식품의약품안전처 공고 제2019-137호

식품첨가물의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

행정예고

2019. 3. 19.

식품의약품안전처

식품의약품안전처 공고 제2019-137호

｢식품첨가물의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2019-1호, 2019.1.9.)을 일부 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 듣고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 ｢행정절차법｣ 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2019년 3월 19일

식품의약품안전처장

｢식품첨가물의 기준 및 규격｣ 일부개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유

식품첨가물로 허용된 아산화질소를 직접 흡입하는 사례가 발생함에 따라, 아산화질소의 오용을 방지하기 위하여 카트리지 형태의 용기를 사용하지 않도록 제조기준을 신설하고, 식용을 목적으로 하는 미생물 등의 배양에 사용되는 식품첨가물의 종류 등 규정을 명확히 하기 위하여 일반사용기준을 신설하며, ｢식품의 기준 및 규격｣의 식품유형 통합 개정사항을 반영하여 해당 사용기준을 변경하고, 영·유아식에 사용가능한 식품첨가물 목록 및 천연향료에 사용되는 기원물질 목록을 정비하는 한편, L-글루탐산나트륨 등 6품목에 대한 성분규격 및 기구등의 살균소독제의 살균력시험법을 개선하고자 ｢식품첨가물의 기준 및 규격｣을 개정하려는 것임

2. 주요 내용

가. “아산화질소” 용기에 대한 제조기준 신설

1) 아산화질소를 직접 흡입하는 오용을 방지하기 위한 용기 제한 필요

2) 아산화질소를 담는 용기 중 카트리지 형태를 제한하는 제조기준 신설(안 II. 1. 5))

3) 아산화질소의 오용 방지로 국민건강을 확보할 수 있을 것으로 기대

나. 미생물 등 배양시 사용되는 식품첨가물에 대한 일반사용기준 신설

1) 미생물 등 배양시 사용하는 식품첨가물의 종류 및 사용기준 등 규정 명확화 필요

2) 미생물 등 배양에 사용할 수 있는 식품첨가물의 범위 및 사용기준에 대한 일반사용기준 신설(안 II. 2. 4))

3) 미생물 등 배양 시 사용할 수 있는 식품첨가물 규정 명확화로 식품산업 활성화 및 민원 이해 제고

다. “글루탐산” 등 6품목의 성분규격 개정

1) 유해시약을 저독성의 시약으로 대체 및 성분규격의 국제기준과 일치 필요

2) “L-글루탐산” 등 3품목의 순도시험 중 피롤리돈카복실산의 시험법 개선(안 Ⅱ. 4. 가. L-글루탐산, L-글루탐산암모늄, L-글루탐산칼륨)

3) “수용성안나토” 등 3품목의 확인시험, 순도시험, 정량법 등 시험법 개선(안 Ⅱ. 4. 가. 수용성안나토, 비타민B12, 보존료제제)

4) 시험법 개선을 통한 시험자 건강보호 및 국제기준과의 조화

라. “천연향료” 기원물질 명칭 등 정비

1) 천연향료 기원물질의 한글명 명시 등 수정 필요

2) 천연향료 기원물질 59종에 대한 명칭, 학명 수정(안 II. 4. 가. 천연향료)

3) 천연향료 기원물질에 대한 정보 명확화

마. 수산화칼륨 등 13품목에 대한 사용기준 개정

1) 식품유형 개정사항과 일치 및 영·유아식에 사용할 수 있는 식품첨가물에 대한 사용기준 정비 필요

2) 영·유아용 곡류조제식과 기타 영·유아식이 영·유아용 이유식으로 통합됨에 따라 이를 반영한 글루콘산동 등 11품목의 사용기준 개정(안 II. 5. 가. 글루콘산동, 글콘산망간, 글루콘산아연, 글루콘산철, 비타민K1, 5’-시티딜산, 5’-시티딜산이나트륨, 5’-아데닐산, 5’-우리딜산이나트륨, 황산동, 황산아연)

3) 영·유아식에 사용할 수 있는 식품첨가물의 사용기준 중 수산화칼륨의 사용기준을 품목별 사용기준과 일치시키고, 헴철을 영양강화 목적으로 사용되는 식품첨가물 목록으로 이동(안 II. 5. 다. (1), (2))

4) 식품공전과의 식품유형 일치 및 식품첨가물 사용기준의 명확화로 민원 이해 제고

바. 살균소독력 시험법 개선

1) 살균소독력 시험법의 이해도 증진 및 수행의 용이성 제고를 위하여 개정 필요

2) 일반시험법 중 살균소독력시험법 개선(안 IV. 37.)

3) 시험분석 편의성 제고

사. 식품첨가물 신규지정시 안전성 제출자료 규정 개선

1) 식품첨가물 신규지정시 제출하여야 하는 안전성 자료범위 규정 명확화 필요

2) 가공보조제로 인정된 식품첨가물을 그 외 용도로 사용할 경우, 기존 식품첨가물과 동일하게 안전성 자료 추가제출 규정 신설(안 [별표 1])

3) 식품첨가물의 안전성 확보로 국민건강 증진

3. 의견 제출

｢식품첨가물의 기준 및 규격｣ 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2019년 5월 18일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전처장(우편번호 : 28159, 주소: 충청북도 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명2로 187 오송보건의료행정타운 식품의약품안전처, 참조: 첨가물기준과, 전화 043-719-2502～11, 팩스 043-719-2500)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬·반여부와 그 사유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2019-000호

｢식품위생법｣ 제7조제1항에 따른 ｢식품첨가물의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2019-1호, 2019.1.9.)을 다음과 같이 개정하고자 합니다.

2019년  월  일

식품의약품안전처장

｢식품첨가물의 기준 및 규격｣ 일부개정고시(안)

식품첨가물의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

II. 1. 5)를 다음과 같이 신설한다.

5) 가스 형태의 식품첨가물

아산화질소는 내용량 2.5L 이상의 고압금속제 용기에만 충전하여야 한다.

II. 2. 4)부터 5)를 5)부터 6)으로 하고, 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 식용을 목적으로 하는 미생물 등의 배양에 사용하는 식품첨가물은 이 고시에서 정하고 있는 품목 또는 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서 미생물 영양원으로 등재된 것으로 최종식품에 잔류하여서는 아니된다. 다만, 불가피하게 잔류할 경우에는 품목별 사용기준에 적합하여야 한다.

II. 4. 가. L-글루탐산의 순도시험 중 (4) 피롤리돈카복실산을 아래와 같이 한다.

(4) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

II. 4. 가. L-글루탐산암모늄의 순도시험 중 (3) 피롤리돈카복실산을 아래와 같이 한다.

(3) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

II. 4. 가. L-글루탐산칼륨의 순도시험 중 (5) 피롤리돈카복실산을 아래와 같이 한다.

(5) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

II. 4. 가. 비타민B12의 순도시험 중 “사염화탄소와”를 “클로로포름과”로 한다.

II. 4. 가. 수용성안나토의 함량 중 “380.49”를 “380.48”로 하고, “100.0∼125.0%”를 “95∼120%”로 한다.

II. 4. 가. 수용성안나토의 확인시험 중 (1)을 아래와 같이 한다.

(1) 이 품목 1g을 물 40mL에 녹이고 황산(1→20) 4mL를 넣어 흔들어 섞은 후 여과한다. 여지상의 잔류물을 물 40mL씩으로 세 번 씻어 이를 시험용액으로 하여 다음의 시험을 한다.

(가) 잔류물의 일부에 수산화나트륨 용액(1→2,500)을 가하여 녹인 액은 파장 452～456nm 및 480～484nm 부근에 흡수를 확인한다.

(나) 잔류물의 일부를 에탄올 10mL에 녹이고, 그 중 한방울을 여지상에 점적한 후 바람에 말린 다음 아질산나트륨용액(1→20) 2～3방울을 떨어뜨린 후 계속하여 0.5mol/L 황산 2～3방울을 떨어뜨릴 때, 여지상의 노란색은 탈색된다.

II. 4. 가. 수용성안나토의 순도시험 중 (1)을 삭제하고 (2)부터 (6)을 (1)부터 (5)로 한다.

II. 4. 가. 수용성안나토의 정량법을 아래와 같이 한다.

정 량 법  측정하는 흡광도가 0.3∼0.7의 범위가 되도록 이 품목 0.3～0.5g을 정밀히 달아, 수산화칼륨 용액(1→200)을 가하여 녹인 후 정확히 100mL로 한다. 이 액 1mL를 정확하게 취한 후 수산화칼륨 용액(1→200)을 넣어 정확하게 100mL로 하여 검액으로 한다. 수산화칼륨 용액(1→200)을 대조로 파장 476∼484nm의 극대흡수부에서 흡광도 A를 측정하여 다음 식에 따라 노르빅신의 함량을 구한다.

함 량(%) ＝	A	×	100	× 100
	2,870		검체의 채취량(g)

II. 4. 가. 천연향료 기원물질 목록 중 “2, 3, 8, 17, 18, 21, 23, 25, 28, 32, 38, 39, 44, 47, 69, 74, 76, 81, 102, 109, 119, 123, 129, 130, 131, 139, 140, 147, 148, 149, 150, 156, 160, 161, 163, 166, 170, 172, 183, 189, 194, 198, 199, 209, 212, 221, 227, 228, 231, 232, 238, 245, 249, 250, 251, 253, 254, 272, 273의 일반명 및 기원물질명을 다음과 같이 한다.

순번	일반명	기원물질명
2	Almond, bitter(free from prussic acid) (Bitter almond)	장미과 벚나무(Prunus amygdalus Batsch. Prunus armeniaca L., Prunus persica(L.) Batsch.)
3	Ambergris	향고래과 향유고래(Physeter macrocephalus L.)
8	Angelica stem	로셀라과 로셀라 푸시포르미스 지의류(Roccella fuciformis Ach)
17	Balm(Lemon balm, Melissa)	꿀풀과 레몬밤(Melissa officinalis L.)
18	Balsam of Peru	콩과 페루발삼(Myroxylon pereirae Klotzsch.)
21	Bay(Myrcia oil)	도금양과 서인도베이오일(Pimenta racemosa(Mill.) J. W. Moore.)
23	Bergamot(Bergamot orange)	운향과 귤(Citrus aurantium L. subsp. bergamia Wright et Arn.)
25	Bois de rose	녹나무과 브라질장미목(Aniba rosaeodora Ducke.)
28	Bryonia root	박과 브리오니아(Bryonia alba L., B. dioca Jacq)
32	Cajeput	도금양과 흰멜라루카(Melaleuca leucadendron L., other Melaleuca spp.)
38	Caraway	산형과 캐러웨이(Carum carvi L.)
39	Cardamom seed(Cardamon)	생강과 소두구(Elettaria cardamomum Maton.)
44	Cassia bark, Padang 또는 Batavia	녹나무과 녹나무(Cinnamomum burmannii Blume.)
47	Castoreum	비버과 유럽비버 또는 아메리카비버(Castor fiber L. and C. canadensis Kuhl.)
69	Civet(Zibeth, Zibet, Zibetum)	사향고양이과 아프리카사향고양이 또는 큰인도사향고양이(Civet cats: Viverra civetta Schreber, Viverra zibetha Schreber.)
74	Cognac oil, white 및 green	포도과 포도(Ethyl oenanthata, so-called)
76	Copaiba	콩과 남미 코파이페라속(South American spp. of Copaifera L.)
81	Cumin(Cummin)	산형과 쿠민(Cuminum cyminum L.)
102	Fenugreek	콩과 호로파(Trigonella foenum-graecum L.)
109	Genet flowers	콩과 스페인 빗자루꽃(Spartium junceum L.)
119	Guaiac	남가새과 구아이아쿰(Guaiacum officinale L., G. sanctum L., Bulnesia sarmienti Lor.)
123	Hemlock needles 및 twigs	북미산 캐나다솔송나무 또는 북미솔송나무(Tsuga canadensis(L.) Carr., T. heterophylla(Raf.) Sarg)
129	Hyssop	꿀풀과 히숍(Hyssopus officinalis L.)
130	Iceland moss	당초무늬지의과 갈퀴지의(Cetraria islandica Ach)
131	Immortelle	국화과 밀짚꽃(Helichrysum angustifolium DC.)
139	Lavender, spike	꿀풀과 라반둘라(Lavandula latifolia Vill.)
140	Lavandin	꿀풀과 라반둘라(Hybrids between Lavandula officinalis Chaix and Lavandula latifolia Vill.)
147	Linden leaves (146에서 flowers)	피나무과 피나무(Tilia spp.)
148	Locust bean(Carob bean)	콩과 캐롭(Ceratonia siliqua L.)
149	Lovage	산형과 로바지(Levisticum officinale Koch)
150	Lungmoss(Lungwort)	투구지의과 갑옷이끼(분말투구지의)(Sticta pulmonacea Ach.)
156	Marjoram, sweet	꿀풀과 오래가눔 마조라나(Majorana hortensis Moench.)
160	Mimosa(Black wattle) flowers	콩과 아카시아(Acacia decurrens Willd. var. dealbata)
161	Molasses(extract)	화본과 사탕수수(Saccharum officinarum L.)
163	Musk(Tonquin musk)	사향노루과 시베리아사향노루(Musk deer, Moschus moschiferus L.)
166	Myrtle leaves	도금양과 도금양(Myrtus communis L.)
170	Olibanum	감람과 유향속(Boswellia carteri Birdw., other Boswellia spp.)
172	Opopanax(Bisabolmyrrh)	산형과 오포파낙스 치로니쿰(Opopanax chironium Koch (true opopanax) of Commiphora erythraea Engl. var. Glabrescens)
183	Parsley	산형과 파슬리(Petroselinum crispum(Mill.) Mansf.)
189	Pennyroyal, American	꿀풀과 북미페니로얄초(Hedeoma pulegioides(L.) Pers)
194	Peruvian balsam	콩과 페루발삼(Myroxylon pereirae Klotzsch.)
198	Pimenta(Allspice)	도금양과 올스파이스(Pimenta officinalis Lindl.)
199	Pimenta leaf	도금양과 올스파이스(Pimenta officinalis Lindl.)
209	Quebracho bark	협죽도과 퀘브라초(Aspidosperma quebracho-blanco Schlecht,, (Quebrachia lorentzii(Griseb))
212	Red saunders(Red sandalwood)	콩과 자단목(Pterocarpus santalinus L.)
221	Rose geranium	쥐손이풀과 펠르고니움(Pelargonium graveolens L'Her.)
227	Sage, Spanish	꿀풀과 단삼(Salvia lavandulifolia Vahl.)
228	St. John's bread	콩과 캐롭(Ceratonia siliqua L.)
231	Sandarac	측백나무과 산다락(Tetraclinis articulata(Vahl.), Mast)
232	Sarsaparilla	청미래덩굴과 청미래덩굴(Smilax aristolochiaefolia Mill., (Mexican sarsaparilla), S. regelii Killip et Morton(Honduras sarsaparilla), S. febrifuga Kunth(Ecuadorean sarsaparilla), or undetermined Smilax spp.(Ecuadorian or Central Americal sarsaparilla).)
238	Simaruba bark	소태나무과 시마루바나무(Simarouba amara Aubl)
245	Tamarind	콩과 타마린(Tamarindus indica L.)
249	Thistle, blessed(Holy thistle)	국화과 홀리티슬(Cnicus benedictus L.)
250	Thyme	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L. and Thymus zygis var. gracilis Boiss.)
251	Thyme, white	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L. and Thymus zygis var. gracilis Boiss.)
253	Tuberose	빗자루과 튜베로즈(Polianthes tuberosa L.)
254	Tolu	콩과 토루발삼(Myroxylon balsamum (L.) Harms)
272	Mastic	옻나무과 유향나무(Pistacia lentiscus LINNE)
273	Para cress	국화과 아크멜라(Spilanthes acmella Linné)

II. 4. 나. 보존료제제의 확인시험 중 “(1) 박층크로마토그래피에 의한 확인”에 대한 시험방법을 아래와 같이 한다.

시험용액의 조제 : 정량법 1) 시험용액의 조제에 따라 얻어진 에테르를 날려보낸 후 잔류물에 0.1% 아세트아닐라이드아세톤용액 대신 에탄올 소량(1～2mL)을 가하여 녹인 액을 시험용액으로 한다.

박층판 : 박층크로마토그래피용 실리카겔(파라옥시안식향산에스테르류는 Silica gel 60 RP-18 F254S 또는 이와 동등한 것, 안식향산, 데히드로초산, 소브산은 Silica gel 60 kieselguhr F254 또는 이와 동등한 것)을 사용한다.

시험조작 : 박층판의 하단에서 약 1.5cm 위치에 시험용액 및 각 보존료 표준용액을 20μL를 약 2cm 간격으로 점적한 다음 각 전개용매 1, 2를 사용하여 전개 후 건조하고 자외선등(254nm) 아래서 반점을 비교관찰한다.

시  액

보존료표준용액 : 안식향산 및 데히드로초산 표준품은 각각 10mg을 아세톤 1mL씩에 녹이고 소브산 및 파라옥시안식향산에스테르류는 각각 10mg을 아세톤 5mL씩에 녹인 액을 각 보존료표준용액으로 한다.

전개용 용매 : 1. 파라옥시안식향산에스테르류 : 아세톤․물(60 : 40, v/v)

2. 안식향산, 데히드로초산, 소브산) 자일렌․메탄올․초산(20 : 0.5 : 0.3, v/v/v)

II. 5. 가. 글루콘산동의 사용기준 중 2의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 글루콘산망간의 사용기준 중 9의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 글루콘산아연의 사용기준 중 3의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 글루콘산철의 사용기준 중 2의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 비타민K1의 사용기준 중 1의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 5’-시티딜산의 사용기준 중 1의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 5’-시티딜산이나트륨의 사용기준 중 1의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 5’-아데닐산의 사용기준 중 1의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 5’-우리딜산이나트륨의 사용기준 중 1의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 황산동의 사용기준 중 3의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 가. 황산아연의 사용기준 중 2의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 다.의 “영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식”을 “영·유아용 이유식”으로 한다.

II. 5. 다. (2) 수산화칼륨의 사용기준을 “최종식품 완성 전에 중화 또는 제거하여야 한다.”로 한다.

II. 5. 다. (2)에서 “헴철(Heme Iron)” 및 그 사용기준을 삭제하고, II. 5. 다. (1)의 피로인산철나트륨 다음에 “헴철(Heme Iron)”을 추가한다.

IV. 37. 살균소독력시험법을 아래와 같이 변경한다.

37. 살균소독력시험법

분석원리 : 본 시험방법은 기구등의 살균소독제의 살균소독력 유무를 측정하는 방법으로 세균현탁액시험법, 세균표면시험법, 포자현탁액시험법이 있으며, 별도의 규정이 없는 한 세균현탁액시험법으로 측정한다.

살균소독력의 정의 : 기구등의 살균소독제에 대하여 규정된 조건에서 규정된 시험균의 초기균수(cfu/mL)에 대한 생균수(cfu/mL) 감소율(%)을 말한다.

가. 세균현탁액시험법

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 경수(바. 시액 ①)로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하여야 하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

다음의 2가지 시험균주를 표준균주로 사용한다.

- Escherichia coli ATCC 10536 또는 Escherichia coli ATCC 11229

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

다만, 상기 표준균주 외에 다음과 같은 시험균주를 선택하여 추가할 수 있다.

- Bacillus cereus ATCC 21772

- Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969

- Salmonella ctyphimurium ATCC 13311

- Listeria monocytogenes ATCC 19111(또는 Listeria monocytogenes ATCC 19115)

3) 시험균주의 배양

시험균주를 TSA배지(마. 배지 ①)에 도말하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 이를 1차 배양이라 하며, 같은 방법으로 2차 배양을 한다. 시험에서는 2차 배양된 시험균주를 사용한다. 다만, 추가 시험균주 중 V. parahaemolyticus의 배양을 위해서는 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 10mL에 시험균 10μL를 접종하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 1차 배양이 완료되면 2차 배양을 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 100mL에 한다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 3)에 따라 2차 배양된 시험균을 백금이를 사용하여 트립톤생리식염수(바. 시약 ②) 10mL와 유리비드(라. 기구 및 재료 ①) 5g이 들어간 100mL 삼각플라스크에 옮긴다. 이때 시험균이 옮겨진 백금이를 트립톤생리식염수에 담그고 삼각플라스크의 벽면에 문질러 완전히 균괘가 떨어지도록 한 다음 3분간 교반기(라. 기구 및 재료 ②)를 이용하여 잘 섞는다. 이후 유리비드 안쪽의 현탁액을 취하여 다른 시험관으로 옮긴다. 트립톤생리식염수을 사용하여 생균수를 1.5×108～5.0×108 cfu/mL로 조정하고 20±1℃의 항온수조(라. 기구 및 재료 ③)에 방치한 후 시험균주 현탁액으로 사용한다. 시험균주 현탁액은 제조 후 2시간 이내에 사용하여야 한다.

다만, 추가 시험균주 중 V. parahaemolyticus의 경우에는 상기 3)의 배양균을 멸균된 50mL 원심분리관에 넣고 원심분리기(라. 기구 및 재료 ④) 20℃, 5000×g (6,000rpm)에서 5분간 원심분리하여 상등액을 조심스럽게 버린 후, 잔류된 균괘에 트립톤생리식염수 25mL를 첨가하여 10초간 진탕교반기를 이용하여 교반한다. 교반이 완료되면 다시 원심분리하여 상등액을 버린 후, 트립톤생리식염수 2mL를 첨가하여 균괘를 현탁시켜 둔다. 100mL 삼각플라스크에 트립톤생리식염수 10mL와 유리비드 5g을 넣고 미리 준비한 균 현탁액을 첨가하여 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 트립톤생리식염수를 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL가 되도록 조정하고 20±1℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 시험균주 현탁액으로 한다. : 100mL 삼각플라스크에 희석액(TSCS) 10mL와 유리비드(직경 3～4㎜) 5g을 넣고 백금이를 사용하여 E. coli 활성배양균을 옮긴다. 이때 백금이를 희석액(TSCS)에 담그고 삼각플라스크의 벽면에 문질러 완전히 균괘가 떨어지도록 한 다음 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 유리비드 안쪽의 현탁액을 취하여 다른 시험관으로 옮긴다. 희석액(TSCS)을 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL로 조정하고 20℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 E. coli 시험균주 현탁액으로 한다.

(2) 계수

시험균주 현탁액을 트립톤생리식염수를 사용하여 10-6과 10-7으로 희석하고, 이 희석액 1mL씩을 멸균 페트리접시(라. 기구 및 재료 ⑤) 2매에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 TSA배지 약 15mL를 무균적으로 분주하고 잘 혼합하여 응고시킨다. 확산집락의 발생을 방지하기 위하여 TSA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 36±1℃에서 48±2시간 배양한 후 다음의 계산식에 따라 시험균주 현탁액의 생균수(N)를 계수한다. 생균수의 계산은 15～300개의 집락을 생성한 페트리접시를 택하여 계산한다.  10-6과 10-7의 희석배수에서 모두 유효범위의 결과가 나오면 다음의 식에 의하여 생균수를 산정한다. 하지만, 한 단계의 희석배수에서만 유효범위의 결과를 얻었을 경우에는 산술평균하고 희석배수를 곱하여 계산한다. 계산된 결과는 두 자리 유효숫자를 얻을 때까지 반올림하여 1.0과 9.9사이의 숫자를 10의 배수로 곱한 방식(예, 2.7×108 cfu/mL)으로 표시한다.

시험균주 현탁액의 생균수(N, cfu/mL) ＝	c
	(n1+0.1n2)d

c  : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n1 : 10-6 희석에서 계수된 페트리접시의 수

n2 : 10-7 희석에서 계수된 페트리접시의 수

d : 첫 번째 희석액의 희석배수(10-6)

5) 시험균주 현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 4)의 시험균주 현탁액을 트립톤생리식염수를 사용하여 생균수가 3.0×102～1.6×103 cfu/mL가 되도록 희석하여 조제한다.

(2) 계수

시험균주 현탁희석액을 트립톤생리식염수로 10배 희석하고 이 희석액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣어 45±1℃로 유지한 TSA배지 약 15mL를 무균적으로 분주하여 냉각응고 시킨 후 TSA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 36±1℃에서 48±2시간 배양한 후 생균수를 계수한다. 시험균주 현탁희석액의 생균수(Nv)는 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이때 시험균주 현탁희석액의 생균수는 3.0×102～1.6×103 cfu/mL이어야 한다.

시험균주 현탁희석액의 생균수(Nv, cfu/mL) ＝	c	×	10
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

6) 시험조작

시험용액, 시험균주 현탁액, 시험균주 현탁희석액, 시액 및 물 등은 항온수조에서 20±1℃로 유지시킨다.

(1) 본시험

시험관(라. 기구 및 재료 ⑥)에 간섭물질 1mL와 시험균주 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한다. 이 후 시험용액 8mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 증류수 1mL가 들어있는 시험관에 넣고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 중화시킨다. 이 중화반응혼합액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4)와 같이 배양한다. 본시험에서의 생균수(Na)를 상기 가. 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질과 시험균주 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

(2) 검증시험

검증시험에는 시험조건 검증시험, 중화제 독성 검증시험 및 희석중화 검증시험이 있으며, 이들 검증시험들은 상기 본시험과 같이 수행해야 한다.

① 시험조건 검증시험

시험관에 시험균주 현탁희석액 1mL와 간섭물질 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한다. 이후 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4) (2)와 같이 배양한다. 시험조건 검증법에서의 생균수(A)를 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 시험조건 검증시험의 생균수(A)는 시험균주 현탁희석액(Nv)에서 산정한 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

시험조건 검증시험의 생균수(A, cfu/mL) ＝	c
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

② 중화제 독성 검증시험

시험관에 시험균주 현탁희석액 1mL, 중화제 8mL 및 증류수 1mL를 넣고 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 배양한다. 중화제 독성 검증시험의 생균수(B)는 ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 중화제 독성 검증시험에서의 생균수(B)는 시험균주 현탁희석액에서 산정한 생균수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

③ 희석중화 검증시험

시험관에 시험용액 8mL, 간섭물질 1mL 및 트립톤생리식염수 1mL를 넣고 즉시 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 중화반응혼합액에 시험균주 현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 30분간 반응시킨다. 이 액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4) (2)와 같이 배양한다. 희석중화 검증법의 생균수(C)는 ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 희석중화 검증시험에서의 생균수(C)는 중화제 독성시험법에서 산정한 생균수(B)의 0.5배수 이상이어야 한다.

7) 판정

다음 계산식에 따라 시험균의 생균수 감소율을 각각 계산하여 생균수 감소율이 99.999%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	N-10Na	×	100
	N

N : 시험균주 현탁액의 생균수(cfu/mL)

Na : 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/mL)

* 본시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Na)는 “3.0×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

나. 세균표면시험법

본 시험방법은 간섭물질이 들어있는 시험균주 현탁액을 스테인리스 스틸 표면(담체)에 도말하여 건조시킨 후 이 막위에 시험용액을 처리하여 20±1℃에서 5분간 반응시키고 즉시 검증된 중화제를 사용하여 반응을 억제 시키는 방법으로 각 표면의 생균수를 측정하여 생균수 감소율을 측정하는 방법이다. 다만, 본 시험을 할 때에는 시험용액 대신 트립톤생리식염수를 사용하여 대조시험을 실시하고 검증시험을 동시에 수행하여야 한다.

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도에 맞게 경수로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하여야 하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

가. 2)의 2가지 시험균주를 사용한다. 추가균주는 사용하지 않는다.

3) 시험균주의 배양

가. 3)에 따른다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

가. 4)에 따른다.

5) 시험표면 접종액의 조제

시험관에 시험균주 현탁액 400μL와 간섭물질 100μL를 첨가하여 1분간 교반기를 이용하여 잘 섞은 후 20±1℃의 항온수조에서 30분간 방치한 액을 시험표면 접종액으로 한다.

6) 시험표면의 조제

시험표면 접종액 10μL를 담체(라. 기구 및 재료 ⑦) 중앙에 접종하여 36±1℃로 조절된 가열판 위에서 건조시킨 것을 시험표면으로 한다.

7) 시험조작

시험용액, 시액, 기구 등은 20±1℃로 유지시킨다. 담체와 유리병(라. 기구 및 재료 ⑧)은 데시케이터(라. 기구 및 재료 ⑨)에 건조하여 준비한다.

(1) 본시험

시험표면을 멸균된 집게를 사용하여 시험표면 접종액의 건조된 표면이 위로 향하게 하여 유리병에 조심스럽게 넣는다. 유리병안의 시험표면 중앙에 시험용액 50μL를 첨가하고 20±1℃에서 5분간 반응시킨 후 중화제 9.95mL와 유리비드 2～3g을 첨가하여 교반기에서 1분간 혼합하고 막여과장치(라. 기구 및 재료 )로 여과한다. 여과할 때 트립톤생리식염수 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 실험과정을 준비된 시험표면으로 5회 반복한다. 본시험의 생균수(Nd)를 다음 계산식에 따라 산정한다.

본시험 및 검증시험의 생균수(cfu/carrier) ＝	c
	n ×d

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

d : 희석배수

따로 트립톤생리식염수를 사용하여 대조시험의 생균수(Nc)를 산정한다. 이 때, 반응혼합액은 트립톤생리식염수로 10-2, 10-3 및 10-4으로 희석하여 막여과장치로 여과하고 시험표면 반복횟수는 3회로 한다. 이때 대조시험의 생균수는 상기 나. 7) (1)의 계산식에 따라 산정할 때 1.5×105 cfu/carrier 이상이어야 한다.

(2) 검증시험

① 중화 검증시험

유리병에 중화제 9.95mL와 시험용액 50μL를 넣고 혼합하여 20±1℃에서 5분간 정치시킨 후 시험표면과 유리비드 2～3g을 첨가한다. 교반기에서 1분간 혼합한 후 반응혼합액을 10-3, 10-4 및 10-5으로 희석하여 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 기술된 실험과정을 따로 준비한 시험표면으로 2회 반복한다. 중화 검증시험의 생균수(A)를 상기 나. 7) ①의 계산식에 따라 산정한다. 이때 중화 검증시험의 생균수는 1.5×105 cfu/carrier이상이어야 한다.

② 중화제 독성 검증시험

유리병에 중화제 9.95mL와 트립톤생리식염수 50μL를 넣고 혼합하여 20±1℃에서 5분간 정치시킨 후 시험표면과 유리비드 2～3g을 첨가한다. 교반기에서 1분간 혼합한 후 반응혼합액을 10-3, 10-4 및 10-5으로 희석하여 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 기술된 실험과정을 따로 준비한 시험표면으로 2회 반복한다.

중화제 독성 검증시험의 생균수(B)를 상기 나. 7) ①의 계산식에 따라 산정한다. 이때 중화제 독성 검증시험의 생균수는 중화 검증시험에서 산정한 생균수의 0.5배수 이상～2배수 이하이어야 한다.

8) 판정

다음 계산식에 따라 생균수 감소율이 99.99%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	Nc - Nd	×	100
	Nc

Nc : 대조시험의 생균수(cfu/carrier)

Nd : 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/carrier)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Nd)는 “1.5×10 cfu/carrier”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Nd)는 “3×102 cfu/carrier”를 각각 적용한다.

다. 포자현탁액시험법

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 경수로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

Bacillus subtilis ATCC 6633

3) 포자용액의 조제

시험균주를 TGB배지(마. 배지 ②)에 접종하고 30±1℃에서 18～24시간 배양한다. 이 배양액 2～3mL를 MYA배지(마. 배지 ③)를 넣어 굳힌 배양병(라. 기구 및 재료 )에 접종하여 30℃±1℃에서 8～10일간 배양한다. 멸균한 유리비드와 증류수를 사용하여 포자를 집균하고 10,000rpm에서 20분간 원심분리한다. 이 후 상층액을 제거한 다음 다시 멸균 증류수에 부유시켜 세척하는 과정을 4회 반복하고 잔사를 멸균 증류수에 부유시켜 75±1℃에서 10분간 가열하여 포자용액을 조제한다. 조제된 포자용액은 냉장(5±1℃)보관 하여 사용하되 장기보관시에는 냉동보관한다.

4) 포자 현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 다. 3)의 포자용액을 멸균 증류수를 사용하여 1.5×106～5×106 cfu/mL로 조정하고 광학현미경(라. 기구 및 재료 )을 사용하여 영양세포가 없는 포자임을 확인하고, 20±1℃의 항온수조에서 방치한 액을 포자 현탁액으로 한다. 이 액은 제조 후 2시간 이내에 사용하여야 한다.

(2) 계수

포자 현탁액을 멸균 증류수로 10-4～10-5 희석하고, 1mL씩을 멸균 패트리접시 2매에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 GYA배지(마. 배지 ④) 약 15mL를 무균적으로 분주하여 냉각응고 시킨 후 GYA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 30±1℃에서 3일간 배양한 후 포자현탁액의 포자수(N)를 산정한다. 이 때, 포자현탁액의 포자수는 1.5×106～5×106 cfu/mL이어야 한다.

포자 현탁액의 포자수(N, cfu/mL) ＝	c
	(n1+0.1n2)d

c  : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n1 : 첫 번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

n2 : 두 번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

d : 첫 번째 희석액의 희석배수

5) 포자 현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 다. 4)의 포자 현탁액을 포자의 수가 6×102～3×103 cfu/mL가 되도록 멸균 증류수로 희석하여 조제한 액을 포자 현탁희석액으로 한다.

(2) 계수

포자 현탁희석액을 멸균 증류수로 10배 희석하고, 1mL씩 취하여 2매의 멸균 페트리접시에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 GYA배지를 가하여 상기 다. 4) (2)와 같이 배양한다. 포자 현탁희석액의 포자수(Nv)는 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자현탁희석액의 포자수(Nv)는 6×102～3×103 cfu/mL이어야 한다.

포자 현탁액의 포자수(Nv, cfu/mL) ＝	c	×	10
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

6) 시험조작

(1) 본시험

시험관에 간섭물질 1mL와 포자 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 멸균 증류수 1mL가 들어있는 시험관에 넣고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 중화시킨다. 이 중화반응혼합액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 본시험의 포자수(Na)를 상기 다. 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 포자 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

(2) 검증시험

검증시험에는 시험조건 검증시험, 중화제 독성 검증시험 및 희석중화 검증시험이 있으며, 이들 검증시험들은 상기 본시험과 같이 수행해야 한다.

① 시험조건 검증시험

시험관에 간섭물질 1mL와 포자 현탁희석액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치하고 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 시험조건 검증시험에서의 포자수(A)를 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 시험조건 검증시험의 포자수(A)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

시험조건 검증시험의 포자수(A, cfu/mL) ＝	c
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

② 중화제 독성 검증시험

시험관에 중화제 8mL, 물 1mL 및 포자 현탁희석액 1mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 중화제 독성 검증법의 포자수(B)를 상기 다. 6) (2) ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 중화제 독성 검증시험의 포자수(B)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

③ 희석중화 검증시험

시험관에 간섭물질 1mL, 물 1mL 및 시험용액 8mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 중화반응혼합액에 포자 현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 30분간 반응킨 후 1mL씩 취하여 2매의 멸균 페트리접시에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 희석중화 검증법의 포자수(C)를 다. 6) (2) ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 희석중화 검증시험의 포자수(C)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

7) 판정

다음 계산식에 따라 포자수 감소율(%)을 계산하여 포자수 감소율이 99.9%이상일 때 적합한 것으로 본다.

포자수 감소율(%) ＝	N - 10Na	×	100
	N

N : 포자 현탁액의 포자수(cfu/mL)

Na : 본시험의 포자수*(cfu/mL)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Nd)는 “3.0×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

라. 기구 및 재료

① 유리비드(glass bead, 직경 3～4mm)

② 교반기(Stirrer), 기계식 교반기(Mixer)

③ 항온수조(Water Bath, 자동온도 조절기능함유, 20±1℃)

④ 원심분리기(Centrifuger)

⑤ 페트리접시(Petridish)

⑥ 시험관(Test Tube, 18×170mm 등)

⑦ 담체(carrier, ø1cm×0.07cm 스테인리스 스틸 디스크 ANSI 304 2B)

⑧ 유리병(바닥 지름 2～3cm, 용량 15～20mL)

⑨ 데시케이터(Desicator)

막여과장치(여과막 지름 : 47～50mm pore size : 0.45㎛, 최소 50mL의 용액을 담을 수 있어야 함, 진공 사용 시 균일한 여과율로 세척액 100mL가 20～40초 사이에 여과될 수 있도록 설계된 장치 사용)

배양병(Roux bottle, 500mL)

광학현미경(Optical microscope)

무균대(Clean bench)

고압멸균기(Autoclave)

건조기(Dry Oven)

배양기(Incubator, 36±1℃와 30±1℃)

냉동 및 냉장고(-70℃ Freezer 포함)

초순수 제조장치(Ultra Pure Water System)

집락계산기(Colony Counter)

수소이온농도측정기(pH meter)

피펫(1mL, 5mL, 10mL 등)

슬라이드/커버 글라스

알콜램프, 백금이, 백금선 등

마. 배지

본 실험을 위한 배지조제시 이미 상품화된 배지의 사용이 가능하며, 사용할 각 제조사별 조제법을 따를 수 있다.

① TSA배지(Tryptone Soya Agar)

Tryptone, pancreatic digest of casein	15.0g
Soya peptone, papaic digest of soybean meal	5.0g
NaCl	5.0g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

② TGB 배지(Tryptone Glucose Broth)

Yeast Extract	2.5g
Tryptone	5.0g
Glucose	1.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

③ MYA배지(Yeast Extract Agar)

Meat Extract	10.0g
Yeast Extract	2.0g
MnSO4·H2O	0.04g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

④ GYA배지(Glucose Yeast Extract Agar)

Amino Acids, acid hydrolysis of casein	1.0g
Soluble Starch	1.0g
Glucose	2.5g
Yeast Extract	2.5g
FeSO4	0.1g
MnSO4·H2O	0.0001g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

바. 시액

① 트립톤생리식염수(Tryptone Sodium Chloride Solution)

Tryptone, pancreatic digest of casein	1.0g
NaCl	8.5g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

② 경수(Hard water)

- 용액 A : 19.84g의 염화마그네슘(MgCl2)과 46.24g의 염화칼슘(CaCl2)을 증류수에 용해하여 1L로 맞춘다. 이 용액은 냉장보관하여 최대 1개월 간 사용할 수 있다.

- 용액 B : 35.02g의 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 증류수로 용해하여 1,000mL로 맞춘다. 이 용액은 냉장보관하여 최대 1주일 간 사용할 수 있다.

1,000mL의 메스플라스크에 용액 A 3.0mL를 넣고 최소 600mL의 증류수를 가해주고, 용액 B 8.0mL를 가해준 후 증류수를 가하여 1,000mL로 한다. 용액의 pH를 7.0±0.2로 조정하고 여과 멸균한다. 이 혼합 용액은 12시간 이내에 사용하여야 한다.

③ 간섭물질(Interfering substance)

0.3g의 알부민(bovine albumin fraction V)을 증류수 100mL에 녹이고 여과 멸균한다. 본 간섭물질이 시험용액과 반응하여 침전이 발생할 경우에는 적절한 다른 간섭물질을 사용하여 실험할 수 있으며, 이때 사용한 간섭물질은 본 간섭물질과 동일한 간섭효과를 가져야 한다.

④ 중화제(Neutralizer)

레시틴(lecithin)	3g
폴리소르베이트 80(polysorbate 80)	30g
치오설페이트염(sodium thiosulfate)	5g
히스티딘(L-histidine)	1g
사포닌(saponine)	30g

위의 성분을 트립톤생리식염수를 가하여 1,000mL로 하고 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 본 중화제 이외에 검증시험에서 유효성이 검증된 다른 중화제를 사용할 수도 있다.

[별표 1] 제 5. 6. 라.를 아래와 같이 신설한다.

라. 가공보조제로 지정받은 식품첨가물을 가공보조제 이외의 용도로 신청하고자 하는 경우에는 기존에 제출하지 않았던 독성시험에 관한 자료(생식‧발생독성시험, 면역독성시험, 만성‧발암성시험 자료), 체내 동태에 관한 자료, 1일 섭취량에 관한 자료를 제출하여야 한다.

부칙<제2019-  호, 2019. . >

제1조(시행일) ① 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

② 제1조제1항에도 불구하고 다음 각호의 구분에 따른 개정규정은 다음 각호에서 정한 날부터 시행한다.

1. II. 1. 5)의 아산화질소 제조기준 : 고시한 날부터 1년 후

2. II. 5. 가. 및 다.의 영·유아용 이유식 관련 사항 : 2020년 1월 1일

제2조(검사중인 사항에 관한 경과조치) ① 이 고시 시행 당시 종전의 고시에 따라 검사가 진행 중인 식품첨가물, 식품, 건강기능식품 또는 축산물(이하 “식품첨가물등”이라 한다)에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 제1항에도 불구하고 2. II. 1. 5)의 개정규정은 이 고시 시행 당시 검사가 진행 중인 사항에 대하여도 적용한다.

제3조(이미 제조된 식품첨가물등에 관한 경과조치) 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 이미 제조·가공·소분·수입(선적일 기준)한 식품첨가물등은 이 고시 시행 이후에도(유통기한이 있는 경우에는 그 유통기한까지 한함) 판매할 수 있으며, 위 식품첨가물등을 이용하여 제조·가공한 식품첨가물등에 대하여도 해당 제품의 유통기한까지 판매할 수 있다. 다만, 2. II. 1. 5)의 개정규정을 적용하는 아산화질소의 경우에는 그러하지 아니한다.

현    행

개 정 (안)

II. 식품첨가물 및 혼합제제류

1. 제조기준

1) ∼ 4) (생  략)

<신  설>

II. 식품첨가물 및 혼합제제류

1. 제조기준

1) ∼ 4) (현행과 같음)

5) 가스 형태의 식품첨가물

아산화질소는 내용량 2.5L 이상의 고압금속제 용기에만 충전하여야 한다.

2. 일반사용기준

1) ∼ 3)  (생  략)

<신  설>

4) ∼ 5) (생  략)

2. 일반사용기준

1) ∼ 3)  (현행과 같음)

4) 식용을 목적으로 하는 미생물 등의 배양에 사용하는 식품첨가물은 이 고시에 정하고 있는 품목 또는 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서 미생물 영양원으로 등재된 것으로 최종식품에 잔류하여서는 아니된다. 다만, 불가피하게 잔류할 경우에는 품목별 사용기준에 적합하여야 한다.

5) ∼ 6) (현행 4)～5)와 같음)

4. 품목별 성분규격

가. 식품첨가물

L-글루탐산

L-Glutamic Acid

함    량  (생  략)

성    상  (생  략)

확인시험  (생  략)

순도시험  (1)∼(3) (생  략)

(4) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 1g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, 피롤리돈카복실산(pyrrolidone carboxylic acid) 1g을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 1μL 씩을 미리 박층크로마토그래피용 실리카겔을 사용하여 조제한 박층판에 점적한 후 n-부탄올․빙초산․물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 80℃에서 30분간 건조시킨다. 이에 발색시액을 분무하고 80℃에서 10분간 가열하여 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피롤리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

발색시액 : 닌히드린 1g 및 초산 3mL에 n-부탄올을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (생  략)

강열잔류물  (생  략)

정량법  (생  략)

4. 품목별 성분규격

가. 식품첨가물

L-글루탐산

L-Glutamic Acid

함    량  (현행과 같음)

성    상  (현행과 같음)

확인시험  (현행과 같음)

순도시험  (1)∼(3) (현행과 같음)

(4) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (현행과 같음)

강열잔류물  (현행과 같음)

정량법  (현행과 같음)

L-글루탐산암모늄

Monoammonium L-Glutamate

함    량  (생  략)

성    상  (생  략)

확인시험  (생  략)

순도시험  (1)∼(2) (생  략)

(3) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 1g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, 피롤리돈카복실산(pyrrolidone carboxylic acid) 1g을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 1μL 씩을 미리 박층크로마토그래피용 실리카겔을 사용하여 조제한 박층판에 점적한 후 n-부탄올․빙초산․물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 80℃에서 30분간 건조시킨다. 이에 발색시액을 분무하고 80℃에서 10분간 가열하여 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피롤리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

발색시액 : 닌히드린 1g 및 초산 3mL에 n-부탄올을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (생  략)

강열잔류물  (생  략)

정량법  (생  략)

L-글루탐산암모늄

Monoammonium L-Glutamate

함    량  (현행과 같음)

성    상  (현행과 같음)

확인시험  (현행과 같음)

순도시험  (1)∼(2) (현행과 같음)

(3) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (현행과 같음)

강열잔류물  (현행과 같음)

정량법  (현행과 같음)

L-글루탐산칼륨

Monopotassium L-Glutamate

함    량  (생  략)

성    상  (생  략)

확인시험  (생  략)

순도시험  (1)∼(4) (생  략)

(5) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 1g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, 피롤리돈카복실산(pyrrolidone carboxylic acid) 1g을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 1μL 씩을 미리 박층크로마토그래피용 실리카겔을 사용하여 조제한 박층판에 점적한 후 n-부탄올․빙초산․물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 80℃에서 30분간 건조시킨다. 이에 발색시액을 분무하고 80℃에서 10분간 가열하여 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피롤리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

발색시액 : 닌히드린 1g 및 초산 3mL에 n-부탄올을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (생  략)

강열잔류물  (생  략)

정량법  (생  략)

L-글루탐산칼륨

Monopotassium L-Glutamate

함    량  (현행과 같음)

성    상  (현행과 같음)

확인시험  (현행과 같음)

순도시험  (1)∼(4) (현행과 같음)

(5) 피롤리돈카복실산 : 이 품목 0.5g을 달아 물 100mL에 녹인 액을 시험용액으로 한다. 따로, L-글루타민산나트륨 0.5g과 피롤리돈카복실산 2.5mg을 달아 물에 녹인 액을 대조액으로 한다. 시험용액 및 대조액 2μL씩을 실리카겔 박층판에 점적한 후 n-부탄올·빙초산·물의 혼액(2 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개하고 박층판을 상온에서 30분간 건조시킨다. 차아염소산나트륨이 3g이 들어있는 50mL 비이커를 전개조 안에 넣고 염소가스를 발생시키기 위해 염산 1mL를 천천히 가한 후 뚜껑을 닫고 30초간 방치한다. 이 전개조에 상기 건조된 박층판을 넣고 뚜껑을 닫은 후 20분간 방치한다. 박층판을 꺼내어 상온에서 10분간 놓아 둔 후 에탄올을 균일하게 분무한다. 상온에서 건조 후 요오드칼륨전분시액을 균일하게 분무한 다음 자연광 하에서 발색된 반점을 관찰할 때, 시험용액에서는 대조액과 같은 위치에 피로리돈카복실산 반점이 나타나서는 아니 된다.

요오드칼륨전분시액 : 전분 0.5g을 달아 물 약 50mL를 가한 다음 열을 가하면서 젤화 될 때까지 젖는다. 식힌 후 요오드칼륨 0.5g을 달아 물을 가하여 100mL로 한다.

건조감량  (현행과 같음)

강열잔류물  (현행과 같음)

정량법  (현행과 같음)

비타민B12

Cyanocobalamin

정    의  (생  략)

함    량  (생  략)

성    상  (생  략)

확인시험  (생  략)

순도시험  유사비타민B12 : 이 품목 1mg을 물 20mL에 녹여 작은 분액깔대기에 옮기고 사염화탄소와 m-크레솔의 같은 양의 혼액 4mL를 넣어 약 1분간 잘 흔들어 섞고 조용히 방치한 다음 아랫층을 다른 분액깔대기에 옮겨 황산(1→7) 5mL를 가하여 심하게 흔들어 섞고 필요하면 원심분리하여 두 액층으로 분리할 때 분리된 윗층은 색이 없거나 또는 0.1N 과망간산칼륨용액 0.15mL와 물 250mL의 혼액의 색보다 진하여서는 아니 된다.

건조감량  (생  략)

정 량 법  (생  략)

비타민B12

Cyanocobalamin

정    의  (현행과 같음)

함    량  (현행과 같음)

성    상  (현행과 같음)

확인시험  (현행과 같음)

순도시험  ------------------- ---------------------------------------------- 클로로포름과 ---------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

건조감량  (현행과 같음)

정 량 법  (현행과 같음)

수용성안나토

Annatto, Water-Soluble

정    의  (생  략)

함    량  이 품목은 노르빅신(C24H28O4 ＝ 380.49)으로서, 표시량의 100.0～125.0%를 함유한다.

성    상  (생  략)

확인시험  (1) 이 품목을 0.1N 수산화나트륨용액으로 희석하여 그 농도를 증크롬산칼륨용액(1→1,000)의 색깔과 거의 같은 정도로 조정하고 그 50mL를 취하여 묽은황산 2mL를 가하여 섞은 다음 벤젠 10mL를 가하여 강하게 흔들어 섞어 추출한다. 이 벤젠추출액을 물 5mL씩으로 세 번 씻어 이를 시험용액으로 하여 다음의 시험을 한다.

(가) 시험용액 5mL를 취하여 0.01N 수산화나트륨용액 5mL씩을 사용하여 0.01N 수산화나트륨용액이 착색하지 아니할 때까지 추출한다. 그 추출된 용액을 모두 합하고 이에 0.01N 수산화나트륨용액을 가하여 50mL로 한다. 이 액은 파장 454±2nm 및 482±2nm에 극대흡수부가 있다.

(나) 벤젠에 현탁한 비타민A 측정용알루미나를 높이 약 5cm의 알루미나층으로 하고 알루미나층이 항상 벤젠 10mL에 잠겨 있도록 흡착관을 만든다. 이 알루미나층의 상부에 여과지의 소편을 끼우고 이에 벤젠 10mL를 넣어 벤젠이 1분간에 약 30방울을 떨어지는 속도로 조정하고 벤젠의 액면이 알루미나층의 상면으로부터 약 1cm가 되었을 때, 시험용액 3mL를 흡착관에 넣는다. 시험용액의 액면이 알루미나층의 상부에 약간 남아 있는 동안에 클로로포름 5mL를 가한다. 다시 같은 조작으로 클로로포름 5mL씩을 2회 가한다. 이어 삼염화안티몬시액 2mL를 가할 때, 알루미나층의 상부의 흡착대의 황등색은 천천히 청록색으로 변한다.

(2) (생  략)

순도시험

(1) 흡광비 : 확인시험의 (1)의 (가)와 같은 방법으로 조작하여 482±2nm에서의 흡광도와 454±2nm에서의 흡광도를 측정할 때, 그 비는 1.18±0.07이어야 한다.

(2) ∼ (6)  (생  략)

정 량 법  이 품목 0.1～1g을 정밀히 달아 0.01N 수산화나트륨용액을 가하여 100mL로 하여 잘 섞는다. 그 1mL를 분액깔대기에 취하고, 염화나트륨용액(1→10) 10mL를 가하여 다시 물을 가하여 50mL로 한 다음, 묽은황산 2mL를 가하여 잘 섞는다. 이어서 벤젠 10mL씩을 사용하여 벤젠추출액이 착색하지 아니할 때까지 계속하여 추출한다. 벤젠추출액을 합하여 이를 물 5mL씩으로 3회 씻고 잠시 정치하여 물층을 완전히 제거한 다음 벤젠추출액을 다른 분액깔대기에 옮기고 먼저의 분액깔대기는 벤젠 2mL씩으로 3회 씻어 씻은 액을 벤젠추출액에 합친다. 이 벤젠추출액에 같은 양의 석유벤진을 가하여 섞은 다음 0.01N 수산화나트륨용액 5mL씩으로 0.01N 수산화나트륨용액이 착색하지 아니할 때까지 계속 추출하여 추출액을 합치고 0.01N 수산화나트륨용액을 가하여 100mL로 한다. 이 액의 파장 454nm에서의 흡광도 A를 측정하고, 다음 계산식에 따라 노르빅신의 함량을 구한다.

함 량(%) ＝	A	×	100,000	× 100
	3,473		검체의 채취량(mg)

수용성안나토

Annatto, Water-Soluble

정    의  (현행과 같음)

함    량  이 품목은 노르빅신(C24H28O4 ＝ 380.48)으로서, 표시량의 95～120%를 함유한다.

성    상  (현행과 같음)

확인시험  (1) 이 품목 1g을 물 40mL에 녹이고 황산(1→20) 4mL를 넣어 흔들어 섞은 후 여과한다. 여지상의 잔류물을 물 40mL씩으로 세 번 씻어 이를 시험용액으로 하여 다음의 시험을 한다.

(가) 잔류물의 일부에 수산화나트륨 용액(1→2,500)을 가하여 녹인 액은 파장 452～456nm 및 480～484nm 부근에 흡수를 확인한다.

(나) 잔류물의 일부를 에탄올 10mL에 녹이고, 그 중 한방울을 여지상에 점적한 후 바람에 말린 다음 아질산나트륨용액(1→20) 2～3방울을 떨어뜨린 후 계속하여 0.5mol/L 황산 2～3방울을 떨어뜨릴 때, 여지상의 노란색은 탈색된다.

(2) (현행과 같음)

순도시험

<삭   제>

(1) ∼ (5)  (현행 (2)∼(6)과 같음)

정 량 법  측정하는 흡광도가 0.3∼0.7의 범위가 되도록 이 품목 0.3～0.5g을 정밀히 달아, 수산화칼륨 용액(1→200)을 가하여 녹인 후 정확히 100mL로 한다. 이 액 1mL를 정확하게 취한 후 수산화칼륨 용액(1→200)을 넣어 정확하게 100mL로 하여 검액으로 한다. 수산화칼륨 용액(1→200)을 대조로 파장 476∼484nm의 극대흡수부에서 흡광도 A를 측정하여 다음 식에 따라 노르빅신의 함량을 구한다.

함 량(%) ＝	A	×	100	× 100
	2,870		검체의 채취량(g)

천연향료

Synthetic Flavoring Substances

정    의  (생  략)

순도시험  (생  략)

순번	일반명	기원물질명
2	(생 략)	장미과 벚나무(Prunus amygdalus Batsch., Prunusarmeniaca L., or Prunus persica(L.)Batsch.)
3	(생 략)	Physeter macrocephalus L.
8	(생 략)	Roccella fuciformis Ach
17	(생 략)	Melissa officinalis L.
18	(생 략)	Myroxylon pereirae Klotzsch.
21	(생 략)	Pimenta racemosa(Mill.) J. W. Moore.
23	(생 략)	운향과 귤(Citrus aurantium L. subsp. beramia Wright et Arn.)
25	(생 략)	Aniba rosaeodora Ducke.
28	(생 략)	박과 브리오니아(Bryonia alba L., or B. diocia Jacq)
32	(생 략)	Melaleuca leucadendron L. and other Melaleuca spp.
38	(생 략)	Carum carvi L.
39	(생 략)	Elettaria cardamomum Maton.
44	(생 략)	녹나무과 녹나무(Cinnamomum burmanni Blume.)
47	(생 략)	Castor fiber L. and C. canadensis Kuhl.
69	(생 략)	Civet cats, Viverra civetta Schreber and Viverra zibetha Schreber.
74	(생 략)	Ethyl oenanthata, so-called.
76	(생 략)	South American spp. of Copaifera L.
81	(생 략)	Cuminum cyminum L.
102	(생 략)	Trigonella foenum-graecum L.
109	(생 략)	Spartium junceum L.
119	(생 략)	남가새과 구아이아쿰(Guaiacum officinale L., G. santum L., Bulnesia sarmienti Lor.)
123	(생 략)	Tsuga canadensis(L.) Carr. or T. heterophylla(Raf.) Sarg
129	(생 략)	Hyssopus officinalis L.
130	(생 략)	Cetraria islandica Ach
131	(생 략)	국화과 밀짚꽃(Helichrysum augustifolium DC.)
139	Laverder, spike	(생 략)
140	(생 략)	꿀풀과 라반둘라(Hybrids between Lavandula officinalis Chaix and Lavandula latifolin Vill.)
147	(생 략)	피나무과 피나무(Tillia spp.)
148	(생 략)	Ceratonia siliqua L.
149	(생 략)	Levisticum officinale Koch
150	(생 략)	Sticta pulmonacea Ach.
156	(생 략)	Majorana hortensis Moench.
160	(생 략)	콩과 아카시아(Acadia decurrens Willd. var. dealbata)
161	(생 략)	Saccarum officinarum L
163	(생 략)	Musk deer, Moschus moschiferus L.
166	(생 략)	Myrtus communis L.
170	(생 략)	Boswellia carteri Birdw. and other Boswellia spp.
172	(생 략)	Opopanax chironium Koch (true opopanax) of Commiphora erythraea Engl. var. Llabrescens
183	(생 략)	Petroselinum crispum(Mill.) Mansf.
189	(생 략)	Hedeoma pulegioides(L.) Pers
194	(생 략)	Myroxylon pereirae klotzsch.
198	(생 략)	Pimenta officinalis Lindl.
199	(생 략)	Pimenta officinalis Lindl.
209	(생 략)	Aspidosperma quebracho-blanco Schlecht, or (Quebrachia lorentzii(Griseb)).
212	(생 략)	Pterocarpus san alinus L.
221	(생 략)	쥐손이풀과 펠르고니움(Pelargonium graveolens L'Hdr.)
227	(생 략)	꿀풀과 단삼(Salvia lavandulaefolia Vahl.)
228	(생 략)	Ceratonia siliqua L.
231	(생 략)	Tetraclinis articulata(Vahl.), Mast
232	(생 략)	청미래덩굴과 청미래덩굴(Smilax aristolochiaefolia Mill., (Mexican sarsaparilla), S. regelii Killip et Morton(Honduras sarsaparilla), S. febrifuga Kunth(Ecuadorean sarsaparilla), or undetermined Smilax spp.(Ecuadorean or Central Americal sarsaparilla).)
238	(생 략)	Simaruba amara Aubl
245	(생 략)	Tamarindus indica L.
249	(생 략)	Onicus benedictus L.
250	(생 략)	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L. and Thymus zygis var. gracils Boiss.)
251	(생 략)	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L. and Thymus zygis var. gracils Boiss.)
253	(생 략)	Polianthes tuberosa L.
254	(생 략)	Myroxylon balsamum (L.) Harms
272	(생 략)	Pistacia lentiscus LINNE
273	(생 략)	Spilanthes acnella Linné

천연향료

Natural Flavoring Substances

정    의  (현행과 같음)

순도시험  (현행과 같음)

순번	일반명	기원물질명
2	(현행과 같음)	장미과 벚나무(Prunus amygdalus Batsch., Prunus armeniaca L., Prunus persica(L.) Batsch.)
3	(현행과 같음)	향고래과 향유고래(Physeter macrocephalus L.)
8	(현행과 같음)	로셀라과 로셀라 푸시포르미스 지의류(Roccella fuciformis Ach)
17	(현행과 같음)	꿀풀과 레몬밤(Melissa officinalis L.)
18	(현행과 같음)	콩과 페루발삼(Myroxylon pereirae Klotzsch.)
21	(현행과 같음)	도금양과 서인도베이오일(Pimenta racemosa(Mill.) J. W. Moore.)
23	(현행과 같음)	운향과 귤(Citrus aurantium L. subsp. bergamia Wright et Arn.)
25	(현행과 같음)	녹나무과 브라질장미목(Aniba rosaeodora Ducke.)
28	(현행과 같음)	박과 브리오니아(Bryonia alba L., B. dioca Jacq)
32	(현행과 같음)	도금양과 흰멜라루카(Melaleuca leucadendron L., other Melaleuca spp.)
38	(현행과 같음)	산형과 캐러웨이(Carum carvi L.)
39	(현행과 같음)	생강과 소두구(Elettaria cardamomum Maton.)
44	(현행과 같음)	녹나무과 녹나무(Cinnamomum burmannii Blume.)
47	(현행과 같음)	비버과 유럽비버 또는 아메리카비버(Castor fiber L., C. canadensis Kuhl.)
69	(현행과 같음)	사향고양이과 아프리카사향고양이 또는 큰인도사향고양이(Civet cats: Viverra civetta Schreber, Viverra zibetha Schreber.)
74	(현행과 같음)	포도과 포도(Ethyl oenanthata, so-called)
76	(현행과 같음)	콩과 남미 코파이페라속(South American spp. of Copaifera L.)
81	(현행과 같음)	산형과 쿠민(Cuminum cyminum L.)
102	(현행과 같음)	콩과 호로파(Trigonella foenum-graecum L.)
109	(현행과 같음)	콩과 스페인 빗자루꽃(Spartium junceum L.)
119	(현행과 같음)	남가새과 구아이아쿰(Guaiacum officinale L., G. sanctum L., Bulnesia sarmienti Lor.)
123	(현행과 같음)	북미산 캐나다솔송나무 또는 북미솔송나무(Tsuga canadensis(L.) Carr., T. heterophylla(Raf.) Sarg)
129	(현행과 같음)	꿀풀과 히숍(Hyssopus officinalis L.)
130	(현행과 같음)	당초무늬지의과 갈퀴지의(Cetraria islandica Ach)
131	(현행과 같음)	국화과 밀짚꽃(Helichrysum angustifolium DC.)
139	Lavender, spike	(현행과 같음)
140	(현행과 같음)	꿀풀과 라반둘라(Hybrids between Lavandula officinalis Chaix and Lavandula latifolia Vill.)
147	(현행과 같음)	피나무과 피나무(Tilia spp.)
148	(현행과 같음)	콩과 캐롭(Ceratonia siliqua L.)
149	(현행과 같음)	산형과 로바지(Levisticum officinale Koch)
150	(현행과 같음)	투구지의과 갑옷이끼(분말투구지의)(Sticta pulmonacea Ach.)
156	(현행과 같음)	꿀풀과 오래가눔 마조라나(Majorana hortensis Moench.)
160	(현행과 같음)	콩과 아카시아(Acacia decurrens Willd. var. dealbata)
161	(현행과 같음)	화본과 사탕수수(Saccharum officinarum L.)
163	(현행과 같음)	사향노루과 시베리아사향노루(Musk deer, Moschus moschiferus L.)
166	(현행과 같음)	도금양과 도금양(Myrtus communis L.)
170	(현행과 같음)	감람과 유향속(Boswellia carteri Birdw., other Boswellia spp.)
172	(현행과 같음)	산형과 오포파낙스 치로니쿰(Opopanax chironium Koch (true opopanax) of Commiphora erythraea Engl. var. Glabrescens)
183	(현행과 같음)	산형과 파슬리(Petroselinum crispum(Mill.) Mansf.)
189	(현행과 같음)	꿀풀과 북미페니로얄초(Hedeoma pulegioides(L.) Pers)
194	(현행과 같음)	콩과 페루발삼(Myroxylon pereirae Klotzsch.)
198	(현행과 같음)	도금양과 올스파이스(Pimenta officinalis Lindl.)
199	(현행과 같음)	도금양과 올스파이스(Pimenta officinalis Lindl.)
209	(현행과 같음)	협죽도과 퀘브라초(Aspidosperma quebracho-blanco Schlecht, Quebrachia lorentzii(Griseb))
212	(현행과 같음)	콩과 자단목(Pterocarpus santalinus L.)
221	(현행과 같음)	쥐손이풀과 펠르고니움(Pelargonium graveolens L'Her.)
227	(현행과 같음)	꿀풀과 단삼(Salvia lavandulifolia Vahl.)
228	(현행과 같음)	콩과 캐롭(Ceratonia siliqua L.)
231	(현행과 같음)	측백나무과 산다락(Tetraclinis articulata(Vahl.), Mast)
232	(현행과 같음)	청미래덩굴과 청미래덩굴(Smilax aristolochiaefolia Mill., (Mexican sarsaparilla), S. regelii Killip et Morton(Honduras sarsaparilla), S. febrifuga Kunth(Ecuadorean sarsaparilla), undetermined Smilax spp.(Ecuadorian or Central Americal sarsaparilla).)
238	(현행과 같음)	소태나무과 시마루바나무(Simarouba amara Aubl)
245	(현행과 같음)	콩과 타마린(Tamarindus indica L.)
249	(현행과 같음)	국화과 홀리티슬(Cnicus benedictus L.)
250	(현행과 같음)	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L., Thymus zygis var. gracilis Boiss.)
251	(현행과 같음)	꿀풀과 백리향(Thymus vulgaris L., Thymus zygis var. gracilis Boiss.)
253	(현행과 같음)	빗자루과 튜베로즈(Polianthes tuberosa L.)
254	(현행과 같음)	콩과 토루발삼(Myroxylon balsamum (L.) Harms)
272	(현행과 같음)	옻나무과 유향나무(Pistacia lentiscus LINNE)
273	(현행과 같음)	국화과 아크멜라(Spilanthes acmella Linné)

가. 혼합제제류

보존료제제

정    의  (생  략)

함    량  (생  략)

확인시험  (생  략)

1) 안식향산, 데히드로초산, 소브산 및 파라옥시안식향산에스테르류

(1) 박층크로마토그래피에 의한 확인

시험용액의 조제 : 정량법 1) 시험용액의 조제에 따라 얻어진 에테르를 날려보낸 후 잔류물에 0.1% 아세트아닐라이드아세톤용액 대신 에탄올 소량(1～2mL)을 가하여 녹인 액을 시험용액으로 한다.

박층판의 조제 : 폴리아미드(박층크로마토그래피용)에 이소프로필알콜(20 : 75)을 가하여 잘 흔들어 호상으로 하여 0.25mm 두께로 박층을 만들어 이를 풍건하여 60～70℃에서 30분간 건조한 것을 사용한다.

시험조작 : 박층판의 하단에서 약 1cm 위치에 시험용액 및 각 보존료표준용액을 0.2～1μL를 약 2cm 간격으로 점적한 다음 전개용용매 1～3을 사용하여 전개 후 풍건하여 자외선등(2,533°의 조사선) 아래서 반점을 관찰하거나 발색시액 1～3을 선택하여 분무한 후 발색된 반점을 비교 관찰하여 확인한다. 발색시액 3을 사용한 경우에는 10% 수산화나트륨용액을 분무하여 정색시켜 비교한다.

시  액

보존료표준용액 : 안식향산 및 데히드로초산 표준품은 각각 10mg을 아세톤 1mL씩에 녹이고 소브산 및 파라옥시안식향산에스테르류는 각각 10mg을 아세톤 5mL씩에 녹인 액을 각 보존료표준용액으로 한다.

전개용용매 : 1. 헥산․초산(20 : 0.7)

2. 벤젠․초산(20 : 0.5)

3. 벤젠․메탄올․초산(20：0.2：0.5) 또는 (20：0.5：0.3)

발색시액：1. 2% 황산제이철용액

2. 0.1% 브로모크레솔그린에탄올용액

3. 디아조화설파닐산용액 : 설파닐산 1g에 염산 3mL를 가하고 가열하여 용해시킨 후 물 100mL를 가한다. 여기에 동량의 0.7% 아질산나트륨용액을 가한다.

가. 혼합제제류

보존료제제

정    의  (현행과 같음)

함    량  (현행과 같음)

확인시험  (현행과 같음)

1) 안식향산, 데히드로초산, 소브산 및 파라옥시안식향산에스테르류

(1) 박층크로마토그래피에 의한 확인

시험용액의 조제 : 정량법 1) 시험용액의 조제에 따라 얻어진 에테르를 날려보낸 후 잔류물에 0.1% 아세트아닐라이드아세톤용액 대신 에탄올 소량(1～2mL)을 가하여 녹인 액을 시험용액으로 한다.

박층판 : 박층크로마토그래피용 실리카겔(파라옥시안식향산에스테르류는 Silica gel 60 RP-18 F254S 또는 이와 동등한 것, 안식향산, 데히드로초산, 소브산은 Silica gel 60 kieselguhr F254 또는 이와 동등한 것)을 사용한다.

시험조작 : 박층판의 하단에서 약 1.5cm 위치에 시험용액 및 각 보존료 표준용액을 20μL를 약 2cm 간격으로 점적한 다음 각 전개용매 1, 2를 사용하여 전개 후 건조하고 자외선등(254nm) 아래서 반점을 비교관찰한다.

시  액

보존료표준용액 : 안식향산 및 데히드로초산 표준품은 각각 10mg을 아세톤 1mL씩에 녹이고 소브산 및 파라옥시안식향산에스테르류는 각각 10mg을 아세톤 5mL씩에 녹인 액을 각 보존료표준용액으로 한다.

전개용 용매 :

1. 파라옥시안식향산에스테르류 :

아세톤․물(60 : 40, v/v)

2. 안식향산, 데히드로초산, 소브산 : 자일렌․메탄올․초산(20 : 0.5 : 0.3, v/v/v)

5. 품목별 사용기준

가. 식품첨가물

아래의 식품첨가물은 해당 품목별 사용기준에 따라 사용하여야 한다. 다만, 따로 사용량이 정하여지지 아니한 것은 이 고시의 II. 2. 1)의 규정에 따라 사용하여야 한다.

품목명	사용기준	주용도
글루콘산동	글루콘산동은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 1. (생 략) 2. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식 3. ∼ 5. (생 략)	(생 략)
글루콘산망간	글루콘산망간은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 1. ∼ 8. (생 략) 9. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 10. (생 략)	(생 략)
글루콘산아연	글루콘산아연은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 1. ∼ 2. (생 략) 3. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식 4. ∼ 6. (생 략)	(생 략)
글루콘산철	글루콘산철은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 다만, 올리브가공품에 한하여 글루콘산철의 사용량은 철로서 1. (생 략) 2. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 3. (생 략)	(생 략)
비타민K1	비타민K1은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 1. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식 2. ∼ 3. (생 략)	(생 략)
수산화칼륨	수산화칼륨은 최종식품 완성 전에 제거하여야 한다.	(생 략)
5'-시티딜산	5'-시티딜산은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 5'-시티딜산의 사용량은 1. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 : 0.125g/kg 이하	(생 략)
5'-시티딜산이나트륨	5'-시티딜산이나트륨은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 5'-시티딜산이나트륨의 사용량은 1. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 : 0.142g/kg 이하	(생 략)
5'-아데닐산	5'-아데닐산은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 5'-아데닐산의 사용량은 1. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 : 0.075g/kg 이하	(생 략)
5'-우리딜산이나트륨	5'-우리딜산이나트륨은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 5'-우리딜산이나트륨의 사용량은 1. 조제유류, 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영·유아용 특수조제식품 : 0.099g/kg 이하 2. (생 략)	(생 략)
황산동	황산동은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 다만, 포도주의 경우 황산동의 사용량은 동으로서 아래의 기준이상 남지 아니하도록 사용하여야 한다. 1. ∼ 2. (생 략) 3. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식 4. ∼ 6. (생 략)	(생 략)
황산아연	황산아연은 아래의 식품에 한하여 사용하여야 한다. 1. (생 략) 2. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식 3. ∼ 5. (생 략)	(생 략)

5. 품목별 사용기준

가. 식품첨가물

----------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------.

품목명	사용기준	주용도
글루콘산동	------------------------------------------ 1. (현행과 같음) 2. ------------------ ------------------영․유아용 이유식 3. ∼ 5. (현행과 같음)	(현행과 같음)
글루콘산망간	------------------------------------------ 1. ∼ 8. (현행과 같음) 9. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, -- ----------------------------------------------------- 10. (현행과 같음)	(현행과 같음)
글루콘산아연	------------------------------------------ 1. ∼ 2. (현행과 같음) 3. ------------------ ------------------영․유아용 이유식 4. ∼ 6. (현행과 같음)	(현행과 같음)
글루콘산철	--------------------------------------------------------------------------------------- 1. (현행과 같음) 2. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, -- ----------------------------------------------------- 3. (현행과 같음)	(현행과 같음)
비타민K1	-----------------------------------------. 1. ------------------ ------------------영․유아용 이유식 2. ∼ 3. (현행과 같음)	(현행과 같음)
수산화칼륨	---------------------------- 중화 또는 제거하여야 --.	(현행과 같음)
5'-시티딜산	------------------------------------------------------------ 1. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, ------------------------------------------- : -------	(현행과 같음)
5'-시티딜산이나트륨	---------------------------------------------------------------------------- 1. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, ------------------------------------------- : -------	(현행과 같음)
5'-아데닐산	------------------------------------------------------------ 1. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, ------------------------------------------- : -------	(현행과 같음)
5'-우리딜산이나트륨	------------------------------------------------------------------------ 1. ------------------ ------------------영․유아용 이유식, ------------------------------------------- : ------- 2. (현행과 같음)	(현행과 같음)
황산동	--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. 1. ∼ 2. (현행과 같음) 3. ------------------ ------------------영․유아용 이유식 4. ∼ 6. (현행과 같음)	(현행과 같음)
황산아연	----------------------------------------. 1. (현행과 같음) 2. ------------------ ------------------영․유아용 이유식 3. ∼ 5. (현행과 같음)	(현행과 같음)

나. 혼합제제류

(생  략)

다. 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영․유아용 특수조제식품

상기 II. 5. 가.의 사용기준에서 따로 사용대상 식품이 정하여지지 아니한 품목일지라도 조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영․유아용 곡류조제식, 기타 영․유아식, 유단백 알레르기 영‧유아용 조제식품, 영․유아용 특수조제식품(이하 “조제유류 등”이라 한다)에는 다음 각 호의 식품첨가물에 한하여 사용하여야 한다.

(1) (생  략)

주 영양소	식품첨가물명(영문명)
철(Fe)	구연산철(Ferric Citrate)
	구연산철암모늄 (Ferric Ammonium Citrate)
	글루콘산철(Ferrous Gluconate)
	인산철(Ferric Phosphate)*
	전해철(Iron, Electrolytic)
	젖산철(Ferrous Lactate)
	푸마르산제일철 (Ferrous Fumarate)
	피로인산제이철 (Ferric Pyrophosphate)*
	피로인산철나트륨 (Sodium Ferric Pyrophosphate)*
	<신 설>
	환원철(Iron, Reduced)
	황산제일철(Ferrous Sulfate)

(2) (생  략)

식품첨가물명(영문명)	사용기준 (희석하여 섭취하는 제품에 있어서는 희석한 것으로서 적용한다)
구아검 ∼ 변성전분	(생 락)
수산화칼륨 (Potassium Hydroxide)	II. 2. 1)의 규정에 따라 사용하여야 한다.
수산화칼슘 ∼ 프로테아제(식물성)	(생 락)
헴철 (Heme Iron)	II. 2. 1)의 규정에 따라 사용하여야 한다.

나. 혼합제제류

(현행과 같음)

다. ---------------------- --------- 영․유아용 이유식, --------------------- --------------------------------------

-------------------------- -------------------------------------------------------------------------------- 영․유아용 이유식, ------- --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(1) (현행과 같음)

주 영양소	식품첨가물명(영문명)
철(Fe)	구연산철(Ferric Citrate)
	구연산철암모늄 (Ferric Ammonium Citrate)
	글루콘산철(Ferrous Gluconate)
	인산철(Ferric Phosphate)*
	전해철(Iron, Electrolytic)
	젖산철(Ferrous Lactate)
	푸마르산제일철 (Ferrous Fumarate)
	피로인산제이철 (Ferric Pyrophosphate)*
	피로인산철나트륨 (Sodium Ferric Pyrophosphate)*
	헴철(Heme Iron)
	환원철(Iron, Reduced)
	황산제일철(Ferrous Sulfate)

(2) (현행과 같음)

식품첨가물명(영문명)	사용기준 (희석하여 섭취하는 제품에 있어서는 희석한 것으로서 적용한다)
구아검 ∼ 변성전분	(현행과 같음)
수산화칼륨 (Potassium Hydroxide)	최종식품 완성 전에 중화 또는 제거하여야 한다.
수산화칼슘 ∼ 프로테아제(식물성)	(현행과 같음)
<삭 제>	<삭 제>

IV. 일반시험법

37. 살균소독력시험법

분석원리 : 본 시험방법은 기구등의 살균소독제의 살균소독력 유무를 측정하는 방법으로 제1법인 세균현탁액시험법과 제2법인 세균표면시험법 및 제3법인 포자현탁액시험법이 있으며, 별도의 규정이 없는 한 제1법인 세균현탁액시험법으로 측정한다.

살균소독력의 정의 : 기구등의 살균소독제에 대하여 규정된 조건에서 규정된 시험균의 초기균수(cfu/mL)에 대한 생균수(cfu/mL) 감소율(%)을 말한다.

제1법 세균현탁액시험법

본 시험방법에는 희석중화시험법과 막여과법이 있다. 희석중화시험법은 간섭물질이 들어있는 시험균주 현탁액을 시험용액에 첨가하여 20℃에서 5분간 반응시킨 후 미리 검증해 둔 적합한 중화제를 즉시 사용하여 반응을 억제시키고 각 시료중의 생균수를 측정하여 생균수 감소율을 측정하는 방법이다. 막여과법은 중화제 대신에 여과막을 사용하여 반응을 억제시키는 방법으로 적합한 중화제가 없는 경우 사용할 수 있다.

또한, 본 시험을 할 때에는 검증시험을 동시에 수행하여야 한다.

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체 일정량을 취하여 경수를 사용하여 다음과 같이 각각 다른 3가지 농도로 조제한다. 또한 이들 시험용액은 시험 60분전에 제조된 것을 사용하여야 한다.

- 제1액 : 제품에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 희석한 액. 단, 원액을 희석하지 않고 그대로 사용하는 경우에는 원액을 제1액으로 한다.

- 제2액 및 제3액 : 제1액을 2배 및 4배 희석한 액

2) 시험균주

다음의 2가지 시험균주를 표준균주로 사용한다.

- Escherichia coli ATCC 10536 또는 Escherichia coli ATCC 11229

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

다만, 상기 표준균주 외에 다음과 같은 시험균주를 선택하여 추가할 수 있다.

- Bacillus cereus ATCC 21772

- Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969

- Salmonella ctyphimurium ATCC 13311

- Listeria monocytogenes ATCC 19111 (또는 Listeria monocytogenes ATCC 19115)

3) 시험균주의 활성배양

시험균주를 TSA배지에 도말하여 36℃에서 18～24시간 배양한다. 같은 방법으로 2차 배양을 하고 다시 3차 배양을 하며, 2차 배양균 또는 3차 배양균을 활성배양균으로 한다. 다만, 추가 시험균주 중 V. parahaemolyticus의 활성배양을 위해서는 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 10mL에 시험균 10μL를 접종하여 36℃에서 18～24시간 배양한다. 1차 배양이 완료되면 2차 배양 및 3차배양은 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 100mL에 한다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제 : 100mL 삼각플라스크에 희석액(TSCS) 10mL와 유리비드(직경 3～4㎜) 5g을 넣고 백금이를 사용하여 E. coli 활성배양균을 옮긴다. 이때 백금이를 희석액(TSCS)에 담그고 삼각플라스크의 벽면에 문질러 완전히 균괘가 떨어지도록 한 다음 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 유리비드 안쪽의 현탁액을 취하여 다른 시험관으로 옮긴다. 희석액(TSCS)을 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL로 조정하고 20℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 E. coli 시험균주 현탁액으로 한다.

따로 S. aureus 활성배양균을 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 S. aureus 시험균주 현탁액을 조제한다. 다만, 추가 시험균주중 V. parahaemolyticus의 경우에는 상기 3)의 활성배양균을 멸균된 50mL 원심분리관에 넣고 20℃, 5000×g (6,000rpm)에서 5분간 원심분리하여 상등액을 조심스럽게 버린 후, 잔류된 균괘에 희석액(TSCS) 25mL를 첨가하여 10초간 진탕교반기를 이용하여 교반한다. 교반이 완료되면 다시 원심분리하여 상등액을 버린 후, 희석액(TSCS) 2mL를 첨가하여 균괘를 현탁시켜 둔다. 100mL 삼각플라스크에 희석액(TSCS) 10mL와 유리비드 5g을 넣고 미리 준비한 균 현탁액을 첨가하여 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 희석액(TSCS)을 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL가 되도록 조정하고 20℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 시험균주 현탁액으로 한다.

(2) 계수 : 희석액(TSCS)을 사용하여 E. coli 시험균주 현탁액을 10-6～10-7으로 희석한 후 이 액 1mL씩 2매의 페트리접시에 각각 넣고 45℃로 유지한 TSA배지 약 15mL를 무균적으로 분주하여 냉각응고 시킨 후 TSA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 36℃에서 24시간 배양한다. 페트리접시에서 집락수를 세고 페트리접시를 24시간 추가 배양한다. 잘 분리된 집락이 추가로 보이지 않을 때, 페트리접시의 최대 집락수를 세어 E. coli 시험균주 현탁액의 생균수(N)를 다음 계산식에 따라 산정한다.

시험균주 현탁액의 생균수*(cfu/mL) ＝	c
	(n1+0.1n2)d

c  : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n1 : 첫 번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

n2 : 두번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

d : 첫 번째 희석액의 희석배수

* 생균수의 계산은 페트리접시 당 15～300개의 집락을 생성한 페트리접시를 택하여 계산한다. 결과의 신뢰성을 위하여 적어도 2개 이상의 페트리접시를 사용하여야 한다. 만약 2단계의 희석배수에서 모두 유효범위의 결과가 나오면 상기 식에 의하여 생균수를 산정한다. 단, 한 단계의 희석배수에서 유효범위의 결과를 얻었을 경우 생균수는 산술평균으로 계산한다. 계산된 결과는 두 자리 유효숫자를 얻을 때까지 반올림한다. 마지막 숫자가 5미만인 경우, 앞자리 숫자는 조정되지 않는다. 마지막 숫자가 5이상인 경우, 앞자리 숫자에 1을 더한다. 마지막 숫자가 5일 경우는 인접한 자리수가 홀수일 때는 위로 반올림하고, 짝수일 경우는 0으로 처리한다. 두 자리의 유효숫자를 얻을 때까지 이 과정을 반복한다. 생균수는 1.0과 9.9사이의 숫자를 10의 배수로 곱한 방식으로 계산한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁액을 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 S. aureus 시험균주 현탁액의 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주 현탁액의 생균수는 1.5×108 cfu/mL～5×108 cfu/mL이어야 한다.

5) 시험균주 현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제 : E. coli의 생균수가 6×102～3×103 cfu/mL가 되도록 E. coli 시험균주 현탁액을 희석액(TSCS)으로 희석하여 조제한 액을 E. coli 시험균주 현탁희석액으로 한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁액을 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 S. aureus 현탁희석액을 조제한다.

(2) 계수 : E. coli 시험균주 현탁희석액을 희석액(TSCS)으로 10배 희석하고 이 액 1mL씩 2매의 페트리접시에 각각 넣어 상기 4) (2)와 같이 배양한다. 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 E. coli 시험균주 현탁희석액의 생균수(Nv)를 다음 계산식에 따라 산정한다.

본시험 및 검증시험의 생균수*(cfu/mL) ＝	c
	n × d × V

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

d : 희석배수(희석중화시험법과 시험균주 현탁희석액의 경우에는 10-1)

V : 샘플의 부피(희석중화시험법과 그 검증시험 및 시험균주 현탁희석액의 경우에는 1.0mL, 막여과법과 그 검증시험의 경우에는 0.1mL)

따로 S. aureus 현탁 희석액을 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 S. aureus 시험균주 현탁희석액의 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주 현탁희석액의 생균수는 6×102 cfu/mL～3×103 cfu/mL이어야 한다.

6) 시험조작

시험용액, 시험균주 현탁액, 시험균주 현탁희석액, 시액 및 물 등은 항온수조에서 20℃로 유지시킨다.

(1) 희석중화시험법

① 본시험

시험관에 간섭물질 1mL 및 E. coli 시험균주 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20℃항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 물 1mL가 들어있는 시험관에 넣고 20℃항온수조에서 5분간 중화시킨다. 중화완료 후 중화반응액 1mL씩 2매의 페트리접시에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 TSA 배지를 가하여 배양한다. 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수(Na)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁액 및 나머지 시험용액(제2액 및 제3액)에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수를 산정한다. 단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액(제1액)을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 시험균주 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

② 검증시험

Ⓐ 시험조건 검증법

시험관에 간섭물질 1mL와 E. coli 시험균주 현탁희석액 1mL를 넣고 수 초 간 혼합하여 20℃항온수조에서 2분간 방치하고 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 시험조건 검증법에서의 생균수(A)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주의 생균수는 시험균주 현탁희석액 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓑ 중화제 독성 검증법

시험관에 중화제 8mL, 물 1mL 및 E. coli 시험균주 현탁희석액 1mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 TSA 배지를 가하여 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 중화제 독성 검증법의 생균수(B)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 생균수를 산정한다.  이 때, 각 시험균주의 생균수는 시험균주 현탁희석액 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓒ 희석중화 검증법

시험관에 간섭물질 1mL, 희석액(TSCS) 1mL 및 시험용액(제1액) 8mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 액에 E. coli 시험균주 현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20℃항온수조에서 30분간 반응시킨다. 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 TSA 배지를 가하여 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 희석중화 검증법의 생균수(C)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주의 생균수는 중화제 독성시험법에서 산정한 생균수의 0.5배수 이상이어야 한다.

(2) 막여과법

시험용액, 시험균주 현탁액, 시액 및 물 등은 항온수조에서 20℃로 유지시킨다.

① 본시험

시험관에 간섭물질 1mL 및 E. coli 시험균주 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20℃항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮기고 즉시 여과한다. 여과시간은 1분을 초과하지 않도록 한다. 각 막여과장치에 세척액 150～500mL씩 첨가하여 여과하고 추가로 물 50mL씩 첨가하여 여과한다. 여과막은 여과한 쪽을 위로 향하게 하여 TSA배지 표면에 밀착시켜 36℃에서 24시간 배양한다. 이 때, 여과막과 배지 표면 사이에 공기가 들어가지 않도록 주의한다. 페트리접시에서 집락수를 세고 페트리접시를 24시간 추가 배양한다. 잘 분리된 집락이 추가로 보이지 않을 때, 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수(Na)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁액 및 나머지 시험용액(제2액 및 제3액)에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수를 산정한다. 단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액(제1액)을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 시험균주 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

② 검증시험

Ⓐ 시험조건 검증법

상기 6) (2) ①의 E. coli 시험균주 현탁액 1mL 대신에 E. coli 시험균주 현탁희석액 1mL를, 시험용액(제1액) 8mL 대신에 경수 8mL를, 반응혼합액 0.1mL 대신에 반응혼합액 1mL를, 세척액 150 ～500mL 대신에 물 50mL를 사용하여 상기 시험과 동일하게 조작한다. 각 페트리접시의 최대 집락수를 세고 시험조건 검증의 생균수(A)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 시험조건 검증의 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주의 생균수는 시험균주 현탁희석액 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓑ 여과과정 검증법

E. coli 시험균주 현탁희석액 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮기고 즉시 여과한다. 각 여과장치에 물 50mL씩 첨가하여 여과한 후 여과지를 상기 6) (2) ①과 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 여과과정 검증의 생균수(B)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 여과과정 검증의 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주의 생균수는 시험균주 현탁희석액 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓒ 여과방법 검증법

시험관에 간섭물질 1mL, 희석액(TSCS) 1mL 및 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합물에서 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮겨 여과하고 물 150mL～500mL씩 첨가하여 여과한다. 각 여과장치에 세척액 50mL 및 E. coli 시험균주 현탁희석액 0.1mL씩 첨가하여 여과한 후 물 50mL를 추가로 가하여 여과한 다음 여과지를 상기 6) (2) ①과 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 여과방법 검증의 생균수(C)를 상기 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁희석액에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 여과방법 검증의 생균수를 산정한다. 이 때, 각 시험균주의 생균수는 여과과정 검증법에서 산정한 생균수의 0.5배수 이상이어야 한다.

7) 판정

각 시험균과 시험용액 별로 다음 계산식에 따라 생균수 감소율을 각각 계산하여 제1액의 생균수 감소율이 99.999%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	N - 10Na	×	100
	N

Na :  시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/mL)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Na)는 “3×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

제2법 세균표면시험법

본 시험방법은 간섭물질이 들어있는 시험균주 현탁액을 스테인리스 스틸 표면에 도말하여 건조시킨 후 이 막위에 시험용액을 처리하여 20℃에서 5분간 반응시키고 즉시 검증된 적합한 중화제를 사용하여 반응을 억제 시키는 방법으로 각 표면의 생균수를 측정하여 생균수 감소율을 측정하는 방법이다. 다만, 본 시험을 할 때에는 시험용액 대신 희석액을 사용하여 대조시험을 실시하고 검증시험을 동시에 수행하여야 한다.

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체 일정량을 취하여 경수를 사용하여 다음과 같이 각각 다른 3가지 농도로 조제한다. 또한 이들 시험용액은 시험 60분전에 제조된 것을 사용하여야 한다.

제1액 : 제품에 표시된 사용농도로 희석한 액. 단, 원액을 희석하지 않고 그대로 사용하는 경우에는 원액을 제1액으로 한다.

제2액 및 제3액 : 제1액을 2배 및 4배 희석한 액

2) 시험균주

제1법 2)의 2가지 시험균주를 표준균주로 사용하되, 추가균주는 사용하지 않는다.

3) 시험균주의 활성배양

제1법 3)에 따른다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

제1법 4)에 따른다.

5) 시험표면 접종액의 조제

소형시험관에 E. coli 시험균주 현탁액 400μL와 간섭물질 100μL를 첨가하여 1분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 20℃항온수조에서 30분간 방치한 액을 E. coli 시험표면 접종액으로 한다.

따로 S. aureus 시험균주 현탁액에 대해서도 상기 시험조작과 같이 S. aureus 시험표면 접종액을 조제한다.

6) 시험표면의 조제

E. coli 시험표면 접종액 10μL를 담체(carrier, ø1㎝×0.07㎝ 스테인리스 스틸 디스크 ANSI 304 2B) 중앙에 접종하여 36℃로 조절된 가열판 위에서 건조시킨 것을 E. coli 시험표면으로 한다. 따로 S. aureus 시험표면 접종액에 대해서도 상기 시험조작과 같이 S. aureus 시험표면을 조제한다.

7) 시험조작

시험용액, 시액, 기구 등은 20℃로 유지시킨다. 담체와 유리병은 데시케이터에 건조하여 준비한다.

① 본시험

E. coli 시험표면을 멸균된 집게를 사용하여 E. coli 시험표면 접종액의 건조된 표면이 위로 향하게 하여 유리병(바닥 지름 2～3㎝, 용량 15～20mL)에 조심스럽게 넣는다. 유리병안의 E. coli 시험표면 중앙에 시험용액(제1액) 50μL를 첨가하고 20℃에서 5분간 반응시킨 후 중화제 9.95mL와 유리비드 2～3g을 첨가하여 진탕교반기에서 1분간 혼합하고 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액(TSCS) 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 제1법 (2) ①에 따라 배양한다. 상기 실험과정을 준비된 E. coli 시험표면으로 5회 반복한다. 각각 페트리접시의 최대 집락수를 세고 시험용액의 살균소독작용에 의한 생균수(Nd)를 다음 계산식에 따라 산정한다.

본시험 및 검증시험의 생균수(cfu/carrier) ＝	c
	n × d

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

d : 희석배수

따로 희석액(TSCS)을 사용하여 대조시험의 생균수(Nc)를 산정한다. 이 때, 반응혼합액은 희석액(TSCS)으로 10-2, 10-3 및 10-4으로 희석하여 막여과장치로 여과하고 시험표면 반복횟수는 3회로 한다.

S. aureus 시험표면과 나머지 시험용액(제2액 및 제3액)에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 시험용액의 살균소독작용에 의한 생균수를 산정한다. 각 시험균의 대조시험 생균수는 상기 식에 따라 산정할 때 1.5×105 cfu/carrier이상이어야 한다.

② 검증시험

Ⓐ 중화 검증법

유리병에 중화제 9.95mL와 시험용액(제1액) 50μL를 넣고 혼합하여 20℃에서 5분간 정치시킨 후 E. coli 시험표면과 유리비드 2～3g을 첨가한다. 진탕교반기에서 1분간 혼합한 후 반응혼합액을 10-3, 10-4 및 10-5으로 희석하여 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 제1법 (2) ①에 따라 배양한다. 상기 기술된 실험과정을 따로 준비한 E. coli 시험표면으로 2회 반복한다. 각각 페트리접시의 최대 집락수를 세고 중화 검증법 시험의 생균수(B)를 상기 7) ①의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험표면에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 중화 검증법 시험의 생균수를 산정한다. 각 시험균주의 생균수는 1.5×105 cfu/carrier이상이어야 한다.

Ⓑ 중화제 독성 검증법

상기 7) ② Ⓐ의 시험용액(제1액) 대신 희석액(TSCS)을 사용하여 상기 중화 검증법에 따라 시험한다. 각각 페트리접시의 최대 집락수를 세고 중화제 독성 검증법 시험의 생균수(A)를 상기 7) ①의 계산식에 따라 산정한다.

따로 S. aureus 시험표면에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 중화제 독성 검증법 시험의 생균수를 산정한다. 각 시험균주의 생균수는 중화검증법에서 산정한 생균수의 0.5배수 이상～2배수 이하이어야 한다.

8) 판정

각 시험균과 시험용액별로 다음 계산식에 따라 생균수 감소율을 각각 계산하여 제1액의 생균수 감소율이 99.99%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	Nc - Nd	×	100
	Nc

Nc : 대조시험의 생균수(cfu/carrier)

Nd : 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/carrier)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Nd)는 “1.5 ×10 cfu/carrier”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Nd)는 “3×102 cfu/carrier”를 각각 적용한다.

제3법 포자현탁액시험법

본 시험방법에는 희석중화시험법과 막여과법이 있다. 희석중화시험법은 간섭물질이 들어있는 포자 현탁액을 시험용액에 첨가하여 20℃에서 60분간 반응시킨 후 미리 검증해 둔 적합한 중화제를 즉시 사용하여 반응을 억제시키고 각 시료중의 포자수를 측정하여 그 감소율을 측정하는 방법이다. 막여과법은 중화제 대신에 여과막을 사용하여 반응을 억제시키는 방법으로 적합한 중화제가 없는 경우 사용할 수 있다.

또한, 본 시험을 할 때에는 검증시험을 동시에 수행하여야 한다.

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체 일정량을 취하여 경수를 사용하여 다음과 같이 각각 다른 3가지 농도로 조제한다. 또한 이들 시험용액은 시험 60분전에 제조된 것을 사용하여야 한다.

제1액 : 제품에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 희석한 액. 단, 원액을 희석하지 않고 그대로 사용하는 경우에는 원액을 제1액으로 한다.

제2액 및 제3액 : 제1액을 2배 및 4배 희석한 액

2) 시험균주

Bacillus subtilis ATCC 6633을 사용한다.

3) 포자용액의 조제

약 106개의 포자를 보통배지에 접종하고 30℃에서 18～24시간 배양한다. 이 배양액 2～3mL를 황산망간첨가 한천배지를 넣어 굳힌 배양병(Roux bottle)에 접종하여 30℃에서 14일간 배양한다. 멸균유리구슬과 물로 집균하여 10,000rpm에서 20분간 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 다시 물에 부유시켜 세척하는 과정을 3회 반복하고 잔사를 물에 부유시켜 75℃에서 10분간 가열한다. 이 포자용액은 냉장보관 하여 사용하되 장기보관시에는 냉동보관한다.

4) 포자현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제 : 포자액을 물을 사용하여 1.5～5×106 cfu/mL로 조정하고 20℃항온수조에서 방치한 액을 포자현탁액으로 한다. 이 액은 제조 후 2시간 이내에 사용하여야 한다.

(2) 계수 : 물을 사용하여 포자현탁액을 10-4～10-5으로 희석한 후 이 액 1mL씩 2매의 페트리접시에 각각 넣고 45℃로 유지한 보통한천배지를 가하여 제1법 4) (2)에 따라 배양하고 포자현탁액의 포자수(N)를 산정한다. 이 때, 포자현탁액의 포자수는 1.5～5×106 cfu/mL이어야 한다.

5) 포자현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제 : 포자의 수가 6×102～3×103 cfu/mL가 되도록 포자현탁액을 물로 희석하여 조제한 액을 포자현탁 희석액으로 한다.

(2) 계수 : 포자현탁희석액을 물로 10배 희석하고 이 액 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 45℃로 유지한 보통한천배지를 가하여 제1법 4) (2)와 같이 배양한다. 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 포자현탁희석액의 포자수(Nv)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자현탁희석액의 포자수는 6×102 cfu/mL～3×103 cfu/mL이어야 한다.

6) 시험조작

다음의 접촉온도(θ) 및 접촉시간(t)을 사용한다.

- 접촉온도(θ) : 20℃

- 접촉시간(t) : 60분

다만, 상기 조건외에 다음과 같은 조건을 선택하여 추가할 수 있다.

- 접촉온도(θ) : 4℃, 10℃, 40℃또는 75℃등

- 접촉시간(t) : 5분, 15분 또는 30분 등

시험전 모든 시약은 다음의 온도에서 유지되어야 한다.

- 접촉온도(θ)가 40℃이하인 경우 : 시험용액, 포자현탁액, 간섭물질은 항온수조에서 θ℃로, 중화제 및 물은 20℃로 유지시킨다.

- 접촉온도(θ)가 40℃를 초과하는 경우 : 시험용액은 θ℃로, 중화제, 포자현탁액, 간섭물질, 물은 20℃로 유지시킨다.

(1) 희석중화시험법

① 본시험

시험관에 간섭물질 1mL 및 포자현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 θ℃항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 θ℃항온수조에서 t분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 물 1mL가  들어있는 시험관에 넣고 20℃항온수조에서 5분간 중화시킨다. 중화완료 후 중화반응액 1mL씩 2매의 페트리접시에 각각 넣고 보통한천배지를 가하여 제1법 4) (2)와 같이 배양한다. 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 시험용액의 멸균 작용에 의한 포자수(Na)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

따로 나머지 시험용액(제2액 및 제3액)에 대해서도 상기 시험조작과 동일하게 조작하여 시험용액의 멸균 작용에 의한 포자수를 산정한다. 단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액(제1액)을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 포자 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

② 검증시험

Ⓐ 시험조건 검증법

시험관에 간섭물질 1mL와 포자현탁희석액 1mL를 넣고 수 초 간 혼합하여 θ℃항온수조에서 2분간 방치하고 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 θ℃항온수조에서 t분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 제1법 4) (2)와 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 시험조건 검증법에서의 포자수(A)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 포자현탁희석액 포자수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓑ 중화제 독성 검증법

시험관에 중화제 8mL, 물 1mL 및 포자현탁희석액 1mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 제1법 4) (2)와 같이 보통한천배지를 가하여 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 중화제 독성 검증법의 포자수(B)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 포자현탁희석액 포자수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓒ 희석중화 검증법

시험관에 간섭물질 1mL, 물 1mL 및 시험용액(제1액) 8mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 θ℃항온수조에서 t분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20℃항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 액에 포자현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20℃항온수조에서 30분간 반응시킨다. 반응혼합액에서 1mL씩 취하여 2매의 페트리접시에 각각 넣고 제1법 4) (2)와 같이 보통한천배지를 가하여 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 희석중화 검증법의 포자수(C)를 상기 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 중화제 독성시험법에서 산정한 포자수의 0.5배수 이상이어야 한다.

(2) 막여과법

① 본시험

시험관에 간섭물질 1mL 및 포자현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 θ℃항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 θ℃항온수조에서 t분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮기고 즉시 여과한다. 여과시간은 1분을 초과하지 않도록 한다. 각 막여과장치에 세척액 150～500mL씩 첨가하여 여과하고 추가로 물 50mL씩 첨가하여 여과한다. 여과막은 여과한 쪽을 위로 향하게 하여 보통한천배지 표면에 밀착시켜 36℃에서 24시간 배양한다. 이 때, 여과막과 배지 표면 사이에 공기가 들어가지 않도록 주의한다. 페트리접시에서 집락수를 세고 페트리접시를 24시간 추가 배양한다. 잘 분리된 집락이 추가로 보이지 않을 때, 페트리접시에서 최대 집락수를 세고 시험용액의 멸균 작용에 의한 포자수(Na)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액(제1액)을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 포자현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

② 검증시험

Ⓐ 시험조건 검증법

상기 6) (2) ①의 포자현탁액 1mL 대신에 포자현탁희석액 1mL를, 시험용액(제1액) 8mL 대신에 경수 8mL를, 반응혼합액 0.1mL 대신에 반응혼합액 1mL를, 세척액 150～500mL대신에 물 50mL를 사용하여 상기 시험과 동일하게 조작한다. 각 페트리접시의 최대 집락수를 세고 시험조건 검증의 포자수(A)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 포자현탁희석액 포자수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓑ 여과과정 검증법

포자현탁희석액 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮기고 즉시 여과한다. 각 여과장치에 물 50mL씩 첨가하여 여과한 후 여과지를 제1법 6) (2) ①과 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 여과과정 검증의 포자수(B)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 포자현탁희석액 포자수의 0.05배수 이상이어야 한다.

Ⓒ 여과방법 검증법

시험관에 간섭물질 1mL, 물 1mL 및 시험용액(제1액) 8mL를 첨가하여 혼합한 후 θ℃항온수조에서 t분간 반응시킨다. 이 반응혼합물에서 0.1mL씩 취하여 세척액 50mL씩과 함께 2대의 막여과장치에 각각 옮겨 여과하고 물 150mL～500mL씩 첨가하여 여과한다. 각 여과장치에 세척액 50mL 및 포자 현탁희석액 0.1mL씩 첨가하여 여과한 후 물 50mL를 추가로 가하여 여과한 다음 여과지를 제1법 6) (2) ①과 같이 배양한다. 페트리접시의 최대 집락수를 세고 여과방법 검증의 포자수(C)를 제1법 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자수는 여과과정 검증법에서 산정한 포자수의 0.5배수 이상이어야 한다.

7) 판정

시험용액 별로 다음 계산식에 따라 포자수 감소율을 각각 계산하여 제1액의 포자수 감소율이 99.9%이상일 때 적합한 것으로 본다.

포자수 감소율(%) ＝	N - 10Na	×	100
	N

Na : 시험용액의 멸균 작용에 의한 포자수*(cfu/mL)

* 본시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Na)는 “3×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

장  치

막여과장치 : 최소한 50mL의 용액을 담을 수 있어야 하고 적합한 여과막(지름 : 47～50㎜, pore size : 0.45㎛)을 사용하여야 한다. 진공을 사용하는 경우 균일한 여과율을 보여 미생물이 여과막 전면에 균일하게 분포될 수 있어야 하며 지나치게 장시간 여과를 하지 않도록 세척액 100mL가 20～40초 사이에 여과될 수 있도록 설계되어야 한다.

배  지

1) TSA배지(Tryptone Soya Agar)

Tryptone, pancreatic digest of casein	15.0g

Soya peptone, papaic digest of soybean meal	5.0g

NaCl	5.0g

Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH  7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

2) TSB배지(Tryptone Soya Broth)

Tryptone, pancreatic digest of casein	15.0g

Soya peptone, papaic digest of soybean meal	5.0g

NaCl	5.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH  7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

3) 보통배지(Nutrient Broth)

Peptone	10.0g

Beef Extract	3.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH  7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

4) 보통한천배지(Nutrient Agar)

보통배지 1,000mL에 정제한천 15.0g을 가하여 가열 용해하고 증류수양을 보정한다. pH  6.8로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

5) 황산망간첨가 한천배지(Amended Nutrient Agar)

보통한천배지에 황산망간(MnSO4․H2O)을 5㎍/mL가 되도록 가하고 121℃에서 15분간 멸균한다.

시  액

1) 멸균인산완충용액

무수인산이수소칼륨 34g을 증류수 500mL에 용해하고 1N 수산화나트륨 175mL를 가해 pH 7.2로 조정하고 여기에 증류수를 가하여 1,000mL로 하여 인산완충액으로 한다. 이것을 121℃에서 20분간 멸균한 후 이 액 1mL를 멸균증류수 800mL에 가하여 희석한 액을 멸균인산완충용액으로 한다.

2) 물

유해한 물질이나 미생물의 성장을 방해하는 물질이 없어야 한다. 증류된 물을 사용하되 탈염된 물을 사용하여서는 안 된다. 121℃에서 15분간 멸균한다.

3) 희석액(TSCS)

Tryptone Sodium Chloride Solution:

Tryptone, pancreatic digest of casein	1.0g

NaCl	8.5g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH  7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

4) 중화제

다음의 중화제 중에서 적절한 것을 선택하여 멸균된 것을 사용하고 검증시험에서 유효성이 검증되어야 한다.

(1) 기본 중화혼합제

레시틴(lecithin)	3g

폴리소르베이트80(polysorbate 80)	30g

치오설페이트염(sodium thiosulfate)	5g

히스티딘(L-histidine)	1g

사포닌(saponine)	30g

위의 성분을 1% 멸균인산완충용액 또는 희석액을 가하여 1,000mL로 한다.

(2) 멸균인산완충용액

인산이수소칼륨(KH2PO4) 34g을 물 500mL에 용해하고 1N 수산화나트륨액을 이용하여 pH 7.2로 조정한 다음 이 액에 물을 가하여 1,000mL로 한다.

(3) 5% 또는 0.5%(V/V) 난황 용액

살균된 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것)을 10mL 또는 1mL에 물을 첨가하여 100mL로 한다.

(4) 3%(V/V) 폴리소르베이트80, 4g/L 라우릴설페이트염(sodium lauryl sulfate)과 3g/L 레시틴을 함유한 용액

(5) 5%(V/V) 난황과 4%(V/V) 폴리소르베이트80를 함유한 용액

(6) 7%(V/V) ethylene oxide condensate of fatty alcohol, 20g/L 레시틴과 4%(V/V) 폴리소르베이트80을 함유한 용액

(7) 4%(V/V) ethylene oxide condensate of fatty alcohol와 4g/L 레시틴을 함유한 용액

(8) 3%(V/V) 폴리소르베이트80, 3g/L 레시틴과 1g/L 히스티딘을 함유한 용액

(9) 글라이신(glycine)

(10) 3%(V/V) 폴리소르베이트80과 3g/L 레시틴을 함유한 용액

(11) 50㎎/mL 인지질 유화제와 4g/L 레시틴을 함유한 용액

(12) 0.05g/L 또는 0.5g/L 치오글리콜레이트염용액

(13) 0.8g/L 또는 1.5g/L 시스테인용액

(14) 0.5g/L 치오설페이트염용액

상기에서 열거한 중화제 이외에 적절한 다른 중화제를 사용할 수 있다.

5) 세척액

세척액은 멸균된 것을 사용하고 막을 통하여 여과 될 수 있어야 한다. 다음의 세척액 중 한가지를 사용할 수 있다.

(1) 물

(2) 희석액(TSCS)

(3) 0.1%(V/V) 폴리소르베이트80 용액

(4) 0.5%(V/V) 폴리소르베이트80 용액

(5) 0.5%(V/V) 폴리소르베이트80과 레시틴(0.7g/L)을 함유한 용액

(6) 중화제

(7) 멸균인산완충용액

상기에서 열거한 용액 이외에 적절한 다른 용액을 사용할 수 있다.

6) 경수

검체의 희석에 사용되는 경수는 다음과 같이 조제한다.

- 용액 A : 19.84g의 무수 염화마그네슘과 46.24g의 무수염화칼슘을 물에 용해하여 1L로 맞춘다.

- 용액 B : 35.02g의 탄산수소나트륨을 물로 용해하여 1,000mL로 맞춘다.

1,000mL의 메스플라스크에 용액 A 3.0mL를 넣고 최소 600mL의 물을 가해주고, 용액 B 8.0mL를 가해준 후 물을 가하여 1,000mL로 한다. 용액의 pH를 7.0으로 조정하고 최대 pore size가 0.45㎛ 이하인 여과막에 통과시켜 제균한다. 용액은 4～8℃에서 최대 1개월 간 보관할 수 있다.

7) 세균현탁액시험법 또는 포자현탁액시험법의 간섭물질

간섭물질로는 알부민용액(청정조건 또는 오염조건)을 사용하여야 하나 간섭물질이 시험용액과 반응하여 침전이 발생할 경우 다음의 적절한 간섭물질을 선택하여 실험할 수 있다.

(1) 알부민 용액(Bovine albumin solutions)

시험에 사용되는 알부민 용액의 조제는 다음과 같다.

- 청정조건을 위한 조제

0.3g의 알부민(Dubos medium을 위한 Cohn fraction V)을 물 100mL에 녹이고 막여과를 통하여 제균한다.

- 오염조건을 위한 조제

3g의 알부민(Dubos medium을 위한 Cohn fraction V)을 물 100mL에 녹여서 막여과를 통하여 제균한다.

(2) 우유

항생제나 어떠한 첨가제도 들어있지 않은 분말우유 100g을 물 1l로 용해한 후 10%(V/V)용액으로 제조하여 105℃에서 30분(또는 121℃에서 5분)간 멸균한다.

(3) 효모추출물

미생물용 건조 효모추출물을 물에 100g/L이 되도록 용해하고, NaOH를 이용하여 pH를 7.0±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

(4) 서당

서당을 물에 100g/L이 되도록 용해하고 여과막을 이용하여 제균한다.

(5) pH 5와 pH 9의 완충용액

(6) 라우릴설페이트염(Sodium lauryl sulfate)

라우릴설페이트염을 물에 50g/L이 되도록 용해하고 121℃에서 15분간 멸균한다.

8) 세균표면시험법의 간섭물질

실제사용 조건을 반영하기 위하여 사용되는 간섭물질은 알부민용액과 트립톤용액을 혼합하여 제조한 것으로 다음의 제조방법에 따라 제조하여 보관한다.

- 알부민용액 : 멸균인산완충용액 10mL에 알부민 0.3g을 첨가하고 여과제균한다.

- 트립톤용액 : 멸균인산완충용액 10mL에 트팁톤 0.1g을 첨가하고 여과제균한다.

각 여과제균한 용액을 사용하기 직전에 50μL씩 동량 혼합하고 20℃에 보관한다.

IV. 일반시험법

37. 살균소독력시험법

분석원리 : 본 시험방법은 기구등의 살균소독제의 살균소독력 유무를 측정하는 방법으로 세균현탁액시험법, 세균표면시험법, 포자현탁액시험법이 있으며, 별도의 규정이 없는 한 세균현탁액시험법으로 측정한다.

살균소독력의 정의 : 기구등의 살균소독제에 대하여 규정된 조건에서 규정된 시험균의 초기균수(cfu/mL)에 대한 생균수(cfu/mL) 감소율(%)을 말한다.

가. 세균현탁액시험법

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 경수(바. 시액 ①)로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하여야 하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

다음의 2가지 시험균주를 표준균주로 사용한다.

- Escherichia coli ATCC 10536 또는 Escherichia coli ATCC 11229

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

다만, 상기 표준균주 외에 다음과 같은 시험균주를 선택하여 추가할 수 있다.

- Bacillus cereus ATCC 21772

- Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969

- Salmonella ctyphimurium ATCC 13311

- Listeria monocytogenes ATCC 19111(또는 Listeria monocytogenes ATCC 19115)

3) 시험균주의 배양

시험균주를 TSA배지(마. 배지 ①)에 도말하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 이를 1차 배양이라 하며, 같은 방법으로 2차 배양을 한다. 시험에서는 2차 배양된 시험균주를 사용한다. 다만, 추가 시험균주 중 V. parahaemolyticus의 배양을 위해서는 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 10mL에 시험균 10μL를 접종하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 1차 배양이 완료되면 2차 배양을 염화나트륨이 2%가 되도록 조정한 TSB배지 100mL에 한다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 3)에 따라 2차 배양된 시험균을 백금이를 사용하여 트립톤생리식염수(바. 시약 ②) 10mL와 유리비드(라. 기구 및 재료 ①) 5g이 들어간 100mL 삼각플라스크에 옮긴다. 이때 시험균이 옮겨진 백금이를 트립톤생리식염수에 담그고 삼각플라스크의 벽면에 문질러 완전히 균괘가 떨어지도록 한 다음 3분간 교반기(라. 기구 및 재료 ②)를 이용하여 잘 섞는다. 이후 유리비드 안쪽의 현탁액을 취하여 다른 시험관으로 옮긴다. 트립톤생리식염수을 사용하여 생균수를 1.5×108～5.0×108 cfu/mL로 조정하고 20±1℃의 항온수조(라. 기구 및 재료 ③)에 방치한 후 시험균주 현탁액으로 사용한다. 시험균주 현탁액은 제조 후 2시간 이내에 사용하여야 한다.

다만, 추가 시험균주 중 V. parahaemolyticus의 경우에는 상기 3)의 배양균을 멸균된 50mL 원심분리관에 넣고 원심분리기(라. 기구 및 재료 ④) 20℃, 5000×g (6,000rpm)에서 5분간 원심분리하여 상등액을 조심스럽게 버린 후, 잔류된 균괘에 트립톤생리식염수 25mL를 첨가하여 10초간 진탕교반기를 이용하여 교반한다. 교반이 완료되면 다시 원심분리하여 상등액을 버린 후, 트립톤생리식염수 2mL를 첨가하여 균괘를 현탁시켜 둔다. 100mL 삼각플라스크에 트립톤생리식염수 10mL와 유리비드 5g을 넣고 미리 준비한 균 현탁액을 첨가하여 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 트립톤생리식염수를 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL가 되도록 조정하고 20±1℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 시험균주 현탁액으로 한다. : 100mL 삼각플라스크에 희석액(TSCS) 10mL와 유리비드(직경 3～4㎜) 5g을 넣고 백금이를 사용하여 E. coli 활성배양균을 옮긴다. 이때 백금이를 희석액(TSCS)에 담그고 삼각플라스크의 벽면에 문질러 완전히 균괘가 떨어지도록 한 다음 3분간 진탕교반기를 이용하여 잘 섞은 후 유리비드 안쪽의 현탁액을 취하여 다른 시험관으로 옮긴다. 희석액(TSCS)을 사용하여 생균수를 1.5～5×108 cfu/mL로 조정하고 20℃의 항온수조에서 2시간 방치한 액을 E. coli 시험균주 현탁액으로 한다.

(2) 계수

시험균주 현탁액을 트립톤생리식염수를 사용하여 10-6과 10-7으로 희석하고, 이 희석액 1mL씩을 멸균 페트리접시(라. 기구 및 재료 ⑤) 2매에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 TSA배지 약 15mL를 무균적으로 분주하고 잘 혼합하여 응고시킨다. 확산집락의 발생을 방지하기 위하여 TSA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 36±1℃에서 48±2시간 배양한 후 다음의 계산식에 따라 시험균주 현탁액의 생균수(N)를 계수한다. 생균수의 계산은 15～300개의 집락을 생성한 페트리접시를 택하여 계산한다.  10-6과 10-7의 희석배수에서 모두 유효범위의 결과가 나오면 다음의 식에 의하여 생균수를 산정한다. 하지만, 한 단계의 희석배수에서만 유효범위의 결과를 얻었을 경우에는 산술평균하고 희석배수를 곱하여 계산한다. 계산된 결과는 두 자리 유효숫자를 얻을 때까지 반올림하여 1.0과 9.9사이의 숫자를 10의 배수로 곱한 방식(예, 2.7×108 cfu/mL)으로 표시한다.

시험균주 현탁액의 생균수(N, cfu/mL) ＝	c
	(n1+0.1n2)d

c  : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n1 : 10-6 희석에서 계수된 페트리접시의 수

n2 : 10-7 희석에서 계수된 페트리접시의 수

d : 첫 번째 희석액의 희석배수(10-6)

5) 시험균주 현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 4)의 시험균주 현탁액을 트립톤생리식염수를 사용하여 생균수가 3.0×102～1.6×103 cfu/mL가 되도록 희석하여 조제한다.

(2) 계수

시험균주 현탁희석액을 트립톤생리식염수로 10배 희석하고 이 희석액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣어 45±1℃로 유지한 TSA배지 약 15mL를 무균적으로 분주하여 냉각응고 시킨 후 TSA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 36±1℃에서 48±2시간 배양한 후 생균수를 계수한다. 시험균주 현탁희석액의 생균수(Nv)는 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이때 시험균주 현탁희석액의 생균수는 3.0×102～1.6×103 cfu/mL이어야 한다.

시험균주 현탁희석액의 생균수(Nv, cfu/mL) ＝	c	×	10
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

6) 시험조작

시험용액, 시험균주 현탁액, 시험균주 현탁희석액, 시액 및 물 등은 항온수조에서 20±1℃로 유지시킨다.

(1) 본시험

시험관(라. 기구 및 재료 ⑥)에 간섭물질 1mL와 시험균주 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한다. 이 후 시험용액 8mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 증류수 1mL가 들어있는 시험관에 넣고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 중화시킨다. 이 중화반응혼합액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4)와 같이 배양한다. 본시험에서의 생균수(Na)를 상기 가. 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질과 시험균주 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

(2) 검증시험

검증시험에는 시험조건 검증시험, 중화제 독성 검증시험 및 희석중화 검증시험이 있으며, 이들 검증시험들은 상기 본시험과 같이 수행해야 한다.

① 시험조건 검증시험

시험관에 시험균주 현탁희석액 1mL와 간섭물질 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한다. 이후 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4) (2)와 같이 배양한다. 시험조건 검증법에서의 생균수(A)를 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 시험조건 검증시험의 생균수(A)는 시험균주 현탁희석액(Nv)에서 산정한 생균수의 0.05배수 이상이어야 한다.

시험조건 검증시험의 생균수(A, cfu/mL) ＝	c
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

② 중화제 독성 검증시험

시험관에 시험균주 현탁희석액 1mL, 중화제 8mL 및 증류수 1mL를 넣고 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 4) (2)와 같이 배양한다. 중화제 독성 검증시험의 생균수(B)는 ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 중화제 독성 검증시험에서의 생균수(B)는 시험균주 현탁희석액에서 산정한 생균수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

③ 희석중화 검증시험

시험관에 시험용액 8mL, 간섭물질 1mL 및 트립톤생리식염수 1mL를 넣고 즉시 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 중화반응혼합액에 시험균주 현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 30분간 반응시킨다. 이 액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 가. 4) (2)와 같이 배양한다. 희석중화 검증법의 생균수(C)는 ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 희석중화 검증시험에서의 생균수(C)는 중화제 독성시험법에서 산정한 생균수(B)의 0.5배수 이상이어야 한다.

7) 판정

다음 계산식에 따라 시험균의 생균수 감소율을 각각 계산하여 생균수 감소율이 99.999%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	N-10Na	×	100
	N

N : 시험균주 현탁액의 생균수(cfu/mL)

Na : 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/mL)

* 본시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Na)는 “3.0×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

나. 세균표면시험법

본 시험방법은 간섭물질이 들어있는 시험균주 현탁액을 스테인리스 스틸 표면(담체)에 도말하여 건조시킨 후 이 막위에 시험용액을 처리하여 20±1℃에서 5분간 반응시키고 즉시 검증된 중화제를 사용하여 반응을 억제 시키는 방법으로 각 표면의 생균수를 측정하여 생균수 감소율을 측정하는 방법이다. 다만, 본 시험을 할 때에는 시험용액 대신 트립톤생리식염수를 사용하여 대조시험을 실시하고 검증시험을 동시에 수행하여야 한다.

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도에 맞게 경수로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하여야 하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

가. 2)의 2가지 시험균주를 사용한다. 추가균주는 사용하지 않는다.

3) 시험균주의 배양

가. 3)에 따른다.

4) 시험균주 현탁액의 조제 및 계수

가. 4)에 따른다.

5) 시험표면 접종액의 조제

시험관에 시험균주 현탁액 400μL와 간섭물질 100μL를 첨가하여 1분간 교반기를 이용하여 잘 섞은 후 20±1℃의 항온수조에서 30분간 방치한 액을 시험표면 접종액으로 한다.

6) 시험표면의 조제

시험표면 접종액 10μL를 담체(라. 기구 및 재료 ⑦) 중앙에 접종하여 36±1℃로 조절된 가열판 위에서 건조시킨 것을 시험표면으로 한다.

7) 시험조작

시험용액, 시액, 기구 등은 20±1℃로 유지시킨다. 담체와 유리병(라. 기구 및 재료 ⑧)은 데시케이터(라. 기구 및 재료 ⑨)에 건조하여 준비한다.

(1) 본시험

시험표면을 멸균된 집게를 사용하여 시험표면 접종액의 건조된 표면이 위로 향하게 하여 유리병에 조심스럽게 넣는다. 유리병안의 시험표면 중앙에 시험용액 50μL를 첨가하고 20±1℃에서 5분간 반응시킨 후 중화제 9.95mL와 유리비드 2～3g을 첨가하여 교반기에서 1분간 혼합하고 막여과장치(라. 기구 및 재료 )로 여과한다. 여과할 때 트립톤생리식염수 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 실험과정을 준비된 시험표면으로 5회 반복한다. 본시험의 생균수(Nd)를 다음 계산식에 따라 산정한다.

본시험 및 검증시험의 생균수(cfu/carrier) ＝	c
	n ×d

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

d : 희석배수

따로 트립톤생리식염수를 사용하여 대조시험의 생균수(Nc)를 산정한다. 이 때, 반응혼합액은 트립톤생리식염수로 10-2, 10-3 및 10-4으로 희석하여 막여과장치로 여과하고 시험표면 반복횟수는 3회로 한다. 이때 대조시험의 생균수는 상기 나. 7) (1)의 계산식에 따라 산정할 때 1.5×105 cfu/carrier 이상이어야 한다.

(2) 검증시험

① 중화 검증시험

유리병에 중화제 9.95mL와 시험용액 50μL를 넣고 혼합하여 20±1℃에서 5분간 정치시킨 후 시험표면과 유리비드 2～3g을 첨가한다. 교반기에서 1분간 혼합한 후 반응혼합액을 10-3, 10-4 및 10-5으로 희석하여 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 기술된 실험과정을 따로 준비한 시험표면으로 2회 반복한다. 중화 검증시험의 생균수(A)를 상기 나. 7) ①의 계산식에 따라 산정한다. 이때 중화 검증시험의 생균수는 1.5×105 cfu/carrier이상이어야 한다.

② 중화제 독성 검증시험

유리병에 중화제 9.95mL와 트립톤생리식염수 50μL를 넣고 혼합하여 20±1℃에서 5분간 정치시킨 후 시험표면과 유리비드 2～3g을 첨가한다. 교반기에서 1분간 혼합한 후 반응혼합액을 10-3, 10-4 및 10-5으로 희석하여 막여과장치로 여과한다. 여과할 때 희석액 100～150mL를 2회 또는 3회 나누어 세척한다. 막여과장치로부터 여과막을 분리하여 상기 가. 6) (2) ①에 따라 배양한다. 상기 기술된 실험과정을 따로 준비한 시험표면으로 2회 반복한다.

중화제 독성 검증시험의 생균수(B)를 상기 나. 7) ①의 계산식에 따라 산정한다. 이때 중화제 독성 검증시험의 생균수는 중화 검증시험에서 산정한 생균수의 0.5배수 이상～2배수 이하이어야 한다.

8) 판정

다음 계산식에 따라 생균수 감소율이 99.99%이상일 때 적합한 것으로 본다.

생균수 감소율(%) ＝	Nc - Nd	×	100
	Nc

Nc : 대조시험의 생균수(cfu/carrier)

Nd : 시험용액의 살균소독 작용에 의한 생균수*(cfu/carrier)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Nd)는 “1.5×10 cfu/carrier”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Nd)는 “3×102 cfu/carrier”를 각각 적용한다.

다. 포자현탁액시험법

1) 시험용액의 조제

시험용액은 검체에 표시된 사용농도보다 1.25배 높게 경수로 희석하여 제조한다. 제조된 시험용액은 바로 사용하며, 최대 2시간을 초과하여 사용할 수 없다. 단, 희석하지 않고 그대로 사용하는 검체의 경우에는 원액을 그대로 사용한다.

2) 시험균주

Bacillus subtilis ATCC 6633

3) 포자용액의 조제

시험균주를 TGB배지(마. 배지 ②)에 접종하고 30±1℃에서 18～24시간 배양한다. 이 배양액 2～3mL를 MYA배지(마. 배지 ③)를 넣어 굳힌 배양병(라. 기구 및 재료 )에 접종하여 30℃±1℃에서 8～10일간 배양한다. 멸균한 유리비드와 증류수를 사용하여 포자를 집균하고 10,000rpm에서 20분간 원심분리한다. 이 후 상층액을 제거한 다음 다시 멸균 증류수에 부유시켜 세척하는 과정을 4회 반복하고 잔사를 멸균 증류수에 부유시켜 75±1℃에서 10분간 가열하여 포자용액을 조제한다. 조제된 포자용액은 냉장(5±1℃)보관 하여 사용하되 장기보관시에는 냉동보관한다.

4) 포자 현탁액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 다. 3)의 포자용액을 멸균 증류수를 사용하여 1.5×106～5×106 cfu/mL로 조정하고 광학현미경(라. 기구 및 재료 )을 사용하여 영양세포가 없는 포자임을 확인하고, 20±1℃의 항온수조에서 방치한 액을 포자 현탁액으로 한다. 이 액은 제조 후 2시간 이내에 사용하여야 한다.

(2) 계수

포자 현탁액을 멸균 증류수로 10-4～10-5 희석하고, 1mL씩을 멸균 패트리접시 2매에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 GYA배지(마. 배지 ④) 약 15mL를 무균적으로 분주하여 냉각응고 시킨 후 GYA배지 3～5mL를 가하여 중첩시킨다. 냉각응고된 페트리접시를 거꾸로 하여 30±1℃에서 3일간 배양한 후 포자현탁액의 포자수(N)를 산정한다. 이 때, 포자현탁액의 포자수는 1.5×106～5×106 cfu/mL이어야 한다.

포자 현탁액의 포자수(N, cfu/mL) ＝	c
	(n1+0.1n2)d

c  : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n1 : 첫 번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

n2 : 두 번째 희석에서 계수된 페트리접시의 수

d : 첫 번째 희석액의 희석배수

5) 포자 현탁희석액의 조제 및 계수

(1) 조제

상기 다. 4)의 포자 현탁액을 포자의 수가 6×102～3×103 cfu/mL가 되도록 멸균 증류수로 희석하여 조제한 액을 포자 현탁희석액으로 한다.

(2) 계수

포자 현탁희석액을 멸균 증류수로 10배 희석하고, 1mL씩 취하여 2매의 멸균 페트리접시에 각각 넣고 45±1℃로 유지한 GYA배지를 가하여 상기 다. 4) (2)와 같이 배양한다. 포자 현탁희석액의 포자수(Nv)는 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 포자현탁희석액의 포자수(Nv)는 6×102～3×103 cfu/mL이어야 한다.

포자 현탁액의 포자수(Nv, cfu/mL) ＝	c	×	10
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

6) 시험조작

(1) 본시험

시험관에 간섭물질 1mL와 포자 현탁액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치한 후 시험용액 8mL를 첨가하여 혼합한 다음 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL와 멸균 증류수 1mL가 들어있는 시험관에 넣고 20±1℃의 항온수조에서 5분간 중화시킨다. 이 중화반응혼합액 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 본시험의 포자수(Na)를 상기 다. 5) (2)의 계산식에 따라 산정한다.

단, 원액을 사용하는 검체는 시험용액을 9.8mL 첨가하고, 간섭물질 및 포자 현탁액의 농도를 상기 사용한 농도보다 10배 높게 조제하여 각각 0.1mL씩 첨가하여 상기 시험조작과 동일하게 조작한다.

(2) 검증시험

검증시험에는 시험조건 검증시험, 중화제 독성 검증시험 및 희석중화 검증시험이 있으며, 이들 검증시험들은 상기 본시험과 같이 수행해야 한다.

① 시험조건 검증시험

시험관에 간섭물질 1mL와 포자 현탁희석액 1mL를 첨가하여 즉시 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 2분간 방치하고 경수 8mL를 첨가하여 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 시험조건 검증시험에서의 포자수(A)를 다음의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 시험조건 검증시험의 포자수(A)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

시험조건 검증시험의 포자수(A, cfu/mL) ＝	c
	n

c : 페트리접시에서 계수된 집락수의 합

n : 계수된 페트리접시의 수

② 중화제 독성 검증시험

시험관에 중화제 8mL, 물 1mL 및 포자 현탁희석액 1mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 반응혼합액에서 1mL씩을 멸균 페트리접시 2매에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 중화제 독성 검증법의 포자수(B)를 상기 다. 6) (2) ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 중화제 독성 검증시험의 포자수(B)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

③ 희석중화 검증시험

시험관에 간섭물질 1mL, 물 1mL 및 시험용액 8mL를 넣고 수 초간 혼합한 후 20±1℃의 항온수조에서 60분간 반응시킨다. 이 반응혼합액 1mL를 취하여 중화제 8mL가 담겨져 있는 시험관에 옮긴 후 20±1℃의 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 이 중화반응혼합액에 포자 현탁희석액 1mL를 첨가하여 혼합하고 20±1℃의 항온수조에서 30분간 반응킨 후 1mL씩 취하여 2매의 멸균 페트리접시에 각각 넣고 상기 다. 4) (2)와 같이 GYA배지를 가하여 배양한다. 희석중화 검증법의 포자수(C)를 다. 6) (2) ① 시험조건 검증시험의 계산식에 따라 산정한다. 이 때, 희석중화 검증시험의 포자수(C)는 포자 현탁희석액 포자수(Nv)의 0.05배수 이상이어야 한다.

7) 판정

다음 계산식에 따라 포자수 감소율(%)을 계산하여 포자수 감소율이 99.9%이상일 때 적합한 것으로 본다.

포자수 감소율(%) ＝	N - 10Na	×	100
	N

N : 포자 현탁액의 포자수(cfu/mL)

Na : 본시험의 포자수*(cfu/mL)

* 본 시험에서 계수된 집락수가 15개 이하인 경우의 생균수(Na)는 “1.5×102 cfu/mL”를, 계수된 집락수가 300개 이상인 경우의 생균수(Nd)는 “3.0×103 cfu/mL”를 각각 적용한다.

라. 기구 및 재료

① 유리비드(glass bead, 직경 3～4mm)

② 교반기(Stirrer), 기계식 교반기(Mixer)

③ 항온수조(Water Bath, 자동온도 조절기능함유, 20±1℃)

④ 원심분리기(Centrifuger)

⑤ 페트리접시(Petridish)

⑥ 시험관(Test Tube, 18×170mm 등)

⑦ 담체(carrier, ø1cm×0.07cm 스테인리스 스틸 디스크 ANSI 304 2B)

⑧ 유리병(바닥 지름 2～3cm, 용량 15～20mL)

⑨ 데시케이터(Desicator)

막여과장치(여과막 지름 : 47～50mm pore size : 0.45㎛, 최소 50mL의 용액을 담을 수 있어야 함, 진공 사용 시 균일한 여과율로 세척액 100mL가 20～40초 사이에 여과될 수 있도록 설계된 장치 사용)

배양병(Roux bottle, 500mL)

광학현미경(Optical microscope)

무균대(Clean bench)

고압멸균기(Autoclave)

건조기(Dry Oven)

배양기(Incubator, 36±1℃와 30±1℃)

냉동 및 냉장고(-70℃ Freezer 포함)

초순수 제조장치(Ultra Pure Water System)

집락계산기(Colony Counter)

수소이온농도측정기(pH meter)

피펫(1mL, 5mL, 10mL 등)

슬라이드/커버 글라스

알콜램프, 백금이, 백금선 등

마. 배지

본 실험을 위한 배지조제시 이미 상품화된 배지의 사용이 가능하며, 사용할 각 제조사별 조제법을 따를 수 있다.

① TSA배지(Tryptone Soya Agar)

Tryptone, pancreatic digest of casein	15.0g
Soya peptone, papaic digest of soybean meal	5.0g
NaCl	5.0g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

② TGB 배지(Tryptone Glucose Broth)

Yeast Extract	2.5g
Tryptone	5.0g
Glucose	1.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

③ MYA배지(Yeast Extract Agar)

Meat Extract	10.0g
Yeast Extract	2.0g
MnSO4·H2O	0.04g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

④ GYA배지(Glucose Yeast Extract Agar)

Amino Acids, acid hydrolysis of casein	1.0g
Soluble Starch	1.0g
Glucose	2.5g
Yeast Extract	2.5g
FeSO4	0.1g
MnSO4·H2O	0.0001g
Agar	15.0g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

바. 시액

① 트립톤생리식염수(Tryptone Sodium Chloride Solution)

Tryptone, pancreatic digest of casein	1.0g
NaCl	8.5g

위의 성분을 증류수 1,000mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

② 경수(Hard water)

- 용액 A : 19.84g의 염화마그네슘(MgCl2)과 46.24g의 염화칼슘(CaCl2)을 증류수에 용해하여 1L로 맞춘다. 이 용액은 냉장보관하여 최대 1개월 간 사용할 수 있다.

- 용액 B : 35.02g의 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 증류수로 용해하여 1,000mL로 맞춘다. 이 용액은 냉장보관하여 최대 1주일 간 사용할 수 있다.

1,000mL의 메스플라스크에 용액 A 3.0mL를 넣고 최소 600mL의 증류수를 가해주고, 용액 B 8.0mL를 가해준 후 증류수를 가하여 1,000mL로 한다. 용액의 pH를 7.0±0.2로 조정하고 여과 멸균한다. 이 혼합 용액은 12시간 이내에 사용하여야 한다.

③ 간섭물질(Interfering substance)

0.3g의 알부민(bovine albumin fraction V)을 증류수 100mL에 녹이고 여과 멸균한다. 본 간섭물질이 시험용액과 반응하여 침전이 발생할 경우에는 적절한 다른 간섭물질을 사용하여 실험할 수 있으며, 이때 사용한 간섭물질은 본 간섭물질과 동일한 간섭효과를 가져야 한다.

④ 중화제(Neutralizer)

레시틴(lecithin)	3g
폴리소르베이트 80(polysorbate 80)	30g
치오설페이트염(sodium thiosulfate)	5g
히스티딘(L-histidine)	1g
사포닌(saponine)	30g

위의 성분을 트립톤생리식염수를 가하여 1,000mL로 하고 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 본 중화제 이외에 검증시험에서 유효성이 검증된 다른 중화제를 사용할 수도 있다.

신․구조문 대비표