위해 냉장으로 수입하여 실온에서 판매하는 제품에 대해 현실적인 면을 고려할 필요가 있음

(2) 냉장제품을 실온에서 유통시켜서는 아니 되는 품목에서 과일·채소류를 제외함

(3) 현실성 있는 유통기준 확보

라. 식염, 장류 등 일부식품에 대해 정제형태로 제조가능 하도록 기준 완화 〔제2. 3. 12)〕

(1) 식품의 섭취편의성 및 휴대성 등 소비자욕구에 따라 다양한 식품의 개발을 위해 의약품과 오인․혼동할 우려가 없는 식품에 대해 정제형태로 제조가능 하도록 제조가공기준을 완화함

(2) 식염, 장류, 복합조미식품, 당류가공품을 정제형태로 제조가능하도록 제조가공기준 개정함

(3) 다양한 식품의 개발 및 운송비 절감, 소비자 섭취편의성 발생

마. 조미건어포류 중 황색포도상구균 정량규격 신설 〔제5. 28. 5) (3)〕

(1) 더 이상의 가공, 가열조리 없이 그대로 섭취하는 식품에 대해서는 불검출 기준을 정하고 있으나 균의 특성, 제조공정, 식품의 특성, 위해정도 등을 감안하여 정량규격으로 설정이 필요함

(2) 정량규격으로 g 당 100 이하로 신설함

(3) 과학적인 위생관리

바. 농산물의 농약 및 축․수산물의 동물용의약품 잔류허용기준 신설

(별표 4, 별표 5 및 별표 7)

(1) 사용등록된 농약 및 동물용의약품의 잔류허용기준을 신설하여 농․축․수산물에 대한 안전성을 확보하고자 함

(2) 농약의 잔류허용기준  및 동물용의약품의 잔류허용기준을 추가 신설함

(3) 농․축․수산물에 대한 안전성확보

사. 이물(쇳가루), 일산화탄소, MCPD, 벤조피렌, GMO, 동물용의약품, 기생충(란)시헙법 및 방사선조사식품검지법 등 개정〔제6, 2, 5) 및 제10〕

(1) 보다 과학적이고 효율적인 분석업무수행을 위해 시험법을 추가 신설하고자 함

(2) 환제품에 대한 금속성이물(쇳가루) 시험법의 명확화 및 일산화탄소처리 유무를 판단할 수 있는 시험법, MCPD, 벤조피렌, GMO(옥수수 2종(MON863, DAS59122-7)의 검사법을 추가), 동물용의약품 잔류시험법,  기생충(란)시헙법, 방사선조사식품검지법 등을 제․개정

(3) 과학적인 분석업무 수행

3. 시행일

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제 2, 5, 11), (1) 중 ⑤항은 2010년 1월 1일부터, 별표 5는 2009년 1월 1일부터, 별표 7은 2008년 11월 1일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행 당시 접수되어 검사가 진행중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용한다. 다만, 발기부전치료제 유사물질의 경우 이 고시 시행 전 접수되어 검사가 진행 중인 사항도 이 고시를 적용한다.

4. 기타참고사항

가. 관계법령 : 식품위생법 제7조 및 제12조

나. 규제실시 : 해당사항 없음

다. 예산 : 별도조치 필요없음

라. 합의 : 해당사항 없음

마. 기타사항

식품의약품안전청 고시 제 2008-51호

식품의 기준 및 규격 일부개정 고시

식품의 기준 및 규격 중 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 2, 3, 12) 중 “다만, 정제형태의 제품으로서 의약품으로 혼동할 우려가 없는 정도로 제조된 과자는 제외한다.”를 “ 다만, 정제형태로 제조된 과자류, 식염, 장류, 복합조미식품, 당류가공품은 제외한다.”로 한다.

제2, 5, 3), (2)를 삭제하고, (3)을 (2)로 한다.

제 2, 5, 10), (1) 중 “이 공전에서 잔류허용기준이 정하여지지 아니한 경우에는 아래에 따라 적용한다.”를 “농산물에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다.”로 하고, ①부터 ③까지를 다음과 같이 하며, ④ 중 과실류의 장과류에 “머루, 복분자(산딸기, 나무딸기 포함)”를 신설하고, 채소류의 엽채류에 “뉴그린, 다청채, 당귀잎”을 신설한다.

① 당해 농산물에 대한 CODEX 기준

② 「식품의 기준 및 규격」중 별표 4 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중 당해농산물과 ④에서 정한 동일 대분류군(단, 견과종실류, 과실류 및 채소류에 한해서는 소분류를 우선 적용)에 속한 농산물의 최저기준

③ 「식품의 기준 및 규격」중 별표 4 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중 최저기준

제 2, 5, 10), (5) 중 “우리나라의 농약잔류허용기준 중 기준이 설정되어 있지 아니한 가공식품중 농약 검출시 적․부 판정에 대한 기준은 다음과 같이 한다.”를 “가공식품에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다.”로 한다.

제 2, 5, 11), (1) 중 ①을 다음과 같이 하고, ④ 및 ⑤를 각각 다음과 같이 신설한다.

① 관련 법령에서 안전성 및 유효성에 문제가 있는 것으로 확인되어 제조 또는 수입 품목허가를 하지 아니하는 동물용의약품(대사물질 포함)은 검출되어서는 아니 된다. 이에 해당되는 주요 물질은 아래와 같으며, 아래에 명시하지 않은 물질에 대해서도 관련 법령에 근거하여 본 항을 적용할 수 있다.

번호	식품*1 중 검출되어서는 아니 되는 물질
1	니트로푸란{푸라졸리돈(Furazolidone), 푸랄타돈(Furaltadone), 니트로푸라존(Nitrofurazone), 니트로푸란토인(Nitrofurantoine), 니트로빈(Nitrovin) 등} 제제 및 대사물질*2
2	클로람페니콜(Chloramphenicol)
3	말라카이트 그린(Malachite green) 및 대사물질
4	디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)
5	디메트리다졸(Dimetridazole)
6	클렌부테롤(Clenbuterol)
7	반코마이신(Vancomycin)
8	클로르프로마진(Chlorpromazine)
9	티오우라실(Thiouracil)
10	콜치신(Colchicine)
11	피리메타민(Pyrimethamine)
12	메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)

*주1. 축산물 및 동물성 수산물과 그 가공식품에 한한다.

*주2. 니트로푸라존의 대사물질인 세미카바자이드(Semicarbazide, SEM)는 비가열 축산물 및 동물성 수산물(단순절단 포함)에 한하여 적용한다.

④ 개별동물에 대한 국내 및 국제식품규격위원회의 기준이 없을 시 유사축종의 잔류허용기준 중 해당부위의 최저기준을 준용한다. 즉, 포유류 중 기준이 없는 반추동물 및 말, 기준이 없는 비반추동물과, 기준이 없는 가금류는 기준이 정해진 반추동물, 비반추동물 및 가금류의 기준 중 해당부위의 최저기준을 각각 적용하며, 로얄젤리 및 프로폴리스는 벌꿀의 기준을 적용한다.

⑤ 「식품의 기준 및 규격」 및 국제식품규격위원회에도 잔류기준이 없는 동물용의약품 중 항생물질 및 합성항균제에 대하여 축․수산물(유, 알 포함) 및 벌꿀(로얄젤리, 프로폴리스 포함)의 잔류기준을 0.03 mg/kg으로 적용한다.

제 2, 5, 12), (1)을 (2)로 하고, (1)을 다음과 같이 신설한다.

(1) 아래의 발기부전치료제․당뇨병치료제․비만치료제 등과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질 : 검출되어서는 아니된다(단, 동성분과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질로서 따로 기준․규격이 정하여진 것은 제외한다).

㉮ 발기부전치료제

a. 실데나필(Sildenafil)

(C22H30N6O4S, 474)

b. 타다라필(Tadalafil)

(C22H19N3O4, 389)

c. 바데나필(Vardenafil)

(C23H32N6O4S, 488)

d. 유데나필(Udenafil)

(C25H36N6O4S, 516)

e. 미로데나필(Mirodenafil)

(C26H37N5O5S, 531)

㉯ 당뇨병치료제

a. 글리벤클라미드(Glibenclamide)

(C23H28ClN3O5S, 493)

b. 글리클라짓(Gliclazide)

(C15H21N3O3S, 323)

c. 글리피짓(Glipizide)

(C21H27N5O4S, 445)

d. 글리메피리드(Glimepiride)

(C24H34N4O5S, 490)

㉰ 비만치료제

a. 시부트라민(Sibutramine)

(C17H26ClN, 279)

b. 오르리스타트(Orlistat)

(C29H53NO5, 495)

㉱ 기타

a. 펜플루라민(Fenfluramine)

(C12H16F3N, 231)

b. 리오치로닌(Liothyronine)

(C15H12I3NO4, 651)

c. 레보치록신(Levothyroxine)

(C15H11I4NO4, 777)

d. 에페드린(Ephedrine)

(C10H15NO, 165)

제 2, 5, 12), (2)부터 (3)까지를 각각 (4)부터 (5)까지로 하고, (2)〔종전의 (1)〕중 “발기부전치료제 성분(실데나필, 타다라필, 바데나필, 유데나필, 미로데나필)과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질 : 검출되어서는 아니된다.(단, 발기부전치료제와 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질로서 따로 기준․규격이 정하여진 것은 제외한다.)”을 “벤질실데나필 (benzylsildenafil) : 검출되어서는 아니된다.”로 하며, (3)을 다음과 같이 신설한다.

(3) 비만치료제 유사물질

① 데스메틸시부트라민 (desmethylsibutramine) : 검출되어서는 아니된다.

제 2, 6, 8) 중 후단을 삭제하고, 제 2, 6, 9)부터 17)까지를 각각 10)부터 18)까지로 하며, 제 2, 6, 9)를 다음과 같이 신설한다.

9) 냉장제품을 실온에서 유통시켜서는 아니된다(단, 과일·채소류 제외)

제 5, 2, 5) 중 (3) 및 (4)를 각각 다음과 같이 한다.

(3) 삭카린나트륨 : 검출되어서는 아니된다.

(4) 보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

프로피온산 프로피온산나트륨 프로피온산칼슘	2.5 이하(프로피온산으로서 기준하며, 빵 및 케이크류에 한한다)
소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	1.0 이하(소르빈산으로서 기준하며, 팥 등 앙금류에 한한다)

제 5, 3, 6) 중 (1)을 다음과 같이한다.

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 5, 6) 중 (3)을 다음과 같이한다.

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 6, 6) 중 (4)를 다음과 같이한다.

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 7, 6) 중 (4)를 다음과 같이한다.

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 8, 6) 중 (3)을 다음과 같이한다.

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 9, 6) 중 (2)를 다음과 같이한다.

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 10, 6) 중 (2)를 다음과 같이한다.

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 11, 5) 중 (8)을 다음과 같이 한다.

(8) 보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	2.0 이하〔소르빈산으로서, 식육가공품(양념육류, 분쇄가공육제품, 갈비가공품 제외)에 한한다〕

제 5, 13, 5) 중 (3)을 다음과 같이한다.

(3) 타르색소 : 검출되어서는 아니된다.

제 5, 16, 6) 중 (2) 및 (3)을 다음과 같이한다.

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(3) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 17, 6) 중 (1) 및 (2)를 다음과 같이한다.

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 18-1, 6) 중 (2)를 다음과 같이한다.

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 18-5, 6) 중 (3) 및 (4)를 다음과 같이한다.

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(4) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 19-4, 6) 중 (6)을 다음과 같이한다.

(6) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 21-5, 5), (4) 위화물 중 “전분, 겨, 탄산염, 식염, 당류 등”을 “전분, 겨, 탄산염, 식염 등”으로 한다.

제 5, 21-6, 3) 중 (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 고추 또는 고춧가루를 함유한 향신료조제품 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니된다.

제 5, 24, 5)에 (5)를 다음과 같이 신설한다.

(5) 대장균 : 음성이어야 한다(다만, 액젓, 조미액젓은 제외한다)

제 5, 24, 6)에 (6)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 대장균

제 10. 일반시험법 8. 미생물시험법 6) 대장균에 따라 시험한다.

제 5, 28, 5)에 (3)을 다음과 같이 신설한다.

(3) 황색포도상구균 : 1 g 당 100 이하(다만, 조미건어포류에 한한다)

제5, 28, 6)에 (3)을 다음과 같이 신설한다.

(3) 황색포도상구균

제 10. 일반시험법 8. 미생물시험법 14) 황색포도상구균 (2) 정량시험법에 따라 시험한다.

제 5, 29-1, 4) 중 (2)를 다음과 같이한다.

(2) 땅콩 또는 견과류가공품

땅콩 또는 견과류를 단순가공하거나 이를 주원료로 하여 설탕, 식용유 등의 식품이나 식품첨가물을 가하여 가공한 것을 말한다.

제 5, 29-2, 6) 중 (3)을 다음과 같이한다.

(3) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 5, 29-12, 6) 중 (8)부터 (10)까지를 각각 다음과 같이한다.

(8) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(9) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(10) 카드뮴

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제 6, 2, 5), (2) 중 ④ 및 ⑤를 각각 다음과 같이 하고, ⑥을 삭제하며,  ⑦부터 ⑨까지를 각각 ⑥부터 ⑧까지로 한다.

④ 칼 럼 : HP-MOLSIV 캐필러리 칼럼 (30 m×0.53 mm ID, 25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

⑤ 칼럼온도 : 초기의 온도 60℃에서 시료를 주입하고 1분간 유지한 후 2분 동안 120℃까지 상승시켜 2분간 유지한다.

제 6, 2, 5), (3), ① 중 가)를 다음과 같이 한다.

가) 시험방법

㉠ 시료를 해동한 직후 껍질을 벗긴 다음 세절하고 300 g을 정밀히 달고 2배량의 약 4℃로 냉각된 물을 가한 후 빙냉하에서 균질화(참치의 경우 30초, 틸라피아의 경우 1분)하여 이를 시료액으로 한다.

㉡ 시료액 200 g을 원심분리관에 취하여 10℃에서 원심분리(3,000 G, 10분)하고 상층액을 얻는다.

㉢ 상층액 50 mL를 100 mL헤드스페이스병에 넣고 n-옥틸알콜 5방울, 물 5 mL, 20% 황산 20 mL를 가하고 밀봉한 후 2분간 강하게 진탕한다. 10분간 정치한 후 다시 1분간 진탕하고 병속의 기체층을 가스타이트시린지로 1 mL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입한다.

㉣ 별도로 표준 일산화탄소가스를 청정공기 또는 질소가스로 적정농도로 희석한 후 1 mL를 가스타이트시린지로 기체크로마토그래프에 주입하고 얻어진 피크면적으로 부터 검량선을 작성하여 시료중의 일산화탄소량을 구한다.

어육중의 일산화탄소농도를 구할 때는 다음의 계수를 이용한다.

일산화탄소 표준가스 1 mL(20℃)의 중량 ＝ 표준가스의 일산화탄소의 농도 × 1.165 mg

㉤ 이 때, 검출된 일산화탄소 농도가 틸라피아에서는 20 ㎍/g 이상, 참치에서는 200 ～ 500㎍/g이 검출된 경우, ㉠의 시료액을 개봉된 용기에 넣고 공기순환이 가능한 저장장치를 이용하여 5℃에서 2일간 육막이 형성되지 아니하도록 교반하면서 보존한 후, ㉡ ～ ㉣의 과정을 거쳐서 일산화탄소의 잔류량을 측정한다.

㉥ ㉠의 시료액과 이를 5℃에서 2일간 보존 한 시료액의 일산화탄소 잔류량 변화를 비교하여 인위적 일산화탄소 처리유무의 판정에 이용한다.

제 6, 2, 5), (3), ①, 나), ㉢ 중 “명확하게”를 “10% 이상”으로 한다.

제 10, 7, 1), (5), ① 중 “검체(분말제품 500g, 액상제품 1 kg)를 증류수 5～ 6 L와 혼합 후”를 “검체(분말제품 및 환제품 500g, 액상 및 페이스트제품 1 kg)를 증류수 5～ 6 L와 혼합 후 (환제품의 경우 2시간 이상 정치하여 시료를 으깸)”로 한다.

제 10, 7, 1) 중 (6)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 김치 중 기생충(란) 시험법

① 장치

㉮ 광학 현미경(100배～400배 검경 가능한 것)

㉯ 원심분리기(swinging bucket rotor가 장착된 것)

② 기구

㉮ 2 L 비이커

㉯ 18 mesh 체 및 35 mesh 체

㉰ 50 mL conical centrifuge tubes

㉱ 10 mL 일회용 주사기 (19 G 바늘 달린 것)

㉲ 현미경용 슬라이드글라스, 커버글라스 (20 x 40 mm)

㉳ 액량계 2 L

③ 시약 및 시액

㉮ 포르말린

㉯ Tween 80

㉰ 포화 sucrose 용액

sucrose 128 g을 80～90℃ 증류수 100 mL를 넣어 녹인 다음 상온이 될 때까지 식힌다. 포화 sucrose 용액에 포르말린 원액 400 μL를 넣고 잘 흔들어서 섞어 준다.

㉱ 세척액(0.5% sodium dodecyl sulfate, SDS) : SDS 0.5 g을 적당량의 물에 녹이고 Tween 80 0.1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 100 mL로 한다.

④ 시험용액의 조제

㉮ 검체 200 g을 2 L의 세척액에 담근다.

㉯ 검체를 건져내고, 침전물을 18메쉬 체(1 × 1 mm) 및 35메쉬 체  (0.5 × 0.5 mm)로 연속해서 걸러 고춧가루 등 고형물을 제거한다.

㉰ 여과액을 2L 액량계에 모으고 30분간 두었다가 200 mL를 남기고 조심스럽게 상층액만을 버린다.

㉱ 같은 방법으로 증류수로 2차례 반복하여 세정한다. 침전물을 50 mL conical centrifuge tubes에 옮겨 1,000 G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버린다.

㉲ 김치 침전물을 1 mL씩 3개의 50 mL conical centrifuge tube에 각각 옮겨놓고 부유액(포화 sucrose 용액) 10 mL를 넣고 잘 흔들어서 김치 침전물이 부유액과 섞이도록 한 후 conical centrifuge tube 상단 10 mm 전까지 부유액을 채운다.

㉳ 50 mL conical centrifuge tube를 swinging bucket rotor가 장착된 원심분리기에서  1,000 G로 15분간 원심분리 한다.

㉴ 원심분리 후 conical centrifuge tube가 흔들리지 않도록 조심스럽게 꺼내어 미리 준비해 둔 부유액(포화 sucrose 용액)이 채워진 주사기의  바늘을 conical centrifuge tube의 한쪽 벽에 대고 조심스럽게 천천히 용액을 주입하여 conical centrifuge tube 상단으로 액면이 약간 볼록하게 솟아  오르도록 한다.

⑤ 검경

㉮ conical tube의 솟아 오른 액면 위에 22 × 40 mm 커버글라스를 살짝 올려서 부유물을 붙게 한 후 커버글라스를 슬라이드글라스 위에 올려놓고 tube 한 개당 2～3장의 슬라이드 표본을 제작하여 검경한다.

㉯ 검체 슬라이드를 광학현미경에서 100배로 검경하다가 충란 유사 물체가 관찰되면 400배로 확인한 후 크기를 계측하고 동정한 다음 기록한다.

제 10, 8, 1), (2) 중  및 를 각각 다음과 같이 신설한다.

Bismuth Sulfite 한천배지

Peptone	10 g
Beef extract	5 g
Dextrose	5 g
Na2HPO4(anhydrous)	4 g
FeSO4(anhydrous)	12 g
Bismuth sulfite(indicator)	8 g
Brilliant green	0.025 g
Agar	20 g
Distilled water	1,000 mL

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 1분간 끓이고 pH를 7.2로 조정하여 사용한다.

PALCAM 한천배지(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar)

Peptone	23 g
Columbia agar	13 g
Manitol	10 g
NaCl	5 g
Starch	1 g
Ferric ammouium citrate	0.5 g
Esculin	0.8 g
Dextrose	0.5 g
Lithium chloride	15.0 g
Phenol red	0.08 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 polymyxin B sulfate 10 mg, acriflavin 5 mg, ceftazidime 20 mg을 증류수 2 mL에 녹여서 여과 멸균하여 가한다.

제 10, 8, 13) 중 (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey 한천배지(배지 30) 또는 desoxycholate citrate 한천배지(배지 31) 또는 XLD한천배지(배지 58) 또는 bismuth sulfite 한천배지(배지63)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 전형적인 집락은 확인시험을 실시한다.

제 10, 8, 17), (1) 중 ②를 다음과 같이 한다.

② 분리배양

카나마이신(kanamycin)을 200 μg/mL의 농도로 가한 난황 첨가 Clostridium  perfringens 한천배지(배지 27) 또는 TSC 한천배지(배지41)에 증균배양액을 접종하여 35℃에서 18～24시간 혐기배양한 결과 Clostridium perfringens 한천배지에서 직경 2mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 TSC 한천배지에서 불투명한 환을 가지는 황회색 집락은 확인시험을 실시한다.

제 10, 8, 18) 중 (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 분리배양

증균배양액을 멸균된 면봉을 이용하여 Oxford 한천배지(배지 38) 또는 lithium chlorideꠀ phenylethanolꠀmoxalactam 한천배지(배지 39) 및 PALCAM 한천배지(배지64)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 tryptic soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다.

제 10, 8, 19) 중 (2)를 다음과 같이 한다

(2) 분리배양

증균배양액을  cefixime (0.05 ㎍/L) 및 potassium tellurite(2.5 ㎍/mL)가 첨가된 MacConkey sorbitol 한천배지(배지 43)에 접종하여 35℃에서 18시간 배양한다. Sorbitol을 분해하지 않는 무색집락을 취하여 EMB 한천배지(배지 6)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하고, 녹색의 금속성 광택이 확인된 집락은 확인시험을 실시한다.

제 10, 14.를 다음과 같이 한다.

14. 3-MCPD(3-Monochloropropane-1,2-diol) 시험법

검체를 알루미늄옥사이드와 혼합하여 크로마토그래프용 유리칼럼에 충진한 다음 디클로로메탄으로 추출하고 HFBA (heptafluorobutyric anhydride)로 유도체화한 후 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석하는 방법이다.

(1) 장치

① 기체크로마토그래프 ․ 질량분석기(GC/MS)를 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 디클로로메탄 : 잔류 농약 시험용 또는 이와 동등한 것

② 유도체시약 : HFBA(Heptafluorobutyric anhydride)

③ 알루미늄옥사이드 : 알루미늄옥사이드(150 mesh) 또는 이와 동등한 것.

④ 표준원액 : 3-MCPD 표준품을 초산에틸에 녹여 1000 ug/mL로 조제한다.

⑤ 표준용액 : 위의 표준원액을 초산에틸로 희석하여 4개 이상의 적당한 농도로 조제한다.

⑥ 내부표준원액 : 3-MCPD-d5 표준품을 초산에틸에 녹여 1000 ug/mL로 조제한다.

⑦내부표준용액 : 위의 내부표준원액을 초산에틸로 희석하여 적당한 농도로 조제한다.

⑧ 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것.

(3) 시험 용액의 조제

① 추출

균질화한 검체 5 g을 정확이 달아 5 M NaCl용액을 가하여 30 mL가 되게 한 뒤 10분간 진탕한 후 원심분리 한다. 이 상층액 2 mL를 취해 알루미늄옥사이드 4 g과 내부표준용액 10 uL를 첨가하여 혼합한 후 크로마토그래프용 유리칼럼(25 mm x 200 mm)에 충진한다. 그리고, 충진물 상단에 무수황산나트륨 약 1 g을 가한 뒤 디클로로메탄 30 mL을 분당 약 2 mL 정도로 용출한다.

용출액을 농축플라스크에 모아 35℃의 수욕조에서 1 mL로 감압농축 한 후 농축액을 파스퇴르 피펫을 이용하여 눈금이 있는 시험관으로 옮긴다. 플라스크에 남아있는 잔류물을 디클로로메탄으로 씻어 시험관에 합친 후, 35℃의 수욕조에서 건조수준으로 질소 농축한다.

단, 지방함량이 많은 시료는 크로마토그래프용 유리칼럼 용출단계에서 먼저 헥산 20 mL로 과량의 지방성분을 제거한 후 디클로로메탄으로 용출하여 상기와 같은 방법으로 농축과정을 거친다.

② 유도체화

위의 농축 시험관에 이소옥탄 1 mL 및 HFBA 150 uL를 첨가하여 마개를 닫고 60℃의 수욕조에서 교반하며 30분간 반응시킨 후 상온에서 10분간 방치한 다음 증류수 5 mL를 가하고 가볍게 흔든 후 정치한다. 상층의 유기용매층을 취하여 소량의 무수황산나트륨이 들어있는 시험관에 넣어 가볍게 흔들어 정치시킨 다음 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

표준시험용액은 마개가 있는 시험관에 농축용액 대신에 이소옥탄 900 uL와 농도가 다른 4개의 표준용액 100 uL 및 HFBA 150 uL를 첨가하여 상기와 같은 순서로 유도체화한 용액을 사용한다.

(4) 시험조작

① 기체크로마토그래프 ․ 질량분석기 측정 조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS (30 m x 0.25 mm, 0.25 um) 또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 230℃

㉱ 칼럼오븐온도 : 초기의 온도 50℃에서 5분간 유지하고 분당 2℃씩 90℃ 까지 승온하여 5분간 유지한 뒤 분당 30℃씩 280℃ 까지 승온하여 3분간 유지한다.

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (0.8 mL/분)

㉳ 이온화 방법 : EI mode

㉴ 이온화 전압 : 70 eV

㉵ 특성이온질량 :

MCPD 유도체 화합물 : m/z 253, 275, 289, 291, 453

내부표준물질 유도체 화합물 : m/z 257, 278, 294, 296, 456

② 정성시험 : 위의 조건에서 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 각 피크를 표준용액의 표준물질 및 내부표준물질의 피크 머무름시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온 m/z 253, 275, 289, 291 및 453이 확인되어야 하고 특성이온 m/z 453과 253, 275, 289 및 291간 4개의 반응세기의 비(response ratio)를 3-MCPD 표준물질의 특성이온 간 반응세기의 비와 비교하여 2개 이상의 반응세기의 비가 ± 20%이내에서 일치하여야 한다.

③ 정량시험 : 검량곡선표준용액에서 얻어진 표준물질의 m/z 253 피크면적(AS)과 내부표준물질의 m/z 257 피크면적(AIS)에 대한 비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 양을 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 3-MCPD의 m/z 253 피크면적(ASAM)과 내부표준물질의 m/z 257 피크면적(ASAMIS)의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 3-MCPD함량을 다음에 따라 계산한다(정량한계 0.01 mg/kg).

계산식 :

3-MCPD함량 (mg/kg) =M × D ×  × V ×

M : 검량선에서 계산된 3-MCPD의 농도 (ng/mL)

D : 전체 시험용액양에 대한 분석에 사용한 시험용액양의 비

S : 검체 채취량 (g)

V : 유도체화 과정에서 농축 시험관에 첨가한 이소옥탄의 부피 (mL)

비고 : HVP(Hydrolyzed Vegetable Protein, 식물성 단백가수분해물)의 경우 수분함량을 측정하여 건조물 기준으로 보정하여 계산한다.

제 10, 15, 2), (2), , ㉷ 중 “마크로라이드계(타이로신(Tylosin), 에리스로마이신(Erythromycin)”을 “타이로신(Tylosin)”으로 하고, Ⓐ, ㉠ 중 “검출기 : 분광광도검출기, 형광검출기 또는 시차굴절계검출기”를 “검출기 : 분광광도검출기”로 하며, ㉡ 중 “각 항생물질의 상용표준품을”을 “타이로신 표준품을”로 하고, Ⓑ, ㉠ 중 ⓒ 및 ⓓ를 각각 삭제하며, ㉡ 중 “각각의 항생물질 표준용액”을  “표준용액”으로, “각각의 피크 머무름시간”을 “피크 머무름시간”으로, “항생물질”을 “타이로신”으로 한다.

제 10, 15, 2), (2), , ㉺ 중 “폴리펩타이드계(버지니아마이신(Virginiamycin), 바시트라신(Bacitracin)”을  “바시트라신(Bacitracin)”으로 하고, Ⓐ, ㉠ 중 “검출기 : 시차굴절계검출기 또는 분광광도검출기”를 “검출기 : 분광광도검출기”로 하며, ㉡ 중 “각 항생물질의 상용표준품의”을 “바시트라신 표준품의”로 하고, Ⓑ, ㉠ 중 ⓐ 및 ⓑ를 삭제하며, ⓒ를 ⓐ로 하고, ㉡ 중 “각각의 항생물질 표준용액”을 “표준용액”으로, “각각의 피크 머무름시간”을 “피크 머무름시간”으로 , “항생물질”을 “바시트라신”으로 한다.

제 10. 15. 2), (2), ① 중 부터 까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

반코마이신(Vancomycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료중의 반코마이신을 20% 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 반코마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 증류수로 희석하여 사용한다.

㉤ 강 양이온교환 폴리머 카트리지 :

X-C(styrene-divinylbenzene polymer surfaced with a strong cation exchanger group) 또는 MCX(Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 20% 아세토니트릴 15 mL를 가한 후 20분간 균질화한 후, 7,600 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심 분리관에 옮긴다. 남은 액에 20% 아세토니트릴 10 mL를 가하여 위의 과정을 반복한 후 상층액을 합한다. 이 상층액에 헥산 10 mL를 가하고 10분간 균질화한 후, 7,600 G에서 원심분리하고 하층액을 취한다. 위의 과정을 반복하여 하층액을 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 3 mL와 증류수 3 mL 그리고 0.1% 개미산 3 mL로 활성화시킨 X-C 카트리지에 추출용액을 흡착시킨다. 증류수 3 mL로 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 : 수산화암모늄 (97 : 3) 혼합용액 3mL로 용출시킨다. 이 용출액을 50℃에서 질소로 농축시킨 시험관에 증류수 1 mL를 넣고 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 40℃

- 이동상 : 10% 아세토니트릴 (0.1% 초산 함유)

- 유속 : 0.2 mL/min

- 주입량 : 10 μL

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Capillary temperature : 320℃

- Collision gas : Ar

- Collision energy : 20 V

㉡ 정량

- 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 1305 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 반코마이신의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
반코마이신 (분자량 1449)	725	144, 1305

- 정량한계 : 0.001 mg/kg

밤버마이신(Bambermycin, Flavomycin, Flavophospholipol)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 밤버마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 밤버마이신(플라보마이신) 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥ C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	50	50
20.0	90	10
20.1	50	50
25.0	50	50

- 유속 : 0.2 mL/min

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(negative)

- Spray voltage : 4.5 kV

- Capillary temperature : 280℃

- Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

- Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

- SIM ion : m/z 1580

아프라마이신(Apramycin), 콜리스틴(Colistin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 아프라마이신 및 콜리스틴을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 콜리스틴 및 아프라마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥ Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

㉠ 유(乳)

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취한 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 가하여 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 혼합한 후 아세토니트릴 6 mL를 가하고 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 4 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉡ 알(卵)

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가하여 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉢ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 아세톤을 2% 포함한 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C8(2.0 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
10.0	10	90
12.0	10	90
13.0	100	0
19.0	100	0

․ 유속 : 0.4 mL/min

- 질량분석기 조건

․ Ionization : ESI(positive)

․ Spray voltage : 5 kV

․ Capillary temperature : 280℃

․ Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

․ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

․ SIM ion : m/z 540(아프라마이신), m/z 585.5(콜리스틴)

㉡ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아프라마이신 및 콜리스틴의 함량을 구한다.

엔라마이신(Enramycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 엔라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 엔라마이신 표준품(엔두라시딘)을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥ 강 양이온교환 폴리머 카트리지 :

X-C(styrene-divinylbenzene polymer surfaced with a strong cation exchanger group) 또는 MCX(Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가하여 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 1 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 개미산 수용액 3 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 2 mL 및 5% 수산화암모늄 함유 메탄올 용액 2 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C8(2.0 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
10.0	10	90
12.0	10	90
13.0	100	0
18.0	100	0

- 유속 : 0.4 mL/min

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Spray voltage : 5 kV

- Capillary Temperature : 280℃

- Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

- Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

- SIM ion : m/z 786

㉡ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 엔라마이신의 함량을 구한다.

에리스로마이신(Erythromycin), 버지니아마이신(Virginiamycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료중의 에리스로마이신과 버지니아마이신을 아세토니트릴/메탄올(95:5) 용액으로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 에리스로마이신(에리스로마이신 A) 및 버지니아마이신(버지니아마이신 M1) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준용액을 냉장보관 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 30% 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

㉤ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

㉠ 어류 및 갑각류

균질화한 시료 10 g을 500 mL 원심분리관에 취하고 70% 아세토니트릴 100 mL와 하이플로슈퍼셀(Hyflo-Super Cel) 5 g을 각각 첨가하여 2분간 균질화한 후 4,000 G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 500 mL 분액깔때기에 옮기고 염화나트륨 7 g을 첨가하여 10분간 강하게 진탕, 정치시킨 후 하층액은 버린다. 상층액에 아세토니트릴포화헥산 100 mL를 첨가하여 10분간 강하게 진탕한 후 정치시킨다. 하층을 45℃에서 감압 농축한 후 잔류물은 90% 메탄올 2 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉡ 어류 및 갑각류 외 식품

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 아세토니트릴/메탄올(95:5) 용액 20 mL를 가한 후 5분간 균질화한다. 이 액을 2,500 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴포화헥산 20 mL를 가하여 15분간 흔들어 주고 2,500 G에서 10분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 멤브레인 필터로 여과한 후 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 25℃

- 이동상 : 아세토니트릴/15 mM 개미산 암모늄(개미산으로 pH4.5 조정)(40:60)

- 유속 : 0.2 mL/분

- 주입량 : 10 μL

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Capillary temperature : 350℃

- Collision gas : 아르곤(Ar)

- Collision energy : 에리스로마이신 22 V, 버지니아마이신 14 V

㉡ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, 에리스로마이신은 m/z 576 이온, 버지니아마이신은 m/z 508 이온에 대한 면적을 각각 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 에리스로마이신과 버지니아마이신 함량을 각각 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
에리스로마이신	734	576
버지니아마이신	526	508

제 10, 15, 3), (2), ⑮ 중 “도라멕틴(Doramectin), 목시덱틴(Moxidectin), 이버멕틴(Ivermectin)”을 “목시덱틴(Moxidectin)”으로 하고, ㉮ 중 “검체 중 이버멕틴류(이버멕틴, 도라멕틴) 및 목시덱틴을”을 “검체 중 목시덱틴을”로 하며, ㉰, Ⓐ 중 “도라멕틴, 목시덱틴 및 이버멕틴 표준품”을 “목시덱틴 표준품”으로 하고, Ⓑ 중 “각각의 표준원액”을 “표준원액”으로 하며, ㉲, Ⓑ 중 “해당물질”을 “목시덱틴”으로 한다.

제 10, 15, 3), (2)에  부터  까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

콜치신(Colchicine)

㉮ 정량법의 원리

시료를 0.05 M 인산완충용액으로 균질화한 후 2 M 염산으로 산성화하고 에틸아세테이트로 추출하여 감압 농축한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 콜치신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) : 1 L 메스플라스크에 1 M 제이인산칼륨(K2HPO4) 40.1 mL와 1 M 제일인산칼륨(KH2PO4) 9.9 mL를 넣고 증류수로 표시선까지 채운다.

Ⓕ 2 mM 개미산완충용액(pH 3.0) : 2 mM 개미산암모늄 1 L에 2 mM 개미산 11 mL를 넣어 혼합한다.

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 10 mL를 넣어 10분간 균질화한 후 4℃에서 8,000 G로 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 위 과정을 1회 반복하고 모아진 상층액은 2 M 염산용액으로 pH 3.5로 조정한 후 염화나트륨 0.5 g을 넣고 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 10분간 강하게 진탕한다. 4℃에서 8,000 G로 10분간 원심분리하고 에틸아세테이트층을 농축 플라스크에 취하고, 다시 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복한 후 40℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고, 잔류물은 이동상 5 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

․ 이동상 A : 2 mM 개미산완충용액(pH 3.0)

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
1.0	80	20
10.0	10	90
10.1	80	20
15.0	80	20

ⓓ 유속 : 0.2 mL/분

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 360℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, m/z 358의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 콜치신의 함량을 구한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
콜치신	400	295, 310, 326, 358

㉡ 정량한계 : 1 μg/kg

클로르프로마진(Chlorpromazine)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 클로르프로마진을 에틸아세테이트와 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 클로르프로마진 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ SCX(strong cation exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 에틸아세테이트 25 mL와 4 M 탄산칼륨용액 1 mL를 넣어 20분간 균질화한 후 6,000 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 농축 플라스크에 취한다. 에틸아세테이트 25 mL로 위 과정을 한 번 반복하여 앞의 상층액과 합하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 아세토니트릴 30 mL와 아세토니트릴포화 헥산 30 mL에 녹여 분액깔때기에 옮긴다. 강하게 진탕한 후 층이 분리될 때까지 정치하여 하층(아세토니트릴층)을 취하고 아세토니트릴 30 mL로 위 과정을 한 번 반복한 후 앞의 아세토니트릴층과 합한다. 이 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 메탄올 : 1.2% 메타인산 수용액(2 : 3) 혼합액 10 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 SCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 세척한 후, 메탄올:0.1 M 제이인산칼륨용액(9:1) 혼합액 15 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상 : 아세토니트릴:개미산:물(500:1:500)

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 330℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 20 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 86의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 클로르프로마진의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
클로르프로마진	319	58, 86

㉡ 정량한계 : 0.001 mg/kg

티오우라실(Thiouracil)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 티오우라실을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 6-phenyl-2-thiouracil 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지 : Silica 카트리지(500 mg, 10 mL)에 무수황산나트륨 1 g을 가한 것 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 5분간 균질화 한다.  균질화한 용액을 3,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 5 mL를 취하여 시험관에 옮긴 후 이를 60℃ 이하에서 질소 농축한다. 디클로로메탄 0.5 mL에 충분히 녹인 후 5분간 초음파 추출한다. 이 추출액을 디클로로메탄 2 mL로 미리 활성화시킨 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지에 흡착시키고 디클로르메탄 0.5 mL로 추출액을 담았던 시험관에 가하여 초음파 추출하여 카트리지에 흡착시킨다. 추출액이 흡착된 카트리지를 디클로로메탄 2 mL로 씻어주고, 시험관에 다시 메탄올 : 디클로로메탄 (25 : 75) 혼합용액 2 mL를 가하고 1분간 초음파 추출한 용액으로 용출한다. 용출액을 60℃ 이하에서 질소 농축하고 메탄올 200 μL와 0.1% 개미산 400 μL를 가하여 충분히 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(4.6 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산

- 이동상 B : 개미산:아세토니트릴:메탄올(1:500:500)

ⓓ 유속 : 0.5 mL/min

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	93	7
6.0	93	7
20.0	20	80
23.0	20	80
25.0	93	7
28.0	93	7

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 330℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 21～25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 각각의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 6-phenyl- 2-thiouracil의 함량을 각각 구한다. 각각의 함량을 합하여 검체 중 티오우라실의 함량으로 한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
2-Thiouracil	129	84, 112
6-Methyl-2-thiouracil	143	126, 84
6-Propyl-2-thiouracil	171	154, 112
6-Phenyl-2-thiouracil	205	188, 146

㉡ 정량한계 : 0.025 mg/kg

피리메타민(Pyrimethamine)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 피리메타민을 메탄올로 추출하고 헥산으로 지방성분을 제거한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 피리메타민 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.1 M 인산완충용액(pH 6.0) : 500 mL 메스플라스크에 1 M 인산일수소칼륨(K2HPO4) 용액 6.6 mL와 1 M 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 43.4 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

Ⓕ SCX(strong cation exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(200 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 균질화한 후 6,000 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 농축플라스크에 취한다. 위 과정을 한 번 반복하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물을 메탄올 20 mL에 녹인 후 50 mL 원심분리관에 옮기고 헥산 20 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 6,000 G에서 5분간 원심분리하여 하층(메탄올층)을 농축 플라스크에 취하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물을 0.2 M 인산완충용액(pH 6.0) 10 mL에 녹여 미리 메탄올 2 mL, 0.5 M 염산용액 2 mL, 물 2 mL로 활성화시킨 SCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 5% 메탄올용액 2 mL와 2% 아세트산을 포함하는 5% 메탄올용액 2 mL로 세척한다. 메탄올 2 mL와 2% 수산화암모늄을 포함하는 95% 메탄올용액 2 mL로 용출하고 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물은 이동상 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.0 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상 : 아세토니트릴:개미산:물(400:1:600)

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 350℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 233의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 피리메타민의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
피리메타민	249	177, 233

㉡ 정량한계 : 0.5 μg/kg

니트로빈(Nitrovin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 니트로빈을 디클로로메탄:메탄올:암모니아수 혼합용액으로 추출하고 메탄올과 아세트산과 부틸아민 혼합용액으로 재분산한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 니트로빈 표준품을 정밀히 달아 2% 암모니아수를 함유한 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 Ⓐ과정[디클로로메탄:메탄올:암모니아수(900:50:1) 혼합용액 20 mL를 가한 후 균질화하고 30분간 진탕한다. 이를 2,500 G에서 10분간 원심분리하고 하층을 취한다.]을 실시한다. Ⓐ과정을 반복하여 하층을 합친 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물을 이동상 1 mL에 녹인다. 이를 다시 4,000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고 여기에 헥산 1 mL를 가하여 혼합한 후 4,000 G에서 5분간 원심분리하고 하층액을 취한다. 이를 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : CN(4.6 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 이동상 : 메탄올:물:아세트산:부틸아민(2500:50:10:1)

㉢ 유속 : 1.0 mL/min

㉣ 측정파장 : 365 nm

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 니트로빈의 함량을 구한다.

㉡ 정량한계 : 0.05 mg/kg

나라신(Narasin), 린코마이신(Lincomycin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 나라신 및 린코마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 나라신 및 린코마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 및 Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 2 g에 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 넣어 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 흔든 후 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 중 4 mL를 취하여 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
7.0	10	90
13.0	10	90
14.0	100	0
22.0	100	0

- 이동상 B : 아세토니트릴

ⓒ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Spray voltage : 5 kV

ⓒ Capillary temperature : 280℃

ⓓ Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

ⓔ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓕ SIM ion : m/z 407.2(린코마이신), m/z 787.5(나라신)

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 린코마이신 및 나라신의 함량을 구한다.

㉡ 나라신 정량한계 : 0.02 mg/kg(알)

라살로시드(Lasalocid), 아빌라마이신(Avilamycin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 라살로시드 및 아빌라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 라살로시드 A 및 아빌라마이신 표준품을 각각 정밀히 달아 라살로시드 A는 아세토니트릴에 아빌라마이신은 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 2 g에 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 넣어 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 흔든 후 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 중 4 mL를 취하여 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다.

용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

ⓑ 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	60	40
5.0	10	90
20.0	10	90
21.0	60	40
30.0	60	40

㉢ 유속 : 0.2 mL/min

㉣ 측정파장 : 254 nm(라살로시드 A), 210 nm(아빌라마이신)

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아빌라마이신 및 라살로시드 A의 함량을 각각 구한다. 이때 라살로시드 A의 함량을 라살로시드 함량으로 한다.

마두라마이신(Maduramycin), 샘두라마이신(Semduramicin), 티아물린(Tiamulin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

- 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	80	20
15.0	0	100
17.0	0	100
18.0	80	20
25.0	80	20

ⓒ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Spray voltage : 5 kV

ⓒ  Capillary temperature : 210℃

ⓓ Sheath gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓔ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓕ SIM ion : m/z 934(마두라마이신), m/z 890(샘두라마이신), m/z 494(티아물린)

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린의 함량을 구한다.

㉡ 정량한계

ⓐ 마두라마이신 : 0.002 mg/kg

ⓑ 샘두라마이신 : 0.005 mg/kg

엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀을 물에 녹인 후 산성화하고 아세토니트릴로 잔류되어 있는 엔로플록사신 및 시프로플록사신을 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 엔로플록사신 및 시프로플록사신 표준품을 각각 정밀히 달아 아세토니트릴로 녹여 100 mg/L농도가 되게 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.1% 개미산 아세토니트릴 용액에 희석하여 사용한다.

Ⓔ 황산나트륨 카트리지 : 0.45 μm 폴리프로필렌 필터가 장착된 튜브에 무수황산나트륨이 1.5 g 충진된 카트리지 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

벌꿀 2.5 g을 50 mL 원심분리관(A)에 취하고 물 5 mL을 넣은 후 벌꿀이 모두 물에 녹을 때까지 흔들어 준다. 이 벌꿀 희석액에 아세토니트릴 10 mL와 아세트산 200 μL를 넣고 30초간 흔들어 준 후 염화나트륨 2 g을 넣고 다시 15초간 흔들어 준다. 이 혼합용액을 2,400 G에서 5분간 원심분리한 후 아세토니트릴층(상층액)을 황산나트륨 카트리지에 통과시켜 새로운 50 mL 원심분리관(B)에 모은다.

처음 벌꿀을 담았던 50 mL 원심분리관(A)에 다시 아세토니트릴 10 mL를 넣고 30초간 흔들어 준 후 2,400 G에서 5분간 원심분리하고 아세토니트릴층(상층액)을 황산나트륨 카트리지에 통과시켜 앞의 아세토니트릴과 합한다(원심분리관 B). 원심분리관 B의 아세토니트릴 용액을 질소농축한 후 0.1% 개미산 아세토니트릴 용액 2.5 mL에 녹여 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산 수용액

- 이동상 B : 0.1% 개미산 아세토니트릴용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	85	15
5.0	85	15
8.0	20	80
10.0	20	80
10.1	85	15
20.0	85	15

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

ⓔ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ  Capillary temperature : 350℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 20 V

Ⓑ 정량

㉠ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, 엔로플록사신은 m/z 316 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 엔로플록사신의 함량을 구한다. 시프로플록사신은 m/z 288 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 시프로플록사신의 함량을 구한다. 앞서 구한 엔로플록사신과 시프로플록사신의 함량을 합하여 검체의 엔로플록사신 함량으로 한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
엔로플록사신	360	316, 342, 245
시프로플록사신	332	288, 314, 231

㉡ 정량한계 : 0.005 mg/kg

델타메쓰린(Deltamethrin)

㉮ 정량법의 원리

시료를 헥산으로 균질화하고 아세토니트릴로 추출하여 감압 농축한 후 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 델타메쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 진탕하고 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 1,000 G에서 10분간 원심분리한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하여 50℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 디클로로메탄:헥산(1:1) 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 20분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 10 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 유기용매층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 20 mL, 증류수 50 mL 및 디클로로메탄 50 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 50℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 가금류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 아세트산을 포함한 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃ 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 mL, 증류수 35 mL 및 디클로로메탄 20 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓓ 어류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 아세트산을 포함한 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃ 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 mL, 증류수 35 mL 및 디클로로메탄 30 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축플라스크에 취한 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 유(乳), 알(卵), 가금류, 어류 외 식품

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 -20℃ 에서 30분간 정치한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

㉢ 오븐온도 : 180℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 240℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다. 다시 5℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시켜 5분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(5：1), 270℃

㉤ 검출기온도 : 300℃

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 델타메쓰린 함량을 구한다.

도라멕틴(Doramectin), 아바멕틴(Abamectin), 에프리노멕틴(Eprinomectin), 이버멕틴( Ivermectin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴, 이버멕틴을 아세토니트릴로 추출하며, 유(乳)의 경우는 수산화나트륨으로 가수분해 후 추출한다. 추출액은 냉동하여 지방을 제거한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다. 또한 이들의 정량은 각각 지표물질 (Marker residue)인 도라멕틴, 아버멕틴(avermectin) B1a, 에프리노멕틴 B1a 및 22, 23-디히드로 아버멕틴 B1a로 한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴 및 이버멕틴 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ 아미노(NH2) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 가한 후 30초간 균질화 하고 1N 수산화나트륨 120 μL를 가한 후 30초간 균질화 한다. 이 용액에 아세토니트릴 6 mL를 넣고 강하게 균질화 하여 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 4 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가한 후 강하게 균질화 한다. 이 균질화한 용액을 5분간 초음파추출하고 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 6 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가한 후 강하게 균질화 한다. 이 균질화한 용액을 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 6 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 25℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

ⓑ 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	45	55
20.0	20	80
21.0	45	55
30.0	45	55

㉣ 유속 : 0.2 mL/분

㉤ 주입량 : 20 μL

㉥ 측정파장 : 245 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴 및 이버멕틴 함량을 각각 구한다.

사라플록사신(Sarafloxacin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 사라플록사신을 올쏘-인산과 염화마그네슘 혼합용액 및 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 올쏘-인산 용액과 아세토니트릴 혼합용액에 재분산하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 사라플록사신 표준품을 정밀히 달아 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 A : 1% 올쏘-인산이 함유되어 있는 0.2 M 염화마그네슘 수용액과 아세토니트릴을 1:4의 비율로 혼합한다.

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 추출용액 A 20 mL를 가한 후 1분간 균질화 하고 30분간 진탕한다. 이 용액을 5,000 G에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 취한다. 상층액에 헥산 8 mL를 가하고 5분간 진탕한 후 정치하여 하층에서 8 mL를 취한다. 이를 50℃ 이하에서 1 mL가 될 때까지 감압 농축한 후 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)/아세토니트릴 혼합용액(8:2)으로 전체 2 mL가 되도록 정용하고 초음파로 충분히 녹인다. 이 액을 원심 분리관에 취한 후 5,000 G에서 10분간 원심 분리하고 상층액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 40℃

㉢ 이동상 : 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)/아세토니트릴 혼합용액(78:22)

㉣ 유속 : 1.0 mL/분

㉤ 주입량 : 20 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 275 nm, 측정파장 460 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 사라플록사신의 함량을 구한다.

싸이퍼메쓰린(Cypermethrin), 싸이플루쓰린(Cyfluthrin), 싸이할로쓰린(Cyhalothrin)

㉮ 정량법의 원리

시료를 헥산으로 균질화하고 아세토니트릴로 추출하여 감압 농축한 후 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 싸이퍼메쓰린, 싸이플루쓰린 및 싸이할로쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 1,000 G에서 10분간 원심분리한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 유(乳)외 식품

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 -20℃에서 30분간 정치한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

㉢ 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 2분간 유지 후 10℃/분의 비율로 200℃까지 온도를 상승시킨다. 다시 5℃/분의 비율로 220℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지하고 계속하여 5℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(10：1), 250℃

㉤ 검출기온도 : 320℃

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 싸이퍼메쓰린, 싸이플루쓰린 및 싸이할로쓰린 함량을 각각 구한다.

아자페론(Azaperone)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 아자페론과 그 대사산물인 아자페롤(azaperol)을 아세토니트릴로 추출하여 실리카겔로 지방 제거 등 정제과정을 거쳐 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다. 정량은 지표물질(marker residue)인 아자페론과 아자페롤의 합으로 한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 아자페론 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 한고 아자페롤 표준품은 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5) : 1 L 메스플라스크에 제일인산나트륨(NaH2PO4) 6.87 g과 제이인산나트륨 (Na2HPO4) 0.057 g을 넣고 증류수로 표시선까지 채우고 0.1M 염산으로 pH 4.5로 조정한다.

Ⓕ 0.05 M 인산용액(pH 4) : 0.05 M 인산용액을 만들고 1 N 수산화나트륨으로 pH 4로 조정한다.

Ⓖ 실리카겔(Silica gel) 60 : 0.063-0.200 mm 입자크기, 70-230 메쉬

Ⓗ 실리카(Silica) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 1분간 균질화 한다. 이 용액을 2,500 G에서 5분간 원심 분리하여 농축플라스크에 상층액을 취하고 한 번 더 반복하여 상층액을 합친 후 45℃에서 감압 농축한다. 잔류물은 메탄올 5 mL를 가하여 녹인 후 실리카겔 60을 2 g 가하여 잘 혼합하고 이를 다시 감압 농축시켜 실리카겔 60에 잔류물을 흡착시킨다. 흡착된 실리카겔 60을 다시 헥산 5 mL에 녹여 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 옮긴다. 헥산 2 mL로 농축플라스크를 씻어주고 이 액을 실리카 카트리지에 옮긴다. 카트리지를 차례로 디클로로메탄 10 mL, 헥산 10 mL, 디클로로메탄 5 mL로 세척한 후 메탄올 30 mL로 용출시킨다. 용출액을 45℃에서 감압 농축하고 잔류물은 이동상 A 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C8(4 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 27℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5)/테트라하이드로퓨란/아세토니트릴(60:5:35)

ⓑ 이동상 B : 0.05 M 인산용액(pH 4)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	78	22
15.0	78	22
16.0	100	0
30.0	100	0

㉣ 유속 : 0.7 mL/분

㉤ 주입량 : 50 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 245 nm, 측정파장 345 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아자페론과 아자페롤의 함량을 각각 구한 후 합한 것을 검체 중 아자페론의 잔류량으로 한다.

이미도캅(Imidocarb)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 이미도캅을 초산나트륨과 트리플루오로 초산나트륨 완충용액으로 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 이미도캅 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 이동상 A 5 mL를 가하여 10분간 균질화한다. 이 균질화한 용액을 10분간 초음파 추출하고 2,500 G에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하고 이를 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 가드칼럼 : C8(4.6 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 분석칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉢ 칼럼온도 : 25℃

㉣ 이동상

ⓐ 이동상 A : 1 mM 초산나트륨, 1 mM  트리플루오로 초산나트륨 혼합용액(pH 7.0)/아세토니트릴(85:15)

ⓑ 이동상 B : 1 mM 테트라에틸 염화암모늄 용액(pH 2.0)/아세토니트릴(90:10)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
5.0	100	0
25.0	0	100
26.0	100	0
30.0	100	0

㉤ 유속 : 2.0 mL/분

㉥ 주입량 : 50 μL

㉦ 측정파장 : 260 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 이미도캅의 함량을 구한다.

트리클로르폰(Trichlorfon, Metrifonate)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 트리클로르폰을 아세토니트릴로 추출하여 무수황산나트륨과 원심분리, 냉동으로 수분과 지방을 응결시켜 제거한 후 디클로로메탄으로 다시 추출하여 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다. 트리클로르폰은 빛에 쉽게 분해되므로 실험과정에 사용되는 초자는 갈색병을 사용하거나 호일로 감싸 빛을 차단하여 실험한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 트리클로르폰 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 에틸아세테이트로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화 한 시료 10 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 30 mL와 염화나트륨 5 g을 가하여 2분간 균질화 한 후 20분간 진탕한다. 이 액을 4,500 G에서 15분간 원심 분리한 후 상층액 전량을 새로운 50 mL 원심 분리관에 옮기고 무수황산나트륨 5 g을 가하여 1분간 균질화 한다. 이를 다시 4,500 G에서 5분간 원심 분리한 후 -20℃에서 30분간 정치한다. 정치 후 상층액에서 12 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮기고 포화 염화나트륨 용액 15 mL, 물 35 mL 및 디클로로메탄 30 mL를 가하여 5분간 진탕한다. 정치 후 하층(디클로로메탄 층)을 취하고 이전의 250 mL 분액깔때기에 디클로로메탄 20 mL를 가하여 5분간 진탕한다. 하층을 합하여 무수황산나트륨 층을 통과시켜 농축플라스크에 취하고 30℃ 이하에서 감압 농축한 후 잔류물을 에틸아세테이트 2 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 유(乳) 외 식품

5) 잔류농약 시험법 중 (5) 푸루실라졸(Flusilazole), 메카밤(Mecarbam), 메타크리포스(Methacrifos), 메타미도포스(Methamidophos), 모노크로토포스(Monocrotophos), 아세페이트(Acephate), 에디펜포스(Edifenfos), 이소펜포스(Isofenphos), 클로르피리포스메틸(Chlorpyifos-methyl), 터브포스(Terbufos), 트리클로폰(Trichlorfon), 펜치온(Fenthion), 펜토에이트(Phenthoate), 폭심(Phoxim) 및 포스메트(Phosmet) 시험법에 따른다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(50 m × 0.32 mm ID, 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 2.25 mL/분

㉢ 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 1분간 유지 후 5℃/분의 비율로 180℃까지 온도를 상승시켜 1분간 유지한다. 이를 다시 30℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시켜 5분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(5：1), 240℃

㉤ 검출기온도 : 300℃

※ 트리클로르폰이 디크로보스(Dichlorvos)로 전환되어 정량함

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 트리클로르폰의 함량을 구한다.

디싸이클라닐(Dicyclanil)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 디싸이클라닐을 아세토니트릴로 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 디싸이클라닐 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 5 mL를 가하여 10분간 균질화한 후 10분간 초음파 추출한다.  이 용액을 2,500 G에서 20분간 원심분리한 후 상징액을 취하고 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 가드칼럼 : C8(4.6 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 분석칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉢ 칼럼온도 : 25℃

㉣ 이동상 :  1 mM 초산암모늄/아세토니트릴(85:15)

㉤ 유속 : 1.5 mL/분

㉥ 주입량 : 10 μL

㉦ 측정파장 : 267 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 디싸이클라닐의 함량을 구한다.

카라졸롤(Carazolol)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 카라졸롤을 아세토니트릴로 추출하여 실리카겔로 지방 제거 등 정제과정을 거쳐 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 카라졸롤 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5) : 1 L 메스플라스크에 제일인산나트륨(NaH2PO4) 6.87 g과 제이인산나트륨(Na2HPO4) 0.057 g을 넣고 증류수로 표시선까지 채우고 0.1M 염산으로 pH 4.5로 조정한다.

Ⓕ 0.05 M 인산용액(pH 4) : 0.05 M 인산용액을 만들고 1 N 수산화나트륨으로 pH 4로 조정한다.

Ⓖ 실리카겔(Silica gel) 60 : 0.063-0.200 mm 입자크기, 70-230 메쉬

Ⓗ 실리카(Silica) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 1분간 균질화 한다. 이 용액을 2,500 G에서 5분간 원심 분리하여 농축플라스크에 상층액을 취하고 위 과정을 1회 반복하여 상층액을 합친 후 45℃에서 감압 농축한다. 잔류물은 메탄올 5 mL를 가하여 녹인 후 실리카겔 60을 2 g 가하여 잘 혼합하고 이를 다시 감압 농축시켜 실리카겔 60에 잔류물을 흡착시킨다. 흡착된 실리카겔 60을 다시 헥산 5 mL에 녹여 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 옮긴다. 헥산 2 mL로 농축수기를 씻어주고 이 액을 실리카 카트리지에 옮긴다. 카트리지를 차례로 디클로로메탄 10 mL, 헥산 10 mL, 디클로로메탄 5 mL로 세척한 후 메탄올 30 mL로 용출시킨다. 용출액을 45℃에서 감압 농축하고 잔류물은 이동상 A 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C8(4 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 27℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5)/테트라하이드로퓨란/아세토니트릴(60:5:35)

ⓑ 이동상 B : 0.05 M 인산용액(pH 4)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	78	22
15.0	78	22
16.0	100	0
30.0	100	0

㉣ 유속 : 0.7 mL/분

㉤ 주입량 : 50 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 245 nm, 측정파장 345 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 카라졸롤의 함량을 구한다.

초산트렌볼론(Trenbolone acetate)

㉮ 정량법의 원리

시료를 증류수와 헥산으로 균질화한 후 2 M 염산으로 산성화하고 에틸아세테이트로 추출하여 감압 농축한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓒ 표준원액 : β-트렌볼론 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 실리카(Silica) 카트리지(1 g, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 20 g을 250 mL 원심분리관에 취하고 증류수 20 mL와 헥산 100 mL를 넣어 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 3,000 G에서 10분간 원심분리한다. 무수황산나트륨으로 수분 제거한 헥산층(상층) 50 mL를 250 mL 분액깔대기에 취하고 아세토니트릴 50 mL를 넣어 진탕한 후 정치하고 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취한다. 다시 아세토니트릴 50 mL를 넣어 위 과정을 4회 더 반복하고 모아진 아세토니트릴층은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 잔류물을 헥산 5 mL에 녹인 후 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 흡착시키고 헥산 5 mL로 세척한 후 아세톤:헥산(1:9) 10 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 아세토니트릴 0.5 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 75% 메탄올

- 유속 : 1.0 mL/분

- 측정파장 : 340 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 β-트렌볼론의 함량을 구한다. 이때 β-트렌볼론의 함량을 초산트렌볼론 함량으로 한다.

제 10, 15, 4) (1) 중 “제라놀 및 디에틸스틸베스트롤”을 “제라놀(Zeranol)”로 하고,  (1), ① 중 “제라놀과 디에틸스틸베스트롤”을 “제라놀”로 하며, ③, ㉱ 중 를 삭제하고, ③, ㉲ 중 “탈레라놀(Taleranol) 각 20 mg, 디에틸스틸베스트롤 및 D8디에틸스틸베스트롤 각 10 mg”을 “탈레라놀(Taleranol) 각 20 mg”으로, “200 μg, DES 및 D8 DES는 100 μg”를 “200 μg”으로 하며, ③, ㉳ 중 “제랄란, DES 및 D8 DES“을 “제랄란“으로, “0.2 μg, DES 및 D8 DES 0.1 μg,”를 “0.2 μg,”으로 하고, ③, ㉴ 및 ㉵를 각각 삭제하고, ㉶를 ㉴로 하며, ④, ㉮ 중 “제라놀과 디에틸스틸베스트롤이 함유되지 않은”을 “제라놀이 함유되지 않은”으로, “제랄란과 D8 DES 또는 DES, Zeranol”을 “제랄란과 Zeranol“로, ”대조시료에 제라놀, 디에틸스틸베스트롤 모노글루쿠로나이드 및 탈레라놀 표준용액”을 “대조시료에 제라놀 및 탈레라놀 표준용액”으로 하고, 표의 농도란 중 디에틸스틸베스트롤란을 삭제하며, ④, ㉯ 중 ”제라놀과 디에틸스틸베스트롤”을 “제라놀”로 하고, ④, ㉱ 중 위 조건에서의 머무름시간 및 특정이온에 대한 표를 아래와 같이하며, ④, ㉲,  중 “디에틸스틸베스트롤 ＝ 이온 412의 Cis 및 Trans 면적 또는 높이의 합/이온 420의 Cis 및 Trans 면적 또는 높이의 합“을 삭제하고, ④, ㉲, ⓒ 중 “제라놀 또는 디에틸스틸베스트롤의 이온농도 대 제라놀 또는 디에틸스틸베스트롤의”를 “제라놀의 이온농도 대 제라놀의”로 하며, ④, ㉲,  중 “시료 중의 제라놀 및 디에틸스틸베스트롤의 농도를”을 “시료 중의 제라놀의 농도를”으로 하고, 4)에 (2) 및 (3)을 각각 아래와 같이 신설한다.

위 조건에서의 머무름시간 및 특정이온

물질	머무름시간	물질	특정이온
제랄란 제라놀 탈레라놀	10.3 12.6 12.8	제랄란 제라놀 탈레라놀	435 538, 523, 433, 379 538, 523, 433, 379

(2) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)

① 정량법의 원리

시료중의 디에틸스틸베스트롤을 분해효소제를 사용하여 조직에서 분해한 후 냉동 및 카트리지를 이용하여 지방 및 단백질을 제거한 후 유도체화 하여 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

② 측정기기

기체크로마토그래프/질량분석기

③ 시약 및 시액

㉮ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉯ 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉰ 표준용액 : 표준곡선을 작성하기 위하여 5가지 농도로 표준원액을 메탄올로 희석한 후 각각 시험관에 100 μL를 취하고 내부 표준물질 용액 100 μL를 가한 후 농축 및 건조시킨다. 시험관에 유도체화 용액 100 μL를 넣고 밀봉하여 60℃에서 20분간 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 각각의 표준용액으로 한다.

㉱ 내부 표준물질 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 D8 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉲ 내부 표준물질 용액 : 내부 표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하여 100 μg/L가 되도록한다.

㉳ 분해효소제 : βꠀ글루쿠로니다제/아릴설파타제 (β-glucuronidase/arylsulfatase)

㉴ 유도체화용액 : BSTFA(N, O-Bistrimethyl-trifluoroacetamide)와 TMSI (N-Trimethyl silylimidazole)의 혼합액 (98 : 2)

㉵ C8 카트리지(500 mg, 6 mL) 및 아미노(NH2) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉶ 기타시약 : 특급

④ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 증류수 5 mL를 가한 후 마이크로파(microwave)로 30초간 추출한다. 이 추출액에 분해효소제 80 μL를 가하고 균질화시켜 배양기에 넣고 52℃에서 15시간 이상 반응시킨다. 실온으로 냉각한 후 내부 표준물질 용액 100 μL와 메탄올 30 mL를 가하고 20분간 초음파 추출한 후 4,000 G에서 5분간 원심분리한다. 이 추출용액을 -20℃의 냉동고에 30분 이상 넣어두어 지질을 응고시킨 후 상층액을 취한다. 이 때 석출된 지방질을 거름종이로 제거하고 용기를 메탄올로 씻어 준다. 상층액과 세척액을 합한 후 40℃에서 감압 농축하여 메탄올을 제거한다. 미리 메탄올 5 mL와 증류수 5 mL로 활성화시킨 C8 카트리지에 농축 후 남은 액을 10% 메탄올 수용액 15 mL에 녹여 흡착시킨다. 증류수 5 mL로 용기와 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 5 mL로 용출시킨다. 이 용출액을 60℃에서 질소로 농축시킨 후 에틸아세테이트 : 메탄올 (80 : 20) 혼합용액 2 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 물포화에틸아세테이트 5 mL와 에틸아세테이트 : 메탄올 (80:20) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 아미노(NH2) 카트리지에 추출액을 흡착시키고 에틸아세테이트 : 메탄올 (80 : 20) 혼합용액 6 mL로 용출시킨다. 이 용출액을 60℃에서 질소로 농축시키고 완전히 농축시킨 시험관에 유도체화 용액 100 μL를 넣고 밀봉한 후 60℃에서 20분간 반응시킨다. 반응액을 4,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ 기체크로마토그래프 조건

㉠ 칼  럼 : Ultra 2, DB 5(5%-phenyl-methylpolysiloxane)(50 m × 0.2 mm, 0.33㎛) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1 mL/분

㉢ 시료주입부 : Split(5:1)

㉣ 주입부온도 : 280℃

㉤ 오븐온도 : 초기온도 160℃에서 10℃/분 비율로 270℃까지 승온한 후 10분간 유지하고 5℃/분 비율로 315℃까지 승온한 후 10분간 유지

㉥ 시료주입량 : 1 μL

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠ 이온 mode : EI

㉡ 이온에너지 : 70 eV

㉢ Interface 온도 : 350℃

㉣ SIM ion : m/z 412(디에틸스틸베스트롤), m/z 420(디에틸스틸베스트롤 D8)

㉯ 정량

Ⓐ 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 질량분석기에 주입한 후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하여 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합의 비를 구하여 검량선을 작성하여 검체 중 디에틸스틸베스트롤의 함량을 구한다.

※ 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량 =

이온 412의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

Ⓑ 정량한계 : 0.5 μg/kg

(3) 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)

① 정량법의 원리

시료 중의 메드록시프로게스테론 아세테이트을 트리스완충액 및 디에틸에테르로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

② 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

③ 시약 및 시액

㉮ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉯ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉰ 표준원액 : 메드록시프로게스테론 아세테이트 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉱ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

㉲ 0.1 M 트리스완충용액(pH 9) : 0.1 M Tris(hydroxymethyl) amino-methane에 염산을 넣어 pH 9로 한다.

㉳ 기타시약 : 특급

④ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 1 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 0.1 M 트리스완충용액(pH 9) 5 mL를 가한후 5분간 초음파추출을 한다. 이 추출액에 디에틸 에테르 5 mL를 가하고 5분간 균질화한 후 3,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 농축플라스크에 옮긴다. 남은 액에 디에틸 에테르 5 mL를 가하여 위의 과정을 두 번 더 반복한다. 모아진 상층액을 45℃에서 감압농축한 후 메탄올 1 mL에 녹여 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ 액체크로마토그래프 조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 20℃

㉢ 이동상

- 이동상 A : 물

- 이동상 B : 5 mM 개미산암모늄 메탄올용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
11.0	20	80
12.0	20	80
13.0	80	20

㉣ 유속 : 0.6 mL/min

㉤ 주입량 : 5 μL

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠ Ionization : ESI(positive)

㉡ Capillary temperature : 350℃

㉢ Collision gas : 아르곤(Ar)

㉣ Collision energy : 20 V

㉯ 정량

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 327 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 메드록시프로게스테론 아세테이트 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
메드록시프로게스테론 아세테이트	387	327, 285

Ⓑ 정량한계 : 0.005 mg/kg

제 10, 22, 1), (2), ③ 중 “아세틸바데나필(acetylvardenafil), 실데나필(sildenafil)”을 “아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 실데나필(sildenafil)”로 한다.

제 10, 22, 1), (5) 중 을 다음과 같이 신설한다.

벤질실데나필(Benzylsildenafil)

(C28H34N6O4S, 550)

제 10, 22 중 2) 및 3)을 각각 3) 및 4)로 하고, 2)를 다음과 같이 신설한다.

2) 비만치료제 유사물질 시험법

(1) 장치

고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(UV detector), PDA 검출기 및 액체크로마토그래프․질량분석기를 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 이동상：물 1l에 인산 및 sodium-1-hexane-sulfonate를 각각 1g을 넣고 용해한 액(A용매), 95% 아세토니트릴(B용매)

② 이동상 gradient : A용매와 B용매 비율을 7 : 3에서 2 : 8로 적정 시간동안 균등분배 한다.

③ 표준원액：데스메틸시부트라민(desmethylsibutramine), 시부트라민(sibutramine) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 100㎎/l이 되게 한다.

④ 표준용액：표준원액을 이동상으로 녹여 적당한 농도로 한다.

⑤ 유기용매：메탄올, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등 유기용매는 HPLC용 또는 이와 동등한 것

⑥ 기타시약 : 무수황산나트륨(sodium sulfate anhydrous), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 등은 특급을 사용한다.

(3) 시험용액의 조제

액체시료와 고체시료의 일정량을 물 10ml에 녹이고 메탄올 70ml을 가하고 진탕 추출한 후 여과지로 여과한다. 여액에 1% 중탄산나트륨용액 약 1ml을 가하고 디클로로메탄 50ml로 3회 추출한 후 디클로로메탄층을 모아 삼각 플라스크에 옮겨 적당량의 무수황산나트륨을 넣어 때때로 흔들어 섞으면서 30분간 방치하여 수분을 제거한다. 이 액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하에 디클로로메탄을 날려보내고 잔사를 메탄올 또는 이동상에 녹여 일정량으로 한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

(4) 시험조작

① 고속액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18(4.6×250㎜, 5㎛) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 시약 및 시액 참조

㉰ 검출기파장 : UV 220㎚

㉱ 유속 : 1.0 ml/min.

② 정성시험

표준용액 및 시험용액을 고속액체크로마토그래프에 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크를 표준용액의 피이크와 비교할 때 어느 측정조건에서도 그 머무름시간(Retention time)이 일치하여야 한다.

* PDA에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

③ 정량시험

정성시험에서 얻어진 결과를 근거로 하여 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라서 정량한다.

④ 확인시험

액체크로마토그래프․질량분석기로 분석하였을 때 시험결과는 표준품과 일치하여야 한다.

(5) 비만치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① 데스메틸시부트라민(Desmethylsibutramine)

(C16H24ClN, 265)

제 10, 23, 3) 중 “이들 방법을 사용하여 콩, 옥수수, 감자 및 이들 가공품으로부터 PCR에 이용할 수 있는 DNA를 추출․정제할 수 있으며, 분석시료에 대하여는 유전자 추출시험을 2회 반복하고 각각의 추출 DNA에 대하여 PCR을 실시한 후 결과를 판정한다.”를 “DNA를 추출․정제 시 하나의 분석시료로부터 적정량을 2회 칭량하여 동시에 DNA를 추출하고, 추출된 각각의 DNA는 적절히 희석하거나 농축하여 PCR에 사용한다.”로 한다.

제 10, 23, 5), (1) 중 “PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1 및 표 2와 같다.”를 “유전자재조합식품 표시제와 관련하여 PCR에 의한 유전자재조합 콩, 유전자재조합 옥수수의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1, 표 2와 같다.”로 한다.

제 10, 23, 5), (2) 중 ①을 다음과 같이 한다.

① 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 표준시료와 0%인 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 각각 DNA를 추출한 DNA 용액을 양성 대조군으로 사용한다. 다만, 표 3의 프라이머나 GMO 검출키트 등을 사용하여 PCR하는 경우 양성 확인용 표준시료에서 추출한 DNA 외에도 해당 프라이머 제조사에서 특이적으로 제작한 양성 확인용 플라스미드 DNA 등을 반응대조군으로 사용할 수 있다.

제 10, 23, 5), (2), ② 중 “표 1의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 3과 같다.”를 “표 1, 표 2의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 4와 같다.”로 한다.

제 10, 23, 5), (2), ③ 중 “㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA을 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 동일 작물로서 0% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 2% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA 또는 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하는 양성 확인용 플라스미드)을 시료와 함께 PCR시험을 한다.”를 “㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA를 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 0% 표준시료에서 추출한 DNA 등), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는 표준시료에서 추출한 DNA 등)을 시료와 함께 PCR 시험을 한다.”로 한다.

제 10, 23, 5), (1), 중 표 1 을 다음과 같이한다.

표 1. 유전자재조합 콩의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 (118 bp)	Le1n02-5' Le1n02-3' Le1-Taq	5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3' 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3' 5'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3'
스크 리닝	CaMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	RRS (121 bp)	RRS 01-5' RRS 01-3' RRS-Taq	5'-CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG-3' 5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3' 5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-TAMRA -3'

제 10, 23, 5), (2) 중 표 2. 및 표 3을 각각 표 3 및 표 4로 하고, 표 2를 다음과 같이 신설한다.

표 2. 유전자재조합 옥수수의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	옥수수 (151 bp) 옥수수 (114 bp)	SSllb 1-5' SSllb 1-3' SSllb-Taq SSllb 3-5' SSllb 3-3' SSllb-Taq	5'-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3' 5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A -TAMRA-3' 5'-CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTC C-3' 5'-GAT CAG CTT TGG GTC CGG A-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMR
스크 리닝	CaMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	Bt176 (100 bp) Bt11 (127 bp) GA21 (133 bp) T25 (149 bp) MON810 (113 bp) NK603 (143 bp) TC1507 (103 bp) MON863 (152 bp) DAS59122-7 (141 bp)	Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt176-Taq Bt11 3-5' Bt11 3-3' Bt11-Taq GA21 3-5' GA21 3-3' GA21-Taq T25 1-5' T25 1-3' T25-Taq M810 2-5' M810 2-3' M810-Taq NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3' tahsp17-5‘ MON 3-3‘ DAS 5-5‘ Pubi-3‘	5'-TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG-3' 5'-ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T-3' 5'-FAM-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-TAMRA-3' 5'-AAA AGA CCA CAA CAA GCC GC-3' 5'-CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CT-3' 5'-FAM-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3' 5'-GAA GCC TCG GCA ACG TCA-3' 5'-ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT-3' 5'-FAM-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG - TAMRA-3' 5'-GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA-3' 5'-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT-3' 5'-FAM-TGC AGG CAT GCC CGC TGA AAT C- TAMRA-3' 5'-GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A-3' 5'-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG-3' 5'-FAM-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-TAMRA-3' 5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3' 5'-GTG TTT TTT GGA TCC CCG G-3' 5'-CCA TCA TGG TTG GTT GGA CTT-3' 5'-GCA CCT GTG ATT GGC TCA TAA A-3' 5'-CTC CCT TAA TTC TCC GCT CAT G-3'

제 10, 23, 5), (3) 중 “그 결과 2 반복 추출 시료 중 하나 이상에서 목적하는 증폭산물(내재성 유전자와 35S 프로모터 및/또는 NOS 터미네이터)이 모두 검출된 추출 유전자를 주형 DNA로 하여 구조유전자에 대한 프라이머를 사용하여 2차 확인시험을 한다.”를 다음과 같이 한다.

그 결과 2 반복 추출 DNA 시료 중 내재유전자 특이 PCR 산물이 확인된 DNA 시료에서의 35S 프로모터와 NOS 터미네이터의 검출 결과에 따라 다음의 유전자재조합 이벤트에 대한 2차 확인시험을 실시한다.

㉠ 35S 프로모터와 NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 모두 확인된 경우: RRS, Bt11, Bt176, T25, MON810, NK603, TC1507, MON863, DAS59122-7, GA21

㉡ 35S 프로모터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: Bt176, T25, MON810, TC1507, DAS59122-7

㉢ NOS 터미네이터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: GA21

10, 23, 5), (3), ① 중 “주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 3의 PCR 반응액의 조성과”를 “주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 4의 PCR 반응액의 조성과”로 한다.

제 10. 23. 5), (3), ③ 중 “반응조건은 표 4와 같다.”를 “반응조건은 표 5와 같다.”로 하고, 표 4를 표 5로 한다.

제 10. 23. 5), (5), ② 중 “검출되나,”를 “검출되나”로 하고, “(표 5)”를 “(표 6)”으로 한다.

제 10, 23, 5), (5) 중 ③을 다음과 같이한다.

③ 유전자재조합 이벤트 중 35S 프로모터를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, MON810, NK603, TC1507, MON863, DAS59122-7이 있으며, NOS 터미네이터를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603, MON863이 있다.

제 10, 23, 5), (5), ④ 중 “다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가 받은 것이나 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우”를 “다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가받은 품목, Bt10 옥수수와 같이 상업적 목적으로 생산되지 않아 조건부 승인받은 품목, 해충 저항성 Bt 쌀과 같이 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우”로 한다.

제 10. 23. 5), (5) 중 “표 5”를 “표 6”으로 하고, 표 6(종전의 표 5) 중 “2. 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터의 경우 유전자재조합 품종에 따라 검출되지 않을 수도 있다.”를 “2. 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터의 경우 유전자재조합 이벤트에 따라 검출되지 않을 수도 있다.”로 하며, “3. 감자와 스타링크 옥수수(CBH351)에 대하여 Nippon Gene사(일본)에서 시판되는 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우”를 “3. NewLeaf Plus 감자, NewLeaf Y 감자, CBH351 옥수수에 대하여 표 3의 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우”로 한다.

제 10, 23, 6)을 다음과 같이 한다.

6) 정량분석방법

시료에 존재하는 GMO 정량의 필요성에 의해 PCR에 기초한 많은 방법들이 개발되었는데, 이 중 가장 일반적인 방법은 실시간 PCR (Real-Time PCR)이다. 실시간 PCR을 사용하면 유전자재조합 여부에 관계 없이 농작물이 반드시 가지고 있는 내재성 유전자에 대한 재조합 유전자의 존재 비율로부터 시료 중에 재조합체가 얼마나 존재하는지를 상대적으로 측정할 수 있다.

(1) 실시간 PCR

PCR이 거듭됨에 따라 증가하는 증폭산물에 프라이머와 프로브가 특이적으로 결합할 때 프로브에서 분리되는 형광물질의 양을 동역학적으로 측정하여 주형 DNA의 양을 산출할 수 있다. TaqMan chemistry를 이용하는 Real-Time PCR에는 일반 PCR에서 이용되는 프라이머와 함께 주형 DNA에 상보적 염기서열을 가지면서 형광물질(리포터(reporter)와 퀜처(quencher))이 결합된 DNA 프로브(probe, 탐침자), Real-Time PCR 장치 등이 필요하다. 이 프로브가 프라이머에 이어 주형 DNA에 결합하고 DNA polymerase의 5’-nuclease 활성에 의해 가수분해되면 리포터가 퀜처로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 형광 강도는 PCR 반응횟수에 대해 지수함수(指數關數)적으로 증강한다. 따라서 일정한 형광 강도에 따른 PCR 반응횟수를 비교하여 원래의 DNA 양을 구할 수 있게 된다. Real-Time PCR 장치로는 플레이트(plate) 방식, 캐필러리(capillary) 방식 등이 있다.

(2) 유전자재조합 콩의 정량

콩의 내재성 유전자(lectin)와 유전자재조합 콩(RRS)의 구조 유전자(EPSPS)의 복제수(copy number)를 구하는데 사용되는 프라이머와 프로브는 표 1과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다. 동일한 시료에 대하여 내재성 유전자와 재조합 유전자의 복제수 측정은 같은 플레이트에서 실시되어야 한다.

(3) 유전자재조합 옥수수의 정량

옥수수의 경우 시료 중에 여러 종의 유전자재조합 이벤트(Bt176, Bt11, T25, MON810, GA21)가 혼재하고 있을 수 있어 분석대상이 복수이므로 정성분석 결과 검출된 구조유전자를 대상으로 Real-Time PCR을 실시하여 각 이벤트별로 정량하고, 이들을 합산하여 결과를 판정한다.

옥수수의 내재성 유전자(Starch Synthase IIb, SSIIb)와 이벤트별 재조합 유전자의 복제수를 구하는데 사용되는 프라이머와 프로브는 표 2와 같으나, 내재성 유전자 측정용 프라이머는 표 3의 SSIIb 3-5'과 SSIIb 3-3'을 사용한다. 또한 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있으며, 동일한 시료에 대하여 내재성 유전자와 재조합 유전자의 복제수 측정은 같은 플레이트에서 실시되어야 한다.

(4) 검량선(Calibration curve) 작성용 표준액

복제수를 아는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액 또는 특정 함량의 유전자재조합 작물 표준품(certified reference material, CRM)으로부터 추출한 DNA 용액을 검량선 작성용 표준액으로 사용한다. 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우 검량선을 작성하기에 적당한 복제수(예를 들면 웰(well) 또는 캐필러리 당 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 복제수)가 되도록 대장균의 ColE1/TE DNA 용액(5 ng/μL)을 사용하여 희석한 것을 사용한다. 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우 검량선 작성에 사용되는 희석액을 4종 이상으로 하며, 그 최소값과 최대값 사이에 시료의 복제수가 있어야 한다. 시료의 내재성 유전자나 재조합 유전자의 복제수가 검량선 작성용 표준액의 최대 복제수를 초과하는 경우에는 검량선의 유효범위 내에서 측정될 수 있도록 시료 DNA를 적절히 희석하여 정량분석을 다시 실시한다.

또한, 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우에 한하여 시료 중 유전자재조합식품 혼입률을 계산할 때 실제 유전자재조합 작물에서 추출한 DNA와의 오차값을 보정하기 위하여 반드시 보정계수를 적용하여야 한다. 이때 보정계수는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으며, 기기 제조사 또는 플라스미드 DNA 표준용액 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

※ 참고

표 1과 표 2의 PCR 반응액 조제에 사용되는 프라이머, 프로브와 이에 대응하는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액은 Nippon Gene사(일본)에서 구입 가능하다.

(5) 정량 PCR용 반응액의 조제

정량 PCR에 사용하는 모든 시약은 실온에서 완전히 녹인 후 혼합기를 사용하여 충분히 혼합하고 spin down하여 사용한다. 사용하는 시약은 같은 팁을 사용하여 연속하여 주입하면 피펫 내의 공기가 냉각되기 때문에 2번째부터는 통상의 피펫 조작으로 정확하게 주입되지 않으므로 피펫의 설명서에 쓰인 저온 시험재료를 취급할 경우의 조작법을 숙지하여 사용한다. 또한, Universal PCR Master Mix와 같이 점성이 강한 시약을 다룰 때에는 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지 서서히 버튼을 누른 뒤 조금 더 깊숙이 누른 상태에서 팁을 시약에 담근다. 이후 팁이 액면에 수직이 되게 하여 서서히 시약을 흡입하고, 그 상태에서 다시 피펫의 버튼을 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 눌러 시약을 빼낸 후 다시 서서히 시약을 흡입한다. 분주 시에는 팁을 수직으로 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 시약을 분주하고 팁을 튜브에서 빼낸 후 제거한다.

표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브를 사용하여 PCR용 반응액을 25 μL로 할 경우 그 조성은 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약 12.5 μL, 프라이머(각 25 μM) 0.5 μL, 프로브(10 μM) 0.5 μL, 멸균증류수 9 μL와 주형 DNA 2.5 μL로 이루어진다. 주형 DNA로는 시료 DNA (20 ng/μL) 2.5 μL, 검량선 작성용 표준용액 2.5 μL, ColE1/TE 용액(5 ng/μL) 또는 멸균증류수 2.5 μL가 사용된다. 음성대조군으로 사용되는 ColE1/TE 용액은 미량의 DNA가 비특이적으로 튜브 벽면에 흡착되는 영향을 보정할 수 있다.

PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액에 대하여 플레이트 방식의 경우 3 반복 시험(3웰 분량의 PCR용 반응액을 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을, 캐필러리 방식의 경우 2 반복 시험을 실시하여 측정된 평균값을 구한다.

표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브를 사용하여 PCR용 반응액을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액은 다음과 같이 조제하며, 그 조성이나 양은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약의 사용 매뉴얼을 참고하거나 기기 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

① 프라이머-프로브 혼합액의 조제

프라이머가 각 1.25 μM, 프로브가 0.5 μM이 되도록 멸균증류수를 사용하여 희석하고 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 사용한다. 예를 들어 프라이머(각 25 μM) 180 μL에 멸균증류수 1,620 μL를 가하고, 프로브(10 μM) 180 μL에 멸균증류수 1,620 μL를 가한 것을 혼합하여 총 3,600 μL로 조제하고 적정량으로 나누어 -20℃에 보관하여 사용한다.

② Master mixture의 조제

프라이머-프로브 혼합액과 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 1 : 1.25의 비율로 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 플레이트 방식의 경우 하나의 DNA 시료액 당 3 웰 분량의 PCR용 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제한다.

③ Master mixture의 분주

주형 DNA (시료 수), 각 검량선 작성용 표준액(프라이머 당 5종), 음성대조군용 시험액(프라이머 당 1종)의 수만큼 500 μL 튜브를 준비하고 분주할 주형 DNA 등의 이름을 각각 표기한 후 준비한 각각의 500 μL 튜브에 master mixture를 78.75 μL씩 분주한다.

④ 주형 DNA, 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액의 분주

Master mixture를 분주한 튜브에 표기된 주형 DNA (20 ng/μL), 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액을 8.75 μL씩 가하고, 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 spin down 한다. 플레이트 방식의 경우 준비된 PCR 반응액을 96웰 플레이트에 웰 당 25 μL씩 분주한다. 플레이트의 뚜껑을 닫을 때 한쪽으로 기울어지지 않도록 대각선 방향으로 번갈아 잘 닫은 후, 전용 롤러를 사용하여 완전히 웰을 밀폐한다. 웰의 하부를 관찰하여 바닥에 기포가 있을 경우는 플레이트의 가장자리를 가볍게 두드리거나, spin down (96웰 플레이트용 원심분리기 사용)하여 바닥의 기포를 완전히 제거한다.

(6) 정량 PCR

정량 PCR은 Real-Time PCR 기기를 이용하여 실시한다. 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96웰 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 다음과 같다. 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 방치하는 고온 개시(hot start)법으로 반응을 시작한다. 95℃에서 30초, 59℃에서 1분을 1회로 하여 총 40회의 증폭 반응을 하고, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 Real-Time PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

(7) 검량선의 작성

시료를 정량분석할 때 매번 내재성 유전자와 재조합 유전자에 대해 다음과 같이 각각 검량선을 작성한다. PCR 반응 횟수에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 증폭곡선에서 baseline을 3～15 사이클로 하고, 검량선 작성용 표준액의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 ΔRn 부위를 선택하여 threshold line (Th. line)을 설정한다. 이때 선택된 Th. line은 음성대조군용 시험액에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 하며, 검량선 작성용 표준액 중 최소값을 가지는 표준액의 증폭곡선과는 교차하여야 한다.

설정된 Th. line과 검량선 작성용 표준액의 증폭곡선이 교차한 점으로부터 threshold cycle (Ct)값을 구하여 그 평균값을 y축으로 하고, 이미 알고 있는 각각의 검량선 작성용 표준액 복제수를 x축으로 하여 각 Ct 값에 대해 얻어진 근사 직선을 검량선으로 한다. 이때 결정계수(coefficient of determination, R2)는 0.990 이상이어야 한다.

(8) 시료의 유전자재조합식품 혼입률의 계산

검량선 작성에 이용한 Th. line을 사용하여 시료의 내재성 유전자와 재조합 유전자의 Ct값을 구하고, 이들을 각각의 검량선에 내삽하여 초기 유전자 복제수를 구한다. 시료별로 반복 시험된 초기 유전자 복제수의 평균값을 각각 내재성 유전자 복제수와 재조합 유전자 복제수로 한 후, 다음 식에 따라 해당 유전자재조합 이벤트의 혼입률을 구한다. 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용한 경우 보정계수를 적용한다.

① 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우

※ 유전자재조합식품 혼입률(%)	=	재조합 유전자 복제수	×	100
		내재성 유전자 복제수

② 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우

※ 유전자재조합식품 혼입률(%)	=	재조합 유전자 복제수	×	1	×	100
		내재성 유전자 복제수		보정계수

(9) 결과의 판정

2반복 추출한 DNA 시료 각각에 대하여 6)의 (2)와 (3)에서 얻은 RRS, GA21, Bt176, Bt11, T25, MON810 함량의 합을 구하여 그 평균값이 3%를 넘은 시료에 대해서는 기준에 맞지 않는 잘못된 구분유통관리가 이루어져 있을 가능성이 있다고 판단한다.

제 10, 23, 7) 중 “스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법”을 “스타링크 옥수수(CBH351)의 분석법”으로 하고, 7), (3) 중 “판정 예시는 표 10과 같다.”를 “판정 예시는 표 7과 같다.”로 하며, 표 10을 표 7로 한다.

제 10, 23, 8) 중 “현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 2 참조),”를 “현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 3 참조),”로 하고, 8), (3) 중 “판정 예시는 표 10과 같다.”를 “판정 예시는 표 7과 같다.”로 한다.

제 10, 23, 10) 중 “PCR의 온도조건은 표 11과 같다.”를 “PCR의 온도조건은 표 8과 같다.”로 하고, 표 11은 표 8로 한다.

제10. 25. 중 “광자극발광법(Photostimulated Luminescence, PSL) 및 열발광법(ThermoLuminescence, TL)은 식품에 혼입된 이물질인 광물질의 발광 특성을 이용하는 방법으로서 광물질은 방사선 조사에 의하여 에너지가 저장되고 일정온도의 적외선이나 열에 노출되면 에너지를 방출하는데 이때 방출하는 빛의 양을 측정하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다.” 다음에 후단을 다음과 같이 신설한다.

전자스핀공명법 (Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR)은 뼈, 셀룰로오스 및 결정형 당(crystalline sugar)을 함유한 식품 등에 잔존하는 방사선 조사로 생긴 자유라디칼(free radical)을 분광학적으로 측정하는 방법으로서, 자장에 의하여 전자가 공명한 후 방출하는 에너지의 차이를 측정하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다. 기체크로마토그래프/질량분석법 (Gas chromatography/ Mass spectrometry)은 지방질 식품에서 방사선 조사로 생성된 탄화수소를 측정하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다. 즉 지방을 함유한 식품을 방사선 조사했을 때 지방산 카보닐기의 α 탄소와 β 탄소위치에서 결합이 끊어져 원래의 지방산보다 탄소수가 1개 적거나, 2개 적으면서 첫 번째 탄소위치에 새로운 이중결합을 가진 탄화수소가 생성된다. 팔미트산(palmitic acid, C16:o)으로부터 펜타데칸(pentadecane, C15:0)과 1-테트라데센(1-tetradecene, C14:1), 스테아린산(stearic acid, C18:o)으로부터 헵타데칸(heptadecane, C17:0)과 1-헥사데센(1-hexadecene, C16:1), 올레인산(oleic acid, C18:1)으로부터 8-헵타데센(8-heptadecene, C17:1)과 1,7-헥사데카디엔(1,7-hexadecadiene, C16:2)이 생성되는데 이들 탄화수소를 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다.

제10, 25에 3) 및 4)를 각각 다음과 같이 신설한다.

3)전자스핀공명법 (Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR)

(1) 측정기기

① 엑스-대 전자스핀공명분광계 (X-band ESR spectrometer) : 자석, 마이크로웨이브 브리지, 콘솔, 공극으로 구성된다.

② g 값 (g value) 측정장치

※ g 값은 고유의 값이며, 가해준 자장과 마이크로웨이브 주파수의 비 [(71,448×마이크로웨이브 주파수)/(자장)]로 계산됨

③ ESR 시험관 (석영, 지름 4.0 mm)

④ 저울

⑤ 진공건조기 또는 동결건조기

(2) 검체조제

① 뼈를 함유한 식품

- 살을 완전히 제거한 뼈를 동결건조기에서 18시간 이상 또는 40 ℃의 진공건조기에서 3시간 이상 건조시킨 다음 적당한 조각 (예: 두께 3.0～3.5 ㎜, 길이 5.0～10.0 ㎜)으로 절단하여 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

② 셀룰로오스를 함유한 식품

- 견과류의 껍질은 적당한 크기(예: 직경 3.0～3.5 ㎜)로 절단하여 동결건조기에서 6시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 2시간 이상 건조한 후 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

- 딸기는 시료 채취 후 바로 검체로 조제하고, 만약 보관 후 조제하고자 하는 경우에는 -18℃에서 보관하여야 한다. 딸기에 물을 가하고 믹서를 이용하여 분쇄한 후 씨를 침전시켜 분리한 다음 동결건조기에서 6시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 2시간 이상 건조시킨 후 200 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

③ 결정형 당을 함유한 식품

- 건조과일을 절단하여 동결건조기에서 18시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 3시간 이상 건조시킨 후 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

(3) 시험조작

조제된 검체를 넣은 ESR 시험관을 전자스핀공명분광계에 있는 공극에 넣고 각각의 라디칼을 측정할 수 있는 조건으로 측정한다.

① 전자스핀공명분광계의 측정조건

마이크로웨이브 주파수와 자장은 실험에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면

㉮ 뼈를 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.5 GHz, 파워 5～12.5 mW

- 중심자장 : 342 mT

㉯ 셀룰로오스를 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.78 GHz, 파워 0.4～0.8 mW

- 중심자장 : 348 mT

㉰ 결정형 당을 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.78 GHz, 파워 5 mW

- 중심자장 : 348 mT

(4) 판정

① 뼈를 함유한 식품에서 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, [Ca10(PO4)6(OH)2]) 유래의 라디칼에 의한 g 값이 2.001～2.003(g1)과 1.997～1.999(g2)인 비대칭 신호가 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 1. 방사선이 조사되지 않은 쇠고기 뼈의 ESR 스펙트럼.

그림 2. 7 kGy의 선량이 조사된 쇠고기 뼈의 ESR 스펙트럼.

② 셀룰로오스를 함유한 비조사 식품에서 나타나는 중심부의 신호 왼쪽(저자장)과 오른쪽(고자장)에 셀룰로오스 라디칼에 의해서 생성되는 한쌍의 피크가 6.0 mT( 60 G)의 공간을 두고 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 3. 방사선이 조사되지 않은 피스타치오(왼쪽)와 ESR 스펙트럼.

그림 4. 1 kGy의 선량이 조사된 피스타치오(오른쪽)의 ESR 스펙트럼.

③ 결정형 당을 함유한 비조사 식품에서 보이지 않던 다성분(multi component) ESR 신호(signal 1, 2, 3......)가 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 5. 방사선이 조사되지 않은 건포도의 ESR 스펙트럼.

그림 6. 1 kGy의 선량이 조사된 건포도의 ESR 스펙트럼.

4) 기체크로마토그래프/질량분석법 (Gas chromatograph/Mass spectrometer)

(1) 측정기기

① 기체크로마토그래프 ․ 질량분석기(GC/MS)

② 분쇄기

③ 원심분리기

④ 감압회전농축기

(2) 시약 및 시액

① 탄화수소 표준용액 : 탄화수소 표준품 [1-테트라데센 (C14:1), 펜타데칸 (C15:0), 1-헥사데센 (C16:1), 헵타데칸 (C17:0), 8-헵타데센 (C17:1), 1,7-헥사데카디엔 (C16:2)]을 헥산에 녹여 4 ㎍/mL가 되게 한다.

② 내부표준용액 : n-에이코산 표준품(n-eicosane, C20:0)을 헥산에 녹여 4 ㎍/mL가 되게 한다.

③ 정제컬럼 : Florisil을 충진한 유리칼럼, Florisil SPE 카트리지(충진제 : Florisil 10 g, 용량 : 35 mL) 또는 이와 동등한 것

- 유리칼럼에 Florisil을 충진하는 방법 : Florisil(60～100 mesh)을 550℃에서 5시간 이상 태워 상온에서 식힌 후 3% 물(물 3 g/ Florisil 100 g)을 가한 뒤 균질화하고 이를 12시간 이상 방치 후 불활성화시킨다. 불활성화 시킨 Florisil 20～25 g을 유리 칼럼(20 ㎜ × 200 ㎜)에 충진시켜 사용한다.

④ 헥산 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

(3) 검체조제

1) 지방추출

① 열처리 추출법

검체(식육 등)에서 지방이 많은 부위를 취하여 균질화 시킨후 50 g을 100 mL 원심분리용 유리관에 담고 50°C의 수조에서 가열한다. 이때 소량의 물 (2～5 mL)을 첨가하면 물과 지방이 쉽게 분리된다. 지방이 완전히 녹을 때까지 유리막대로 잘 저어준다음 물과 지방을 분리하기 위하여 원심분리 (900 g, 10분)하고 물층이 혼입되지 않도록 상층액을 취한다. 만약에 추출한 지방이 적을 때는 검체를 유리막대로 저은 다음 원심분리하여 위와 동일한 방법으로 추출하여 지방을 얻는다.

② 용매 추출법

검체 (건조식육 등) 60 g에 무수황산나트륨 70 g을 첨가하여 분쇄하고 헥산 300 mL을 가하여 잘 혼합한 후 원심분리 (900 g, 5분) 한다. 원심분리 후 상층액을 취하여 감압농축기로 농축(40℃)하여 지방을 얻는다. 만약에 추출한 지방이 적을 때는 헥산 100 mL를 가한 후 위와 동일한 방법으로 추출하여 지방을 추가로 얻는다.

2) 탄화수소의 분리 정제

① Florisil 칼럼 정제 : 추출한 지방 1 g에 내부표준용액 1 mL를 첨가하여 Florisil 유리칼럼에 가한다. 헥산 60 mL를 사용하여 3 mL/분의 유속으로 용출시켜 2 mL가 될 때까지 감압농축기로 농축한 (40℃) 후 0.5 mL까지 질소로 농축하여 기체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

② SPE 카트리지 정제 : 추출한 지방 1 g에 내부표준용액 1 mL를 첨가하여 헥산으로 활성화시킨 Florisil SPE 카트리지에 가한다. 헥산 30 mL를 사용하여 2 mL가 될 때까지 회전농축기로 농축한 (40℃) 후 0.5 mL까지 질소로 농축하여 기체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

(4) 시험조작

1) 기체크로마토그래프의 측정조건

① 칼럼 : DB-5column(30 m×0.32 ㎜ ID, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

② 주입부 : split ratio 1:20, 250℃

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/min.

④ 오븐온도 : 60°C 에서 25°C/min 속도로 170°C 까지 승온하고, 2°C/min속도로 205°C 까지 승온하며, 10°C/min 속도로 270°C 까지 승온한다.

⑤ 이온화방식 : Electron impact

⑥ 이온화에너지: 70 eV

⑦ 분석할 분자량 범위: 40-350

2) 정성시험

탄화수소는 크로마토그램상(total ionization chromatogram)에 분리된 각 피크와 표준물질 [1-테트라데센 (C14:1), 펜타데칸 (C15:0), 1-헥사데센 (C16:1), 헵타데칸 (C17:0), 8-헵타데센 (C17:1), 1,7-헥사데카디엔 (C16:2)]의 머무름시간(retention time)과 질량스펙트럼(mass spectrum)을 비교하여 확인한다.

(5) 판정

지방을 방사선 조사시키면 2 가지 형태의 탄화수소 (Cn-1 탄화수소와 Cn-2:1 탄화수소)가 생성되는데 이들의 존재여부로서 방사선 조사여부를 판단하며, 검지마커인 8-heptadecene (C17:1) 또는 1,7-hexadecadiene (C16:2)이 존재하면 방사선 조사된 것으로 판단한다.

제10, 26, (3) 중 ②를 다음과 같이 한다.

② Florisil카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 1 mL/분의 속도로 가한다. 이어서 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

제10, 26, (4), ⓛ 중 ㉮를 다음과 같이 한다.

㉮ 칼럼 : Supelcosil LC-PAH (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

[별표 4], (4) 나프로파마이드(Napropamide) 중 “견과류”를 “기타견과류”로 한다.

[별표 4], (8) 다이아지논 (Diazinon) 중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	3.0

[별표 4], (9) 델타메쓰린 (Deltametrin) 중 다음 항목을 신설한다.

구기자(건조)        2.0

[별표 4], (22) 디크로프루아니드 (Dichlofluanid) 중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	5.0

[별표 4], (26) 디페노코나졸(Difenoconazole) 중 다음 항목을 신설한다.

매실	0.2

[별표 4], (31) 마이클로부타닐(Myclobutanil) 중 “고추(건조) 3.0”을 “고추(건조) 5.0“으로 한다.

[별표 4], (35) 메소밀 (Methomyl) 중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	5.0

[별표 4], (38) 메타락실 (Metalaxyl) 중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	5.0

[별표 4], (66) 싸이퍼메쓰린 (Cypermethrin) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	1.0

구기자(건조)        5.0

[별표 4], (68) 싸이할로쓰린 (Cyhalothrin) 중 배추 “1.0”을 “0.2”로 하고 다음 항목을 신설한다.

구기자(건조)        2.0

[별표 4], (85) 에토펜프록스 (Ethofenprox) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

배추(건조)	7.0

파  (건조)	10

[별표 4], (101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	3.0

파  (건조)	2.0

딸기                   0.3

겨자채                 5.0

[별표 4], (105) 이프로디온 (Iprodione)중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	15

[별표 4], (114) 카보후란 (Carbofuran) 중 다음 항목을 신설한다.

매실	0.7

[별표 4], (125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil) 중 “감귤류”를 "기타감귤류“로 하고 다음 항목을 각각 신설한다.

마*	0.1

고추(건조)	15

[별표 4], (137) 테트라디폰 (Tetradifon) 중 다음 항목을 신설한다.

무화과                1.0

[별표 4], (140) 중 “트라로메스린 (Tralomethrin)”을 “트라로메스린 (Tralomethrin, 델타메쓰린(Deltamethrin)으로서)“로 한다.

[별표 4], (148) 트리플루라린 (Trifluralin) 중 "견과류“를 ”기타견과류“로 한다.

[별표 4], (165) 펜부코나졸 (Fenbuconazole) 중 다음 항목을 신설한다.

오미자*	3.0

[별표 4], (179) 폴펫 (Folpet) 중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	25

[별표 4], (183) 풀루아지호프-부틸 (Fluazifop-butyl) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

감자	0.05

무(뿌리)	0.05

무(잎)                  0.3

[별표 4], (185) 프로시미돈 (Procymidone) 중 "들깻잎 10.0“을 삭제하고 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	15

[별표 4], (186) 프로클로라즈 (Prochloraz) 중 자두의 “0.05”를 “0.5”로 한다.

[별표 4], (188) 프로파모카브 (Propamocarb) 중 다음 항목을 신설한다.

수박	0.7

[별표 4], (200) 헥사코나졸 (Hexaconazole) 중 다음 항목을 신설한다.

오미자	1.0

[별표 4], (203) 벤푸라카브 (Benfuracarb) 중 다음 항목을 신설한다.

파                    0.3

[별표 4], (206) 클로르훼나피르 (Chlorfenapyr)  중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	5.0

배추(건조)	3.0

감                      0.5

무화과                  0.5

복분자                0.5

취나물                3.0

[별표 4], (207) 테부페노자이드 (Tebufenozide) 중 다음 항목을 신설한다.

배추(건조)	3.0

[별표 4], (212) 플루페녹수론 (Flufenoxuron) 중 배추(건조)의 “4.0”을 “2.0”으로 한다.

[별표 4], (218) 디메토모르프 (Dimethomorph) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

파(건조)	15

무화과                  3.0

[별표 4], (220) 디에토펜카브 (Diethofencarb) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	3.0

자두                   0.5

[별표 4], (222) 메파니피림 (Mepanipyrim) 중 다음 항목을 신설한다.

양상추	3.0

[별표 4], (224) 싸이목사닐 (Cymoxanil)중 다음 항목을 신설한다.

배추(건조)	3.0

[별표 4], (225) 싸이프로디닐 (Cyprodinil) 중 다음 항목을 신설한다.

키위	3.0

[별표 4], (226) 싸이프로코나졸 (Cyproconazole) 중 다음 항목을 신설한다.

감                    0.2

[별표 4], (227) 아세타미프리드 (Acetamiprid)중 다음 항목을 각각 신설한다.

배추(건조)	10

[별표 4], (228) 아족시스트로빈 (Azoxystrobin)중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	7.0

파(건조)	7.0

매실	0.5

무화과	2.0

[별표 4], (230) 크레속심-메칠 (Kresoxim-methyl) 중 다음 항목을 신설한다.

대추	0.3

[별표 4], (231) 클로르플루아주론 (Chlorfluazuron) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

복숭아                0.5

대두	0.1

[별표 4], (233) 펜시쿠론 (Pencycuron) 중 다음 항목을 신설한다.

딸기                 2.0

[별표 4], (237) 피메트로진 (Pymetrozin) 중 다음 항목을 신설한다.

겨자채              3.0

[별표 4], (239) 후루아지남 (Fluazinam)중 다음 항목을 각각 신설한다.

파  (건조)	10

자두                    0.5

[별표 4], (242) 루페누론 (Lufenuron) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	2.0

복분자                  0.3

[별표 4], (248) 아바멕틴 (Abamectin) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

매실                0.05

무화과              0.05

[별표 4], (249) 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin benzoate) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

구기자(건조)         0.1

복분자              0.03

[별표 4], (251) 에톡사졸 (Etoxazole) 중 다음 항목을 신설한다.

무화과              0.3

[별표 4], (254) 카보설판 (Carbosulfan) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

배	0.2

복숭아                0.2

매실	0.07

[별표 4], (257) 플루퀸코나졸 (Fluquinconazole) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

양상추	1.0

오미자*                3.0

[별표 4], (259) 피리메타닐 (Pyrimethanil) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

양상추	3.0

오미자*	3.0

자두	2.0

[별표 4], (265) 디메텐아미드 (Dimethenamid) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추	0.05

피망	0.05

양배추	0.07

[별표 4], (290) 인독사카브 (Indoxacarb) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)              5.0

배추(건조)	10

파  (건조)	2.0

대두	0.2

복분자	0.5

[별표 4], (291) 족사마이드 (Zoxamide) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

배추(건조)	15

무화과	0.5

수박	0.05

[별표 4], (297) 테트라코나졸 (Tetraconazole)중 다음 항목을 신설한다.

고추(건조)	3.0

[별표 4], (301) 펜헥사미드 (Fenhexamid) 중 다음 항목을 신설한다.

사과	1.0

[별표 4], (304) 프로베나졸 (Probenazole) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추	0.07

피망	0.07

배추	0.07

[별표 4], (309) 플루토라닐 (Flutolanil) 중 다음 항목을 신설한다.

양상추             0.7

[별표 4], (321) 디노테푸란 (Dinotefuran) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

무(뿌리)	0.05

대두	0.05

[별표 4], (323) 보스칼리드 (Boscalid) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

대추	1.0

키위	5.0

[별표 4], (325) 시아조파미드 (Cyazofamid) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

밀감	0.5

멜론	0.5

참외	0.5

[별표 4], (326) 아세퀴노실 (Acequinocyl )중 다음 항목을 신설한다.

무화과	2.0

[별표 4], 중 (327) “아자페니딘(Azafenidine)” 을 삭제하고, “오리사스트로빈(Orysastrobin)”을 신설하며, 다음 항목을 각각 신설한다.

쌀               0.3

기타농산물       0.07

[별표 4], (332) 크로치아니딘 (Clothianidin)중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	10

겨자채	3.0

[별표 4], (335) 트리프록시스트로빈 (Trifloxystrobin) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

더덕	0.2

마*	0.2

[별표 4], (337) 티아메톡삼 (Thiamethoxam) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

겨자채	5.0

파	0.2

[별표 4], (338) 티아클로프리드 (Thiacloprid) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

딸기	2.0

토마토	1.0

매실	0.5

[별표 4], (345) 피라크로스트로빈 (Pyraclostrobin) 중 다음 항목을 신설한다.

대추	2.0

[별표 4], (349) 노발루론 (Novaluron) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

복숭아	1.0

복분자	2.0

구기자(건조)	5.0

취나물	5.0

[별표 4], (352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추(건조)	5.0

배추(건조)	20

파  (건조)	10

복숭아	1.0

밤	0.1

복분자	1.0

들깻잎	5.0

취나물	3.0

[별표 4], (355) 스피로디크로펜 (Spirodiclofen) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

딸기	2.0

유자	2.0

차	5.0

[별표 4], (358) 이프로발리카브 (Iprovalicarb) 중 다음 항목을 신설한다.

무화과	1.0

[별표 4], (361) 테플루스린 (Tefluthrin) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

파	0.05

고구마	0.05

[별표 4], (370) ”플루피라조포스(Flupyrazofos)”를 삭제하고, “Benthiavalicarb-isopropyl(벤티아발리카브아이소프로필)”를 신설하며, 다음 항목을 각각 신설한다.

오이              0.07

포도              0.5

기타농산물        0.07

[별표 4], (374) 알라니카브(Alanycarb) 중 다음 항목을 신설한다.

사과	0.5

[별표 4], (379) 플루아크리피림 (Fluacrypyrim) 중 다음 항목을 신설한다.

무화과	0.5

[별표 4], (380) 피리다릴 (Pyridaryl) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

수박	0.2

오이	0.5

참외	0.5

복분자	1.0

취나물	5.0

[별표 4], (384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

감	0.05

배	0.2

복숭아	0.2

멜론	0.2

수박	0.2

[별표 4], (388) 시안화수소 (Hydrogen cyanide) 중 다음 항목을 신설한다.

오렌지	5.0

[별표 4], (390) 시메코나졸 (Simeconazole) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

딸기	0.3

사과	0.3

[별표 4], (392) 메소트리온 (Mesotrion) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

옥수수	0.2

[별표 4], (395) 플루오피콜라이드 (Fluopicolide) 중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추                  0.3

피망                  0.2

오이                  0.5

[별표 4] 중 (399)를 다음과 같이 신설한다.

(399) 사이플루메토펜 (Cyflumetofen)

밀감              0.5

사과              0.3

기타농산물        0.07

[별표 4] 중 “주3 기타농산물 --- 적용한다.” 후단에 “(기타농산물의 기준은 해당 농약에서 기준이 설정되지 아니한 농산물에서 농약이 검출될 경우에 적용하는 기준임)”을 신설하고, 주7 및 주8을 각각 다음과 같이 신설한다.

주7 실고추 및 고춧가루에서 농약이 검출될 경우 고추(건조)의 기준을 적용한다.

주8 복분자에는 나무딸기와 산딸기가 포함된다.

[별표 5], (20) 중 “에틸렌비스디치오카바메이트〔Ethylenebis(dithiocarbamate)s〕”를 “에틸렌비스디치오카바메이트*〔Ethylenebis(dithiocarbamate)s〕”로 한다.

[별표 5], (30) 중 “디메토모르프(Dimethomorph)”를 “디메토모르프* (Dimethomorph)”로 하고, 다음 항목을 각각 신설한다.

건삼	1.0

홍삼	0.7

[별표 5], (31) “클로로타로닐(Chlorothalonil)”을 “클로로타로닐*(Chlorothalonil)”로 한다

[별표 5], (32) “테플루스린(Tefluthrin)”을 “테플루스린* (Tefluthrin)”로 하고 다음 항목을 신설한다.

인삼농축액	0.3

[별표 5], (33) “플루퀸코나졸(Fluquinconazole)”을 “플루퀸코나졸* (Fluquinconazole)”로 하고, 다음 항목을 각각 신설한다.

건삼	0.5

홍삼	0.5

인삼농축액	0.5

[별표 5] 중 (35)부터 (44)까지를 다음과 같이 각각 신설한다.

(35) 아미트라즈(Amitraz : 아미트라즈와 (2,4-Dimethylphenyl)-N'- methyl formamidine의 합계)

수삼                0.05

(36) 부프로페진(Buprofezin)

수삼                0.07

(37) 싸이할로쓰린 (Cyhalothrin)

수삼                0.05

(38) 푸루실라졸 (Flusilazole)

수삼                0.07

(39) 프로클로라즈 (Prochloraz)

수삼                0.3

(40) 디치아논(Dithianon)

수삼                0.2

(41) 싸이목사닐* (Cymoxanil)

수삼                0.2

(42) 클로치아니딘 (Clothianidin)

수삼                0.2

(43) 티아메톡삼 (Thiametoxam)

수삼                0.1

(44) 에타복삼 (Ethaboxam)

수삼                0.2

[별표 7] 중 (56)부터 (69)까지를 다음과 같이 각각 신설한다.

(56) 노르플록사신(Norfloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류     불검출

(57) 오플록사신(Ofloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류     불검출

(58) 페플록사신(Pefloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류      불검출

(59) 나라신(Narasin)

가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.3 0.5 0.3	알	불검출

(60) 라살로시드(Lasalocid)

소근육 소간 소지방 소신장 유	0.02 0.02 0.02 0.02 0.01	가금근육 가금간 가금지방 가금신장 알	0.02 0.02 0.02 0.02 0.05

(61) 린코마이신(Lincomycin)

소근육 소간 소지방 소신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.5 0.05 1.0 0.2 0.5 0.1 0.5	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 유 알 어류 갑각류	0.2 0.5 0.1 1.5 0.15 0.05 0.1 0.1

(62) 마두라마이신(Maduramycin)

가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.8 0.4 1.0	알	불검출

(63) 밤버마이신(Bambermycin, Flavomycin, Flavophospholipol)

소근육 소간 소지방 소신장 닭근육 닭간 닭지방 닭신장	0.01 0.01 0.01 0.01 0.03 0.03 0.03 0.03	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 유 알	0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02

(64) 샘두라마이신(Semduramicin)

가금근육 가금간 가금신장 가금지방	0.1 0.5 0.2 0.5	알	불검출

(65) 아빌라마이신(Avilamycin)

돼지근육 돼지간 돼지신장 돼지지방	0.05 0.05 0.05 0.05	가금근육 가금간 가금신장 가금지방	0.05 0.05 0.05 0.05

(66) 아프라마이신(Apramycin)

소근육 소간 소지방 소신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.5 6.0 1.0 10.0 0.2 0.8 0.2 0.8	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장	0.1 0.1 0.1 0.1

(67) 엔라마이신(Enramycin)

돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장	0.03 0.03 0.03 0.03	닭근육 닭간 닭지방 닭신장	0.03 0.03 0.03 0.03

(68) 콜리스틴(Colistin)

소근육 소간 소지방 소신장 돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2	양근육 양간 양지방 양신장 염소근육 염소간 염소지방 염소신장 알 유 어류 갑각류	0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2 0.3 0.05 0.15 0.15

(69) 티아물린(Tiamulin)

소근육 소간 소지방 소신장 염소근육 염소간 염소지방 염소신장 양근육 양간 양지방 양신장	0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장 알	0.1 0.5 0.08 0.04 0.1 0.2 0.1 0.1 1.0

부 칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제 2. 5. 11), (1) 중 ⑤항은 2010년 1월 1일부터, 별표 5는 2009년 1월 1일부터, 별표 7은 2008년 11월 1일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행 당시 접수되어 검사가 진행중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용한다. 다만, 발기부전치료제 유사물질의 경우 이 고시 시행 전 접수되어 검사가 진행 중인 사항도 이 고시를 적용한다.

신․구조문 대비표

현  행

개  정

제 1. (생 략)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 2. (생 략)

3. 제조·가공기준

1) ～ 11) (생략)

12) 캡슐 또는 정제형태로 제조할 수 없다. 다만, 정제형태의 제품으로서 의약품으로 혼동할 우려가 없는 정도로 제조된 과자는 제외한다.

13) ～ 18) (생 략)

4.  (생 략)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 2) (생 략)

3) 식품첨가물

(1) (생 략)

(2) 기준 및 규격이 고시된 화학적합성품으로서 사용기준이 설정된 품목 중 그 기준이 국제기준과 상이하여 기준적용상 문제가 제기되었을 경우에 식품의약품안전청장은 식품위생심의위원회 심의를 거쳐 잠정적으로 CODEX 규정의 사용기준을 준용할 수 있다.

(3)  (생 략)

4) ～ (9) (생 략)

10)농약의 잔류허용기준

(1) 농산물의 잔류농약 기준적용

이 공전에서 잔류허용기준이 정하여지지 아니한 경우에는 아래에 따라 적용한다.

① CODEX 기준을 적용

② ①항에 적용되지 아니한 경우, 농약이 검출된 농산물은 우리나라 농약 잔류허용기준에서 해당 농약 잔류기준 중 유사한 농산물(유사농산물은 ④ 농산물의 분류중 동일 대분류군에 속한 품목을 말한다. 다만, 견과종실류, 과실류 및 채소류에 한해서는 소분류를 우선 적용한다)의 최저기준을 적용

③ ①, ②항에 적용되지 아니한 경우, 검출된 농약은 우리나라 농약 잔류허용기준 중 해당 농약의 최저기준을 적용

④ 농산물의 분류

대분류	소분류	품목
곡류	-	(생 략)
서류	-	(생 략)
콩류	-	(생 략)
견과 종실류	견과류	(생 략)
	종실류	(생 략)
과실류	이과류	(생 략)
	감귤류	(생 략)
	핵과류	(생 략)
	장과류	--- 구기자 등
	열대과일류	(생 략)
채소류	엽채류	--- 겨자채 등
	엽경채류	(생 략)
	근채류	(생 략)
	과채류	(생 략)
버섯류	-	(생 략)
차	-	(생 략)
인삼	-	(생 략)
호프	-	(생 략)
기타 식물류	-	(생 략)

(2) ～ (4) (생  략)

(5) 가공식품의 잔류농약 잠정기준적용

우리나라의 농약잔류허용기준중 기준이 설정되어 있지 아니한 가공식품중 농약 검출시 적․부 판정에 대한 기준은 다음과 같이 한다.

① ～ ② (생  략)

(6) ～ (7) (생  략)

11) 동물용의약품의 잔류허용기준

(1) 잔류동물용의약품의 기준적용

① 관련법령에서 --------- 관련 법령에 근거하여 본 항을 적용할 수 있다.

번호	식품 중 검출되어서는 아니 되는 물질
1	니트로푸란{푸라졸리돈(Furazolidone), 푸랄타돈(Furaltadone), 니트로푸라존(Nitrofurazone), 니트로푸란토인(Nitrofurantoine), 니트로빈(Nitrovin) 등} 제제 및 대사물질
2	(생 략)
3	(생 략)
4	(생 략)
5	(생 략)
6	(생 략)
7	(생 략)
8	(생 략)
9	(생 략)
10	(생 략)
11	(생 략)
12	(생 략)

② ～ ③ (생  략)

<신  설>

<신  설>

12) 기타 유해물질 기준

<신  설>

(1) 발기부전치료제 유사물질

①～ (생  략)

발기부전치료제 성분(실데나필, 타다라필, 바데나필, 유데나필, 미로데나필)과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질 : 검출되어서는 아니된다.(단, 발기부전치료제와 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질로서 따로 기준․규격이 정하여진 것은 제외한다.)

<신  설>

(2)～(3) (생  략)

6. 보존 및 유통기준

1) ～ 7) (생략)

8) 냉동제품을 해동시켜 실온 또는 냉장제품으로 유통시켜서는 아니되며, 실온 또는 냉장제품을 냉동시켜 냉동식품으로 유통시켜서는 아니된다. 또한, 냉장제품을 실온에서 유통시켜서는 아니된다.

< 신 설 >

9) ～ 17)

제 3. ～ 제 4. (생  략)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. (생  략)

2. 빵 또는 떡류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3)인공감미료 : 검출되어서는 아니된다(식빵에 한한다)

(4)보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

프로피온산 프로피온산나트륨 프로피온산칼슘	2.5 이하(프로피온산으로서 기준하며, 빵류에 한한다)
소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	(생 략)

(5) ～ (6)  (생  략)

6)  (생  략)

3. 코코아가공품류 또는 초콜릿류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(2) ～ (3)  (생  략)

4. (생  략)

5. 설 탕

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (2)  (생  략)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(4) (생  략)

6. 포도당

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (3)  (생  략)

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

7. 과 당

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (3)  (생  략)

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

8. 엿 류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

9. 당시럽류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) (생  략)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(3) (생  략)

10. 올리고당류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) (생  략)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

11. 식육 또는 알가공품

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (7) (생  략)

(8)보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	2.0 이하(식육 및 식육가공품에 한한다)

6)  (생  략)

12.  (생  략)

13. 두부류 또는 묵류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3)타르색소 : 검출되어서는 아니된다(묵류에 한한다)

6)  (생  략)

14. ～ 15. (생  략)

16. 다 류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) (생  략)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(3) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (3) 주석에 따라 시험한다.

(4) (생  략)

17. 커 피

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (3) 주석에 따라 시험한다.

(3) ～ (5) (생  략)

18. 음료류

18-1 과일․채소류음료

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) (생  략)

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (3) 주석에 따라 시험한다.

(3) ～ (6) (생  략)

18-2. ～ 18-4. (생  략)

18-5. 인삼․홍삼음료

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(4) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (3) 주석에 따라 시험한다.

(5) ～ (7) (생  략)

18-6. ～ 19-3. (생  략)

19-4. 기타 영․유아식

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (5) (생  략)

(6) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(7) ～ (10) (생  략)

19-6. ～ 21-4 (생  략)

21-5 고춧가루

1) ～ 4)  (생  략)

5) 규격

(1) ～ (3)  (생  략)

(4) 위화물 : 불검출(전분, 겨, 탄산염, 식염, 당류 등)

(5) ～ (6)  (생  략)

6)  (생  략)

21-6 향신료가공품

1) ～ 2) (생 략)

3) 제조․가공기준

(1) (생 략)

(2) 향신료조제품 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니된다.

(3) ～ (6) (생 략)

4) ～ 6) (생 략)

21-7 ～ 23. (생  략)

24. 젓갈류

1)～4) (생  략)

5) 규격

(1)～(4) (생  략)

<신  설>

6) 시험방법

(1)～(5) (생  략)

<신  설>

25. ～ 27. (생  략)

28. 건포류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생 략)

<신  설>

6) 시험방법

(1) ～ (2) (생 략)

<신  설>

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 3) (생  략)

4) 식품유형

(1)  (생  략)

(2) 견과류가공품

견과류를 주원료로 하여 설탕, 식용유 등의 식품이나 식품첨가물을 가하여 가공한 것을 말한다.

5) ～ 6)  (생  략)

29-2 캡슐류

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(3) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (1) 비소 ① 굿짜이트법에 따라 시험한다.

29-3. ～ 29-11. (생  략)

29.-12 식 염

1) ～ 5) (생  략)

6) 시험방법

(1) ～ (7)  (생  략)

(8) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (1) 비소에 따라 시험한다.

(9) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 3) 금속별시험 (2) 납에 따라 시험한다.

(10) 카드뮴

제 10. 일반시험법 11. 미량영양성분시험법 1) 무기성분 (1) 시험용액의 조제에 따라  처리한 검체를 제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법 2) 측정 (1) 원자흡광광도법에 따라 시험한다.

(11) ～ (12)  (생  략)

29-13. ～ 29-18. (생  략)

제 6. 수산물에 대한 규격

1. (생  략)

2. 시험방법

5) 일산화탄소 시험법

(1) (생  략)

(2) 가스크로마토그래프의 측정조건

① ～ ③ (생  략)

④ 칼 럼 : 안지름 3mm, 길이 2.3m의 스테인레스관

⑤ 칼럼 충전제 : Molecular sieve 13X(60～80mesh)

⑥ 칼럼온도 : 70～90℃

⑦ ～ ⑨ (생 략)

(3) 시험방법

① 일반법

가) 시험방법

㉠ 시료를 해동한 직후 껍질을 벗긴 다음 세절하고 300g을 정밀히 달고 2배량의 물을 가한 후 빙냉하에서 1분간 균질화하여 이를 시료액으로 한다.

㉡ 시료액 조제일 또는 5℃에서 2일간 보존 후에 각각 시료액 200g을 원심분리관에 취하여 10℃에서 원심분리(3,000rpm, 10분)하고 상층액을 얻는다.

㉢ (생  략)

㉣ 별도로 표준 일산화탄소가스를 청정공기로 적정농도로 희석한 후 1 mL를 가스타이트시린지로 가스크로마토그래프에 주입하고 얻어진 피크면적으로 부터 검량선을 작성하여 시료중의 일산화탄소량을 구한다.

어육중의 일산화탄소농도를 구할 때는 다음의 계수를 이용한다.

일산화탄소 표준가스 1 mL(20℃)의 중량

＝ 표준가스의 일산화탄소의 농도 × 1.165 mg

<신   설>

<신   설>

나) 일산화탄소 처리 유무판정

㉠ ～ ㉡ (생략)

㉢ 상기 이외의 경우 시료액 조제일로부터 2일간 보존후의 분석치가 시료 조제일보다 명확하게 감소한 것은 일산화탄소를 처리한 것으로 판정한다.

② (생 략)

제 7. ～ 제 9.  (생  략)

제 10. 일반시험법

1.～ 6. (생 략)

7. 이물시험법

1) 일반시험

(1) ～ (4) (생 략)

(5) 금속성이물(쇳가루) 시험법

① 검체(분말제품 500g, 액상제품 1 kg)를 증류수 5～ 6 L와 혼합 후 비닐을 씌운 봉자석(10,000 가우스 자력)으로 10분간 저어 쇳가루를 모은 후 건조하여 무게를 측정한다.

② ～ ③ (생 략)

<신  설>

2) (생 략)

8. 미생물시험법

1) 일반사항

(1)  (생 략)

(2) 배지

① ～  (생 략)

<신 설>

<신 설>

(3) (생 략)

2) ～ 12) (생 략)

13) 살모넬라(Salmonella spp.)

(1) (생 략)

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey 한천배지(배지 30) 또는 Desoxycholate Citrate 한천배지(배지 31) 또는 XLD한천배지(배지 58)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후, 의심되는 집락은 확인시험을 실시한다.

14) ～ 16) (생 략)

17) 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

(1) 정성시험법

① (생 략)

②  분리배양

카나마이신을 200 μg/mL의 농도로 가한 난황 첨가 CW한천평판배지(배지 27)에 증균배양액을 접종하여 35℃에서 18～24시간 혐기배양한 결과 분리배지상에서 직경 2 mm정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 혼탁한 백색환이 있는 집락은 확인시험을 실시한다.

③ (생 략)

(2) (생 략)

18) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

(1) (생 략)

(2) 분리배양

증균배양액을 멸균된 면봉을 이용하여 Oxford agar(배지 38) 또는 Lithium chloride- phenylethanol-moxalactam 한천배지(배지 39)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다.

(3) (생 략)

19) 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)

(1) (생 략)

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey Sorbitol 한천배지(배지 43)에 접종하여 35℃에서 18시간 배양한다. Sorbitol을 분해하지 않는 무색집락을 취하여 EMB 한천배지(배지 6)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하고, 녹색의 금속성 광택이 확인된 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) ～ (4) (생 략)

20) ～ 24) (생 략)

9. ～ 13.  (생 략)

14. 3-MCPD(3-Monochloropropane-1,2-diol) 시험법

단백질을 염산에 의해 가수분해시 잔존하는 지질에서 유래하는 글리세린과 염소가 반응하여 생성된 글리세린 염소화합물인 3-MCPD를 함유하는 검체를 정제칼럼(Extrelut, 실리카겔충전)을 통과, 수분과 고형물을 분리하고 용매(초산 에틸)로 추출한 후 무수물상태에서 붕산페닐(Phenylboric acid)로 유도체화한 후 GC-FID 또는 GC-MS로 분석하는 방법이다.

(1) 장치

① 가스크로마토그래프 : 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용한다.

② (생 략)

(2) 시약 및 시액

① 초산에틸(Ethyl acetate) : 잔류 농약 시험용 또는 이와 동등한 것

② 0.2% 붕산페닐 : 붕산페닐 0.2g을 초산에틸에 녹여 100㎖가 되게한다.

③ 정제칼럼 : Extrelut 3 (3㎖용임. needle No. 32), Extrelut 20 또는 이와 동등한 것.

④ 표준원액 : 3-MCPD 0.1g을 취해 초산에틸에 녹여 100㎖가 되게 한다(1000㎍/㎖).

⑤ 표준용액 :  위의 액을 초산에틸로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

⑥ 내부표준원액 : 헵타데칸(Heptadecane)을 0.1g을 취해 초산에틸에 녹여 100㎖가 되게 한다(1000㎍/㎖).

⑦ 내부표준용액 : 위의 액을 초산에틸로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

<신  설>

(3) 시험 용액의 조제

① 추출

검체(액상인 경우 검체 3～20㎖, 분말 또는 페이스트상인 경우 1～3g의 무게를 정확히 달아 물에 녹여 진탕 후 사용)를 정제칼럼(Extrelut 3 또는 20)에 정확히 취하여 약 10분간 정치하여 흡착시킨 후 초산 에틸 약 15～150㎖로 용출한다. 용출액을 무수 황산나트륨으로 탈수하여 KD 수기에 받은 후 약 65°의 수욕조에서 질소 하에 농축한다. 이에 0.2% 붕산페닐 1㎖와 내부표준용액 1㎖를 첨가하여  일정양으로 한 후 30초간 혼합 후 상온에서 5분간 정치하여 시험용액으로 한다.

별도로 추출 농축액 대신에 표준용액 1㎖를 취하여 0.2% 붕산페닐 1㎖와 내부표준용액 1㎖를 첨가하여 30초간 혼합 후 상온에서 5분간 정치하여 표준시험용액으로 한다.

<신  설>

(4) 시험조작

① (생 략)

② 가스크로마토그래프, 질량분석기 측정 조건

㉮ 칼럼 : HP - 5MS 또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 240°

㉰ 검출기 온도 : 280°

㉱ 칼럼오븐온도 : 초기의 온도 70°에서 1분간 유지하고 30°/분의 비율로 200°까지 온도를 상승시켜 10분간 유지한 후 다시 50°/분의 비율로 280°까지 온도를 상승시켜 15분간 유지한다.

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1㎖/분)

㉳ (생 략)

㉴ (생 략)

㉵ 특성이온질량 :

MCPD 유도체 화합물 :  147(base peak), 91, 196, 104

헵타데칸 :  57(base peak), 85, 113

③ 정성시험 : 표준시험용액 및 시험용액의 일정량을 가스크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크를 표준시험용액의 피크와 비교하여 머무름시간의 일치 여부를 확인한다. GC-MS의 경우 표준물질의 이온/질량값을 비교, 일치성을 확인한다.

④ 정량시험 : 정성시험의 크로마토그람에서 확인된 피크에 대하여 피크 높이 또는 피크 면적으로 다음에 따라 계산한다.

계산식:

3-MCPD함량 (μg/g) = STC ×  × ×

STc : 표준 시험용액의 최종 3-MCPD 농도 (㎍/㎖)

ST  : 표준 시험용액의 3-MCPD 피크 높이 또는 면적

SA  : 시험용액의 3-MCPD_피크 높이 또는 면적

STis : 표준 시험 용액내 내부표준물질 피크 높이 또는 면적

SAis : 시험용액내 내부표준물질 피크 높이 또는 면적

V : 시험용액의 전량 (㎖)

S : 검체 채취량 (g)

비고 : HVP 의 경우 수분함량을 측정하여 건조물 기준으로 보정하여 계산한다.

15. 식품중의 잔류물질시험법

1) (생  략)

2) 항생물질

(1) (생  략)

(2) 정량시험법

① 기기분석법

㉮～㉶ (생  략)

㉷ 마크로라이드계 항생물질(타이로신(Tylosin), 에리스로마이신(Erythromycin))

Ⓐ 기기, 시약 및 시험용액의 조제

㉠ 검출기：분광광도검출기, 형광검출기 또는 시차굴절계검출기

㉡ 표준용액의 조제

각 항생물질의 상용표준품을 ------ 표준용액으로 한다.

㉢ (생  략)

Ⓑ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ～ⓑ (생  략)

ⓒ 에리스로마이신의 분석조건

- 칼럼：길이 50 mm, 안지름 2.1 mm, 전다공성화학결합실리카충전칼럼

- 검출기：형광검출기

- 검출파장：여기파장(Ex)

360nm, 측정파장(Em) 440nm

- 이동상：아세토니트릴‧물 ‧0.2M 초산암모늄(65：25：10)

- 유속：0.9 mL/분

ⓓ 에리스로마이신의 분석조건

- 칼럼：길이 183 mm, 안지름 2.3 mm, 실리카충전칼럼

- 검출기：시차굴절검출기

- 이동상：클로로포름

- 유속：0.5 mL/분

㉡ 정량시험

각각의 항생물질 표준용액을 측정조건에 따라서 ------ 각각의 피크 머무름시간을 측정한다. ------ 이에 따라 항생물질의 양을 구한다.

㉸～㉹ (생  략)

㉺ 폴리펩타이드계 항생물질(버지니아마이신(Virginiamycin), 바시트라신(Bacitracin))

Ⓐ 기기, 시약 및 시험용액의 조제

㉠ 검출기：시차굴절계검출기 또는 분광광도검출기

㉡ 표준용액의 조제

각 항생물질의 상용표준품의 무게를 달아 ------ 희석해서 표준용액으로 한다.

㉢ (생  략)

Ⓑ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 버지니아마이신의 분석조건

- 칼럼：길이 300 mm, 안지름 3.9 mm, 전다공성화학결합실리카충전칼럼

- 검출기：시차굴절계검출기

- 이동상：아세토니트릴‧물(1：1)

- 유속：0.45 mL/분

ⓑ 버지니아마이신의 분석조건

- 칼럼：길이 300 mm, 안지름 3.9 mm, 전다공성화학결합실리카충전칼럼

- 검출기 및 파장：자외부검출기(UV) 230nm

- 이동상：0.01M 인산2수소나트륨‧아세토니트릴(65∶35)

- 유속：0.5 mL/분

ⓒ (생  략)

㉡ 정량시험

각각의 항생물질 표준용액을 측정조건에 따라서 -------- 각각의 피크 머무름시간을 측정한다. ------ 이에 따라 항생물질의 양을 구한다.

㉻～ (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3) 합성항균제

(1) (생  략)

(2) 정량시험법

①～⑭ (생  략)

⑮ 도라멕틴(Doramectin), 목시덱틴(Moxidectin), 이버멕틴(Ivermectin)

㉮ 정량법의 원리

검체 중 이버멕틴류(이버멕틴, 도라멕틴) 및 목시덱틴을 아세토니트릴로 추출하고 -------- 형광검출기로 측정한다.

㉯ (생  략)

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 표준원액 : 도라멕틴, 목시덱틴 및 이버멕틴 표준품을 ------ 냉동보관시에는 6개월간 유효하다 .

Ⓑ 표준용액 : 각각의 표준원액을 메탄올을 이용하여 ---- 표준용액으로 사용한다.

Ⓒ (생  략)

㉱ (생  략)

㉲ 시험조작

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액  ------ 검체 중 해당물질의 농도를 구한다.

～ (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4) 성장호르몬제

(1) 제라놀 및 디에틸스틸베스트롤

① 정량법의 원리

이 방법은 -------제라놀과 디에틸스틸베스트롤을 측정한다.

② (생  략)

③ 시약, 시액

㉮～㉰ (생  략)

㉱ 내부표준물질

Ⓐ (생  략)

Ⓑ D8디에틸스틸베스트롤(Diethyl-1,1,1'-1'-d4-stilbestrol-3,3',5,5'-d4, D8Diethylstilbestrol：D8DES)：디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol：DES)의 내부표준물질

㉲ 표준원액：제라놀, 제랄란 및 탈레라놀(Taleranol) 각 20 mg, 디에틸스틸베스트롤 및 D8디에틸스틸베스트롤 각 10 mg을 ------ 메탄올에 녹인다(이 용액 각 1 mL는 제라놀, 제랄란 및 탈레라놀 200 μg, DES 및 D8 DES는 100 μg에 상당).

㉳ 표준용액：표준원액의 제라놀, 제랄란, DES 및 D8 DES 각각 ------ 희석한다(이 용액 1 mL는 제라놀 및 제랄란 0.2 μg, DES 및 D8 DES 0.1 μg, 탈레라놀 0.4 μg에 상당).

㉴ DES-MG표준원액：디에틸스틸베스트롤모노글루쿠로나이드(Diethylstilbestrol mono glucuronide DES-MG) L 앰플(DES 1 mg 상당량)을 100 mL 메스플라스크에 넣고 메탄올로 녹인다(이 용액 1 mL는 DES 10 μg에 상당).

㉵ DES-MG 표준용액：표준원액 1 mL를 100 mL 메스플라스크에 취하여 메탄올로 희석한다(이 용액 1 mL는 DES 0.1 μg에 상당).

㉶  (생  략)

④ 시험조작

㉮ 추출

분쇄한 시료 -----(Control sample：제라놀과 디에틸스틸베스트롤이 함유되지 않은 시료) 5±0.1 g을 달아 각각 50 mL 폴리프로필렌 원심관에 넣고 내부표준물질인 제랄란과 D8 DES 또는 DES, Zeranol 표준용액 각각 50 μL를 넣는다. 따로 4개의 대조시료에 제라놀, 디에틸스틸베스트롤 모노글루쿠로나이드 및 탈레라놀 표준용액을 아래의 표와 같이 0, 25.0, 50.0, 100.0 μL를 첨가한다.

표준용액 첨가량(μL)	농도(ppb)
	제라놀	디에틸스틸베스트롤	탈레라놀
0.0 25.0 50.0 100.0	0.00 1.00 2.00 4.00	0.00 0.50 1.00 2.00	0.00 2.00 4.00 8.00

각 시료에 --------  .

㉯ 정제

위의 액을 --------다시 메탄올 2.5～3.0 mL를 넣어 제라놀과 디에틸스틸베스트롤을 회수용수기에 용출시킨다. ----------.

㉰  (생  략)

㉱ 정성 및 정량 시험

위의 잔류물을 ----- 주입한다.

물질	머무름시간	물질	특정이온
cis 디에틸스틸베스트롤 trans 디에틸스틸베스트롤 제랄란 제라놀 탈레라놀	7.3 8.0 10.3 12.6 12.8	제랄란 제라놀 D8DES 디에틸스틸베스트롤 탈레라놀	435 538, 523, 433, 379 420 412, 397, 383 538, 523, 433, 379

위 조건에서의 머무름시간 및 특정이온

㉲ 계산

Ⓐ  (생  략)

Ⓑ ---------

디에틸스틸베스트롤 ＝ 이온 412의 Cis 및 Trans 면적 또는 높이의 합/이온 420의 Cis 및 Trans 면적 또는 높이의 합

Ⓒ 다음의 회귀방정식을 사용하여 제라놀 또는 디에틸스틸베스트롤의 이온농도 대 제라놀 또는 디에틸스틸베스트롤의 이온비에 대한 표준곡선을 작성한다.

---------

Ⓓ 기울기와 ------ 제라놀 및 디에틸스틸베스트롤의 농도를 계산한다.

<신  설>

<신  설>

4)～7) (생 략)

16～21. (생 략)

22. 식품 중 유해물질 시험법

1) 발기부전 치료제 유사물질 시험법

(1) (생  략)

(2) (생  략)

① ～ ② (생  략)

③ 표준원액：호모실데나필

(homosildenafil),---------------------------------------

--------------- 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 실데나필(sildenafil), ----------

------------------

④ ～ ⑥ (생  략)

(3)～(4) (생  략)

(5) 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① ～  (생  략)

<신  설>

<신  설>

3) (생  략)

23. 유전자재조합식품의 시험법

1)～2) (생  략)

3) DNA 추출․정제법

DNA추출․정제법으로는---- 확인할 필요가 있다. 이들 방법을 사용하여 콩, 옥수수, 감자 및 이들 가공품으로부터 PCR에 이용할 수 있는 DNA를 추출․정제할 수 있으며, 분석시료에 대하여는 유전자 추출시험을 2회 반복하고 각각의 추출 DNA에 대하여 PCR을 실시한 후 결과를 판정한다. 본 시험법에서 ----사용하여야 한다.

4) (생  략)

5) 정성분석방법

정성분석은 일반 PCR을 이용하며 ----------- 분말이 없는 것을 사용한다.

(1) 프라이머의 준비

PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1 및 표 2와 같다. 그 밖에 이와 동등한 ---- 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

(2) PCR용 시약의 조제

Taq DNA polymerase(이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase도 사용할 수 있다) 등의 ----------얻어지는 지를 확인해야 한다.

① 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제

0%와 2% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 각각 DNA를 추출한 DNA 용액을 양성 대조군으로 사용한다. . 한편, 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 외에도 제조사에서 해당 프라이머에 특이적으로 제작하여 시판 중인 양성 확인용 DNA 플라스미드를 반응대조군으로 사용할 수 있다.

② PCR 반응 시약의 조제

PCR 반응에 필요한 시약은---- ㉱ 프라이머이며, 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 3과 같다.

③ 반응 대조군의 조제

각 PCR 반응시에는 ---- ㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA을 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 동일 작물로서 0% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 2% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA 또는 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하는 양성 확인용 플라스미드)을 시료와 함께 PCR시험을 한다.

표 1. PCR 검사에 사용되는 프라이머 및 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 (118 bp) 옥수수 (151 bp)	Le1n02-5' Le1n02-3' Le1-Taq SSllb 1-5' SSllb 1-3' SSllb-Taq	5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3' 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3' 5'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3' 5'-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3' 5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A -TAMRA-3'
스크 리닝	CMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	[콩] RRS (121 bp) [옥수수] Bt176 (100 bp) Bt11 (127 bp) GA21 (133 bp) T25 (149 bp) MON810 (113 bp) NK603 (143bp) TC1507 (103bp)	RRS 01-5' RRS 01-3' RRS-Taq Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt176-Taq Bt11 3-5' Bt11 3-3' Bt11-Taq GA21 3-5' GA21 3-3' GA21-Taq T25 1-5' T25 1-3' T25-Taq M810 2-5' M810 2-3' M810-Taq NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3'	5'-CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG-3' 5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3' 5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-TAMRA -3' 5'-TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG-3' 5'-ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T-3' 5'-FAM-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-TAMRA-3' 5'-AAA AGA CCA CAA CAA GCC GC-3' 5'-CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CT-3' 5'-FAM-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3' 5'-GAA GCC TCG GCA ACG TCA-3' 5'-ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT-3' 5'-FAM-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG - TAMRA-3' 5'-GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA-3' 5'-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT-3' 5'-FAM-TGC AGG CAT GCC CGC TGA AAT C- TAMRA-3' 5'-GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A-3' 5'-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG-3' 5'-FAM-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-TAMRA-3' 5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3'

<신  설>

표 2. Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판 중인 프라이머

(생 략)

표 3. PCR 반응액의 조성

(생 략)

(3) PCR

각 추출 DNA에 대한 PCR은---- 프라이머로 PCR을 실시한다. 그 결과 2 반복 추출 시료 중 하나 이상에서 목적하는 증폭산물(내재성 유전자와 35S 프로모터 및/또는 NOS 터미네이터)이 모두 검출된 추출 유전자를 주형 DNA로 하여 구조유전자에 대한 프라이머를 사용하여 2차 확인시험을 한다.

① Master mixture의 조제

PCR을 하고자 하는 시료 수에-------주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 3의 PCR 반응액의 조성과 ----멸균증류수 0.5 μL를 가한다.

② (생 략)

③ PCR 증폭

모든 반응액을 분주한 후---- 반응조건은 표 4와 같다. 95℃에서 10분간 방치하여---증폭산물을 확인하거나 냉동 보관한다.

표 4. PCR 반응 조건

(생 략)

(4) (생 략)

(5) 분석 결과의 판정 및 처리

① (생 략)

② 2반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과 하나----내재유전자의 PCR산물은 모두 검출되나, 재조합유전자 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는--- ‘검사불능’으로 판정한다(표 5).

③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810, NK603, TC1507이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603이 있다.

④ 이상과 같이 하여 정성분석에서----- 다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가 받은 것이나 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우 ----

표 5. 결과 판정의 흐름도(예시)

(생 략)

1. (생 략)

2. 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터의 경우 유전자재조합 품종에 따라 검출되지 않을 수도 있다.

3. 감자와 스타링크 옥수수(CBH351)에 대하여 Nippon gene사(일본)에서 시판되는 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우 -----사용하여 실험한다.

6) 정량분석방법

현재까지의 기술로는 PCR법을 이용한 유전자재조합식품의 정량분석으로 절대량을 알 수는 없지만, AOAC학회지에 보고된 방법에 의해 해당하는 농작물이 반드시 가지고 있는 내재성유전자에 대한 재조합유전자의 존재비율로부터 재조합체가 얼마나 존재하는지를 상대적으로 측정할 수 있다. 이 방법은 일반 PCR에서 이용되는 polymerase 반응용 프라이머와 함께 주형 DNA에 상보적 염기서열을 가지면서 형광물질이 결합된 DNA 프로브(probe, 탐침자) 등이 필요하며, polymerase 반응이 거듭됨에 따라 증가하는 증폭산물에 이들이 특이적으로 결합할 때 프로브에서 분리되는 형광물질의 양을 동역학적으로 측정하여 주형 DNA양을 산출하는 실시간유전자증폭반응장치(Real-Time PCR)가 필요하다.

PCR을 이용한 정량법으로는 특수한 장치를 필요로 하지 않는 경합적 PCR법이나 외부표준시료로 정량표준곡선을 만들어 측정하는 방법도 사용할 수 있다.

(1) 실시간유전자증폭반응

TaqMan Chemistry를 이용한 정량법에는 3'과 5'의 두 프라이머 쌍의 DNA서열에 결합하는 리포터(reporter)와 소광제(quencher)의 두 색소를 결합시킨 형광 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 사용한다. 이 프로브가 DNA polymerase의 5’-nuclease 활성에 의해 가수분해되면 리포터색소가 소광제 색소로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 형광강도는 PCR 반응 회수에 대해 지수함수(指數關數)적으로 증강한다. 따라서 일정한 형광강도에 따른 PCR 반응횟수를 비교하여 원래의 DNA양을 구할 수 있게 된다.유전자재조합식품의 정량분석은 비유전자재조합체(non-GMO)에 보편적으로 존재하는 유전자를 내재성 유전자로 사용하여, 내재성 유전자 양에 대한 재조합유전자 양의 비를 구하여 정량치를 계측한다.

(2) 유전자재조합 콩의 정량

콩의 경우 콩에 보편적으로 존재하는 렉틴(lectin)유전자를 내재성 유전자로 하여, 렉틴유전자와 재조합유전자 각각을 확인하는 프라이머 쌍(Lel-n02)과 프로브(Lel-Taq)를 사용하여 각각 정량 PCR을 하고 얻어진 시료 중 복제 수를 구한다. 재조합유전자의 복제 수를 렉틴유전자의 복제 수로 나누고, 그 값을 미리 정한 계수(보정계수: 종자를 사용하여 요구된 정량 PCR반응에서 검출되는 종자 중의 내재성 유전자(대두의 경우 렉틴유전자) 수에 대한 재조합유전자 수의 비를 구한 것으로, 각 프라이머 쌍 및 프로브를 이용할 때의 보정계수는 대상품목별로 규정된다)로 다시 나누어 얻은 값에 100을 곱한 것이 시료 내에 함유된 유전자재조합 콩의 % 함량이 된다.

(3) 유전자재조합 옥수수의 정량

옥수수의 경우 여러 종의 유전자재조합 품종(Bt176, Bt11, T25, Mon810, GA21)이 있고 이들이 혼재하고 있을 수 있어 분석대상이 복수이므로 우선 정성분석 결과에 근거하여 각각의 품종별로 정량하고, 유전자재조합 옥수수의 품종별 정량치를 합산하여 결과를 판정한다.

분석 방법은 사용하는 프라이머 쌍과 프로브를 제외하면 콩의 정량 PCR법에서 제시된 방법과 동일하다. 옥수수의 경우 옥수수에 보편적으로 존재하는 내재성 유전자로서 전분합성효소(Starch Synthase IIb (SSIIb)) 유전자를 사용하며, 이 유전자에 특이적인 프라이머 쌍(SSIIb-3)과 프로브(SSIIb-Taq)를 사용하여 얻은 유전자의 복제 수와 분석대상이 되는 재조합유전자에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 사용하여 얻은 재조합유전자의 복제 수를 산출하여 유전자재조합 옥수수 품종별 함량을 구한다.

유전자재조합 품종 Bt176, Bt11, T25, MON810, GA21은 정량용 프라이머 쌍 및 프로브인 Bt176-2와 Bt176-Taq, Bt11-3과 Bt11-Taq, T25-1과 T25-Taq, M810-2와 M810-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq을 각각 사용한다. 주로 재배되는 유전자재조합 콩 및 옥수수의 각각의 품종에 대한 보정계수는 Real-Time PCR 기기의 기종별로 차이가 있으며, 그 값은 표6, 표7, 표8, 표9와 같다.

(4) 검량선용 표준액

복제수를 아는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액을 검량선용 표준액으로 사용한다. 검량선을 작성하기에 적당한 복제수(예를 들면 웰 당 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 복제수)가 되도록 대장균의 ColE1/TE DNA용액(5 ng/μL)을 사용하여 희석한 것을 사용한다.

표 6. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7700 및 5700)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.39	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.44	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.01	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.34	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	1.99	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.05	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 7. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7900HT 96well)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.40	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	1.99	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.34	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.02	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.36	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.04	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 8. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7900HT 384well)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.39	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.43	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.06	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.37	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.12	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.00	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 9. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(LightCycler)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.53	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.63	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.63	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.31	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.60	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.49	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.01	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

(5) 정량PCR용 반응액의 조제

정량PCR에 사용하는 모든 시약은 실온에서 녹인 후 혼합기를 사용하여 충분히 혼합하고 spin down하여 사용한다. 사용하는 시약은 같은 팁을 사용하여 연속하여 주입하면 피펫내의 공기가 냉각되기 때문에 2번째부터는 통상의 피펫조작으로는 정확하게 주입되지 않으므로 주의한다. 피펫의 설명서에 쓰인 저온 시험재료를 취급할 경우의 조작법을 숙지하여 사용한다. 또한, Universal PCR Master Mix와 같이 점성이 강한 시약을 다룰 때에는 피펫을 액면에 수직이 되게 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지 서서히 버튼을 누른 뒤 조금 더 깊숙이 누른 후 아주 서서히 버튼에서 힘을 빼 Taq polymerase를 흡입하고 그 상태에서 다시 피펫의 버튼을 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 눌러 액을 빼낸 후 다시 서서히 버튼에서 힘을 빼 액을 흡입한다. 분주 시에는 피펫을 수직으로 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 버튼을 눌러 액을 분주하고 피펫을 튜브에서 서서히 빼낸 후 팁을 제거한다. PCR용 반응액은 25 μL로서 그 조성은 Universal PCR Master Mix 12.5 μL, 대상 프라이머 0.5 μL(각 25 mM), 대상 프로브 0.5 μL(10 mM), 멸균증류수 9 μL와 20 ng/μL DNA시료액 2.5 μL(50 ng), 각 검량선용 표준액 2.5 μL 또는 5 ng/μL ColE1/TE용액 2.5 μL로 이루어진다. 5 ng/μL ColE1/TE용액은 미량의 DNA가 비특이적으로 튜브벽면에 흡착되는 영향을 보정하고, 음성대조군용 시험액으로 사용된다.

① 프라이머-프로브 혼합액의 조제

시험에 사용할 대상 프라이머가 각 1.25mM, 대상 프로브가 0.5mM이 되도록 멸균증류수를 사용하여 희석하고 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다.

② 마스터 믹스(Master mix)의 조제

프라이머-프로브 혼합액과 Universal PCR Master Mix를 1 : 1.25의 비율로 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액 당 3 웰 분량의 PCR용 반응액을 동시에 조제한다. 이 때 조제량은 잉여분을 고려하여 하나의 DNA 시료 당 81 μL가 되도록 만든다.

③ 마스터 믹스의 분주

주형 DNA(시료 수), 각 검량선용 표준액(프라이머 당 5종), 음성대조군용 시험액(프라이머 당 1종)의 수만큼 500 μL 튜브를 준비하여 번호를 써둔다. 위의 혼합액을 78.75 μL씩 준비한 각각의 500 μL 튜브에 분주한다.

④ 마스터 믹스 분주액에 주형 DNA, 각 검량선용 표준액 또는 음성대조군용 시험액의 첨가  마스터 믹스를 분주한 튜브에 주형 DNA(20 ng/μL), 각 검량선용 표준액 또는 음성대조군용 시험액을 8.75 μL씩 가한다. 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 spin down 한다. 혼합용액을 웰 당 25 μL씩 분주한다. 플레이트의 뚜껑을 닫을 때 한쪽으로 기울어지지 않도록 대각선 방향으로 번갈아 웰의 뚜껑을 닫은 후, 전용 롤러를 사용하여 완전히 웰을 밀폐한다. 웰의 하부를 관찰하여 바닥에 기포가 있을 경우는 플레이트의 가장자리를 가볍게 두드리거나, 원심분리(96웰 플레이트용 원심분리기 사용)하여 기포를 완전히 제거한다.

(6) 정량 PCR반응 실시

정량PCR은 실시간중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)기기를 이용하여 실시한다. 장치에 plate를 설치하고 웰 정보를 입력한 후, 장치의 덮개 온도(Cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 반응조건은 다음과 같다.  50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 방치하여, 고온 개시(hot start)법으로 반응을 시작한다. 95℃에서 30초, 59℃에서 1분을 1회로 하여 총 40회의 증폭 반응을 하고, 반응종료 후 실험결과를 해석한다.

(7) 검량선의 작성

내재성 유전자와 재조합유전자에 대해 아래의 조작으로 검량선을 작성한다. 다음은 ABI PRISM 7700기종을 사용하여 실험한 경우 검량선을 작성하는 방법을 예로 든 것으로, 다른 기종의 경우 각 기기의 사용설명서를 참고하여 작성한다. 반응회수에 대해 형광 시그널의 증가량(△Rn)을 표시한 증폭곡선 위에서 검량선용 표준액 및 DNA 시료 유래의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 △Rn부를 선택하여, threshold line(Th. line)을 설정한다. 이때, 음성대조군(blank시료로서 ColE1 DNA용액을 사용한 것)에 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않도록 주의한다.

또한 Th. line은 「Amplification Plot」의 윈도우상에서 다음과 같은 조작에 의해 정한다. ① Baseline의 Start를 3으로, Stop을 15로 한다. ② Mult*Stddev의 값에 2m을 입력한다. 처음에는 ｍ＝0으로 한다. (즉 1을 입력한다.) ③「Suggest」button을 누른 후, 「Update Calculations」button을 누른다. ④「Analysis」,「Standard Curve」를 선택하여, 표준곡선의 상관계수, 기울기 및 Y 절편의 값을 확인하여, 「Th. line 결정표」에 Th. line의 값과 함께 기입한다. ｍ을 1씩 증가시키면서 이와 같은 절차를 반복한다.

이때 NTC의 증폭곡선 중 1개라도 Th. line과 교차하는 경우(눈대중으로 판단할 수 없는 경우 Experiment Report에서 Ct값이 40(40cycle PCR인 경우)이라면 교차하였다고 판단한다.(이하 같음)는 비고란에 NTC라고 기입한다. ⑤ 이 조작은 실험에 사용된 최대 복제수의 표준증폭곡선이 Th. line과 교차하게 될 때까지 반복한다. ⑥ 최대복제수의 표준증폭곡선이 하나라도 Th. line과 교차하면「Th. line 결정표」비고란에 plot out이라고 기입한다. ⑥ 증폭율(A) 및 ｜ΔA｜를 계산하여 이하의 조건을 만족시키는 Th. line을 택한다. A 및 ΔA의 정의：A= 10(-1 /slop), ΔA=(Am+1－Am)/Am×100

조건 1：｜ΔA｜가 2구간 이상 연속하여 1％이하가 되는 구간(최소n최대m)에 있어서 중점에서의 Th. line을 택한다. 단, 선택한 Th. line이 정수가 안 되는 경우에는 소수점 이하를 절상한다. 단, 선택된 Th. line에서 얻어진 표준곡선의 상관계수가 0.99이상이며, 증폭율(A)의 값이 2.1 이하의 조건을 만족하고, 선택된 Th. line이 NTC의 곡선과 교차하지 않아야 한다.

조건 2：조건 1에 합치하지 않는 경우에는 조건 1의 ｜ΔA｜의 허용치를 2％로 바꿔본다. 그래도 합치하지 않는 경우에는 ｜ΔA｜의 허용치를 3％, 4％, ５％로 바꿔본다.

조건 3：조건 1 또는 조건 2를 만족시키는 m이 여러 개 있는 경우에는 큰 m값을 채용한다.

재실험：｜ΔA｜의 허용치를 ５％로 바꾸어도 Th. line을 정할 수 없는 경우에는 실험을 다시 한다.

한편, Th. line과 검량선용 표준액의 형광시그널이 교차한 점을 threshold cycle(Ct)값으로 하여 Experiment Report에서 각각의 복제(copy수)를 구한다. 다음에 각각의 검량선용 표준액 복사수의 대수치(x축)를 작성하여, 각 Ct에 대해 얻은 근사 직선을 검량선으로 한다.

(8) 시료의 유전자재조합식품 혼입율의 계산

미지의 DNA시료에 대해 검량선 작성에 이용한 Th. line을 사용하여 Ct값을 구하여 내재성 유전자와 재조합유전자에 대한 각각의 검량선에 내삽하여 각 3웰의 초기 유전자 복제수의 평균값을 초기 내재성 유전자 복제수 및 초기 재조합유전자 복제수로 한 후, 다음 식에 따라 해당 유전자재조합 품종의 혼입율을 구한다.

※ 유전자재조합 품종 혼입율(%)	=	재조합유전자 복제수	×	1	×	100
		내재성유전자 복제수		보정계수

콩의 경우 현재 몬산토사에서 개발한 제초제 내성 라운드업레디 콩(Roundup Ready Soybean)이 대부분이며, Le-1과 RRS유전자 복제수로부터 유전자재조합 콩 함유율을 구할 수 있다.

(9) (생  략)

※ 참고

검량선용 표준액 작성에 사용된 유전자재조합 표준 플라스미드 DNA는 Nippon Gene Co.(FASMARK Co.)나 Wako Co.에서 구입 가능하다. 또한 PCR용 반응액의 조제에 사용된 대상 프라이머, 대상 프로브도 이들 회사에서 구입 가능하다.

7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법

(1) (생  략)

(2) (생  략)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 --- “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 10과 같다.

8) 유전자재조합 감자(New Leaf Plus, New Leaf Y)의 분석법

유전자재조합 감자는 ---- 현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 2 참조), 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다.

(1) (생 략)

(2) (생 략)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기---- “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 10과 같다.

표 10. 스타링크 옥수수(CBH351)와 유전자재조합 감자의 결과 판정의 예

(생 략)

9) (생 략)

10) 해충 저항성 Bt 쌀의 분석법

쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여---- PCR의 온도조건은 표 11과 같다. 쌀 내재성 유전자와 ---- 혼입 여부를 판정한다.

(1) (생  략)

(2) 내재성 유전자를 확인하기----- “검사불능”으로 판정한다.

표 11. 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 확인시험용 PCR 조건

(생 략)

24. (생  략)

25. 방사선 조사식품 검지법

광자극발광법 (Photostimulated luminescence, PSL) 및 열발광법 (Thermoluminescence, TL)은 ------ 판정하는 방법이다.

<신  설>

1)～2) (생 략)

<신  설>

<신  설>

26. 벤조피렌 시험법

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 시험용액의 조제

① (생  략)

② 후로리실카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 1 mL/분의 속도로 가한다. 이어서 헥산 10 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 8 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.5 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

(4) 시험조작

① 고속액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

㉯ ～ ㉱ (생  략)

② ～ ③ (생  략)

27. ～ 30.  (생  략)

〔별표 4〕 농산물의 농약잔류허용기준

(1)～(3) (생  략)

(4) 나프로파마이드(Napropamide)

--- 견과류 ---

(5) ～ (7) (생  략)

(8) 다이아지논 (Diazinon)

--- 호프 0.1

(9) 델타메쓰린 (Deltametrin)

--- 호프 5.0

(10) ～ (21) (생  략)

(22) 디크로프루아니드 (Dichlofluanid)

--- 호프 5.0

(23) ～ (25) (생  략)

(26) 디페노코나졸(Difenoconazole)

--- 호박 0.3

(27) ～ (30) (생  략)

(31) 마이클로부타닐 (Myclobutanil)

--- 호박 1.0, 고추(건조) 3.0,

(33) ～ (34) (생  략)

(35) 메소밀 (Methomyl)

--- 호밀 2.0

(36) ～ (37) (생  략)

(38) 메타락실 (Metalaxyl)

--- 호프 10.0

(39) ～ (65) (생  략)

(66) 싸이퍼메쓰린 (Cypermethrin)

--- 호박 5.0

(67) (생략)

(68) 싸이할로쓰린 (Cyhalothrin)

--- 배추 1.0 --- 호박 0.5

(69) ～ (84) (생  략)

(85) 에토펜프록스 (Ethofenprox)

--- 호밀 0.005

(86) ～ (100) (생  략)

(101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)

--- 호프 3.0

(101) ～ (104) (생  략)

(105) 이프로디온 (Iprodione)

--- 피망 5.0

(106) ～ (113) (생  략)

(114) 카보후란 (Carbofuran)

--- 호프 0.5

(115)～(124) (생  략)

(125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)

--- 호박 2.0, 감귤류 5.0

(126) ～ (136) (생  략)

(137) 테트라디폰 (Tetradifon)

--- 호프 1.0

(138)～(139) (생  략)

(140) 트라로메스린 (Tralomethrin)

(141)～(147) (생  략)

(148) 트리플루라린 (Trifluralin)

--- 견과류 ---

(149)～(164) (생  략)

(165) 펜부코나졸 (Fenbuconazole)

--- 피칸 0.1

(166)～(178) (생  략)

(179) 폴펫 (Folpet)

--- 호박 5.0

(180) ～ (182) (생  략)

(183) 풀루아지호프-부틸 (Fluazifop-butyl)

--- 피칸 0.05

(184) (생략)

(185) 프로시미돈 (Procymidone)

--- 들깻잎 10.0, --- 해바라기씨 2.0

(186) 프로클로라즈 (Prochloraz)

--- 자두 0.05 ---

(187) (생  략)

(188) 프로파모카브 (Propamocarb)

--- 피망 1.0

(189)～(199) (생  략)

(200) 헥사코나졸 (Hexaconazole)

--- 포도 0.1

(201)～(202) (생  략)

(203) 벤푸라카브 (Benfuracarb)

--- 쌀 0.01

(204)～(205) (생  략)

(206) 클로르훼나피르 (Chlorfenapyr)

--- 피망 0.7

(207) ～ (206) (생  략)

(207) 테부페노자이드 (Tebufenozide)

--- 파 0.7

(208) ～ (211) (생  략)

(212) 플루페녹수론 (Flufenoxuron)

--- 피망 0.3, 배추(건조) 4.0

(213) ～ (217) (생  략)

(218) 디메토모르프 (Dimethomorph)

--- 피망 0.5

(219) (생  략)

(220) 디에토펜카브 (Diethofencarb)

--- 피망 5.0

(221) (생  략)

(222) 메파니피림 (Mepanipyrim)

--- 포도 5.0

(223) (생  략)

(224) 싸이목사닐 (Cymoxanil)

--- 피망 0.1

(225) 싸이프로디닐 (Cyprodinil)

--- 포도 5.0

(226) 싸이프로코나졸 (Cyproconazole)

--- 사과 0.1

(227) 아세타미프리드 (Acetamiprid)

--- 피망 5.0

(228) 아족시스트로빈 (Azoxystrobin)

--- 호박 0.1

(229) (생  략)

(230) 크레속심-메틸 (Kresoxim-methyl)

--- 피망 2.0

(231) 클로르플루아주론 (Chlorfluazuron)

--- 피망 0.5

(232) (생  략)

(233) 펜시쿠론 (Pencycuron)

--- 쌀 0.3

(234)～(236) (생  략)

(237) 피메트로진 (Pymetrozin)

--- 피망 1.0

(238) (생  략)

(239) 후루아지남 (Fluazinam)

--- 피망 0.3

(240) ～ (241) (생략)

(242) 루페누론 (Lufenuron)

--- 호박 0.5

(243) ～ (247) (생  략)

(248) 아바멕틴 (Abamectin)

--- 호박 0.01

(249) 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin benzoate)

--- 호박 0.05

(250) (생  략)

(251) 에톡사졸 (Etoxazole)

--- 수박 0.1

(252)～(253) (생  략)

(254) 카보설판 (Carbosulfan)

--- 포도 0.1

(255) ～ (256) (생  략)

(257) 플루퀸코나졸 (Fluquinconazole)

--- 포도 1.0

(258) (생  략)

(259) 피리메타닐 (Pyrimethanil)

--- 포도 5.0

(260) ～ (264) (생  략)

(265) 디메텐아미드 (Dimethenamid)

--- 옥수수 0.1

(266) ～ (289) (생  략)

(290) 인독사카브 (Indoxacarb)

--- 피망 1.0

(291) 족사마이드 (Zoxamide)

--- 피망 0.3

(292) ～ (296) (생  략)

(297) 테트라코나졸 (Tetraconazole)

--- 피망 1.0

(298) ～ (300) (생  략)

(301) 펜헥사미드 (Fenhexamid)

--- 포도 3.0

(302)～(303) (생  략)

(304) 프로베나졸 (Probenazole)

--- 쌀 0.1

(305)～(308) (생  략)

(309) 플루토라닐 (Flutolanil)

--- 쌀 1.0

(310) ～ (320) (생  략)

(321) 디노테푸란 (Dinotefuran)

--- 오이 1.0

(322) (생  략)

(323) 보스칼리드 (Boscalid)

--- 토마토 2.0

(324) (생  략)

(325) 시아조파미드 (Cyazofamid)

--- 피망 2.0

(326) 아세퀴노실 (Acequinocyl)

--- 수박 0.2

(327) 아자훼니딘(Azafenidine)

사과 0.1

(328) ～ (331) (생  략)

(332) 크로치아니딘 (Clothianidin)

--- 피망 2.0

(333) ～ (334) (생  략)

(335) 트리프록시스트로빈 (Trifloxystrobin)

--- 포도 0.5

(336) (생  략)

(337) 티아메톡삼 (Thiamethoxam)

--- 피망 1.0

(338) 티아크로프리드 (Thiacloprid)

--- 피망 1.0

(339)～(344) (생  략)

(345) 피라크로스트로빈 (Pyraclostrobin)

--- 피망 0.5

(346)～(348) (생  략)

(349) 노발루론 (Novaluron)

--- 사과 1.0

(350) ～ (351) (생  략)

(352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)

--- 파 2.0

(353) ～ (354) (생  략)

(355) 스피로디크로펜 (Spirodiclofen)

--- 포도 1.0

(356) ～ (357) (생  략)

(358) 이프로발리카브 (Iprovalicarb)

--- 포도 2.0

(359) ～ (360) (생  략)

(361) 테플루스린 (Tefluthrin)

--- 땅콩 0.05

(362) ～ (369) (생  략)

(370) 플루피라조포스(Flupyrazofos)

배추 0.5

(371) ～ (373) (생  략)

(374) 알라니카브(Alanycarb)

--- 오이 0.1

(375) ～ (378) (생  략)

(379) 플루아크리피림 (Fluacrypyrim)

--- 사과 1.0

(380) 피리다릴 (Pyridaryl)

--- 파 0.5

(381) ～ (383) (생  략)

(384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid)

--- 포도 0.5

(385) ～ (387) (생  략)

(388) 시안화수소 (Hydrogen cyanide)

--- 피망 5.0

(389) (생  략)

(390) 시메코나졸 (Simeconazole)

--- 포도 1.0

(391) (생  략)

(392) 메소트리온 (Mesotrion)

--- 쌀 0.2

(393) ～ (394)

(395)플루오피콜라이드 (Fluopicolide)

--- 토마토 0.2

(398) (생  략)

<신  설>

주1 ～주2(생략)

주3. 기타농산물의 기준적용은 CODEX 기준이 없을 경우에만 적용한다.

주4～주6 (생  략)

<신설>

<신설>

〔별표 5〕인삼의 농약 잔류허용기준

(1)～(19) (생  략)

(20) 에틸렌비스디치오카바메이트

〔Ethylenebis(dithiocarbamate)s〕

(21)～(29) (생  략)

(30) 디메토모르프 (Dimethomorph)

--- 수삼 0.2

(31) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)

(32) 테플루스린 (Tefluthrin)

--- 수삼 0.2

(33) 플루퀸코나졸 (Fluquinconazole)

--- 수삼 0.2

(34) (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

〔별표7〕식품 중  동물용의약품의 잔류허용기준

(1)～(55) (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

제 1. (현행과 같음)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 2. (현행과 같음)

3. 제조·가공기준

1) ～ 11) (현행과 같음)

12) 캡슐 또는 정제형태로 제조할 수 없다. 다만, 정제형태로 제조된 과자류, 식염, 장류, 복합조미식품, 당류가공품은 제외한다.

13) ～ 18) (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 식품첨가물

(1) (현행과 같음)

<삭  제>

(3)  (현행과 같음)

4) ～ (9) (현행과 같음)

10) 농약의 잔류허용기준

(1) 농산물의 잔류농약 기준적용

농산물에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다.

① 당해 농산물에 대한 CODEX 기준

② 「식품의 기준 및 규격」중 별표 4 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중  당해농산물과 ④에서 정한 동일 대분류군(단, 견과종실류, 과실류 및 채소류에 한해서는 소분류를 우선 적용)에 속한 농산물의 최저기준

③ 「식품의 기준 및 규격」중 별표 4 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중 최저기준

④ 농산물의 분류

대분류	소분류	품목
곡류	-	(현행과 같음)
서류	-	(현행과 같음)
콩류	-	(현행과 같음)
견과 종실류	견과류	(현행과 같음)
	종실류	(현행과 같음)
과실류	이과류	(현행과 같음)
	감귤류	(현행과 같음)
	핵과류	(현행과 같음)
	장과류	--- 구기자, 머루, 복분자(산딸기, 나무딸기 포함) 등
	열대과일류	(현행과 같음)
채소류	엽채류	--- 겨자채, 뉴그린, 다청채, 당귀잎 등
	엽경채류	(현행과 같음)
	근채류	(현행과 같음)
	과채류	(현행과 같음)
버섯류	-	(현행과 같음)
차	-	(현행과 같음)
인삼	-	(현행과 같음)
호프	-	(현행과 같음)
기타 식물류	-	(현행과 같음)

(2) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 가공식품의 잔류농약 잠정기준적용

가공식품에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다.

① ～ ② (현행과 같음)

(6) ～ (7) (현행과 같음)

11) 동물용의약품의 잔류허용기준

(1) 잔류동물용의약품의 기준적용

① 관련법령에서 --------- 관련 법령에 근거하여 본 항을 적용할 수 있다.

번호	식품*1 중 검출되어서는 아니 되는 물질
1	니트로푸란{푸라졸리돈(Furazolidone), 푸랄타돈(Furaltadone), 니트로푸라존(Nitrofurazone), 니트로푸란토인(Nitrofurantoine), 니트로빈(Nitrovin) 등} 제제 및 대사물질*2
2	(현행과 같음)
3	(현행과 같음)
4	(현행과 같음)
5	(현행과 같음)
6	(현행과 같음)
7	(현행과 같음)
8	(현행과 같음)
9	(현행과 같음)
10	(현행과 같음)
11	(현행과 같음)
12	(현행과 같음)

*주1. 축산물 및 동물성 수산물과  그 가공식품에 한한다.

*주2. 니트로푸라존의 대사물질인 세미카바자이드(Semicarbazide, SEM)는 비가열 축산물 및 동물성 수산물(단순절단 포함)에 한하여 적용한다.

② ～ ③ (현행과 같음)

④ 개별동물에 대한 국내 및 국제식품규격위원회의 기준이 없을 시 유사축종의 잔류허용기준 중 해당부위의 최저기준을 준용한다. 즉, 포유류 중 기준이 없는 반추동물 및 말, 기준이 없는 비반추동물과 기준이 없는 가금류는 기준이 정해진 반추동물, 비반추동물 및 가금류의 기준 중 해당부위의 최저기준을 각각 적용하며, 로얄젤리 및 프로폴리스는 벌꿀의 기준을 적용한다.

⑤ 「식품의 기준 및 규격」 및 국제식품규격위원회에도 잔류기준이 없는 동물용의약품 중 항생물질 및 합성항균제에 대하여 축․수산물(유, 알 포함) 및 벌꿀(로얄젤리, 프로폴리스 포함)의 잔류기준을 0.03 mg/kg으로 적용한다.

12) 기타 유해물질 기준

(1) 아래의 발기부전치료제․당뇨병치료제․비만치료제 등과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질 : 검출되어서는 아니된다.(단, 동성분과 화학구조가 근원적으로 유사한 합성물질로서 따로 기준․규격이 정하여진 것은 제외한다.)

㉮ 발기부전치료제

a. 실데나필(Sildenafil)

(C22H30N6O4S, 474)

b. 타다라필(Tadalafil)

(C22H19N3O4, 389)

c. 바데나필(Vardenafil)

(C23H32N6O4S, 488)

d. 유데나필(Udenafil)

(C25H36N6O4S, 516)

e. 미로데나필(Mirodenafil)

(C26H37N5O5S, 531)

㉯ 당뇨병치료제

a. 글리벤클라미드(Glibenclamide)

(C23H28ClN3O5S, 493)

b. 글리클라짓(Gliclazide)

(C15H21N3O3S, 323)

c. 글리피짓(Glipizide)

(C21H27N5O4S, 445)

d. 글리메피리드(Glimepiride)

(C24H34N4O5S, 490)

㉰ 비만치료제

a. 시부트라민(Sibutramine)

(C17H26ClN, 279)

b. 오르리스타트(Orlistat)

(C29H53NO5, 495)

㉱ 기타

a. 펜플루라민(Fenfluramine)

(C12H16F3N, 231)

b. 리오치로닌(Liothyronine)

(C15H12I3NO4, 651)

c. 레보치록신(Levothyroxine)

(C15H11I4NO4, 777)

d. 에페드린(Ephedrine)

(C10H15NO, 165)

(2) 발기부전치료제 유사물질

①～  (현행과 같음)

벤질실데나필 (benzylsildenafil) : 검출되어서는 아니된다.

(3) 비만치료제 유사물질

① 데스메틸시부트라민 (desmethylsibutramine) : 검출되어서는 아니된다.

(4)～(5) (현행과 같음)

6. 보존 및 유통기준

1) ～ 7) (현행과 같음)

8) --------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------- 아니된다.

9) 냉장제품을 실온에서 유통시켜서는 아니된다(단, 과일·채소류 제외).

10) ～ 18)

제 3. ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. (현행과 같음)

2. 빵 또는 떡류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3)삭카린나트륨 : 검출되어서는 아니된다.

(4)보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

프로피온산 프로피온산나트륨 프로피온산칼슘	2.5 이하(프로피온산으로서 기준하며, 빵 및 케이크류에 한한다)
소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	(현행과 같음)

(5) ～ (6)  (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

3. 코코아가공품류 또는 초콜릿류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(2) ～ (3)  (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

5. 설 탕

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(4) (생  략)  (현행과 같음)

6. 포도당

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (3)  (현행과 같음)

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

7. 과 당

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (3)  (현행과 같음)

(4) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

8. 엿 류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

9. 당시럽류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) (현행과 같음)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(3) (현행과 같음)

10. 올리고당류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) (현행과 같음)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

11. 식육 또는 알가공품

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (7) (현행과 같음)

(8)보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	2.0 이하〔소르빈산으로서, 식육가공품(양념육류, 분쇄가공육제품, 갈비가공품 제외)에 한한다〕

6) (현행과 같음)

12.  (현행과 같음)

13. 두부류 또는 묵류

1) ～ 4)  (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2)  (현행과 같음)

(3)타르색소 : 검출되어서는 아니된다

6) (현행과 같음)

14. ～ 15. (현행과 같음)

16. 다 류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) (현행과 같음)

(2) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(3) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(4) (현행과 같음)

17. 커 피

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(3) ～ (5) (현행과 같음)

18. 음료류

18-1 과일․채소류음료

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) (현행과 같음)

(2) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(3) ～ (5) (현행과 같음)

18-2. ～ 18-4. (현행과 같음)

18-5. 인삼․홍삼음료

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(4) 주석

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(5) ～ (7) (현행과 같음)

18-6. ～ 19-3. (현행과 같음)

19-4. 기타 영․유아식

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (5) (현행과 같음)

(6) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(7) ～ (10)  (현행과 같음)

19-6. ～ 21-4 (현행과 같음)

21-5 고춧가루

1) ～ 4)  (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (3)  (현행과 같음)

(4) 위화물 : 불검출(전분, 겨, 탄산염, 식염 등)

(5) ～ (6)  (현행과 같음)

6)  (현행과 같음)

21-6 향신료가공품

1) ～ 2)  (현행과 같음)

3) 제조․가공기준

(1) (생 략)

(2) 고추 또는 고춧가루 함유한 향신료조제품 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니된다.

(3) ～ (6) (현행과 같음)

4) ～ 6)  (현행과 같음)

21-7 ～ 23. (현행과 같음)

24. 젓갈류

1)～4) (현행과 같음)

5) 규격

(1)～(4) (현행과 같음)

(5) 대장균 : 음성이어야 한다(다만, 액젓, 조미액젓은 제외한다)

6) 시험방법

(1)～(5) (현행과 같음)

(6) 대장균

제 10. 일반시험법 8. 미생물시험법 6) 대장균에 따라 시험한다.

25. ～ 27. (현행과 같음)

28. 건포류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 황색포도상구균 : 1 g 당 100 이하  (다만, 조미건어포류에 한한다)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 황색포도상구균

제 10. 일반시험법 8. 미생물시험법 14) 황색포도상구균 (2) 정량시험법에 따라 시험한다.

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 식품유형

(1)  (현행과 같음)

(2) 땅콩 또는 견과류가공품

땅콩 또는 견과류를 단순가공하거나 이를 주원료로 하여 설탕, 식용유 등의 식품이나 식품첨가물을 가하여 가공한 것을 말한다.

5) ～ 6)  (현행과 같음)

29-2 캡슐류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(3) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

29-3. ～ 29-11. (현행과 같음)

29.-12 식 염

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (7)  (현행과 같음)

(8) 비소

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(9) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(10) 카드뮴

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

(11) ～ (12) (현행과 같음)

29-13. ～ 29-18. (현행과 같음)

제 6. 수산물에 대한 규격

1. (현행과 같음)

2. 시험방법

5) 일산화탄소 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) 기체크로마토그래프의 측정조건

① ～ ③ (현행과 같음)

④ 칼 럼 : HP-MOLSIV 캐필러리 칼럼 (30m×0.53mm ID, 25㎛) 또는 이와 동등한 것

⑤ (삭 제)

⑤ 칼럼온도 : 초기의 온도 60℃에서 시료를 주입하고 1분간 유지한 후 2분 동안 120℃까지 상승시켜 2분간 유지한다.

⑥ ～ ⑧ (현행과 같음)

(3) 시험방법

① 일반법

가) 시험방법

㉠ ------------------------- ---------------------------------------- 4℃로 냉각된 물을 가한 후 빙냉하에서 균질화(참치의 경우 30초, 틸라피아의 경우 1분)하여 이를 시료액으로 한다.

㉡ 시료액 ----------------

----------------------

---------------------    ----------------------

㉢ (현행과 같음)

㉣ --------------------- --청정공기 또는 질소가스로 --------------------

------------------------       -------------------------        -------------------------       -------------------------     -------------------------     ------------------------      -------------------------     -------------------------

-------------------------

㉤ 이 때, 검출된 일산화탄소 농도가 틸라피아에서는 20 ㎍/g 이상, 참치에서는 200 ～ 500㎍/g이 검출된 경우, ㉠의 시료액을 개봉된 용기에 넣고 공기순환이 가능한 저장장치를 이용하여 5℃에서 2일간 육막이 형성되지 아니하도록 교반하면서 보존한 후, ㉡ ～ ㉣의 과정을 거쳐서 일산화탄소의 잔류량을 측정한다.

㉥ ㉠의 시료액과 이를 5℃에서 2일간 보존 한 시료액의 일산화탄소 잔류량 변화를 비교하여 인위적 일산화탄소 처리유무의 판정에 이용한다.

나) 일산화탄소 처리 유무판정

㉠ ～ ㉡ (현행과 같음)

㉢ ----------------------

----------------------

---------------------

10% 이상 --------------

-----------------------

----

② (현행과 같음)

제 7. ～ 제 9.  (현행과 같음)

제 10. 일반시험법

1.～ 6. (현행과 같음)

7. 이물시험법

1) 일반시험

(1) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 금속성이물(쇳가루) 시험법

① 검체(분말제품 및 환제품 500g, 액상 및 페이스트제품 1 kg)를 증류수 5～ 6 L와 혼합 후 (환제품의 경우 2시간이상 정치하여 시료를 으깸) -------------------------

----------------------------

-------------------------

② ～ ③ (현행과 같음)

(6) 김치 중 기생충(란) 시험법

① 장치

㉮ 광학 현미경(100배～400배 검경 가능한 것)

㉯ 원심분리기(swinging bucket rotor가 장착된 것)

② 기구

㉮ 2 L 비이커

㉯ 18 mesh 체 및 35 mesh 체

㉰ 50 mL conical centrifuge tubes

㉱ 10 mL 일회용 주사기 (19 G 바늘 달린 것)

㉲ 현미경용 슬라이드글라스, 커버글라스 (20 x 40 mm)

㉳ 액량계 2 L

③ 시약 및 시액

㉮ 포르말린

㉯ Tween 80

㉰ 포화 sucrose 용액

sucrose 128 g을 80～90℃ 증류수 100 mL를 넣어 녹인 다음 상온이 될 때까지 식힌다. 포화 sucrose 용액에 포르말린 원액 400 μL를 넣고 잘 흔들어서 섞어 준다.

㉱ 세척액(0.5% sodium dodecyl sulfate, SDS) : SDS 0.5 g을 적당량의 물에 녹이고 Tween 80 0.1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 100 mL로 한다.

④ 시험용액의 조제

㉮ 검체 200 g을 2 L의 세척액에 담근다.

㉯ 검체를 건져내고, 침전물을 18메쉬 체(1 × 1 mm) 및 35메쉬 체  (0.5 × 0.5 mm)로 연속해서 걸러 고춧가루 등 고형물을 제거한다.

㉰ 여과액을 2L 액량계에 모으고 30분간 두었다가 200 mL를 남기고 조심스럽게 상층액만을 버린다.

㉱ 같은 방법으로 증류수로 2차례 반복하여 세정한다. 침전물을 50  mL conical centrifuge tubes에 옮겨 1,000 G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버린다.

㉲ 김치 침전물을 1 mL씩 3개의 50  mL conical centrifuge tube에 각각 옮겨놓고 부유액(포화 sucrose 용액) 10 mL를 넣고 잘 흔들어서 김치 침전물이 부유액과 섞이도록 한 후 conical centrifuge tube 상단 10 mm 전까지 부유액을 채운다.

㉳ 50 mL conical centrifuge tube를 swinging bucket rotor가 장착된 원심분리기에서  1,000 G로 15분간 원심분리 한다.

㉴ 원심분리 후 conical centrifuge tube가 흔들리지 않도록 조심스럽게 꺼내어 미리 준비해 둔 부유액(포화 sucrose 용액)이 채워진 주사기의  바늘을 conical centrifuge tube의 한쪽 벽에 대고 조심스럽게 천천히 용액을 주입하여 conical tube 상단으로 액면이 약간 볼록하게 솟아  오르도록 한다.

⑤ 검경

㉮ conical tube의 솟아 오른 액면 위에 22 × 40 mm 커버글라스를 살짝 올려서 부유물을 붙게 한 후 커버글라스를 슬라이드글라스 위에 올려놓고 tube 한 개당 2～3장의 슬라이드 표본을 제작하여 검경한다.

㉯ 검체 슬라이드를 광학현미경에서 100배로 검경하다가 충란 유사 물체가 관찰되면 400배로 확인한 후 크기를 계측하고 동정한 다음 기록한다.

2) (현행과 같음)

8. 미생물시험법

1) 일반사항

(1)  (현행과 같음)

(2) 배지

① ～  (현행과 같음)

Bismuth Sulfite 한천배지

Peptone	10 g
Beef extract	5 g
Dextrose	5 g
Na2HPO4(anhydrous)	4 g
FeSO4(anhydrous)	12 g
Bismuth sulfite(indicator)	8 g
Brilliant green	0.025 g
Agar	20 g
Distilled water	1,000 mL

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 1분간 끓이고 pH를 7.2로 조정하여 사용한다.

PALCAM 한천배지(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar)

Peptone	23 g
Columbia agar	13 g
Manitol	10 g
NaCl	5 g
Starch	1 g
Ferric ammouium citrate	0.5 g
Esculin	0.8 g
Dextrose	0.5 g
Lithium chloride	15.0 g
Phenol red	0.08 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 polymyxin B sulfate 10 mg, acriflavin 5 mg, ceftazidime 20 mg을 증류수 2 mL에 녹여서 여과 멸균하여 가한다.

(3) (현행과 같음)

2) ～ 12) (현행과 같음)

13) 살모넬라(Salmonella spp.)

(1) (현행과 같음)

(2) 분리배양

증균배양액을 MacConkey 한천배지(배지 30) 또는 desoxycholate citrate 한천배지(배지 31) 또는 XLD한천배지(배지 58) 또는 bismuth sulfite 한천배지(배지63)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 전형적인 집락은 확인시험을 실시한다.

15) ～ 16) (현행과 같음)

17) 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

(1) 정성시험법

① (현행과 같음)

②  분리배양

카나마이신(kanamycin)을 200 μg/mL의 농도로 함유한 난황 첨가 Clostridium  perfringens 한천배지(배지 27) 또는 TSC 한천배지(배지41)에 증균배양액을 접종하여 35℃에서 18～24시간 혐기배양한 결과 Clostridium  perfringens 한천배지에서 직경 2mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 TSC 한천배지에서 불투명한 환을 가지는 황회색 집락은 확인시험을 실시한다.

③ (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

18) 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

(1)  (현행과 같음)

(2) 분리배양

증균배양액을 멸균된 면봉을 이용하여 Oxford 한천배지(배지 38) 또는 lithium chloride-phenylethanol-moxalactam 한천배지(배지 39) 및 PALCAM 한천배지(배지64)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 tryptic soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다.

(3)  (현행과 같음)

19) 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)

(1) (현행과 같음)

(2) 분리배양

증균배양액을  cefixime (0.05 ㎍/L) 및 potassium tellurite(2.5 ㎍/mL)가 첨가된 MacConkey sorbitol 한천배지(배지 43)에 접종하여 35℃에서 18시간 배양한다. Sorbitol을 분해하지 않는 무색집락을 취하여 EMB 한천배지(배지 6)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하고, 녹색의 금속성 광택이 확인된 집락은 확인시험을 실시한다.

(3) ～ (4) (현행과 같음)

20) ～ 24) (현행과 같음)

9. ～ 13.  (현행과 같음)

14. 3-MCPD(3-Monochloropropane-1,2-diol) 시험법

검체를 알루미늄옥사이드와 혼합하여 크로마토그래프용 유리칼럼에 충진한 다음 디클로로메탄으로 추출하고 HFBA (heptafluorobutyric anhydride)로 유도체화한 후 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석하는 방법이다.

(1) 장치

< 삭  제 >

① (현행과 같음)

(2) 시약 및 시액

① 디클로로메탄 : 잔류 농약 시험용 또는 이와 동등한 것

② 유도체시약 : HFBA(heptafluorobutyric anhydride)

③ 알루미늄옥사이드 : 알루미늄옥사이드(150 mesh) 또는 이와 동등한 것.

④ 표준원액 : 3-MCPD 표준품을 초산에틸에 녹여 1000 ㎍/mL로 조제한다.

⑤ 표준용액 : 위의 표준원액을 초산에틸로 희석하여 4개 이상의 적당한 농도로 조제한다.

⑥ 내부표준원액 : 3-MCPD-d5 표준품을 초산에틸에 녹여 1000 ㎍/mL로 조제한다.

⑦ 내부표준용액 : 위의 내부표준원액을 초산에틸로 희석하여 적당한 농도로 조제한다.

⑧ 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것.

(3) 시험 용액의 조제

① 추출

균질화한 검체 5 g을 정확이 달아 5M NaCl용액을 가하여 30 mL가 되게 한 뒤 10분간 진탕한 후 원심분리 한다. 이 상층액 2 mL를 취해 알루미늄옥사이드 4 g과 내부표준용액 10 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 크로마토그래프용 유리칼럼(25 mm x 200 mm)에 충진한다. 그리고, 충진물 상단에 무수황산나트륨 약 1 g을 가한 뒤 디클로로메탄 30 mL을 분당 약 2 mL 정도로 용출한다.

용출액을 농축플라스크에 모아 35℃의 수욕조에서 1 mL로 감압농축 한 후 농축액을 파스퇴르 피펫을 이용하여 눈금이 있는 시험관으로 옮긴다. 플라스크에 남아있는 잔류물을 디클로로메탄으로 씻어 시험관에 합친 후, 35℃의 수욕조에서 건조수준까지 질소 농축한다.

단, 지방함량이 많은 시료는 크로마토그래프용 유리칼럼 용출단계에서 먼저 헥산 20 mL로 과량의 지방성분을 제거한 후 디클로로메탄으로 용출하여 상기와 같은 방법으로 농축과정을 거친다.

② 유도체화

위의 농축 시험관에 이소옥탄 1 mL 및 HFBA 150 ㎕를 첨가하여 마개를 닫고 60℃의 수욕조에서 교반하며 30분간 반응시킨 후 상온에서 10분간 방치한 다음 증류수 5 mL를 가하고 가볍게 흔든 후 정치한다. 상층의 유기용매층을 취하여 소량의 무수황산나트륨이 들어있는 시험관에 넣어 가볍게 흔들어 정치시킨 다음 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

표준시험용액은 마개가 있는 시험관에 농축용액 대신에 이소옥탄 900 ㎕와 농도가 다른 4개의 표준용액 100 ㎕ 및 HFBA 150 ㎕를 첨가하여 상기와 같은 순서로 유도체화한 용액을 사용한다.

(4) 시험조작

〈삭 제〉

① 기체크로마토그래프, 질량분석기 측정 조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS (30 m x 0.25 mm, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 230℃

㉱ 칼럼오븐온도 : 초기의 온도 50℃에서 5분간 유지하고 분당 2℃씩 90℃ 까지 승온하여 5분간 유지한 뒤 분당 30℃씩 280℃ 까지 승온하여 3분간 유지한다.

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (0.8 mL/분)

㉳ (현행과 같음)

㉴ (현행과 같음)

㉵ 특성이온질량 :

MCPD 유도체 화합물 : m/z 253, 275, 289, 291, 453

내부표준물질 유도체 화합물 : m/z 257, 278, 294, 296, 456

② 정성시험 : 위의 조건에서 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 각 피크를 표준용액의 표준물질 및 내부표준물질의 피크 머무름시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온 m/z 253, 275, 289, 291 및 453이 확인되어야 하고 특성이온 m/z 453과 253, 275, 289 및 291간 4개의 반응세기의 비(response ratio)를 3-MCPD 표준물질의 특성이온 간 반응세기의 비와 비교하여 2개 이상의 반응세기의 비가 ± 20%이내에서 일치하여야 한다.

③ 정량시험 : 검량곡선표준용액에서 얻어진 표준물질의 m/z 253 피크면적(AS)과 내부표준물질의 m/z 257 피크면적(AIS)에 대한 비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 양을 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 3-MCPD의 m/z 253 피크면적(ASAM)과 내부표준물질의 m/z 257 피크면적(ASAMIS)의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 3-MCPD함량을 다음에 따라 계산한다(정량한계 0.01 mg/kg).

계산식:

3-MCPD함량 (mg/kg) =M × D ×  × V ×

M : 검량선에서 계산된 3-MCPD의 농도 (ng/mL)

D : 전체 시험용액양에 대한 분석에 사용한 시험용액양의 비

S : 검체 채취량 (g)

V : 유도체화 과정에서 농축 시험관에 첨가한 이소옥탄의 부피 (mL)

비고 : HVP(Hydrolyzed Vegetable Protein, 식물성 단백가수분해물)의 경우 수분함량을 측정하여 건조물 기준으로 보정하여 계산한다.

15. 식품중의 잔류물질시험법

1) (현행과 같음)

2) 항생물질

(1) (현행과 같음)

(2) 정량시험법

① 기기분석법

㉮～㉶ (현행과 같음)

㉷ 타이로신(Tylosin)

Ⓐ 기기, 시약 및 시험용액의 조제

㉠ 검출기：분광광도검출기

㉡ 표준용액의 조제

타이로신 표준품을 ----- 표준용액으로 한다.

㉢ (현행과 같음)

Ⓑ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ～ⓑ (현행과 같음)

< 삭  제 >

< 삭  제 >

㉡ 정량시험

표준용액을 측정조건에 따라서 ------ 피크 머무름시간을 측정한다. ------ 이에 따라 타이로신의 양을 구한다.

㉸～㉹ (현행과 같음)

㉺ 바시트라신(Bacitracin)

Ⓐ 기기, 시약 및 시험용액의 조제

㉠ 검출기： 분광광도검출기

㉡ 표준용액의 조제

바시트라신 표준품의 무게를 달아 ------ 희석해서 표준용액으로 한다.

㉢ (현행과 같음)

Ⓑ 시험조작

㉠ 측정조건

< 삭  제 >

< 삭  제 >

ⓐ (현행 ⓒ와 같음)

㉡ 정량시험

표준용액을 측정조건에 따라서 -------- 피크 머무름시간을 측정한다. ------ 이에 따라 바시트라신의 양을 구한다.

㉻～ (현행과 같음)

반코마이신(Vancomycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료중의 반코마이신을 20% 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 반코마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 증류수로 희석하여 사용한다.

㉤ 강 양이온교환 폴리머  카트리지 :

X-C(styrene-divinylbenzene polymer surfaced with a strong cation exchanger group) 또는 MCX(Mixed Mode Cation Exchange)  카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 20% 아세토니트릴 15 mL를 가한 후 20분간 균질화한 후, 7,600 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심 분리관에 옮긴다. 남은 액에 20% 아세토니트릴 10 mL를 가하여 위의 과정을 반복한 후 상층액을 합한다. 이 상층액에 헥산 10 mL를 가하고 10분간 균질화한 후, 7,600 G에서 원심분리하고 하층액을 취한다. 위의 과정을 반복하여 하층액을 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 3 mL와 증류수 3 mL 그리고 0.1% 개미산 3 mL로 활성화시킨 X-C 카트리지에 추출용액을 흡착시킨다. 증류수 3 mL로 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 : 수산화암모늄 (97 : 3) 혼합용액 3mL로 용출시킨다. 이 용출액을 50℃에서 질소로 농축시킨 시험관에 증류수 1 mL를 넣고 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 40℃

- 이동상 : 10% 아세토니트릴 (0.1% 초산 함유)

- 유속 : 0.2 mL/min

- 주입량 : 10 μL

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Capillary temperature : 320℃

- Collision gas : 아르곤(Ar)

- Collision energy : 20 V

㉡ 정량

- 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 1305 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 반코마이신의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
반코마이신 (분자량 1449)	725	144, 1305

- 정량한계 : 0.001 mg/kg

밤버마이신(Bambermycin, Flavomycin, Flavophospholipol)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 밤버마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 밤버마이신(플라보마이신) 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥  C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	50	50
20.0	90	10
20.1	50	50
25.0	50	50

- 유속 : 0.2 mL/min

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(negative)

- Spray voltage : 4.5 kV

- Capillary temperature : 280℃

- Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

- Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

- SIM ion : m/z 1580

아프라마이신(Apramycin), 콜리스틴   (Colistin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 아프라마이신 및 콜리스틴을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 콜리스틴 및 아프라마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥ Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

㉠ 유(乳)

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취한 후 0.2 M 인산완용충액(pH 7.2) 3 mL를 가하여 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 혼합한 후 아세토니트릴 6 mL를 가하고 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 4 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉡ 알(卵)

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가하여 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉢ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 아세톤을 2% 포함한 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C8(2.0 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
10.0	10	90
12.0	10	90
13.0	100	0
19.0	100	0

․ 유속 : 0.4 mL/min

- 질량분석기 조건

․ Ionization : ESI(positive)

․ Spray voltage : 5 kV

․ Capillary temperature : 280℃

․ Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

․ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

․ SIM ion : m/z 540(아프라마이신), m/z 585.5(콜리스틴)

㉡ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아프라마이신 및 콜리스틴의 함량을 구한다.

엔라마이신(Enramycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료 중 엔라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 엔라마이신 표준품(엔두라시딘)을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

㉥ 강 양이온교환 폴리머 카트리지 :

X-C(styrene-divinylbenzene polymer surfaced with a strong cation exchanger group) 또는 MCX(Mixed Mode Cation Exchange)  카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

㉦ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가하여 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 1 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 개미산 수용액 3 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 2 mL 및 5% 수산화암모늄 함유 메탄올 용액 2 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C8(2.0 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상

․ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
10.0	10	90
12.0	10	90
13.0	100	0
18.0	100	0

- 유속 : 0.4 mL/min

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Spray voltage : 5 kV

- Capillary temperature : 280℃

- Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

- Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

- SIM ion : m/z 786

㉡ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 엔라마이신의 함량을 구한다.

에리스로마이신(Erythromycin), 버니지아마이신(Virginiamycin)

Ⓐ 정량법의 원리

시료중의 에리스로마이신과 버지니아마이신을 아세토니트릴/메탄올(95:5) 용액으로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 에리스로마이신(에리스로마이신 A) 및 버지니아마이신(버지니아마이신 M1) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준용액을 냉장보관 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 30% 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

㉤ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

㉠ 어류 및 갑각류

균질화한 시료 10 g을 500 mL 원심분리관에 취하고 70% 아세토니트릴 100 mL와 하이플로 슈퍼셀(Hyflo-Super Cel) 5 g을 각각 첨가하여 2분간 균질화한 후 4,000 G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 500 mL 분액깔때기에 옮기고 염화나트륨 7 g을 첨가하여 10분간 강하게 진탕, 정치시킨 후 하층액은 버린다. 상층액에 아세토니트릴포화헥산 100 mL를 첨가하여 10분간 강하게 진탕한 후 정치시킨다. 하층을 45℃에서 감압 농축한 후 잔류물은 90% 메탄올 2 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉡ 어류 및 갑각류 외 식품

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 아세토니트릴/메탄올(95:5) 용액 20 mL를 가한 후 5분간 균질화한다. 이 액을 2,500 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴포화헥산 20 mL를 가하여 15분간 흔들어 주고 2,500 G에서 10분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 멤브레인 필터로 여과한 후 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

ⓐ 액체크로마토그래프 조건

- 칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 25℃

- 이동상 : 아세토니트릴/15 mM 개미산 암모늄(개미산으로 pH4.5 조정)(40:60)

- 유속 : 0.2 mL/분

- 주입량 : 10 μL

ⓑ 질량분석기 조건

- Ionization : ESI(positive)

- Capillary temperature : 350℃

- Collision gas : 아르곤(Ar)

- Collision energy : 에리스로마이신 22 V, 버지니아마이신 14 V

㉡ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, 에리스로마이신은 m/z 576 이온, 버지니아마이신은 m/z 508 이온에 대한 면적을 각각 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 에리스로마이신과 버지니아마이신 함량을 각각 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
에리스로마이신	734	576
버지니아마이신	526	508

3) 합성항균제

(1) (현행과 같음)

(2) 정량시험법

①～⑭ (현행과 같음)

⑮ 목시덱틴(Moxidectin)

㉮ 정량법의 원리

검체 중 목시덱틴을 아세토니트릴로 추출하고 -------- 형광검출기로 측정한다.

㉯ (현행과 같음)

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 표준원액 : 목시덱틴 표준품을 ------ 냉동보관시에는 6개월간 유효하다 .

Ⓑ 표준용액 : 표준원액을 메탄올을 이용하여 ---- 표준용액으로 사용한다.

Ⓒ (현행과 같음)

㉱ (현행과 같음)

㉲ 시험조작

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액  ------ 검체 중 목시덱틴의 농도를 구한다.

～ (현행과 같음)

콜치신(Colchicine)

㉮ 정량법의 원리

시료를 0.05 M 인산완충용액으로 균질화한 후 2 M 염산으로 산성화하고 에틸아세테이트로 추출하여 감압 농축한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 콜치신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) : 1 L 메스플라스크에 1 M 제이인산칼륨(K2HPO4) 40.1 mL와 1 M 제일인산칼륨(KH2PO4) 9.9 mL를 넣고 증류수로 표시선까지 채운다.

Ⓕ 2 mM 개미산완충용액(pH 3.0) : 2 mM 개미산암모늄 1 L에 2 mM 개미산 11 mL를 넣어 혼합한다.

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 10 mL를 넣어 10분간 균질화한 후 4℃에서 8,000 G로 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 위 과정을 1회 반복하고 모아진 상층액은 2 M 염산용액으로 pH 3.5로 조정한 후 염화나트륨 0.5 g을 넣고 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 10분간 강하게 진탕한다. 4℃에서 8,000 G로 10분간 원심분리하고 에틸아세테이트층을 농축 플라스크에 취하고, 다시 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복한 후 40℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고, 잔류물은 이동상 5 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

․ 이동상 A : 2 mM 개미산완충용액(pH 3.0)

․ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
1.0	80	20
10.0	10	90
10.1	80	20
15.0	80	20

ⓓ 유속 : 0.2 mL/분

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 360℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, m/z 358의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 콜치신의 함량을 구한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
콜치신	400	295, 310, 326, 358

㉡ 정량한계 : 1 μg/kg

클로르프로마진(Chlorpromazine)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 클로르프로마진을 에틸아세테이트와 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 클로르프로마진 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ  SCX(strong cation exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 에틸아세테이트 25 mL와 4 M 탄산칼륨용액 1 mL를 넣어 20분간 균질화한 후 6,000 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 농축 플라스크에 취한다. 에틸아세테이트 25 mL로 위 과정을 한 번 반복하여 앞의 상층액과 합하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 아세토니트릴 30 mL와 아세토니트릴포화 헥산 30 mL에 녹여 분액깔때기에 옮긴다. 강하게 진탕한 후 층이 분리될 때까지 정치하여 하층(아세토니트릴층)을 취하고 아세토니트릴 30 mL로 위 과정을 한 번 반복한 후 앞의 아세토니트릴층과 합한다. 이 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 메탄올 : 1.2% 메타인산 수용액(2 : 3) 혼합액 10 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 SCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 세척한 후, 메탄올:0.1 M 제이인산칼륨용액(9:1) 혼합액 15 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상 : 아세토니트릴:개미산:물(500:1:500)

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 330℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 20 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 86의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 클로르프로마진의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
클로르프로마진	319	58, 86

㉡ 정량한계 : 0.001 mg/kg

티오우라실(Thiouracil)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 티오우라실을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 2-thiouracil, 6-methyl-2- thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 6-phenyl-2-thiouracil 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지 : Silica 카트리지(500 mg, 10 mL)에 무수황산나트륨 1 g을 가한 것 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 5분간 균질화 한다.  균질화한 용액을 3,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 5 mL를 취하여 시험관에 옮긴 후 이를 60℃ 이하에서 질소 농축한다. 디클로로메탄 0.5 mL에 충분히 녹인 후 5분간 초음파 추출한다. 이 추출액을 디클로로메탄 2 mL로 미리 활성화시킨 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지에 흡착시키고 디클로르메탄 0.5 mL로 추출액을 담았던 시험관에 가하여 초음파 추출하여 카트리지에 흡착시킨다. 추출액이 흡착된 카트리지를 디클로로메탄 2 mL로 씻어주고, 시험관에 다시 메탄올 : 디클로로메탄 (25 : 75) 혼합용액 2 mL를 가하고 1분간 초음파 추출한 용액으로 용출한다. 용출액을 60℃ 이하에서 질소 농축하고 메탄올 200 μL와 0.1% 개미산 400 μL를 가하여 충분히 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(4.6 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산

- 이동상 B : 개미산:아세토니트릴:메탄올(1:500:500)

ⓓ 유속 : 0.5 mL/min

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	93	7
6.0	93	7
20.0	20	80
23.0	20	80
25.0	93	7
28.0	93	7

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 330℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 21～25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 각각의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 6-phenyl-2-

thiouracil의 함량을 각각 구한다. 각각의 함량을 합하여 검체 중 티오우라실의 함량으로 한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
2-Thiouracil	129	84, 112
6-Methyl-2-thiouracil	143	126, 84
6-Propyl-2-thiouracil	171	154, 112
6-Phenyl-2-thiouracil	205	188, 146

㉡ 정량한계 : 0.025 mg/kg

피리메타민(Pyrimethamine)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 피리메타민을 메탄올로 추출하고 헥산으로 지방성분을 제거한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 피리메타민 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.1 M 인산완충용액(pH 6.0) : 500 mL 메스플라스크에 1 M 인산일수소칼륨(K2HPO4) 용액 6.6 mL와 1 M 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 43.4 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

Ⓕ SCX(strong cation exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(200 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 20 mL를 넣어 균질화한 후 6,000 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 농축플라스크에 취한다. 위 과정을 한 번 반복하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물을 메탄올 20 mL에 녹인 후 50 mL 원심분리관에 옮기고 헥산 20 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 6,000 G에서 5분간 원심분리하여 하층(메탄올층)을 농축 플라스크에 취하고 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물을 0.2 M 인산완충용액(pH 6.0) 10 mL에 녹여 미리 메탄올 2 mL, 0.5 M 염산용액 2 mL, 물 2 mL로 활성화시킨 SCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 5% 메탄올용액 2 mL와 2% 아세트산을 포함하는 5% 메탄올용액 2 mL로 세척한다. 메탄올 2 mL와 2% 수산화암모늄을 포함하는 95% 메탄올용액 2 mL로 용출하고 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물은 이동상 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.0 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상 : 아세토니트릴:개미산:물(400:1:600)

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 350℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 25 V

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 233의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 피리메타민의 함량을 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
피리메타민	249	177, 233

㉡ 정량한계 : 0.5 μg/kg

니트로빈(Nitrovin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 니트로빈을 디클로로메탄:메탄올:암모니아수 혼합용액으로 추출하고 메탄올과 아세트산과 부틸아민 혼합용액으로 재분산한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 니트로빈 표준품을 정밀히 달아 2% 암모니아수를 함유한 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 Ⓐ과정[디클로로메탄:메탄올:암모니아수(900:50:1) 혼합용액 20 mL를 가한 후 균질화하고 30분간 진탕한다.    이를 2,500 G에서 10분간 원심분리하고 하층을 취한다.]을 실시한다. Ⓐ과정을 반복하여 하층을 합친 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물을 이동상 1 mL에 녹인다. 이를 다시 4,000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고 여기에 헥산 1 mL를 가하여 혼합한 후 4,000 G에서 5분간 원심분리하고 하층액을 취한다. 이를 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : CN(4.6 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 이동상 : 메탄올:물:아세트산:부틸아민(2500:50:10:1)

㉢ 유속 : 1.0 mL/min

㉣ 측정파장 : 365 nm

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 니트로빈의 함량을 구한다.

㉡ 정량한계 : 0.05 mg/kg

나라신(Narasin), 린코마이신(Lincomycin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 나라신 및 린코마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 나라신 및 린코마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ  C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 및 Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 2 g에 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 넣어 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 흔든 후 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 중 4 mL를 취하여 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

- 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
7.0	10	90
13.0	10	90
14.0	100	0
22.0	100	0

ⓒ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Spray voltage : 5 kV

ⓒ Capillary temperature : 280℃

ⓓ Sheath gas : 질소(N2)(50 psi)

ⓔ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓕ SIM ion : m/z 407.2(린코마이신), m/z 787.5(나라신)

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 린코마이신 및 나라신의 함량을 구한다.

㉡ 나라신 정량한계 : 0.02 mg/kg(알)

라살로시드(Lasalocid), 아빌라마이신(Avilamycin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 라살로시드 및 아빌라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 라살로시드 A 및 아빌라마이신 표준품을 각각 정밀히 달아 라살로시드 A는 아세토니트릴에 아빌라마이신은 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 2 g에 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 넣어 균질화하고 1 M 수산화나트륨용액 120 μL를 넣어 10초간 흔든 후 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 다음 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 중 4 mL를 취하여 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다.

용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 용액 5 mL로 3회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

ⓑ 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	60	40
5.0	10	90
20.0	10	90
21.0	60	40
30.0	60	40

㉢ 유속 : 0.2 mL/min

㉣ 측정파장 : 254 nm(라살로시드 A), 210 nm(아빌라마이신)

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아빌라마이신 및 라살로시드 A의 함량을 각각 구한다. 이때 라살로시드 A의 함량을 라살로시드 함량으로 한다.

마두라마이신(Maduramycin), 샘두라마이신(Semduramicin), 티아물린(Tiamulin)

㉮ 정량법의 원리

시료 중 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ  Florisil 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 알(卵)

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕하고 5분간 초음파 추출한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵) 외 식품

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 원심분리한다.       -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

- 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	80	20
15.0	0	100
17.0	0	100
18.0	80	20
25.0	80	20

ⓒ 유속 : 0.2 mL/min

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Spray voltage : 5 kV

ⓒ Capillary temperature : 210℃

ⓓ Sheath gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓔ Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)

ⓕ SIM ion : m/z 934(마두라마이신), m/z 890(샘두라마이신), m/z 494(티아물린)

Ⓑ 정량

㉠ 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 마두라마이신, 샘두라마이신 및 티아물린의 함량을 구한다.

㉡ 정량한계

ⓐ 마두라마이신 : 0.002 mg/kg

ⓑ 샘두라마이신 : 0.005 mg/kg

엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀을 물에 녹인 후 산성화하고 아세토니트릴로 잔류되어 있는 엔로플록사신 및 시프로플록사신을 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 엔로플록사신 및 시프로플록사신 표준품을 각각 정밀히 달아 아세토니트릴로 녹여 100 mg/L농도가 되게 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.1% 개미산 아세토니트릴 용액에 희석하여 사용한다.

Ⓔ 황산나트륨 카트리지 : 0.45 μm 폴리프로필렌 필터가 장착된 튜브에 무수황산나트륨이 1.5 g 충진된 카트리지 또는 이와 동등한 것

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

벌꿀 2.5 g을 50 mL 원심분리관(A)에 취하고 물 5 mL을 넣은 후 벌꿀이 모두 물에 녹을 때까지 흔들어 준다. 이 벌꿀 희석액에 아세토니트릴 10 mL와 아세트산 200 μL를 넣고 30초간 흔들어 준 후 염화나트륨 2 g을 넣고 다시 15초간 흔들어 준다. 이 혼합용액을 2,400 G에서 5분간 원심분리한 후 아세토니트릴층(상층액)을 황산나트륨 카트리지에 통과시켜 새로운 50 mL 원심분리관(B)에 모은다.

처음 벌꿀을 담았던 50 mL 원심분리관(A)에 다시 아세토니트릴 10 mL를 넣고 30초간 흔들어 준 후 2,400 G에서 5분간 원심분리하고 아세토니트릴층(상층액)을 황산나트륨 카트리지에 통과시켜 앞의 아세토니트릴과 합한다(원심분리관 B). 원심분리관 B의 아세토니트릴 용액을 질소농축한 후 0.1% 개미산 아세토니트릴 용액 2.5 mL에 녹여 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

ⓐ 칼럼 : C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

ⓑ 칼럼온도 : 40℃

ⓒ 이동상

- 이동상 A : 0.1% 개미산 수용액

- 이동상 B : 0.1% 개미산 아세토니트릴용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	85	15
5.0	85	15
8.0	20	80
10.0	20	80
10.1	85	15
20.0	85	15

ⓓ 유속 : 0.2 mL/min

ⓔ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

ⓐ Ionization : ESI(positive)

ⓑ Capillary temperature : 350℃

ⓒ Collision gas : 아르곤(Ar)

ⓓ Collision energy : 20 V

Ⓑ 정량

㉠ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, 엔로플록사신은 m/z 316 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 엔로플록사신의 함량을 구한다. 시프로플록사신은 m/z 288 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 시프로플록사신의 함량을 구한다. 앞서 구한 엔로플록사신과 시프로플록사신의 함량을 합하여 검체의 엔로플록사신 함량으로 한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
엔로플록사신	360	316, 342, 245
시프로플록사신	332	288, 314, 231

㉡ 정량한계 : 0.005 mg/kg

델타메쓰린(Deltamethrin)

㉮ 정량법의 원리

시료를 헥산으로 균질화하고 아세토니트릴로 추출하여 감압 농축한 후 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 델타메쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 진탕하고 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 1,000 G에서 10분간 원심분리한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하여 50℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 디클로로메탄:헥산(1:1) 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 20분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 10 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 유기용매층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 20 mL, 증류수 50 mL 및 디클로로메탄 50 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 50℃ 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 가금류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 아세트산을 포함한 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃ 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 mL, 증류수 35 mL 및 디클로로메탄 20 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓓ 어류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 아세트산을 포함한 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20℃ 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층(상층) 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 mL, 증류수 35 mL 및 디클로로메탄 30 mL를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층(하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 유(乳), 알(卵), 가금류, 어류 외식품

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 -20℃ 에서 30분간 정치한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

㉢ 오븐온도 : 180℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 240℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다. 다시 5℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시켜 5분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(5：1), 270℃

㉤ 검출기온도 : 300℃

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 델타메쓰린 함량을 구한다.

도라멕틴(Doramectin), 아바멕틴(Abamectin), 에프리노멕틴(Eprinomectin), 이버멕틴( Ivermectin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴, 이버멕틴을 아세토니트릴로 추출하며, 유(乳)의 경우는 수산화나트륨으로 가수분해 후 추출한다. 추출액은 냉동하여 지방을 제거한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다. 또한 이들의 정량은 각각 지표물질 (Marker residue)인 도라멕틴, 아버멕틴(avermectin) B1a, 에프리노멕틴 B1a 및 22, 23-디히드로 아버멕틴 B1a로 한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴 및 이버멕틴 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) : 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다.

Ⓕ 아미노(NH2) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL를 가한 후 30초간 균질화 하고 1N 수산화나트륨 120 μL를 가한 후 30초간 균질화 한다. 이 용액에 아세토니트릴 6 mL를 넣고 강하게 균질화 하여 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 4 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 알(卵)

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가한 후 강하게 균질화 한다. 이 균질화한 용액을 5분간 초음파추출하고 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 6 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓒ 유(乳), 알(卵) 외 식품

균질화 한 시료 2 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 가한 후 강하게 균질화 한다. 이 균질화한 용액을 2,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 -20℃에서 30분간 방치한다. 상층액 6 mL를 유리시험관에 옮긴 후 50℃에서 질소농축하고 잔류물을 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL로 활성화시킨 아미노 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 아세톤 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 25℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액

ⓑ 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	45	55
20.0	20	80
21.0	45	55
30.0	45	55

㉣ 유속 : 0.2 mL/분

㉤ 주입량 : 20 μL

㉥ 측정파장 : 245 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 도라멕틴, 아바멕틴, 에프리노멕틴 및 이버멕틴 함량을 각각 구한다.

사라플록사신(Sarafloxacin)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 사라플록사신을 올쏘-인산과 염화마그네슘 혼합용액 및 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 올쏘-인산 용액과 아세토니트릴 혼합용액에 재분산하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 사라플록사신 표준품을 정밀히 달아 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 A : 1% 올쏘-인산이 함유되어 있는 0.2 M 염화마그네슘 수용액과 아세토니트릴을 1:4의 비율로 혼합한다.

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 추출용액 A 20 mL를 가한 후 1분간 균질화 하고 30분간 진탕한다. 이 용액을 5,000 G에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 취한다. 상층액에 헥산 8 mL를 가하고 5분간 진탕한 후 정치하여 하층에서 8 mL를 취한다. 이를 50℃ 이하에서 1 mL가 될 때까지 감압 농축한 후 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)/아세토니트릴 혼합용액(8:2)으로 전체 2 mL가 되도록 정용하고 초음파로 충분히 녹인다.이 액을 원심분리관에 취한 후 5,000 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 40℃

㉢ 이동상 : 0.025 M 올쏘-인산용액(수산화나트륨용액으로 pH 3.0 조정)/아세토니트릴 혼합용액(78:22)

㉣ 유속 : 1.0 mL/분

㉤ 주입량 : 20 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 275 nm, 측정파장 460 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 사라플록사신의 함량을 구한다.

싸이퍼메쓰린(Cypermethrin), 싸이플루쓰린(Cyfluthrin), 싸이할로쓰린(Cyhalothrin)

㉮ 정량법의 원리

시료를 헥산으로 균질화하고 아세토니트릴로 추출하여 감압 농축한 후 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 싸이퍼메쓰린, 싸이플루쓰린 및 싸이할로쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 1,000 G에서 10분간 원심분리한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 유(乳) 외 식품

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 4,500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 -20℃에서 30분간 정치한다. 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취하고 50℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

㉢ 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 2분간 유지 후 10℃/분의 비율로 200℃까지 온도를 상승시킨다. 다시 5℃/분의 비율로 220℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지하고 계속하여 5℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(10：1), 250℃

㉤ 검출기온도 : 320℃

Ⓑ 정량

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 싸이퍼메쓰린, 싸이플루쓰린 및 싸이할로쓰린 함량을 각각 구한다.

아자페론(Azaperone)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 아자페론과 그 대사산물인 아자페롤(azaperol)을 아세토니트릴로 추출하여 실리카겔로 지방 제거 등 정제과정을 거쳐 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다. 정량은 지표물질(marker residue)인 아자페론과 아자페롤의 합으로 한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 아자페론 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 하고 아자페롤 표준품은 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5) : 1 L 메스플라스크에 제일인산나트륨(NaH2PO4) 6.87 g과 제이인산나트륨 (Na2HPO4) 0.057 g을 넣고 증류수로 표시선까지 채우고 0.1M 염산으로 pH 4.5로 조정한다.

Ⓕ 0.05 M 인산용액(pH 4) : 0.05 M 인산용액을 만들고 1 N 수산화나트륨으로 pH 4로 조정한다.

Ⓖ 실리카겔(Silica gel) 60 : 0.063-0.200 mm 입자크기, 70-230 메쉬

Ⓗ 실리카(Silica) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 1분간 균질화 한다. 이 용액을 2,500 G에서 5분간 원심 분리하여 농축플라스크에 상층액을 취하고 한 번 더 반복하여 상층액을 합친 후 45℃에서 감압 농축한다. 잔류물은 메탄올 5 mL를 가하여 녹인 후 실리카겔 60을 2 g 가하여 잘 혼합하고 이를 다시 감압 농축시켜 실리카겔 60에 잔류물을 흡착시킨다. 흡착된 실리카겔 60을 다시 헥산 5 mL에 녹여 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 옮긴다. 헥산 2 mL로 농축플라스크를 씻어주고 이 액을 실리카 카트리지에 옮긴다. 카트리지를 차례로 디클로로메탄 10 mL, 헥산 10 mL, 디클로로메탄 5 mL로 세척한 후 메탄올 30 mL로 용출시킨다. 용출액을 45℃에서 감압 농축하고 잔류물은 이동상 A 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C8(4 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 27℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5)/테트라하이드로퓨란/아세토니트릴(60:5:35)

ⓑ 이동상 B : 0.05 M 인산용액(pH 4)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	78	22
15.0	78	22
16.0	100	0
30.0	100	0

㉣ 유속 : 0.7 mL/분

㉤ 주입량 : 50 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 245 nm, 측정파장 345 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아자페론과 아자페롤의 함량을 각각 구한 후 합한 것을 검체 중 아자페론의 잔류량으로 한다.

이미도캅(Imidocarb)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 이미도캅을 초산나트륨과 트리플루오로 초산나트륨 완충용액으로 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 이미도캅 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 이동상 A 5 mL를 가하여 10분간 균질화 한다. 이 균질화한 용액을 10분간 초음파 추출하고 2,500 G에서 20분간 원심 분리한 후 상층액을 취하고 이를 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 가드칼럼 : C8(4.6 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 분석칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉢ 칼럼온도 : 25℃

㉣ 이동상

ⓐ 이동상 A : 1 mM 초산나트륨, 1 mM  트리플루오로 초산나트륨 혼합용액(pH 7.0)/아세토니트릴(85:15)

ⓑ 이동상 B : 1 mM 테트라에틸 염화암모늄 용액(pH 2.0)/아세토니트릴(90:10)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
5.0	100	0
25.0	0	100
26.0	100	0
30.0	100	0

㉤ 유속 : 2.0 mL/분

㉥ 주입량 : 50 μL

㉦ 측정파장 : 260 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 이미도캅의 함량을 구한다.

트리클로르폰(Trichlorfon, Metrifonate)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 트리클로르폰을 아세토니트릴로 추출하여 무수황산나트륨과 원심분리, 냉동으로 수분과 지방을 응결시켜 제거한 후 디클로로메탄으로 다시 추출하여 기체크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다. 트리클로르폰은 빛에 쉽게 분해되므로 실험과정에 사용되는 초자는 갈색병을 사용하거나  호일로 감싸 빛을 차단하여 실험한다.

㉯ 측정기기

기체크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 트리클로르폰 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장 보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 에틸아세테이트로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

균질화 한 시료 10 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 30 mL와 염화나트륨 5 g을 가하여 2분간 균질화 한 후 20분간 진탕한다. 이 액을 4,500 G에서 15분간 원심 분리한 후 상층액 전량을 새로운 50 mL 원심 분리관에 옮기고 무수황산나트륨 5 g을 가하여 1분간 균질화 한다. 이를 다시 4,500 G에서 5분간 원심 분리한 후 -20℃에서 30분간 정치한다. 정치 후 상층액에서 12 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮기고 포화 염화나트륨 용액 15 mL, 물 35 mL 및 디클로로메탄 30 mL를 가하여 5분간 진탕한다. 정치 후 하층(디클로로메탄 층)을 취하고 이전의 250 mL 분액깔때기에 디클로로메탄 20 mL를 가하여 5분간 진탕한다. 하층을 합하여 무수황산나트륨 층을 통과시켜 농축플라스크에 취하고 30℃ 이하에서 감압 농축한 후 잔류물을 에틸아세테이트 2 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 유(乳) 외 식품

5) 잔류농약 시험법 중 (5) 푸루실라졸(Flusilazole), 메카밤(Mecarbam), 메타크리포스(Methacrifos), 메타미도포스(Methamidophos), 모노크로토포스(Monocrotophos), 아세페이트(Acephate), 에디펜포스(Edifenfos), 이소펜포스(Isofenphos), 클로르피리포스메틸(Chlorpyifos-methyl), 터브포스(Terbufos), 트리클로폰(Trichlorfon), 펜치온(Fenthion), 펜토에이트(Phenthoate), 폭심(Phoxim) 및 포스메트(Phosmet) 시험법에 따른다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼(50 m × 0.32 mm ID, 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 질소, 2.25 mL/분

㉢ 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 1분간 유지 후 5℃/분의 비율로 180℃까지 온도를 상승시켜 1분간 유지한다. 이를 다시 30℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시켜 5분간 유지한다.

㉣ 주입부 : Split mode(5：1), 240℃

㉤ 검출기온도 : 300℃

※ 트리클로르폰이 디크로보스(Dichlorvos)로 전환되어 정량함.

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 트리클로르폰의 함량을 구한다.

디싸이클라닐(Dicyclanil)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 디싸이클라닐을 아세토니트릴로 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 디싸이클라닐 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 15 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 5 mL를 가하여 10분간 균질화한 후 10분간 초음파 추출한다.  이 용액을 2,500 G에서 20분간 원심분리한 후 상징액을 취하고 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 가드칼럼 : C8(4.6 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 분석칼럼 : C18(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉢ 칼럼온도 : 25℃

㉣ 이동상 :  1 mM 초산암모늄/아세토니트릴(85:15)

㉤ 유속 : 1.5 mL/분

㉥ 주입량 : 10 μL

㉦ 측정파장 : 267 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 디싸이클라닐의 함량을 구한다.

카라졸롤(Carazolol)

㉮ 정량법의 원리

시료중의 카라졸롤을 아세토니트릴로 추출하여 실리카겔로 지방 제거 등 정제과정을 거쳐 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 카라졸롤 표준품을 정밀히 달아 아래의 이동상 A에 녹여 100 μg/mL로 하고 냉장보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 이동상 A 용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5) : 1 L 메스플라스크에 제일인산나트륨(NaH2PO4) 6.87 g과 제이인산나트륨(Na2HPO4) 0.057 g을 넣고 증류수로 표시선까지 채우고 0.1M 염산으로 pH 4.5로 조정한다.

Ⓕ 0.05 M 인산용액(pH 4) : 0.05 M 인산용액을 만들고 1 N 수산화나트륨으로 pH 4로 조정한다.

Ⓖ 실리카겔(Silica gel) 60 : 0.063-0.200 mm 입자크기, 70-230 메쉬

Ⓗ 실리카(Silica) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 1분간 균질화 한다. 이 용액을 2,500 G에서 5분간 원심 분리하여 농축플라스크에 상층액을 취하고 위 과정을 1회 반복하여 상층액을 합친 후 45℃에서 감압 농축한다. 잔류물은 메탄올 5 mL를 가하여 녹인 후 실리카겔 60을 2 g 가하여 잘 혼합하고 이를 다시 감압 농축시켜 실리카겔 60에 잔류물을 흡착시킨다. 흡착된 실리카겔 60을 다시 헥산 5 mL에 녹여 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 옮긴다. 헥산 2 mL로 농축수기를 씻어주고 이 액을 실리카 카트리지에 옮긴다. 카트리지를 차례로 디클로로메탄 10 mL, 헥산 10 mL, 디클로로메탄 5 mL로 세척한 후 메탄올 30 mL로 용출시킨다. 용출액을 45℃에서 감압 농축하고 잔류물은 이동상 A 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼 : C8(4 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 27℃

㉢ 이동상

ⓐ 이동상 A : 0.05 M 인산완충용액(pH 4.5)/테트라하이드로퓨란/아세토니트릴(60:5:35)

ⓑ 이동상 B : 0.05 M 인산용액(pH 4)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	100	0
3.0	78	22
15.0	78	22
16.0	100	0
30.0	100	0

㉣ 유속 : 0.7 mL/분

㉤ 주입량 : 50 μL

㉥ 측정파장 : 여기파장 245 nm, 측정파장 345 nm

Ⓑ 정량

표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 카라졸롤의 함량을 구한다.

초산트렌볼론(Trenbolone acetate)

㉮ 정량법의 원리

시료를 증류수와 헥산으로 균질화한 후 2 M 염산으로 산성화하고 에틸아세테이트로 추출하여 감압 농축한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓒ 표준원액 : β-트렌볼론 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 실리카(Silica) 카트리지(1 g, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 20 g을 250 mL 원심분리관에 취하고 증류수 20 mL와 헥산 100 mL를 넣어 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 3,000 G에서 10분간 원심분리한다. 무수황산나트륨으로 수분 제거한 헥산층(상층) 50 mL를 250 mL 분액깔대기에 취하고 아세토니트릴 50 mL를 넣어 진탕한 후 정치하고 아세토니트릴층(하층)을 농축 플라스크에 취한다. 다시 아세토니트릴 50 mL를 넣어 위 과정을 4회 더 반복하고 모아진 아세토니트릴층은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 잔류물을 헥산 5 mL에 녹인 후 미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 흡착시키고 헥산 5 mL로 세척한 후 아세톤:헥산(1:9) 10 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 아세토니트릴 0.5 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 75% 메탄올

- 유속 : 1.0 mL/분

- 측정파장 : 340 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 β-트렌볼론의 함량을 구한다. 이때 β-트렌볼론의 함량을 초산트렌볼론 함량으로 한다.

4) 성장호르몬제

(1) 제라놀

① 정량법의 원리

이 방법은 -------제라놀을 ---------측정한다.

② (현행과 같음)

③ 시약, 시액

㉮～㉰ (현행과 같음)

㉱ 내부표준물질

Ⓐ (현행과 같음)

Ⓑ <삭  제>

㉲ 표준원액：제라놀, 제랄란 및 탈레라놀(Taleranol) 각 20 mg을 ------ 메탄올에 녹인다(이 용액 각 1 mL는 제라놀, 제랄란 및 탈레라놀 200 μg에 상당).

㉳ 표준용액：표준원액의 제라놀, 제랄란 각각 ------ 희석한다(이 용액 1 mL는 제라놀 및 제랄란 0.2 μg, 탈레라놀 0.4 μg에 상당).

<삭 제>

<삭  제>

㉴  (현행과 같음)

④ 시험조작

㉮ 추출

분쇄한 시료 -----(Control sample：제라놀이 함유되지 않은 시료) 5±0.1 g을 달아 각각 50 mL 폴리프로필렌 원심관에 넣고 내부표준물질인 제랄란과 Zeranol 표준용액 각각 50 μL를 넣는다. 따로 4개의 대조시료에 제라놀,  탈레라놀 표준용액을 아래의 표와 같이 0, 25.0, 50.0, 100.0 μL를 첨가한다.

표준용액 첨가량(μL)	농도(ppb)
	제라놀	<삭 제>	탈레라놀
0.0 25.0 50.0 100.0	0.00 1.00 2.00 4.00	<삭 제> <삭 제> <삭 제> <삭 제>	0.00 2.00 4.00 8.00

각 시료에 --------  .

㉯ 정제

위의 액을 --------다시 메탄올 2.5～3.0 mL를 넣어 제라놀을 회수용수기에 용출시킨다. ----------.

㉰  (현행과 같음)

㉱ 정성 및 정량 시험

위의 잔류물을 ----- 주입한다.

물질	머무름시간	물질	특정이온
<삭 제> <삭 제> 제랄란 제라놀 탈레라놀	<삭제> <삭제> 10.3 12.6 12.8	제랄란 제라놀 <삭 제> <삭 제> 탈레라놀	435 538, 523, 433, 379 <삭제> <삭제> 538, 523, 433, 379

위 조건에서의 머무름시간 및 특정이온

㉲ 계산

Ⓐ  (생  략)

Ⓑ ---------

<삭  제>

Ⓒ 다음의 회귀방정식을 사용하여 제라놀의 이온농도 대 제라놀 의 이온비에 대한 표준곡선을 작성한다.

---------

Ⓓ 기울기와 ------ 제라놀의 농도를 계산한다.

(2) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)

① 정량법의 원리

시료중의 디에틸스틸베스트롤을 분해효소제를 사용하여 조직에서 분해한 후 냉동 및 카트리지를 이용하여 지방 및 단백질을 제거한 후 유도체화 하여 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

② 측정기기

기체크로마토그래프/질량분석기

③ 시약 및 시액

㉮ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉯ 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉰ 표준용액 : 표준곡선을 작성하기 위하여 5가지 농도로 표준원액을 메탄올로 희석한 후 각각 시험관에 100 μL를 취하고 내부 표준물질 용액 100 μL를 가한 후 농축 및 건조시킨다. 시험관에 유도체화 용액 100 μL를 넣고 밀봉하여 60℃에서 20분간 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 각각의 표준용액으로 한다.

㉱ 내부 표준물질 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 D8 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉲ 내부 표준물질 용액 : 내부 표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하여 100 μg/L가 되도록 한다.

㉳ 분해효소제 : β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase /arylsulfatase)

㉴ 유도체화용액 : BSTFA(N, O-Bistrimethyl -trifluoroacetamide)와 TMSI (N-Trimethyl silylimidazole)의 혼합액 (98 : 2)

㉵  C8 카트리지(500 mg, 6 mL) 및 아미노(NH2) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

㉶ 기타시약 : 특급

④ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 증류수 5 mL를 가한 후 마이크로파(microwave)로 30초간 추출한다. 이 추출액에 분해효소제 80 μL를 가하고 균질화시켜 배양기에 넣고 52℃에서 15시간 이상 반응시킨다. 실온으로 냉각한 후 내부 표준물질 용액 100 μL와 메탄올 30 mL를 가하고 20분간 초음파 추출한 후 4,000 G에서 5분간 원심분리한다. 이 추출용액을 -20℃의 냉동고에 30분 이상 넣어두어 지질을 응고시킨 후 상층액을 취한다. 이 때 석출된 지방질을 거름종이로 제거하고 용기를 메탄올로 씻어 준다. 상층액과 세척액을 합한 후 40℃에서 감압 농축하여 메탄올을 제거한다. 미리 메탄올 5 mL와 증류수 5 mL로 활성화시킨 C8 카트리지에 농축 후 남은 액을 10% 메탄올 수용액 15 mL에 녹여 흡착시킨다. 증류수 5 mL로 용기와 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 5 mL로 용출시킨다. 이 용출액을 60℃에서 질소로 농축시킨 후 에틸아세테이트 : 메탄올 (80 : 20) 혼합용액 2 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 물포화에틸아세테이트 5 mL와 에틸아세테이트 : 메탄올 (80:20) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 아미노(NH2) 카트리지에 추출액을 흡착시키고 에틸아세테이트 : 메탄올 (80 : 20) 혼합용액 6 mL로 용출시킨다. 이 용출액을 60℃에서 질소로 농축시키고 완전히 농축시킨 시험관에 유도체화 용액 100 μL를 넣고 밀봉한 후 60℃에서 20분간 반응시킨다. 반응액을 4,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ 기체크로마토그래프 조건

㉠ 칼  럼 : Ultra 2, DB 5(5%-phenyl -methylpolysiloxane)(50 m × 0.2 mm, 0.33㎛) 또는 이와 동등한 것

㉡ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1 mL/분

㉢ 시료주입부 : Split(5:1)

㉣ 주입부온도 : 280℃

㉤ 오븐온도 : 초기온도 160℃에서 10℃/분 비율로 270℃까지 승온한 후 10분간 유지하고 5℃/분 비율로 315℃까지 승온한 후 10분간 유지

㉥ 시료주입량 : 1 μL

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠ 이온 mode : EI

㉡ 이온에너지 : 70 eV

㉢ Interface 온도 : 350℃

㉣ SIM ion : m/z 412(디에틸스틸베스트롤), m/z 420(디에틸스틸베스트롤 D8)

㉯ 정량

Ⓐ 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 질량분석기에 주입한 후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하여 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합의 비를 구하여 검량선을 작성하여 검체 중 디에틸스틸베스트롤의 함량을 구한다.

※ 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량 =

이온 412의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

Ⓑ 정량한계 : 0.5 μg/kg

(3) 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)

① 정량법의 원리

시료중의 메드록시프로게스테론 아세테이트를 트리스완충액 및 디에틸 에테르로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

② 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

③ 시약 및 시액

㉮ 용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

㉯ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉰ 표준원액 : 메드록시프로게스테론 아세테이트 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉱ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다.

㉲ 0.1 M 트리스완충용액(pH 9) : 0.1 M Tris(hydroxymethyl) amino-methane에 염산을 넣어  pH 9가 되도록 한다.

㉳ 기타시약 : 특급

④ 시험용액의 조제

균질화 한 시료 1 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 0.1 M 트리스완충용액(pH 9) 5 mL를 가한후 5분간 초음파추출을 한다. 이 추출액에 디에틸 에테르 5 mL를 가하고 5분간 균질화한 후 3,000 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 농축수기에 옮긴다. 남은 액에 디에틸 에테르 5 mL를 가하여 위의 과정을 두 번 더 반복한다. 모아진 상층액을 45℃에서 감압농축한 후 메탄올 1 mL에 녹여 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ 액체크로마토그래프 조건

㉠ 칼럼 : C18(2.1 × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 20℃

㉢ 이동상

- 이동상 A : 물

- 이동상 B : 5 mM 개미산암모늄 메탄올용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
11.0	20	80
12.0	20	80
13.0	80	20

㉣ 유속 : 0.6 mL/min

㉤ 주입량 : 5 μL

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠ Ionization : ESI(positive)

㉡ Capillary temperature : 350℃

㉢ Collision gas : 아르곤(Ar)

㉣ Collision energy : 20 V

㉯ 정량

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 327 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 메드록시프로게스테론 아세테이트 함량을 구한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
메드록시프로게스테론 아세테이트	387	327, 285

Ⓑ 정량한계 : 0.005 mg/kg

4)～7) (현행과 같음)

16～21. (현행과 같음)

22. 식품 중 유해물질 시험법

1) 발기부전 치료제 유사물질 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

① ～ ② (현행과 같음)

③ 표준원액：호모실데나필

(homosildenafil),-----------------------------------------------

----------------- 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 실데나필(sildenafil), -----------------

------------------------

④ ～ ⑥ (현행과 같음)

(3)～(4) (현행과 같음)

(5) 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① ～  (현행과 같음)

벤질실데나필(Benzylsildenafil)

(C28H34N6O4S, 550)

2) 비만 치료제 유사물질 시험법

(1) 장치

고속액체크로마토그래프자외부흡광광도검출기(UVꠀdetector), PDA 검출기 및 액체크로마토그래프․질량분석기를 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 이동상：물 1l에 인산 및 sodium-1

-hexane-sulfonate를 각각 1g을 넣고 용해한 액(A용매), 95% 아세토니트릴(B용매)

② 이동상 gradient : A용매와 B용매 비율을 7 : 3에서 2 : 8로 적정 시간동안 균등분배 한다.

③ 표준원액：데스메틸시부트라민(desmethylsibutramine), 시부트라민(sibutramine) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 100㎎/l이 되게 한다.

④ 표준용액：표준원액을 이동상으로 녹여 적당한 농도로 한다.

⑤ 유기용매：메탄올, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등 유기용매는 HPLC용 또는 이와 동등한 것

⑥ 기타시약 : 무수황산나트륨(sodium sulfate anhydrous), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 등은 특급을 사용한다.

(3) 시험용액의 조제

액체시료와 고체시료의 일정량을 물 10ml에 녹이고 메탄올 70ml을 가하고 진탕 추출한 후 여과지로 여과한다. 여액에 1% 중탄산나트륨용액 약 1ml을 가하고 디클로로메탄 50ml로 3회 추출한 후 디클로로메탄층을 모아 삼각 플라스크에 옮겨 적당량의 무수황산나트륨을 넣어 때때로 흔들어 섞으면서 30분간 방치하여 수분을 제거한다. 이 액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하에 디클로로메탄을 날려보내고 잔사를 메탄올 또는 이동상에 녹여 일정량으로 한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

(4) 시험조작

① 고속액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18(4.6×250㎜, 5㎛) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 시약 및 시액 참조

㉰ 검출기파장 : UV 220㎚

㉱ 유속 : 1.0 ml/min.

② 정성시험

표준용액 및 시험용액을 고속액체크로마토그래프에 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크를 표준용액의 피이크와 비교할 때 어느 측정조건에서도 그 머무름시간(Retention time)이 일치하여야 한다.

* PDA에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

③ 정량시험

정성시험에서 얻어진 결과를 근거로 하여 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라서 정량한다.

④ 확인시험

액체크로마토그래프․질량분석기로 분석하였을 때 시험결과는 표준품과 일치하여야 한다.

(5) 비만치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① 데스메틸시부트라민

(Desmethylsibutramine)

(C16H24ClN, 265)

3) (현행과 같음)

23. 유전자재조합식품의 시험법

1)～2) (현행과 같음)

3) DNA 추출․정제법

DNA추출․정제법으로는---- 확인할 필요가 있다. DNA를 추출․정제 시 하나의 분석시료로부터 적정량을 2회 칭량하여 동시에 DNA를 추출하고, 추출된 각각의 DNA는 적절히 희석하거나 농축하여 PCR에 사용한다. 본 시험법에서 -------사용하여야 한다.

4) (현행과 같음)

5) 정성분석방법

정성분석은 일반 PCR을 이용하며 ----------- 분말이 없는 것을 사용한다.

(1) 프라이머의 준비

유전자재조합식품 표시제와 관련하여 PCR에 의한 유전자재조합 콩, 유전자재조합 옥수수의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1, 표 2와 같다. 그 밖에 이와 동등한 ---- 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

(2) PCR용 시약의 조제

Taq DNA polymerase(이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase도 사용할 수 있다) 등의 ----------얻어지는 지를 확인해야 한다.

① 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제

검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 표준시료와 0%인 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 각각 DNA를 추출한 DNA 용액을 양성 대조군으로 사용한다.다만, 표 3의 프라이머나 GMO 검출키트 등을 사용하여 PCR하는 경우 양성 확인용 표준시료에서 추출한 DNA 외에도 해당 프라이머 제조사에서 특이적으로 제작한 양성 확인용  플라스미드 DNA 등을 반응대조군으로 사용할 수 있다.

② PCR 반응 시약의 조제

PCR 반응에 필요한 시약은---- ㉱ 프라이머이며, 표 1, 표 2의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 4와 같다.

③ 반응 대조군의 조제

각 PCR 반응시에는 ---- ㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA를 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 0% 표준시료에서 추출한 DNA 등), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용이며, 동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는 표준시료에서 추출한 DNA 등)을 시료와 함께 PCR 시험을 한다.

표 1. 유전자재조합 콩의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 (118 bp)	Le1n02-5' Le1n02-3' Le1-Taq	5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3' 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3' 5'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3'
스크 리닝	CaMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	RRS (121 bp)	RRS 01-5' RRS 01-3' RRS-Taq	5'-CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG-3' 5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3' 5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-TAMRA -3'

표 2. 유전와 프로브자재조합 옥수수의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	옥수수 (151 bp) 옥수수 (114 bp)	SSllb 1-5' SSllb 1-3' SSllb-Taq SSllb 3-5' SSllb 3-3' SSllb-Taq	5'-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3' 5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A -TAMRA-3' 5'-CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTC C-3' 5'-GAT CAG CTT TGG GTC CGG A-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA-3'
스크 리닝	CaMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	Bt176 (100 bp) Bt11 (127 bp) GA21 (133 bp) T25 (149 bp) MON810 (113 bp) NK603 (143 bp) TC1507 (103 bp) MON863 (152 bp) DAS59122-7 (141 bp)	Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt176-Taq Bt11 3-5' Bt11 3-3' Bt11-Taq GA21 3-5' GA21 3-3' GA21-Taq T25 1-5' T25 1-3' T25-Taq M810 2-5' M810 2-3' M810-Taq NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3' tahsp17-5‘ MON 3-3‘ DAS 5-5‘ Pubi-3‘	5'-TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG-3' 5'-ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T-3' 5'-FAM-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-TAMRA-3' 5'-AAA AGA CCA CAA CAA GCC GC-3' 5'-CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CT-3' 5'-FAM-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3' 5'-GAA GCC TCG GCA ACG TCA-3' 5'-ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT-3' 5'-FAM-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG - TAMRA-3' 5'-GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA-3' 5'-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT-3' 5'-FAM-TGC AGG CAT GCC CGC TGA AAT C- TAMRA-3' 5'-GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A-3' 5'-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG-3' 5'-FAM-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-TAMRA-3' 5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3' 5'-GTG TTT TTT GGA TCC CCG G-3' 5'-CCA TCA TGG TTG GTT GGA CTT-3' 5'-GCA CCT GTG ATT GGC TCA TAA A-3' 5'-CTC CCT TAA TTC TCC GCT CAT G-3'

표 3. Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판 중인 프라이머

(현행과 같음)

표 4. PCR 반응액의 조성

(현행과 같음)

(3) PCR

각 추출 DNA에 대한 PCR은---- 프라이머로 PCR을 실시한다. 그 결과 2 반복 추출 DNA 시료 중 내재성 유전자 특이 PCR 산물이 확인된 DNA 시료에서의 35S 프로모터와 NOS 터미네이터의 검출 결과에 따라 다음의 유전자재조합 이벤트에 대한 2차 확인시험을 실시한다.

㉠ 35S 프로모터와 NOS 터미네이터 특이 PCR 산물이 모두 확인된 경우: RRS, Bt11, Bt176, T25, MON810, NK603, TC1507, MON863, DAS59122-7, GA21 (RRS는 시료 성분 중 콩이 포함된 경우에 한함)

㉡ 35S 프로모터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: Bt176, T25, MON810, TC1507, DAS59122-7

㉢ NOS 터미네이터 특이 PCR 산물만 확인된 경우: GA21

① Master mixture의 조제

PCR을 하고자 하는 시료 수에-------주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 4의 PCR 반응액의 조성과 ----멸균증류수 0.5 μL를 가한다.

② (현행과 같음)

③ PCR 증폭

모든 반응액을 분주한 후---- 반응조건은 표 5와 같다. 95℃에서 10분간 방치하여---증폭산물을 확인하거나 냉동 보관한다.

표 5. PCR 반응 조건

(현행과 같음)

(4) (현행과 같음)

(5) 분석 결과의 판정 및 처리

① (현행과 같음)

② 2반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과 하나----내재유전자의 PCR산물은 모두 검출되나 재조합유전자 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는--- ‘검사불능’으로 판정한다(표 6).

③ 유전자재조합 이벤트 중 35S 프로모터를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, MON810, NK603, TC1507, MON863, DAS59122-7이 있으며, NOS 터미네이터를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603, MON863이 있다

④ 이상과 같이 하여 정성분석에서----- 다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가받은 품목, Bt10 옥수수와 같이 상업적 목적으로 생산되지 않아 조건부 승인받은 품목, 해충 저항성 Bt 쌀과 같이 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우 ----

표 6. 결과 판정의 흐름도(예시)

(현행과 같음)

1. (현행과 같음)

2. 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터의 경우 유전자재조합 이벤트에 따라 검출되지 않을 수도 있다.

3. NewLeaf Plus 감자, NewLeaf Y 감자, CBH351 옥수수에 대하여 표 3의 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우 -----사용하여 실험한다.

6) 정량분석방법

시료에 존재하는 GMO 정량의 필요성에 의해 PCR에 기초한 많은 방법들이 개발되었는데, 이 중 가장 일반적인 방법은 실시간 PCR (Real-Time PCR)이다. 실시간 PCR을 사용하면 유전자재조합 여부에 관계 없이 농작물이 반드시 가지고 있는 내재성 유전자에 대한 재조합 유전자의 존재 비율로부터 시료 중에 재조합체가 얼마나 존재하는지를 상대적으로 측정할 수 있다.

(1) 실시간 PCR

PCR이 거듭됨에 따라 증가하는 증폭산물에 프라이머와 프로브가 특이적으로 결합할 때 프로브에서 분리되는 형광물질의 양을 동역학적으로 측정하여 주형 DNA의 양을 산출할 수 있다. TaqMan chemistry를 이용하는 Real-Time PCR에는 일반 PCR에서 이용되는 프라이머와 함께 주형 DNA에 상보적 염기서열을 가지면서 형광물질[리포터(reporter)와 퀜처(quencher)]이 결합된 DNA 프로브(probe, 탐침자), Real-Time PCR 장치 등이 필요하다. 이 프로브가 프라이머에 이어 주형 DNA에 결합하고 DNA polymerase의 5’-nuclease 활성에 의해 가수분해되면 리포터가 퀜처로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 형광 강도는 PCR 반응횟수에 대해 지수함수(指數關數)적으로 증강한다. 따라서 일정한 형광 강도에 따른 PCR 반응횟수를 비교하여 원래의 DNA 양을 구할 수 있게 된다. Real-Time PCR 장치로는 플레이트(plate) 방식, 캐필러리(capillary) 방식 등이 있다.

(2) 유전자재조합 콩의 정량

콩의 내재성 유전자(lectin)와 유전자재조합 콩(RRS)의 구조 유전자(EPSPS)의 복제수(copy number)를 구하는데 사용되는 프라이머와 프로브는 표 1과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다. 동일한 시료에 대하여 내재성 유전자와 재조합 유전자의 복제수 측정은 같은 플레이트에서 실시되어야 한다.

(3) 유전자재조합 옥수수의 정량

옥수수의 경우 시료 중에 여러 종의 유전자재조합 이벤트(Bt176, Bt11, T25, MON810, GA21)가 혼재하고 있을 수 있어 분석대상이 복수이므로 정성분석 결과 검출된 구조유전자를 대상으로 Real-Time PCR을 실시하여 각 이벤트별로 정량하고, 이들을 합산하여 결과를 판정한다.

옥수수의 내재성 유전자(Starch Synthase IIb, SSIIb)와 이벤트별 재조합 유전자의 복제수를 구하는데 사용되는 프라이머와 프로브는 표 2와 같으나, 내재성 유전자 측정용 프라이머는 표 3의 SSIIb 3-5'과 SSIIb 3-3'을 사용한다. 또한 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있으며, 동일한 시료에 대하여 내재성 유전자와 재조합 유전자의 복제수 측정은 같은 플레이트에서 실시되어야 한다.

(4) 검량선(Calibration curve) 작성용 표준액

복제수를 아는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액 또는 특정 함량의 유전자재조합 작물 표준품(certified reference material, CRM)으로부터 추출한 DNA 용액을 검량선 작성용 표준액으로 사용한다. 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우 검량선을 작성하기에 적당한 복제수(예를 들면 웰(well) 또는 캐필러리 당 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 복제수)가 되도록 대장균의 ColE1/TE DNA용액 (5 ng/μL)을 사용하여 희석한 것을 사용한다. 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우 검량선 작성에 사용되는 희석액을 4종 이상으로 하며, 그 최소값과 최대값 사이에 시료의 복제수가 있어야 한다. 시료의 내재성 유전자나 재조합 유전자의 복제수가 검량선 작성용 표준액의 최대 복제수를 초과하는 경우에는 검량선의 유효범위 내에서 측정될 수 있도록 시료 DNA를 적절히 희석하여 정량분석을 다시 실시한다.

또한, 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우에 한하여 시료 중 유전자재조합식품 혼입률을 계산할 때 실제 유전자재조합 작물에서 추출한 DNA와의 오차값을 보정하기 위하여 반드시 보정계수를 적용하여야 한다. 이때 보정계수는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으며, 기기 제조사 또는 플라스미드 DNA 표준용액 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

※ 참고

표 1과 표 2의 PCR 반응액 조제에 사용되는 프라이머, 프로브와 이에 대응하는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액은 Nippon Gene사(일본)에서 구입 가능하다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

(5) 정량 PCR용 반응액의 조제

정량 PCR에 사용하는 모든 시약은 실온에서 완전히 녹인 후 혼합기를 사용하여 충분히 혼합하고 spin down하여 사용한다. 사용하는 시약은 같은 팁을 사용하여 연속하여 주입하면 피펫 내의 공기가 냉각되기 때문에 2번째부터는 통상의 피펫 조작으로 정확하게 주입되지 않으므로 피펫의 설명서에 쓰인 저온 시험재료를 취급할 경우의 조작법을 숙지하여 사용한다. 또한, Universal PCR Master Mix와 같이 점성이 강한 시약을 다룰 때에는 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지 서서히 버튼을 누른 뒤 조금 더 깊숙이 누른 상태에서 팁을 시약에 담근다. 이후 팁이 액면에 수직이 되게 하여 서서히 시약을 흡입하고, 그 상태에서 다시 피펫의 버튼을 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 눌러 시약을 빼낸 후 다시 서서히 시약을 흡입한다. 분주 시에는 팁을 수직으로 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 시약을 분주하고 팁을 튜브에서 빼낸 후 제거한다.  표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브를 사용하여 PCR용 반응액을 25 μL로 할 경우 그 조성은 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약 12.5 μL, 프라이머(각 25 μM) 0.5 μL, 프로브(10 μM) 0.5 μL, 멸균증류수 9 μL와 주형 DNA 2.5 μL로 이루어진다. 주형 DNA로는 시료 DNA (20 ng/μL) 2.5 μL, 검량선 작성용 표준용액 2.5 μL, ColE1/TE 용액(5 ng/μL) 또는 멸균증류수 2.5 μL가 사용된다. 음성대조군으로 사용되는 ColE1/TE 용액은 미량의 DNA가 비특이적으로 튜브 벽면에 흡착되는 영향을 보정할 수 있다.

PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액에 대하여 플레이트 방식의 경우 3 반복 시험(3웰 분량의 PCR용 반응액을 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을, 캐필러리 방식의 경우 2 반복 시험을 실시하여 측정된 평균값을 구한다.

표 1 또는 표 2의 프라이머와 프로브를 사용하여 PCR용 반응액을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액은 다음과 같이 조제하며, 그 조성이나 양은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약의 사용 매뉴얼을 참고하거나 기기 제조사에 별도 문의하여 적용하여야 한다.

① 프라이머-프로브 혼합액의 조제

프라이머가 각 1.25 μM, 프로브가 0.5 μM이 되도록 멸균증류수를 사용하여 희석하고 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 사용한다. 예를 들어 프라이머(각 25 μM) 180 μL에 멸균증류수 1,620 μL를 가하고, 프로브(10 μM) 180 μL에 멸균증류수 1,620 μL를 가한 것을 혼합하여 총 3,600 μL로 조제하고 적정량으로 나누어 -20℃에 보관하여 사용한다.

② Master mixture의 조제

프라이머-프로브 혼합액과 Universal PCR Master Mix 또는 이와 동등한 시약을 1 : 1.25의 비율로 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 플레이트 방식의 경우 하나의 DNA 시료액 당 3 웰 분량의 PCR용 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제한다.

③ Master mixture의 분주

주형 DNA (시료 수), 각 검량선 작성용 표준액(프라이머 당 5종), 음성대조군용 시험액(프라이머 당 1종)의 수만큼 500 μL 튜브를 준비하고 분주할 주형 DNA 등의 이름을 각각 표기한 후 준비한 각각의 500 μL 튜브에 master mixture를 78.75 μL씩 분주한다.

④ 주형 DNA, 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액의 분주

Master mixture를 분주한 튜브에 표기된 주형 DNA (20 ng/μL), 각 검량선 작성용 표준액 또는 음성대조군용 시험액을 8.75 μL씩 가하고, 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 spin down 한다. 플레이트 방식의 경우 준비된 PCR 반응액을 96웰 플레이트에 웰 당 25 μL씩 분주한다. 플레이트의 뚜껑을 닫을 때 한쪽으로 기울어지지 않도록 대각선 방향으로 번갈아 잘 닫은 후, 전용 롤러를 사용하여 완전히 웰을 밀폐한다. 웰의 하부를 관찰하여 바닥에 기포가 있을 경우는 플레이트의 가장자리를 가볍게 두드리거나, spin down (96웰 플레이트용 원심분리기 사용)하여 바닥의 기포를 완전히 제거한다.

(6) 정량 PCR

정량 PCR은 Real-Time PCR 기기를 이용하여 실시한다. 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96웰 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 다음과 같다.      50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 방치하는 고온 개시(hot start)법으로 반응을 시작한다. 95℃에서 30초, 59℃에서 1분을 1회로 하여 총 40회의 증폭 반응을 하고, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 Real-Time PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

(7) 검량선의 작성

시료를 정량분석할 때 매번 내재성 유전자와 재조합 유전자에 대해 다음과 같이 각각 검량선을 작성한다. PCR 반응 횟수에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 증폭곡선에서 baseline을 3～15 사이클로 하고, 검량선 작성용 표준액의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 ΔRn 부위를 선택하여 threshold line (Th. line)을 설정한다. 이때 선택된 Th. line은 음성대조군용 시험액에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 하며, 검량선 작성용 표준액 중 최소값을 가지는 표준액의 증폭곡선과는 교차하여야 한다. 설정된 Th. line과 검량선 작성용 표준액의 증폭곡선이 교차한 점으로부터 threshold cycle (Ct)값을 구하여 그 평균값을 y축으로 하고, 이미 알고 있는 각각의 검량선 작성용 표준액 복제수를 x축으로 하여 각 Ct 값에 대해 얻어진 근사 직선을 검량선으로 한다. 이때 결정계수(coefficient of determination, R2)는 0.990 이상이어야 한다.

(8) 시료의 유전자재조합식품 혼입률의 계산

검량선 작성에 이용한 Th. line을 사용하여 시료의 내재성 유전자와 재조합 유전자의 Ct값을 구하고, 이들을 각각의 검량선에 내삽하여 초기 유전자 복제수를 구한다. 시료별로 반복 시험된 초기 유전자 복제수의 평균값을 각각 내재성 유전자 복제수와 재조합 유전자 복제수로 한 후, 다음 식에 따라 해당 유전자재조합 이벤트의 혼입률을 구한다. 검량선 작성에 플라스미드 DNA 표준용액을 사용한 경우 보정계수를 적용한다.

① 표준품으로부터 추출한 DNA 용액을 사용하는 경우

※ 유전자재조합식품 혼입률(%)	=	재조합 유전자 복제수	×	100
		내재성 유전자 복제수

② 플라스미드 DNA 표준용액을 사용하는 경우

※ 유전자재조합식품 혼입률(%)	=	재조합 유전자 복제수	×	1	×	100
		내재성 유전자 복제수		보정계수

(9) (현행과 같음)

<삭  제>

7) 스타링크 옥수수(CBH351)의 분석법

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 ---- “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 7과 같다.

8) 유전자재조합 감자(New Leaf Plus, New Leaf Y)의 분석법

유전자재조합 감자는 ---- 현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 3 참조), 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다.

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기---- “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 7과 같다.

표 7. 스타링크 옥수수(CBH351)와 유전자재조합 감자의 결과 판정의 예

(현행과 같음)

9) (현행과 같음)

10) 해충 저항성 Bt 쌀의 분석법

쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여 ---- PCR의 온도조건은 표 8과 같다. 쌀 내재성 유전자와 ---- 혼입 여부를 판정한다.

(1) (현행과 같음)

(2) 내재성 유전자를 확인하기 ----- “검사불능”으로 판정한다.

표 8. 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 확인시험용 PCR 조건

(현행과 같음)

24. (현행과 같음)

25. 방사선 조사식품 검지법

광자극발광법 (Photostimulated luminescence, PSL) 및 열발광법 (Thermoluminescence, TL)은 ------ 판정하는 방법이다.

전자스핀공명법 (Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR)은 뼈, 셀룰로오스 및 결정형 당(crystalline sugar)을 함유한 식품 등에 잔존하는 방사선 조사로 생긴 자유라디칼(free radical)을 분광학적으로 측정하는 방법으로서, 자장에 의하여 전자가 공명한 후 방출하는 에너지의 차이를 측정하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다.

기체크로마토그래프/질량분석법 (Gas chromatography/ Mass spectrometry)은 지방질 식품에서 방사선 조사로 생성된 탄화수소(원래의 지방산보다 탄소수가 1개 적거나, 2개 적으면서 첫 번째 탄소위치에 새로운 이중결합을 가진 탄화수소)를 측정하여 방사선 조사여부를 판정하는 방법이다.

1)～2) (현행과 같음)

3)전자스핀공명법 (Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR)

(1) 측정기기

① 엑스-대 전자스핀공명분광계 (X-band ESR spectrometer) : 자석, 마이크로웨이브 브리지, 콘솔, 공극으로 구성된다.

② g 값 (g value) 측정장치

※ g 값은 고유의 값이며, 가해준 자장과 마이크로웨이브 주파수의 비 [(71,448×마이크로웨이브 주파수)/(자장)]로 계산됨

③ ESR 시험관 (석영, 지름 4.0 mm)

④ 저울

⑤ 진공건조기 또는 동결건조기

(2) 검체조제

① 뼈를 함유한 식품

- 살을 완전히 제거한 뼈를 동결건조기에서 18시간 이상 또는 40 ℃의 진공건조기에서 3시간 이상 건조시킨 다음 적당한 조각 (예: 두께 3.0～3.5 ㎜, 길이 5.0～10.0 ㎜)으로 절단하여 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

② 셀룰로오스를 함유한 식품

- 견과류의 껍질은 적당한 크기(예: 직경 3.0～3.5 ㎜)로 절단하여 동결건조기에서 6시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 2시간 이상 건조한 후 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

- 딸기는 시료 채취 후 바로 검체로 조제하고, 만약 보관 후 조제하고자 하는 경우에는 -18℃에서 보관하여야 한다. 딸기에 물을 가하고 믹서를 이용하여 분쇄한 후 씨를 침전시켜 분리한 다음 동결건조기에서 6시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 2시간 이상 건조시킨 후 200 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

③ 결정형 당을 함유한 식품

- 건조과일을 절단하여 동결건조기에서 18시간 이상 또는 40℃의 진공건조기에서 3시간 이상 건조시킨 후 100 ㎎을 ESR 시험관에 넣는다.

(3) 시험조작

조제된 검체를 넣은 ESR 시험관을 전자스핀공명분광계에 있는 공극에 넣고 각각의 라디칼을 측정할 수 있는 조건으로 측정한다.

① 전자스핀공명분광계의 측정조건

마이크로웨이브 주파수와 자장은 실험에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면

㉮ 뼈를 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.5 GHz, 파워 5～12.5 mW

- 중심자장 : 342 mT

㉯ 셀룰로오스를 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.78 GHz, 파워 0.4～0.8 mW

- 중심자장 : 348 mT

㉰ 결정형 당을 함유한 시료

- 마이크로웨이브 : 주파수 9.78 GHz, 파워 5 mW

- 중심자장 : 348 mT

(4) 판정

① 뼈를 함유한 식품에서 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, [Ca10(PO4)6(OH)2]) 유래의 라디칼에 의한 g 값이 2.001～2.003(g1)과 1.997～1.999(g2)인 비대칭 신호가 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 1. 방사선이 조사되지 않은 쇠고기   뼈의 ESR 스펙트럼.

그림 2. 7 kGy의 선량이 조사된 쇠고기   뼈의 ESR 스펙트럼.

② 셀룰로오스를 함유한 비조사 식품에서 나타나는 중심부의 신호 왼쪽(저자장)과 오른쪽(고자장)에 셀룰로오스 라디칼에 의해서 생성되는 한쌍의 피크가 6.0 mT의 공간을 두고 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 3. 방사선이 조사되지 않은 피스타치오의 ESR 스펙트럼.

그림 4. 1 kGy의 선량이 조사된 피스타치오의 ESR 스펙트럼.

③ 결정형 당을 함유한 비조사 식품에서 보이지 않던 다성분(multi component) ESR 신호(signal 1, 2, 3......)가 나타나면 방사선 조사된 것으로 판정한다.

그림 5. 방사선이 조사되지 않은 건포도의 ESR 스펙트럼.

그림 6. 1 kGy의 선량이 조사된 건포도의 ESR 스펙트럼.

4)기체크로마토그래프/질량분석법(Gas chromatography/Mass spectrometry)

(1) 측정기기

① 기체크로마토그래프 ․ 질량분석기(GC/MS)

② 분쇄기

③ 원심분리기

④ 감압회전농축기

(2) 시약 및 시액

① 탄화수소 표준용액 : 탄화수소 표준품 [1-테트라데센 (C14:1), 펜타데칸 (C15:0), 1-헥사데센 (C16:1), 헵타데칸 (C17:0), 8-헵타데센 (C17:1), 1,7-헥사데카디엔 (C16:2)]을 헥산에 녹여 4 ㎍/mL가 되게 한다.

② 내부표준용액 : n-에이코산 표준품(n-eicosane, C20:0)을 헥산에 녹여 4 ㎍/mL가 되게 한다.

③ 정제컬럼 : Florisil을 충진한 유리칼럼, Florisil SPE 카트리지(충진제 : Florisil 10 g, 용량 : 35 mL) 또는 이와 동등한 것

- 유리칼럼에 Florisil을 충진하는 방법 : Florisil(60～100 mesh)을 550℃에서 5시간 이상 태워 상온에서 식힌 후 3% 물(물 3 g/ Florisil 100 g)을 가한 뒤 균질화하고 이를 12시간 이상 방치 후 불활성화시킨다. 불활성화 시킨 Florisil 20～25 g을 유리 칼럼(20 ㎜ × 200 ㎜)에 충진시켜 사용한다.

④ 헥산 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

(3) 검체조제

1) 지방추출

① 열처리 추출법

검체(식육 등)에서 지방이 많은 부위를 취하여 균질화 시킨후 50 g을 100 mL 원심분리용 유리관에 담고 50°C의 수조에서 가열한다. 이때 소량의 물 (2～5 mL)을 첨가하면 물과 지방이 쉽게 분리된다. 지방이 완전히 녹을 때까지 유리막대로 잘 저어준다음 물과 지방을 분리하기 위하여 원심분리 (900 g, 10분)하고 물층이 혼입되지 않도록 상층액을 취한다. 만약에 추출한 지방이 적을 때는 검체를 유리막대로 저은 다음 원심분리하여 위와 동일한 방법으로 추출하여 지방을 얻는다.

② 용매 추출법

검체 (건조식육 등) 60 g에 무수황산나트륨 70 g을 첨가하여 분쇄하고 헥산 300 mL을 가하여 잘 혼합한 후 원심분리 (900 g, 5분) 한다. 원심분리 후 상층액을 취하여 감압농축기로 농축(40℃)하여 지방을 얻는다. 만약에 추출한 지방이 적을 때는 헥산 100 mL를 가한 후 위와 동일한 방법으로 추출하여 지방을 추가로 얻는다.

2) 탄화수소의 분리 정제

① Florisil 칼럼 정제 : 추출한 지방 1 g에 내부표준용액 1 mL를 첨가하여 Florisil 유리칼럼에 가한다. 헥산 60 mL를 사용하여 3 mL/분의 유속으로 용출시켜 2 mL가 될 때까지 감압농축기로 농축한 (40℃) 후 0.5 mL까지 질소로 농축하여 기체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

② SPE 카트리지 정제 : 추출한 지방 1 g에 내부표준용액 1 mL를 첨가하여 헥산으로 활성화시킨 Florisil SPE 카트리지에 가한다. 헥산 30 mL를 사용하여 2 mL가 될 때까지 회전농축기로 농축한 (40℃) 후 0.5 mL까지 질소로 농축하여 기체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

(4) 시험조작

1) 기체크로마토그래프의 측정조건

① 칼럼 : DB-5column(30 m×0.32 ㎜ ID, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

② 주입부 : split ratio 1:20, 250℃

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/min.

④ 오븐온도 : 60°C 에서 25°C/min 속도로 170°C 까지 승온하고, 2°C/min속도로 205°C 까지 승온하며, 10°C/min 속도로 270°C 까지 승온한다.

⑤ 이온화방식 : Electron impact

⑥ 이온화에너지: 70 eV

⑦ 분석할 분자량 범위: 40-350

2) 정성시험

탄화수소는 크로마토그램상(total ionization chromatogram)에 분리된 각 피크와 표준물질 [1-테트라데센 (C14:1), 펜타데칸 (C15:0), 1-헥사데센 (C16:1), 헵타데칸 (C17:0), 8-헵타데센 (C17:1), 1,7-헥사데카디엔 (C16:2)]의 머무름시간(retention time)과 질량스펙트럼(mass spectrum)을 비교하여 확인한다.

(5) 판정

지방을 방사선 조사시키면 2 가지 형태의 탄화수소 (Cn-1 탄화수소와 Cn-2:1 탄화수소)가 생성되는데 이들의 존재여부로서 방사선 조사여부를 판단하며, 검지마커인 8-heptadecene (C17:1) 또는 1,7-hexadecadiene (C16:2)이 존재하면 방사선 조사된 것으로 판단한다.

26. 벤조피렌 시험법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 시험용액의 조제

① (현행과 같음)

② Florisil카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2～3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 1 mL/분의 속도로 가한다. 이어서 헥산 5 mL와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

(4) 시험조작

① 고속액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : Supelcosil LC-PAH (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

㉯ ～ ㉱ (현행과 같음)

② ～ ③ (현행과 같음)

27. ～ 30.  (현행과 같음)

〔별표 4〕 농산물의 농약잔류허용기준

(1)～(3) (현행과 같음)

(4) 나프로파마이드(Napropamide)

--- 기타견과류 ---

(5) ～ (7) (현행과 같음)

(8) 다이아지논 (Diazinon)

--- 호프 0.1, 고추(건조) 3.0

(9) 델타메쓰린 (Deltametrin)

--- 호프 5.0, 구기자(건조) 2.0

(10) ～ (21) (현행과 같음)

(22) 디크로프루아니드 (Dichlofluanid)

--- 호프 5.0, 고추(건조) 5.0

(23) ～ (25) (현행과 같음)

(26) 디페노코나졸(Difenoconazole)

--- 호박 0.3, 매실 0.2

(27) ～ (30) (현행과 같음)

(31) 마이클로부타닐 (Myclobutanil)

--- 호박 1.0, 고추(건조) 5.0,

(33) ～ (34) (현행과 같음)

(35) 메소밀 (Methomyl)

--- 호밀 2.0, 고추(건조) 5.0

(36) ～ (37) (현행과 같음)

(38) 메타락실 (Metalaxyl)

--- 호프 10.0, 고추(건조) 5.0

(39) ～ (65) (현행과 같음)

(66) 싸이퍼메쓰린 (Cypermethrin)

--- 호박 5.0, 고추(건조) 1.0, 구기자(건조) 5.0

(67) (현행과 같음)

(68) 싸이할로쓰린 (Cyhalothrin)

--- 배추 0.2 --- 호박 0.5, 구기자(건조) 2.0

(69) ～ (84) (현행과 같음)

(85) 에토펜프록스 (Ethofenprox)

--- 호밀 0.005, 배추(건조) 7.0, 파(건조) 10

(86) ～ (100) (현행과 같음)

(101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)

--- 호프 3.0, 고추(건조) 3.0, 파(건조) 2.0, 딸기 0.3, 겨자채 5.0

(101) ～ (104) (현행과 같음)

(105) 이프로디온 (Iprodione)

--- 피망 5.0, 고추(건조) 15

(106) ～ (113) (현행과 같음)

(114) 카보후란 (Carbofuran)

--- 호프 0.5, 매실 0.7

(115)～(124) (현행과 같음)

(125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)

--- 호박 2.0, 기타감귤류 5.0, 고추(건조) 15, 마* 0.1

(126) ～ (136) (현행과 같음)

(137) 테트라디폰 (Tetradifon)

--- 호프 1.0, 무화과 1.0

(138)～(139) (현행과 같음)

(140) 트라로메스린 (Tralomethrin, 델타메쓰린(Deltamethrin)으로서)

(141)～(147) (현행과 같음)

(148) 트리플루라린 (Trifluralin)

--- 기타견과류 ---

(149)～(164) (현행과 같음)

(165) 펜부코나졸 (Fenbuconazole)

--- 피칸 0.1, 오미자* 3.0

(166)～(178) (현행과 같음)

(179) 폴펫 (Folpet)

--- 호박 5.0, 고추(건조) 25

(180) ～ (182) (현행과 같음)

(183) 풀루아지호프-부틸 (Fluazifop-butyl)

--- 피칸 0.05, 감자 0.05, 무(뿌리) 0.05, 무(잎) 0.3

(184) (현행과 같음)

(185) 프로시미돈 (Procymidone)

--- <삭제>, --- 해바라기씨 2.0, 고추(건조) 15

(186) 프로클로라즈 (Prochloraz)

--- 자두 0.5 ---

(187) (현행과 같음)

(188) 프로파모카브 (Propamocarb)

--- 피망 1.0, 수박 0.7

(189)～(199) (현행과 같음)

(200) 헥사코나졸 (Hexaconazole)

--- 포도 0.1, 오미자 1.0

(201)～(202) (현행과 같음)

(203) 벤푸라카브 (Benfuracarb)

--- 쌀 0.01, 파  0.3

(204)～(205) (현행과 같음)

(206) 클로르훼나피르 (Chlorfenapyr)

--- 피망 0.7, 감 0.5, 무화과 0.5, 복분자 0.5, 취나물 3.0,  고추(건조) 5.0, 배추(건조) 3.0

(207) ～ (206) (현행과 같음)

(207) 테부페노자이드 (Tebufenozide)

--- 파 0.7, 배추(건조) 3.0

(208) ～ (211) (현행과 같음)

(212) 플루페녹수론 (Flufenoxuron)

--- 피망 0.3, 배추(건조) 2.0

(213) ～ (217) (현행과 같음)

(218) 디메토모르프 (Dimethomorph)

--- 피망 0.5, 무화과 3.0, 파(건조) 15

(219) (현행과 같음)

(220) 디에토펜카브 (Diethofencarb)

--- 피망 5.0, 자두 0.5, 고추(건조) 3.0

(221) (현행과 같음)

(222) 메파니피림 (Mepanipyrim)

--- 포도 5.0, 양상추 3.0

(223) (현행과 같음)

(224) 싸이목사닐 (Cymoxanil)

--- 피망 0.1, 배추(건조) 3.0

(225) 싸이프로디닐 (Cyprodinil)

--- 포도 5.0, 키위 3.0

(226) 싸이프로코나졸 (Cyproconazole)

--- 사과 0.1, 감 0.2

(227) 아세타미프리드 (Acetamiprid)

--- 피망 5.0, 배추(건조) 10

(228) 아족시스트로빈 (Azoxystrobin)

--- 호박 0.1, 매실 0.5, 무화과 2.0, 고추(건조) 7.0, 파(건조) 7.0

(229) (현행과 같음)

(230) 크레속심-메틸 (Kresoxim-methyl)

--- 피망 2.0, 대추 0.3

(231) 클로르플루아주론 (Chlorfluazuron)

--- 피망 0.5, 복숭아  0.5, 대두 0.1

(232) (현행과 같음)

(233) 펜시쿠론 (Pencycuron)

--- 쌀 0.3, 딸기 2.0

(234)～(236) (현행과 같음)

(237) 피메트로진 (Pymetrozin)

--- 피망 1.0, 겨자채 3.0

(238) (현행과 같음)

(239) 후루아지남 (Fluazinam)

--- 피망 0.3,  자두 0.5, 파(건조)  10

(240) ～ (241) (현행과 같음)

(242) 루페누론 (Lufenuron)

--- 호박 0.5, 복분자  0.3, 고추(건조) 2.0

(243) ～ (247) (현행과 같음)

(248) 아바멕틴 (Abamectin)

--- 호박 0.01, 매실 0.05, 무화과 0.05

(249) 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin benzoate)

--- 호박 0.05, 구기자(건조) 0.1, 복분자0.03

(250) (현행과 같음)

(251) 에톡사졸 (Etoxazole)

--- 수박 0.1, 무화과 0.3

(252)～(253) (현행과 같음)

(254) 카보설판 (Carbosulfan)

--- 포도 0.1, 배 0.2, 복숭아 0.2, 매실 0.07

(255) ～ (256) (현행과 같음)

(257) 플루퀸코나졸 (Fluquinconazole)

--- 포도 1.0, 양상추 1.0, 오미자* 3.0

(258) (현행과 같음)

(259) 피리메타닐 (Pyrimethanil)

--- 포도 5.0, 양상추 3.0, 오미자* 3.0, 자두 2.0

(260) ～ (264) (현행과 같음)

(265) 디메텐아미드 (Dimethenamid)

--- 옥수수 0.1, 고추 0.05, 피망 0.05, 양배추 0.07

(266) ～ (289) (현행과 같음)

(290) 인독사카브 (Indoxacarb)

--- 피망 1.0, 대두 0.2, 복분자 0.5, 고추(건조) 5.0, 배추(건조) 10, 파(건조) 2.0

(291) 족사마이드 (Zoxamide)

--- 피망 0.3, 무화과 0.5, 수박 0.05, 배추(건조) 15

(292) ～ (296) (현행과 같음)

(297) 테트라코나졸 (Tetraconazole)

--- 피망 1.0, 고추(건조) 3.0

(298) ～ (300) (현행과 같음)

(301) 펜헥사미드 (Fenhexamid)

--- 포도 3.0, 사과 1.0

(302)～(303) (현행과 같음)

(304) 프로베나졸 (Probenazole)

--- 쌀 0.1, 고추 0.07, 피망 0.07, 배추 0.07

(305)～(308) (현행과 같음)

(309) 플루토톨라닐 (Flutolanil)

--- 쌀 1.0, 양상추 0.7

(310) ～ (320) (현행과 같음)

(321) 디노테푸란 (Dinotefuran)

--- 오이 1.0, 무(뿌리) 0.05, 대두 0.05

(322) (현행과 같음)

(323) 보스칼리드 (Boscalid)

--- 토마토 2.0, 대추 1.0, 키위 5.0

(324) (현행과 같음)

(325) 시아조파미드 (Cyazofamid)

--- 피망 2.0, 밀감 0.5, 멜론 0.5, 참외 0.5

(326) 아세퀴노실 (Acequinocyl)

--- 수박 0.2, 무화과 2.0

(327) 오리사스트로빈 (Orysastrobin)

쌀 0.1, 기타농산물 0.07

(328)～(331) (현행과 같음)

(332) 크로치아니딘 (Clothianidin)

--- 피망 2.0, 겨자채 3.0, 고추(건조) 10

(333)～(334) (현행과 같음)

(335) 트리프록시스트로빈 (Trifloxystrobin)

--- 포도 0.5, 더덕 0.2, 마* 0.2

(336) (현행과 같음)

(337) 티아메톡삼 (Thiamethoxam)

--- 피망 1.0, 겨자채 5.0, 파 0.2

(338) 티아크로프리드 (Thiacloprid)

--- 피망 1.0, 딸기 2.0 토마토 1.0, 매실 0.5

(339)～(344) (현행과 같음)

(345) 피라크로스트로빈 (Pyraclostrobin)

--- 피망 0.5, 대추 2.0

(346)～(348) (현행과 같음)

(349) 노발루론 (Novaluron)

--- 사과 1.0, 복숭아 1.0, 복분자 2.0, 구기자(건조) 5.0, 취나물 5.0

(350) ～ (351) (현행과 같음)

(352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)

--- 파 2.0, 복숭아 1.0, 밤 0.1, 복분자 1.0, 들깻잎 5.0, 취나물 3.0, 고추(건조) 5.0, 배추(건조) 20, 파(건조) 10

(353) ～ (354) (현행과 같음)

(355) 스피로디크로펜 (Spirodiclofen)

--- 포도 1.0, 딸기 2.0, 유자 2.0, 차 5.0

(356)～(357) (현행과 같음)

(358) 이프로발리카브 (Iprovalicarb)

--- 포도 2.0, 무화과 1.0

(359) ～ (360) (현행과 같음)

(361) 테플루스린 (Tefluthrin)

--- 땅콩 0.05, 파 0.05, 고구마 0.05

(362) ～ (369) (현행과 같음)

(370) Benthiavalicarb-isopropyl(벤티아발리카브아이소프로필)

오이 0.07, 포도 0.5, 기타농산물 0.07

(371) ～ (373) (현행과 같음)

(374) 알라니카브(Alanycarb)

--- 오이 0.1, 사과 0.5

(375) ～ (378) (현행과 같음)

(379) 플루아크리피림 (Fluacrypyrim)

--- 사과 1.0, 무화과 0.5

(380) 피리다릴 (Pyridaryl)

--- 파 0.5, 수박 0.2, 오이 0.5, 참외 0.5, 복분자 1.0, 취나물 5.0

(381) ～ (383) (현행과 같음)

(384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid)

--- 포도 0.5, 감 0.05, 배 0.2, 복숭아 0.2, 멜론 0.2, 수박 0.2

(385) ～ (387) (현행과 같음)

(388) 시안화수소 (Hydrogen cyanide)

--- 피망 5.0, 오렌지 5.0

(389) (현행과 같음)

(390) 시메코나졸 (Simeconazole)

--- 포도 1.0, 딸기 0.3, 사과 0.3

(391) (현행과 같음)

(392) 메소트리온 (Mesotrion)

--- 쌀 0.2, 옥수수 0.2

(393) ～ (394)

(395) 플루오피콜라이드 (Fluopicolide)

---토마토 0.2 고추 0.3, 피망 0.2, 오이 0.5

(398) (현행과 같음)

(399) 사이플루메토펜 (Cyflumetofen)

밀감 0.5, 사과 0.3, 기타농산물 0.07

주1 ～주2(현행과 같음)

주3. 기타농산물의 기준적용은 CODEX 기준이 없을 경우에만 적용한다(기타농산물의 기준은 해당 농약에서 기준이 설정되지 아니한 농산물에서 농약이 검출될 경우에 적용하는 기준임).

주4～주6 (현행과 같음)

주7 실고추 및 고춧가루에서 농약이 검출될 경우 고추(건조)의 기준을 적용한다.

주8 복분자기준에는 나무딸기와 산딸기가 포함된다.

〔별표 5〕인삼의 농약 잔류허용기준

(1)～(19) (현행과 같음)

(20) 에틸렌비스디치오카바메이트*

〔Ethylenebis(dithiocarbamate)s〕

(21)～(29) (현행과 같음)

(30) 디메토모르프* (Dimethomorph)

--- 수삼 0.2, 건삼 1.0, 홍삼 0.7

(31) 클로로타로닐* (Chlorothalonil)

(32) 테플루스린* (Tefluthrin)

--- 수삼 0.2, 인삼농축액 0.3

(33) 플루퀸코나졸* (Fluquinconazole)

--- 수삼 0.2, 건삼 0.5, 홍삼 0.5, 인삼농축액 0.5

(34) (현행과 같음)

(35) 아미트라즈 (Amitraz : 아미트라즈와 (2,4- Dimethylphenyl)-N'- methylformamidine의 합계)

수삼 0.05

(36) 부프로페진(Buprofezin)

수삼 0.07

(37) 싸이할로쓰린 (Cyhalothrin)

수삼 0.05

(38) 푸루실라졸 (Flusilazole)

수삼 0.07

(39) 프로클로라즈 (Prochloraz)

수삼 0.3

(40) 디치아논(Dithianon)

수삼 0.2

(41) 싸이목사닐* (Cymoxanil)

수삼 0.2

(42) 클로치아니딘 (Clothianidin)

수삼 0.2

(43) 티아메톡삼 (Thiametoxam)

수삼 0.1

(44) 에타복삼 (Ethaboxam)

수삼 0.2

〔별표7〕식품 중  동물용의약품의 잔류허용기준

(1)～(55) (현행과 같음)

(56) 노르플록사신(Norfloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류    불검출

(57) 오플록사신(Ofloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류  불검출

(58) 페플록사신(Pefloxacin)

축산물(유, 알 포함), 어류 및 갑각류   불검출

(59) 나라신(Narasin)

가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.3 0.5 0.3	알	불검출

(60) 라살로시드(Lasalocid)

소근육 소간 소지방 소신장 유	0.02 0.02 0.02 0.02 0.01	가금근육 가금간 가금지방 가금신장 알	0.02 0.02 0.02 0.02 0.05

(61) 린코마이신(Lincomycin)

소근육 소간 소지방 소신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.5 0.05 1.0 0.2 0.5 0.1 0.5	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 유 알 어류 갑각류	0.2 0.5 0.1 1.5 0.15 0.05 0.1 0.1

(62) 마두라마이신(Maduramycin)

가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.1 0.8 0.4 1.0	알	불검출

(63) 밤버마이신(Bambermycin, Flavomycin, Flavophospholipol)

소근육 소간 소지방 소신장 닭근육 닭간 닭지방 닭신장	0.01 0.01 0.01 0.01 0.03 0.03 0.03 0.03	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 유 알	0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02

(64) 샘두라마이신(Semduramicin)

가금근육 가금간 가금신장 가금지방	0.1 0.5 0.2 0.5	알	불검출

(65) 아빌라마이신(Avilamycin)

돼지근육 돼지간 돼지신장 돼지지방	0.05 0.05 0.05 0.05	가금근육 가금간 가금신장 가금지방	0.05 0.05 0.05 0.05

(66) 아프라마이신(Apramycin)

소근육 소간 소지방 소신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.5 6.0 1.0 10.0 0.2 0.8 0.2 0.8	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장	0.1 0.1 0.1 0.1

(67) 엔라마이신(Enramycin)

돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장	0.03 0.03 0.03 0.03	닭근육 닭간 닭지방 닭신장	0.03 0.03 0.03 0.03

(68) 콜리스틴(Colistin)

소근육 소간 소지방 소신장 돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장	0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2	양근육 양간 양지방 양신장 염소근육 염소간 염소지방 염소신장 알 유 어류 갑각류	0.15 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 0.2 0.3 0.05 0.15 0.15

(69) 티아물린(Tiamulin)

소근육 소간 소지방 소신장 염소근육 염소간 염소지방 염소신장 양근육 양간 양지방 양신장	0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.5	돼지근육 돼지간 돼지지방 돼지신장 가금근육 가금간 가금지방 가금신장 알	0.1 0.5 0.08 0.04 0.1 0.2 0.1 0.1 1.0