국립수의과학검역원 고시 제2008-9호

축산물가공처리법 제4조제2항의 규정에 의거 축산물의가공기준및성분규격을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2008  7.  31.

국립수의과학검역원장

축산물의가공기준및성분규격

제1조 (목적) 이 고시는 축산물가공처리법(이하“법”이라 한다) 제4조제2항의 규정에 의하여 축산물의 가공기준 및 성분규격을 규정함으로써 축산물의 위생적인 관리와 그 품질의 향상을 도모하여 공중위생의 향상에 이바지함을 목적으로 한다.

제2조 (적용범위) 축산물의 가공기준 및 성분규격에 관하여는 축산물가공처리법령에 규정된 사항을 제외하고는 이 규정에 의한다. 판매를 목적으로 수입하는 축산물의 경우에도 또한 같다.

제3조 (한시적 인정) 이 고시에서 가공기준 및 성분규격이 정하여지지 아니한 축산물에 대하여는 그 축산물가공업의 영업자로 하여금 가공기준 및 성분규격을 제출하게 하여 법 제20조의 규정에 의하여 지정된 축산물위생검사기관의 검토를 거쳐 그 가공기준 및 성분규격을 이 고시에서 정하기 전까지 한시적으로 인정할 수 있다.

제4조 (수출축산물) 수출을 목적으로 하는 축산물의 가공기준 및 성분규격은 법 제4조제4항의 규정에 의거 이 고시에 불구하고 수입자가 요구하는 가공기준 및 성분규격에 의할 수 있다.

제5조 (가공기준 및 성분규격) 축산물의 가공기준 및 성분규격 내용은 따로 붙임 “축산물의가공기준및성분규격”에 의한다.

부      칙

제1조 (시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조 (적용특례) 종전 제1.축산물에 대한 공통기준 및 규격의 8.보존 및 유통기준 중 차 및 카의 개정규정과 제2.축산물가공품별 기준 및 규격의 1.유가공품 가.우유류중 (6)보존 및 유통기준의 (라)유통기간의 개정규정은 이 고시 시행에 불구하고 2002. 7. 1일부터 적용한다.

제3조 (경과조치) 이 고시 시행당시 종전의 축산물의가공기준및성분규격(국립수의과학검역원고시 제 2000-6호)에 의하여 가공된 축산물은 이 고시에 의한 것으로 본다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 2002년 7월 1일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행당시 종전의 축산물의가공기준및성분규격(국립수의과학검역원고시 제2000-20호)에 의하여 가공된 축산물은 이 고시에 의한 것으로 본다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 2004년 1월1일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행당시 종전의 축산물의가공기준및성분규격(국립수의과학검역원고시 제2002-3호, '02.6.15.)에 의하여 가공된 축산물은 이 고시에 의한 것으로 본다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행당시 종전의 축산물의가공기준및성분규격(국립수의과학검역원고시 제2003-14호, '03.12.17.)에 의하여 가공된 축산물은 이 고시에 의한 것으로 본다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제2. 2. 가.(2) (아), 제2. 2. 사. 및 제2. 2. 타.의 개정규정은 2006. 9. 24일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행당시 종전의 축산물의가공기준및성분규격(국립수의과학검역원고시 제2005-2호, 2005.2.28)에 의하여 가공된 축산물은 이 고시에 의한 것으로 본다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

부      칙

①(시행일)이 고시는 고시한 날부터 시행한다.(2007.6.5)

②(경과조치)이 고시가 시행되기 전 제조․수입한 제품의 경우는 종전의 규정에 의한다.

부      칙

①(시행일)이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

부      칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.(2008.7.31.)

제2조(적용특례) 이 고시의 따로 붙임 제2. 축산물별 기준 및 규격 2. 식육가공품 및 포장육 자. 식육추출가공품 (1) 정의 및 (2) 축산물가공품의 유형 (나) 식육추출가공품의 개정규정은 이 고시 시행에 불구하고 2008년 10월 1일부터 적용한다.

제3조(경과조치) 이 고시 부칙 제2조(적용특례) 적용당시 식품위생법 제7조의 규정에 의하여 제조․수입된 제품의 경우 이 고시에 의한 것으로 본다.

국립수의과학검역원 고시 제2008-9호 (2008. 7. 31.)

축산물의가공기준및성분규격

2008. 7. 31.

국립수의과학검역원

목         차

제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격	……………………………	1
1. 용어의 풀이	…………………………………………………………………	1
2. 원료 등의 구비요건	………………………………………………………	3
3. 사용할 수 있는 식품 또는 식품첨가물	…………………………………	4
4. 축산물의 주원료	…………………………………………………………	4
5. 축산물의 가공기준	………………………………………………………	4
6. 축산물의 성분규격	……………………………………………………	11
7. 축산물의 기준 및 규격의 적용	…………………………………………	13
8. 보존 및 유통기준	…………………………………………………………	14
제2. 축산물별 기준 및 규격	………………………………………	16
1. 유가공품	…………………………………………………………………	16
가. 우유류	………………………………………………………………………	16
나. 저지방우유류	………………………………………………………………	17
다. 유당분해우유	………………………………………………………………	18
라. 가공유류	……………………………………………………………………	19
마. 산양유	………………………………………………………………………	20
바. 발효유류	……………………………………………………………………	21
사. 버터유류	……………………………………………………………………	22
아. 농축유류	……………………………………………………………………	23
자. 유크림류	……………………………………………………………………	24
차. 버터류	………………………………………………………………………	25
카. 자연치즈	……………………………………………………………………	26
타. 가공치즈	……………………………………………………………………	27
파. 분유류	………………………………………………………………………	28
하. 유청류	………………………………………………………………………	29
거. 유당	…………………………………………………………………………	30
너. 유단백가수분해식품	………………………………………………………	31

더. 조제유류	……………………………………………………………………	32
러. 아이스크림류	……………………………………………………………………	35
머. 아이스크림분말류	…………………………………………………………	36
버. 아이스크림믹스류	…………………………………………………………	37
2. 식육가공품 및 포장육	……………………………………………………	38
가. 공통사항	……………………………………………………………………	38
나. 햄류	…………………………………………………………………………	38
다. 소시지류	……………………………………………………………………	39
라. 베이컨류	……………………………………………………………………	39
마. 건조저장육류	………………………………………………………………	39
바. 양념육류	……………………………………………………………………	39
사. 분쇄가공육제품	……………………………………………………………	39
아. 갈비가공품	…………………………………………………………………	40
자. 식육추출가공품	……………………………………………………………	40
차. 식용우지	……………………………………………………………………	40
카. 식용돈지	……………………………………………………………………	41
타. 포장육	………………………………………………………………………	42
3. 알가공품	………………………………………………………………………	43
제3. 축산물 시험방법	……………………………………………	44
Ⅰ. 총 칙	………………………………………………………………	44
Ⅱ. 검사시료의 채취 및 취급방법	……………………………………	47
Ⅲ. 일반시험법	………………………………………………………	50
1. 일반성분시험법	……………………………………………………………	50
가. 수분	…………………………………………………………………………	50
(1) 건조감량법	………………………………………………………………	50
(2) 증류법	………………………………………………………………………	51
(3) 칼핏샤법	……………………………………………………………………	52
나. 회분	…………………………………………………………………………	54
다. 질소화합물	…………………………………………………………………	55
(1) 총질소 및 조단백	………………………………………………………	55
(2) 아미노산질소	……………………………………………………………	57

라. 지질	…………………………………………………………………………	61
(1) 조지방	………………………………………………………………………	61
(2) 물리적 시험	………………………………………………………………	63
(3) 화학적 시험	………………………………………………………………	64
(4) 지방산	………………………………………………………………………	66
마. 탄수화물	……………………………………………………………………	68
(1) 당질	………………………………………………………………………	68
바. 열량의 계산	…………………………………………………………………	72
2. 무기물	………………………………………………………………………	73
가. 시험용액의 조제	……………………………………………………………	73
나. 칼슘	…………………………………………………………………………	74
다. 인	……………………………………………………………………………	75
라. 철	……………………………………………………………………………	76
마. 식염	……………………………………………………………………………	77
바. 나트륨	…………………………………………………………………………	78
사. 칼륨	……………………………………………………………………………	78
아. 아연	……………………………………………………………………………	78
자. 요오드	…………………………………………………………………………	78
3. 비타민류	……………………………………………………………………	80
가. 비타민 A	……………………………………………………………………	80
나. 비타민 B1	……………………………………………………………………	83
다. 비타민 B2	……………………………………………………………………	87
라. 비타민 C	………………………………………………………………………	89
마. 니코틴산(나이아신)	…………………………………………………………	93
바. 비타민 E	………………………………………………………………………	97
사. 비타민 D	………………………………………………………………………	100
아. 비타민 K1	………………………………………………………………………	103
자. 비타민의 미생물학적 분석법	………………………………………………	105
4. 발색제 및 보존료 시험법	…………………………………………………	116
가. 발색제	…………………………………………………………………………	116
(1) 아질산이온(NO2-)및 그 염류	……………………………………………	116

나. 보존료	…………………………………………………………………………	117
(1) 솔빈산(Sorbic acid) 및 그 염류	………………………………………	117
(2) 데히드로초산 및 그 염류	…………………………………………………	118
(3) 데히드로초산, 솔빈산 및 그 염류	………………………………………	120
(4) 프로피온산 및 그 염류	……………………………………………………	123
(5) 동시분석법(스크리닝법)	……………………………………………………	124
5. 산화방지제 시험법	…………………………………………………………	126
가. 부틸히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT)	………………	126
나. 몰식자산프로필	………………………………………………………………	127
다. 부틸히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT),
터셔리부틸히드로퀴논(TBHQ) 및 몰식자산프로필(PG)	…………	128
6. 착색료 시험법	………………………………………………………………	130
가. 타르색소(산성색소)	…………………………………………………………	130
나. 유용성 색소(유용성 타르색소 포함)	………………………………………	132
7. 유해성금속 시험법	…………………………………………………………	134
가. 시험용액의 조제	………………………………………………………………	134
나. 측정	……………………………………………………………………………	136
다. 금속별 시험	……………………………………………………………………	137
(1) 비소	……………………………………………………………………………	137
(2) 납	………………………………………………………………………………	139
(3) 주석	……………………………………………………………………………	141
(4) 동	………………………………………………………………………………	142
(5) 수은	……………………………………………………………………………	143
라. 중금속	……………………………………………………………………………	146
8. 이물시험법	……………………………………………………………………	147
가. 일반시험	………………………………………………………………………	147
나. 품목별 이물시험	………………………………………………………………	148
(1) 우유, 살균산양유, 탈지유, 가공유, 발효유등	……………………………	148
(2) 버터등	…………………………………………………………………………	149
(3) 아이스크림분말, 무당연유, 가당연유, 가당탈지연유, 전지분유, 탈지
분유, 가당분유 및 조제분유	…………………………………………………	149
(4) 식육가공품(납탄검사)	…………………………………………………………	149
(5) 아이스크림류	…………………………………………………………………	149
(6) 통조림	…………………………………………………………………………	149

9. 미생물 시험법	………………………………………………………………	151
가. 일반사항	…………………………………………………………………………	151
나. 시료채취 및 준비	……………………………………………………………	153
다. 세균수	…………………………………………………………………………	154
라. 세균발육시험	…………………………………………………………………	159
마. 대장균군수	……………………………………………………………………	160
바. 대장균수	………………………………………………………………………	163
사. 유산균수	………………………………………………………………………	165
아. 진균수	…………………………………………………………………………	167
자. 탄저균	…………………………………………………………………………	167
차. 결핵균	…………………………………………………………………………	168
카. 부루세라균	………………………………………………………………………	170
타. 병원성대장균	…………………………………………………………………	171
파. 살모넬라균	……………………………………………………………………	173
하. 리스테리아균	…………………………………………………………………	175
거. 캠필로박터균	…………………………………………………………………	176
너. 황색포도상구균	………………………………………………………………	178
더. 클로스트리디움	…………………………………………………………………	180
러. 장염비브리오	…………………………………………………………………	184
10. 체세포수 검사법	…………………………………………………………	186
11. 축산물 중 잔류물질 시험법	………………………………………………	188
가. 식육 및 식육가공품중의 잔류물질시험법	…………………………………	188
(1) EEC 4-plate법	………………………………………………………………	188
나. 원유 및 유가공품중의 잔류물질시험법	……………………………………	191
(1) 개량 TTC테스트(TTC-Ⅱ)	…………………………………………………	191
12. 내용량 시험법	…………………………………………………………………	195
가. 용량표시제품	…………………………………………………………………	195
나. 중량표시제품	…………………………………………………………………	195
다. 소포장제품	……………………………………………………………………	195
라. 아이스크림류	…………………………………………………………………	195
마. 통조림	…………………………………………………………………………	196
13. 진공도시험법	………………………………………………………………	197
14. 성상시험법(관능시험법)	……………………………………………………	198
15. 유전자재조합식품(GMO) 함유 축산물 검사법(스크리닝검사법)	…………………	199

Ⅳ. 원유․식육․원료알의 시험법	………………………………………	204
1. 원유의 시험법	………………………………………………………………	204
가. 관능검사	…………………………………………………………………………	204
나. 이화학적 시험법	………………………………………………………………	204
(1) 시료채취법	……………………………………………………………………	204
(2) 시험법	…………………………………………………………………………	204
(가) 수분 측정법	………………………………………………………………	204
(나) 지방 정량법	………………………………………………………………	204
(다) 회분 정량법	………………………………………………………………	204
(라) 단백질 정량법	……………………………………………………………	204
(마) 유당 정량법	………………………………………………………………	204
(바) 유고형분 정량법	…………………………………………………………	205
(사) 무지유고형분 정량법	……………………………………………………	205
(아) 유해성금속 시험법	………………………………………………………	205
(자) 신선도 시험법	……………………………………………………………	205
(차) 산도 시험법	………………………………………………………………	205
(카) 비중 측정법	………………………………………………………………	205
(타) 순수유지방 정량법(낙산가 측정법)	……………………………………	205
(파) 진애 시험법	………………………………………………………………	205
(하) 중화유 감별법	……………………………………………………………	206
(거) 가수유 감별시험법	………………………………………………………	207
(너) 두유감식 시험법	…………………………………………………………	208
다. 세균학적 시험법	………………………………………………………………	209
라. 체세포수 검사법	………………………………………………………………	209
2. 식육 시험법	…………………………………………………………………	210
가. 관능검사	………………………………………………………………………	210
(1) 실시요령	………………………………………………………………………	210
(2) 이상판정	………………………………………………………………………	211
나. 이화학적 시험법	………………………………………………………………	212
(1) 시료의 채취 및 조제법	……………………………………………………	212

(2) 시험방법	………………………………………………………………………	212
(가) 일반시험법	…………………………………………………………………	212
1) 수분 측정법	…………………………………………………………………	212
2) 회분 정량법	…………………………………………………………………	212
3) 지방 정량법	…………………………………………………………………	212
4) 단백질 정량법	………………………………………………………………	213
(나) 특수검사법	………………………………………………………………	213
1) 식육중의 기생충(선모충)검사법	…………………………………………	213
2) 식육감별법	…………………………………………………………………	214
3) 부패육검사법(신선도 검사법)	……………………………………………	223
다. 세균학적 시험법	………………………………………………………………	225
3. 원료알의 시험법	………………………………………………………………	229
가. 이화학적 시험법	………………………………………………………………	229
(1) 시료의 채취 및 조제	………………………………………………………	229
(가) 시료의 채취	………………………………………………………………	229
(나) 시료의 조제법	……………………………………………………………	229
(2) 시험법	…………………………………………………………………………	229
(가) 수분 측정법	………………………………………………………………	229
(나) 회분 정량법	………………………………………………………………	229
(다) 지방 정량법	………………………………………………………………	229
(라) 단백질 정량법	………………………………………………………………	230
(마) pH측정법	…………………………………………………………………	230
(바) 휘발성 염기질소 정량법	…………………………………………………	230
(사) 유해성금속 시험법	………………………………………………………	230
나. 관능검사법	……………………………………………………………………	230
(1) 외부검사법	……………………………………………………………………	230
(2) 내용검사법	……………………………………………………………………	231
(3) 비중에 의한 검사법	…………………………………………………………	231
(4) 관능검사 결과 식용부적합알 분류	…………………………………………	231
다. 세균학적 시험법	………………………………………………………………	232

Ⅴ. 가공품 시험법	…………………………………………………………	233
1. 유가공품	………………………………………………………………………	233
가. 우유류	…………………………………………………………………………	233
(1) 비중	……………………………………………………………………………	233
(2) 산도	……………………………………………………………………………	233
(3) 무지유고형분	…………………………………………………………………	233
(4) 유지방(Gerber법)	……………………………………………………………	233
(5) 세균수	…………………………………………………………………………	234
(6) 대장균군	………………………………………………………………………	234
(7) 포스파타제	……………………………………………………………………	234
(8) 유산균수	………………………………………………………………………	235
나. 저지방우유류	…………………………………………………………………	235
다. 유당분해우유	…………………………………………………………………	235
라. 가공유류	…………………………………………………………………………	235
마. 산양유	……………………………………………………………………………	235
바. 발효유류	………………………………………………………………………	235
사. 버터유류	………………………………………………………………………	236
아. 농축유류	………………………………………………………………………	236
자. 유크림류	………………………………………………………………………	237
차. 버터류	……………………………………………………………………………	237
카. 자연치즈	…………………………………………………………………………	239
타. 가공치즈	…………………………………………………………………………	239
파. 분유류	……………………………………………………………………………	240
하. 유청류	……………………………………………………………………………	240
거. 유당	……………………………………………………………………………	241
너. 유단백가수분해식품	…………………………………………………………	241
더. 조제유류	………………………………………………………………………	242
러. 아이스크림류	…………………………………………………………………	244
머. 아이스크림분말류	……………………………………………………………	244
버. 아이스크림믹스류	……………………………………………………………	244

2. 식육가공품 및 포장육	……………………………………………………	246
가. 공통사항(햄류‧소시지류‧베이컨류‧건조저장육류‧양념육류‧분쇄가공육제품‧갈비가공품‧포장육) ………………………………………………	246
나. 식육추출가공품	………………………………………………………………	250
다. 식용우지	………………………………………………………………………	250
라. 식용돈지	………………………………………………………………………	250
3. 알가공품	……………………………………………………………………	251
Ⅵ. 기구 및 용기․포장의 시험법	………………………………………	252
Ⅶ. 시약․시액․표준용액 및 용량분석용 규정시액	…………………	253
Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지	…………………………………………	267
Ⅸ. 부표	……………………………………………………………………	290
1. 벨트란 당류 정량표	…………………………………………………………	290
2. 레인․에이논 전화당 정량표	………………………………………………	292
3. 레인․에이논 유당 정량표	…………………………………………………	293
4. 우유 비중보정표	……………………………………………………………	295
5. 탈지우유 비중보정표	………………………………………………………	297
6. 산도 환산표	…………………………………………………………………	299
7. 3단계 희석 시험관 3개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수	………	300
8. 3단계 희석 시험관 5개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수	………	301
9. 난수표	…………………………………………………………………………	302
10. 한국인 1일 영양권장량(2000년 제7차 개정)	…………………………	305

제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격

1. 용어의 풀이

이 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 사용되는 용어들은 다음과 같다.

가. “정의”는 해당 개별축산물을 규정짓는 것으로서 “축산물가공품의 유형”에 분류되지 않은 축산물도 “정의”에 적합한 경우는 해당 개별축산물의 기준 및 규격을 적용할 수 있다.  그리고 “축산물가공품의 유형”에 “기타”항이 없는 경우도 “정의”에 적합한 축산물은 그 기준 및 규격에 의한다. 단, 별도의 개별기준‧규격이 정하여져 있는 경우는 그 기준 및 규격을 우선적으로 적용하여야 한다.

나. “……등”은 예시 개념으로 일반적으로 많이 사용하는 것을 기재하고 그 외에 관련된 것을 포괄하는 개념이다.

다. “A 또는 B”는 “A와 B”, “A나 B”, “A 단독” 또는 “B 단독”으로 해석할 수   있으며, “A, B, C 또는 D” 역시 그러하다.

라. “A 및 B”는 A와 B를 동시에 만족하여야 한다.

마. “적절한 ○○과정(공정)”은 개별축산물의 가공에 필요한 과정(공정)을 말하며 축산물의 안전성, 건전성을 얻으며 일반적으로 널리 통용되는 방법이나 과학적으로 충분히 입증된 방법을 일컫는다.

바. “식품 및 식품첨가물은 그 기준 및 규격에 적합하여야 한다”는 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전의 ‘식품일반에 대한 공통기준‧규격’, ‘식품별 기준‧규격’ 및 식품첨가물공전에 의한 ‘식품첨가물의 기준‧규격’에 적합하여야 함을 말한다.

사. “보관 관리되어야 한다”는 원료의 특성을 고려하여 그 품질이 최대로 유지될 수 있는 방법으로 보관하고 관리하여야 함을 말한다.

아. “가능한 한”, “권장한다”와 “할 수 있다”는 위생수준과 품질향상을 유도하기 위하여 설정하는 것으로 권고사항을 뜻한다.

자. “이와 동등이상의 효력을 가지는 방법”은 기술된 방법이외에 일반적으로 널리 통용되는 방법이나 과학적으로 충분히 입증된 것으로 위생학적 뿐만 아니라 영양학적, 관능적 품질의 유지가 가능한 방법을 말한다.

차. 정의 또는 축산물가공품의 유형에서 “○○%, ○○% 이상, 이하, 미만” 등으로 명시되어 있는 것은 성분배합기준으로서 원료배합시의 기준을 말한다.

카. “건조물(고형물)”은 원재료를 건조하여 남은 고형물로서 별도의 규격이 정하여지지 않은 한 수분함량이 15% 이하인 것을 말한다.

타. “액체축산물”은 외형이 액체로서 직접 음용하는 축산물을 말한다.

파. ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’에 수재된 축산물가공품외의 축산물은 해당 축산물의 정의, 가공기준, 주원료, 성상, 제품명 및 용도 등이 ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’에서 정하여진 축산물가공품에 해당되는 것으로 개별기준 및 규격에 부적합한 제품은 제외한다.

하. “유통기간”이라 함은 소비자에게 판매가능한 최대기간을 말하고 제품의 특성에 따라 설정한 유통기간 내에서 유통기한을 자율적으로 정할 수 있다. 다만, 표시된 유통기한내에서는 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 정하는 축산물의 기준 및 규격에 적합하여야 한다.

거. “충전․포장은 자동기계류를 사용하여야 한다.”는 소비자용인 경우에는 그러하나 다른 제품 가공용 원료 또는 업소용으로 공급될 경우는 오염이 방지되고 품질이 유지될 수 있는 위생적 포장방법을 사용할 수 있다.

너. “성분규격”은 최종제품에 대한 규격을 말한다.

더. “검출되어서는 아니된다”라 함은 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에 규정된 방법에 의하여 시험하여 검출되지 않는 것을 말한다.

러. “원료에서 유래되는”은 원료가 해당 기준 및 규격에 적합하거나 품질이 양호한 원료에서 불가피하게 유래되었음을 공인된 자료, 문헌으로 입증할 경우 인정할 수 있다.

머. 냉동‧냉장축산물의 보존온도는 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 따로 정하여진 것을 제외하고는 냉동은 -18℃(이하 온도의 표시는 셀시우스법(℃)을 쓴다)이하, 냉장은 0～10℃를 말한다.

버. “이물”이라 함은 정상축산물의 성분이 아닌 물질을 말하며 동물성으로 절족동물 및 그 알, 유충과 배설물, 설치류 및 곤충의 기식 흔적물, 동물의 털, 배설물, 기생충 및 그 알 등이 있고, 식물성으로 종류가 다른 식물 및 그 종자, 곰팡이, 짚, 겨 등이 있으며, 광물성으로 토사, 유리, 금속, 도자기파편 등이 있다.

서. “살균”이라 함은 따로 규정이 없는 한 세균, 효모, 곰팡이 등 미생물의 영양 세포를 사멸시키는 것을 말한다.

어. “멸균”이라 함은 따로 규정이 없는 한 미생물의 영양세포 및 포자를 사멸시켜 무균상태로 만드는 것을 말한다.

저. “밀봉”이라 함은 적절한 방법으로 용기 또는 포장 내 외부의 공기유통을 차단시키는 것을 말한다.

처. “가공품”이라 함은 축산물원료에 식품첨가물을 가하거나, 그 원형을 알아볼 수 없도록 분쇄․절단 등의 방법으로 변형시키거나, 이와 같이 변형시킨 것을 혼합하거나 또는 이와 같이 변형시키거나 서로 혼합한 것에 다른 식품이나 식품첨가물을 사용하여 가공한 제품을 말한다.

커. 여기서 정한 용어 이외의 용어 및 풀이는 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에 따른다.

터. 즉석섭취(Ready-to-eat) 축산물이라 함은 정상적으로 원상 그대로 섭취되거나, 어떠한 처리․가공․혼합․조리과정 또는 더 이상 리스테리아균의 살균 단계 없이 정상적으로 섭취되는 형태로 제조된 축산물을 말한다.

2. 원료 등의 구비요건

가. 축산물원료

(1) 원재료는 품질과 선도가 양호하고 부패‧변질되었거나, 유독․유해물질 등에 오염되지 아니한 것이어야 한다.

(2) 축산물가공 영업의 허가대상이 아닌 천연성 원료를 직접처리하여 축산물의 원료로 사용하는 때에는 흙, 모래, 티끌 등과 같은 이물을 충분히 제거하고 필요한 때에는 먹는물로 깨끗이 씻어야 하며 가공목적에 필요하지 아니한 비가식부분은 충분히 제거하여야 한다.

(3) 허가(신고)대상인 축산물을 구입 사용할 때에는 그에 대한 영업허가(신고)를 받았거나 수입신고를 마친 것으로서 해당축산물의 기준 및 규격에 적합한 것이어야 한다.

(4) 기준 및 규격이 정하여져 있는 식품, 식품첨가물, 수처리제 등은 그 기준 및 규격에, 원료소금은 염관리법에 적합한 것이어야 한다.

(5) 축산물을 축산물가공품의 원료로 사용하는 경우 축산물가공처리법 시행규칙 제12조의 검사기준에 적합한 것이어야 한다. 또한 생지방은 축산물가공처리법에 의하여 검사에 합격한 가축으로부터 식용을 목적으로 채취, 취급, 가공, 관리된 것으로 축산물가공처리법에 의한 도축업 또는 식육가공업 영업허가를 받았거나 축산물판매업 영업의 신고를 한 업소에서 위생적으로 채취한 것이어야 하며 정상의 유지성분 이외의 이물의 혼입이나 다른 동물의 지방조직 등이 혼합되지 아니한 위생적인 것이어야 한다.

(6) 다음에 해당되는 동‧식물성 기타 원재료는 가공용으로 사용하여서는 아니된다.

(가) 일반인들의 전래적인 식생활이나 통념상 식용으로 하지 아니하는 것.

(나) 식용을 목적으로 채취, 취급, 가공, 처리 또는 관리되지 아니한 것.

(다) 원료로서 안전성 및 건전성이 입증되지 아니한 것.

(라) 신개발원료로서 안전성에 대한 입증이나 또는 확인이 되지 아니한 것.

(마) 기타 농림부장관이 식용으로 부적당하다고 인정한 것.

(7) 조제유류의 원료성분은 영․유아가 섭취하기에 적합하도록 처리한 것이어야 한다.

(8) 조제유류의 원료는 방사선조사처리를 하지 아니한 것이어야 한다.

(9) 원료알은 직사광선을 피하여 냉소(0～15℃)에, 원유는 0～10℃에, 원료육은 냉장시 5℃이하, 냉동시는 -18℃이하에서 보존하여야 한다.

(10) 축산물의 제조․가공 등에 사용하는 원료알은 부패된 알, 산패취가 있는 알, 곰팡이가 생긴 알, 이물이 혼입된 알, 혈액이 함유된 알, 내용물이 누출된 알, 난황이 파괴된 알 (단, 물리적 원인에 의한 것은 제외한다), 부화를 중지한 알 등 식용에 부적합한 알이 아니어야 한다.

나. 기구 및 용기‧포장

(1) 축산물의 용기‧포장은 식품위생법령의 규정에 의한 용기‧포장류 제조업 신고를 필한 업소에서 제조한 것이어야 한다 (다만, 그 자신의 제품을 포장하기 위하여 용기‧포장류를 직접 제조하는 경우는 제외한다).

(2) 기구 및 용기‧포장류는 그 기준 및 규격에 적합한 것이어야 한다.

3. 사용할 수 있는 식품 또는 식품첨가물

축산물에 사용되는 식품 또는 식품첨가물은 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전 및 식품첨가물공전에 따른다.

4. 축산물의 주원료

가. “주원료”는 해당 개별 축산물의 주용도, 제품의 특성 등을 고려하여 다른 축산물과 구별, 특징짓게 하기 위하여 사용되는 원료를 말한다

나. 제2. 축산물별 기준 및 규격에서 원료 배합시의 기준이 정하여진 가공품은 그 기준에 의하고, 개별 기준 및 규격이 정하여지지 아니한 경우에는 해당 제품의 원료성분 중 가장 많은 원료비율(%)의 원료를 말한다(물이나 부형제는 제외할 수 있다). 다만, 어떤 원료 배합시의 기준이 100%인 경우에는 식품첨가물의 함량을 제외한다.

다. 원료 배합시의 기준에는 제품의 특성에 따라 첨가되는 배합수는 제외하며, 물을 첨가하여 복원되는 건조 또는 농축된 축산물의 경우는 복원상태의 성분 및 함량비(%)로 환산 적용한다.

5. 축산물의 가공기준

가. 일반기준

(1) 축산물 처리․가공․포장에 사용되는 기계․기구류와 부대시설물은 항시 위생적으로 유지․관리하여야 하며, 원료와 직접 접촉하는 기계 또는 기구류는 세척이 용이하고 내부식성의 재질이어야 하며 작업 전․후에 위생적으로 세척 및 살균하여야 한다.

(2) 축산물 처리․가공에 사용하는 물은 먹는물관리법의 수질기준에 적합한 것이어야 한다.

(3) 축산물 처리․가공‧포장과정 중에는 가능한 한 이물의 혼입이나 병원 미생물 등에 오염되지 않도록 적절한 예방대책을 강구하여야 한다.

(4) 냉동된 원료의 해동은 위생적으로 실시하여야 한다.

(5) 상온에서 장기보존이 어려운 축산물은 제품의 특성에 따라 냉장, 냉동하거나 적정한 방법으로 살균 또는 멸균처리하여야 한다.

(6) 가공 중에는 수시로 자가품질관리를 실시하여야 한다.

(7) 축산물의 처리․가공․포장․보존 및 유통 중에는 항생물질, 합성항균제, 홀몬제를 사용할 수 없다.

(8) 축산물 처리․가공 중 건조, 농축, 열처리, 냉각 또는 냉동 등의 공정은 제품의 영양성, 안전성을 고려하여 적절한 방법으로 실시하여야 한다.

(9) 축산물의 용기‧포장을 회수하여 재사용하고자 하는 때에는 음용수 등으로 깨끗이 세척하여 일체의 불순물 등이 잔류하지 아니하였음을 확인한 후 사용하여야 한다.

(10) 원유(原乳)는 이물을 제거하기 위한 청정공정과 필요한 경우 유지방구의 입자를 미세화하기 위한 균질공정을 거쳐야 한다.

(11) 유가공품의 살균 또는 멸균 공정은 따로 정하여진 경우를 제외하고 저온장시간살균법(63～65℃에서 30분간), 고온단시간 살균법(72～75℃에서 15초내지 20초간), 초고온순간처리법(130～150℃에서 0.5초내지 5초간) 또는 이와 동등 이상의 효력을 가지는 방법으로 실시하여야 한다. 그리고 살균제품에 있어서는 살균 후 즉시 10℃이하로 냉각하여야 하고, 멸균제품은 멸균한 용기 또는 포장에 무균공정으로 충전․포장하여야 한다.

(12) 식육가공품(식육추출가공품, 식용우지, 식용돈지는 제외) 중 가열식육가공품 (비가열식육가공품과 건조식육가공품 이외의 것을 말한다)은 그 중심부 온도를 63℃이상에서 30분간 가열살균하거나 또는 이와 동등이상의 효력이 있는 방법으로 가열살균하여야 하며, 멸균식육가공품은 기밀성이 있는 용기‧포장에 넣은 후 밀봉한 제품의 중심부 온도를 120℃이상에서 4분이상 멸균처리하거나 또는 이와 동등이상의 멸균처리를 하여야 한다.

(13) 축산물은 용기 또는 포장에 넣어 가능한 한 신속하게 포장하고, 미생물의 오염이 방지되도록 위생적으로 포장하여야 하며, 멸균제품은 멸균한 용기 또는 포장에 무균공정으로 충전․포장하여야 한다.

(14) 건조된 제품은 수분의 흡수 및 오염이 방지될 수 있도록 신속히 밀봉 포장 하여야 한다.

(15) 식품첨가물은 소기의 목적을 달성할 수 있는 최소량을 사용하여야 한다.

(16) 식염으로는 재제염 또는 정제염을 사용하여야 하며 천일염으로 염수를 제조하는 때에는 이물이 제거될 수 있도록 충분히 정제하고, 원료의 전처리 과정에는 천일염을 사용할 수 있으나 이때에는 불순물 등이 축산물에 이행되지 않도록 하여야 한다.

(17) 원료의 전처리는 저장장소와 분리되어 있는 별도의 장소에서 실시하여야 하며, 원료처리의 각 공정은 오염방지를 적절히 하고 신속히 다음 공정으로 연결되어야 한다.

(18) 축산물에 사용하는 식용유지는 신선한 것이어야 한다.

(19) 냉동은 가능한 한 개별 급속냉동하여야 한다.

(20) 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 규정하는 축산물의 가공기준보다 더 위생적이거나 타당성이 있을 때에는 그 방법에 의하여 가공할 수 있다.

나. 개별기준

(1) 병‧통조림 축산물

(가) 원료는 청결한 전용용기에 담아 운반하여야 하며 제품의 특성에 따라 성형한 후 외형이 손상되지 않도록 관 또는 병에 살재임하여야 한다

(나) 조미액은 미생물의 오염이 방지되도록 충분히 살균 또는 멸균한 후 적정온도로 주액하여야 한다

(다) 제품의 보존성을 확보하기 위하여 적절한 온도에서 탈기한 후 밀봉하여야 한다.

(라) 제품은 저장성을 가질 수 있도록 그 특성에 따라 적절한 방법으로 살균 또는 멸균처리하여야 하며, 살균 또는 멸균한 후 내용물의 변색이 방지되고 호열성 세균의 증식이 억제될 수 있도록 적절한 방법으로 냉각하여야 한다.

(마) 멸균은 제품의 중심온도가 120℃에서 4분간 또는 이와 동등이상의 효력을 갖는 방법으로 열처리하여야 한다.

(바) 제조․가공시 제품의 특성에 따라 영양소 및 비타민 등의 파괴를 최소화 할 수 있도록 관리하여야 한다.

(사) 밀봉이 적합한가를 보증하기 위하여 롯드별 무작위 추출한 통조림관에 대해 육안검사와 권체 관리의 파괴 검사를 철저히 하여야 한다.

(2) 레토르트축산물

(가) 가공공정은 제품의 특성에 따라 영양소 및 비타민 등의 파괴를 최소화 할 수 있도록 실시하여야 한다.

(나) 밀봉이 끝나면 제품의 저장성을 확보할 수 있도록 그 특성에 맞는 적절한 방법으로 살균하여야 한다. 다만, pH가 4.5이상이고 수분활성도가 0.94이상인 제품은 중심부의 온도를 120℃에서 4분 또는 동등이상의 효력이 있는 방법으로 멸균하여야 한다.

(다) 멸균후 제품은 내용물의 변색이 방지되고 호열성 세균의 증식이 억제될 수 있도록 적절한 방법으로 냉각시켜야 한다.

(라) 보존료는 일절 사용하여서는 아니된다.

(3) 우유류, 저지방우유류

(가) 우유 및 저지방우유에 강화제를 보강하는 경우에는 열안정성과 미생물 오염을 고려하여 적절한 시기에 첨가하여야 한다.

(나) 우유류는 유지방을 감하여 표준화할 수 있다.

(다) 우유류 및 저지방우유류에는 일체의 다른 물질을 혼합하여서는 아니된다. 다만, 환원우유 및 환원저지방우유에 있어서는 원유와 유사한 것을, 강화우유, 강화저지방우유 및 환원강화저지방우유에 있어서는 비타민, 무기질을 가할 수 있다.

(4) 발효유류

(가) 배합된 원료(유산균, 효모는 제외한다)는 살균 또는 멸균, 냉각공정을 거친 후 이종 미생물이 오염되지 않도록  유의하여야 한다.

(나) 유산균 또는 효모는 적절한 온도를 유지하여 배양 또는 발효하여야 한다.

(다) 발효유류는 냉동공정을 거칠 수 있다.

(5) 버터유류

(가) 가공 중 식품첨가물을 사용할 수 없다.

(6) 농축유류

(가) 유당을 석출방지에 사용하는 때에는 미세한 분말로서 미생물의 오염을 방지할 수 있도록 처리하여야 한다.

(나) 농축유류에는 일체의 다른 물질을 가하여서는 아니된다.  다만, 가당연유와 가당탈지연유에 있어서는 당류(설탕,포도당,과당)를, 가공연유에 있어서는 식품 또는 식품첨가물을 가할 수 있다.

(7) 유크림류

(가) 살균 또는 멸균공정은 저온장시간살균법(65～68℃에서 30분간), 고온단시간 살균법(74～76℃에서 15초내지 20초간), 초고온순간처리법(130～150℃에서 0.5초내지 5초간) 또는 이와 동등이상의 효력을 가지는 방법으로 실시하여야 한다.

(나) 유크림(가공유크림, 분말유크림은 제외한다)에는 일체의 다른 물질을 가하여서는 아니된다.

(8) 버터류

(가) 발효버터 가공 시에는 이종 미생물이 오염되지 않도록 충분한 주의를 하여야 한다.

(나) 원하는 조직과 수분함량을 가질 수 있도록 교반시의 온도 및 시간관리를 철저히 하여야 한다.

(9) 자연치즈

(가) 치즈용 원유 및 유가공품은 63～65℃에서 30분간, 72～75℃에서 15초간 이상 또는 이와 동등 이상의 효력을 가지는 방법으로 살균하여야 한다.

(나) 유산균 접종 시 이종 미생물에 2차 오염이 되지 않도록 하고, 산도 및 시간 관리를 철저히 하여야 한다.

(다) 발효 또는 숙성 시에는 표면에 유해미생물이 오염되지 않도록 숙성실의 온도 및 습도관리를 철저히 하여야 한다.

(10) 가공치즈

(가) 자연치즈는 분쇄전 표면의 곰팡이 등 이물을 제거한 후 사용하여야 한다.

(나) 자연치즈는 분쇄한 후 균일한 조직이 되도록 충분히 교반 유화시켜야 한다.

(다) 경성가공치즈는 사용하는 원료치즈 이외의 유가공품은 10%이하로 제조하여야 한다.

(라) 유화, 살균이 끝난 치즈믹스는 가능한 한 2차오염이 되지 않도록 신속히 충전‧포장하여야한다.

(마) 보존료를 첨가할 경우에는 자연치즈에서 유래되는 보존료의 양을 고려하여 사용 기준양이 초과되지 않도록 주의를 기울여야 한다.

(11) 분유류

(가) 혼합분유 이외의 분유류에는 일체의 다른 물질을 가하여서는 아니된다. 다만, 가당분유에 있어서는 당류(설탕, 과당, 포도당)를 가할 수 있다.

(12) 유당

(가) 고온으로 가열하거나 응고제를 가하여 탄수화물 이외의 단백질 또는 유지방분 등을 충분히 제거하여야 한다.

(나) 이온교환공정을 거쳐서 염류 성분을 최대한 제거한 후 분말화하여야 한다.

(13) 유단백가수분해식품

(가) 가수분해시 산 또는 효소를 적정량 사용하고 산 가수분해의 경우 사용된 산을 제거 또는 중화시켜야 한다.

(나) 산 가수분해에 사용되는 산은 염산에 한한다.

(다) 최종제품 완성 전에 적절한 살균 또는 멸균공정을 거쳐야 한다.

(14) 조제유류

(가) 열에 쉽게 파괴되는 비타민류나 용해가 잘 되지 않는 무기질류를 살균 전에 용액에 첨가할 경우에는 비타민의 파괴율 및 무기질의 용해도를 감안하여 적절한 방법으로 실시하여야 한다.

(나) 첨가하는 비타민류, 무기질류, 영양성분 등은 제품 중에 균일하게 혼합하여야 한다.

(다) 조제우유, 성장기용 조제우유, 기타조제우유의 경우는 건조된 분말 또는 이에 비타민류, 무기질류 등을 정확한 농도로 가하여 멸균, 균질, 냉각하고 무균적으로 포장하여야 한다.

(라) 조제분유, 성장기용 조제분유, 기타조제분유는 질소가스를 넣어 자동포장공정으로 충전하여야 한다.

(마) 모유에 들어있는 영양소를 첨가하기 위하여 또는 영․유아의 유일한 영양공급원으로서 적합하도록 하기 위하여 필요한 경우 다른 영양소를 첨가할 수 있다. 단, 해당 영양소의 유용함이 과학적으로 입증된 것이어야 하며 첨가량은 모유를 표준으로 하여야 한다.

(바) 조제유류는 방사선조사 처리를 하지 않아야 한다.

(사) 유성분에 대하여 대사장애 또는 알레르기를 일으키는 영‧유아를 위한 제품은 성분규격 중 유성분의 적용을 받지 아니하고 가공할 수 있다.

(15) 아이스크림류, 아이스크림믹스류, 아이스크림분말류

(가) 계란을 사용할 경우에는 할란전에 계란표면을 세척‧살균하여야 한다.

(나) 제품의 조직감이 증진되도록 유지방구 크기를 2㎛이하로 균질 처리함을 권장한다.

(다) 살균은 68.5℃에서 30분이상 또는 이와 동등이상의 효력을 가지는 방법으로 실시하여야 한다(단, 유산균 함유제품은 필요한 경우 살균공정을 제외할 수 있다).

(라) 살균처리 후에 다른 원재료를 가하는 때에는 미생물이 오염되지 않도록 유의하여야 한다.

(마) 아이스크림류 등의 제조시 최종제품의 무지유고형분은 탈지분유와 성분규격이 같은 것을 75%(중량기준으로 한다)이상 함유하여야 한다.

(16) 식육가공품(식용우지, 식용돈지, 식육추출가공품제외) 및 포장육

(가) 비가열식육가공품(중심부의 온도를 63℃이상에서 30분간 가열하거나 또는 이와 동등이상의 효력이 있는 방법으로 가열살균하지 아니한 가공품)은 다음의 기준에 적합한 방법이나 이와 동등이상의 효력이 있는 방법으로 관리하여야 한다(단, 건조식육가공품은 제외).

1) 원료육으로 사용하는 돼지고기는 도살 후 24시간 이내에 5℃이하로 냉각‧유지하여야 한다.

2) 원료육의 정형이나 냉동 원료육의 해동은 고기의 중심부 온도가 10℃를 넘지 않도록 하여야 한다.

(나) 작업장의 실내온도는 15℃이하로 유지 관리하여야 한다(다만, 가열처리작업장은 제외).

(다) 공정상 특별한 경우를 제외하고는 가능한 한 신속히 가공하여야 한다.

(라) 포장육은 일체의 첨가물을 사용하여서는 아니된다.

(마) 소시지류에서 건조는 수분 35%이하, 반건조는 수분 55%이하, 건조저장육류에서 건조는 수분 55%이하로 가공한 것을 말한다.

(17) 식육추출가공품

(가) 추출시 적절한 여과공정을 거쳐야 한다.

(나) 원료를 추출할 경우에는 물을 용제로 하여 원료의 특성에 따라 적절한 방법을 사용하여야 한다.

(다) 액상, 시럽상 또는 페이스트상 제품의 경우 제품의 특성에 따라 적절한 방법으로 살균하여야 한다.

(18) 식용우지․식용돈지

(가) 소 및 돼지의 지방조직으로부터 적절한 방법으로 채유한 원료우지 및 원료돈지는 탈검, 탈산, 탈색, 탈취의 정제공정을 거치거나 이와 동등이상의 복합정제공정을 거쳐야 한다.

(나) 제조공정 중 사용된 수산화나트륨 등이 최종제품에 잔류하지 않도록 처리하여야 한다.

(다) 생지방, 원료우지 및 원료돈지는 필요에 따라 이화학적 검사를 행한 후 사용하여야 한다.

(라) 과열은 제품의 품질에 나쁜 영향을 미치므로 지나치게 과열하지 않도록 하여야 한다.

(마) 원료우지, 원료돈지의 포장 또는 운반용기는 같이 사용할 수 없으며, 용기‧포장은 내용물의 유출, 산화방지 및 오염 등을 방지할 수  있는 위생적인 것이어야 한다.

(19) 알가공품

(가) 할란은 오염이 되지 않도록 구획된 작업장에서 위생적으로 실시하여야 한다.

(나) 난각이 분변 등에 오염된 알을 사용하는 경우에는 깨끗이 세척하는 동시에 150ppm이상의 차아염소산 나트륨으로 살균 또는 이와 동등 이상의 효력이 있는 방법으로 살균하여야 한다.

(다) 살균란은 여과, 균질 및 살균공정을 거쳐야 한다.

(라) 제품의 특성에 따라 살균온도 및 시간관리를 철저히 하여야 한다. 특히 알가열성형제품에 있어서는 90℃에서 20분간, 전란액은 64℃에서 2분 30초간, 난황액은 60℃에서 3분 30초간, 난백액은 55℃에서 9분 30초간 가열살균하거나 또는 이와 동등이상의 효력이 있는 방법으로 가열살균하여야 한다.

(마) 건조제품에 있어서는 제품의 변색․변성 등이 방지되도록 알 중의 당성분을 제거한 후 건조하여야 한다.

(바) 비살균제품은 할란 후 속히 5℃이하로 냉각하여야 하며, 48시간 이상 보관 시는 0℃이하에 보관하여야 한다.

(사) 살균제품은 모두 미생물의 증식을 극소화시킬 수 있도록 5℃이하에 신속히 냉각시켜야 한다.

6. 축산물의 성분규격

가. 일반규격

(1) 식품첨가물

(가) 축산물 중의 식품첨가물 사용기준은 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품첨가물 공전에 의한다

(나) 어떤 축산물에 사용할 수 없는 식품첨가물이 그 식품첨가물을 사용할 수 있는 원료에서 유래되었을 경우에는 그 축산물 중의 식품첨가물 함유는 원료로부터 이행된 범위안에서 첨가물 사용기준의 제한을 받지 아니할 수 있다.

(2) 이물

(가) 축산물은 원료의 처리과정에서 그 이상 제거되지 아니하는 정도 이상의 이물과 오염된 비위생적인 이물과 인체에 위해를 끼치는 단단하거나 날카로운 이물을 함유해서는 아니된다. 다만, 고배율 현미경으로 존재가 확인되는 미세한 것과 다른 식물이나 원료식물의 표피 또는 토사 등과 같이 실제에 있어 정상적인 처리․가공상 완전히 제거되지 아니하고 잔존하는 경우의 이물로서 그 양이 적고 일반적으로 인체의 건강을 해할 우려가 없는 정도는 제외한다.

(나) 금속이물은 2mm 그리고 비금속 이물은 3mm를 초과하여서는 아니되며, 2～3mm이하의 미세입자인 경우에도 영․유아에게 유해할 가능성이 있다고 판단되는 경우에는 축산물위생심의위원회의 심의를 통하여 적부를 결정할 수 있다.

(3) 식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 가공품에서는 특성에 따라 살모넬라(Salmonella spp), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)등 식중독균이 검출되어서는 아니된다.

(4) 항생물질 등의 잔류허용기준

(가) 축산물 중의 항생물질, 합성항균제, 합성홀몬제 및 농약의 잔류허용 기준은 보건복지부장관이 농림부장관과의 협의를 거쳐 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에서 정한 바에 따른다.

(나) 잔류허용기준이 정하여진 축산물을 원료로 한 가공품은 그 원료의 잔류허용기준범위 이내에서 이행된 항생물질 등의 잔류를 허용할 수 있다.

(5) 축산물의 방사선 조사기준 및 방사능 잠정허용기준은 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에 따른다.

나. 병․통조림축산물의 성분규격

병․통조림축산물이라 함은 축산물을 관 또는 병에 넣어 탈기와 밀봉 및 살균 또는 멸균하여 상당기간동안 내용물인 축산물 고유의 품질이 보존되도록 가공한 것을 말한다.

(1) 성상 : 관 또는 병 뚜껑이 팽창 또는 변형되었거나 녹이 슬어서는 아니되며, 내용물은 고유의 색택을 가지고 이미․이취가 없어야 한다.

(2) 진공도(cmHg) : 적당한 진공도를 가져야 한다.(다만, 알루미늄 재질로 원터치캔의 경우는 제외한다)

(3) 주석(mg/kg) : 150이하

(4) 납(mg/kg) : 0.3이하

(5) 세균 : 세균발육이 음성이어야 한다(단, 멸균제품에 한한다).

(6) 고형량 및 내용량 : 표시량 이상이어야 한다.

다. 레토르트축산물의 성분규격

레토르트(retort)축산물이라 함은 단층 플라스틱필름이나 금속박 또는 이를 여러층으로 접착하여, 파우치와 기타 모양으로 성형한 용기에 가공한 식육가공품․알가공품을 충전하고 밀봉하여 가압가열멸균 또는 살균한 것으로 직접 또는 간단한 처리로 식용이 가능하며 보존성이 높고 휴대와 운반이 용이하도록 인스턴트화한 것을 말한다.

(1) 성상 : 외형이 팽창, 변형되었거나 이물이 부착되어 있어서는 아니되며, 내용물은 고유의 향미, 색택, 물성을 가지고 이미․이취가 없어야 한다.

(2) 세균 : 세균발육이 음성이어야 한다(단, 멸균제품에 한한다).

(3) 타르색소 : 검출되어서는 아니된다.

라. 제2. 축산물기준 및 규격 외의 축산물 규격

(1) 성상 : 적합하여야 한다.

(2) 이물 : 적합하여야 한다.

(3) 대장균군 : 음성이어야 한다(살균제품에 한한다).

(4) 세균수 : 음성이어야 한다(멸균제품에 한한다).

(5) 타르색소 : 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품첨가물공전 사용기준에 적합하여야 한다(단, 식품첨가물공전 사용기준에 적용되는 축산물에 한한다).

(6) 합성보존료 : 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품첨가물공전 사용기준에 적합하여야 한다(단, 식품첨가물공전 사용기준에 적용되는 축산물에 한한다).

(7) 산화방지제 : 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품첨가물공전 사용기준에 적합하여야 한다(단, 식품첨가물공전 사용기준에 적용되는 축산물에 한한다).

7. 축산물의 기준 및 규격의 적용

이 축산물의 가공기준 및 성분규격에 수재된 기준 및 규격은 제품명, 성상 , 주원료 및 원료배합시의 기준, 제조방법 및 용도 등에 의하여 적합하게 표시된 가공품의 유형에 따라 적용하여야 하며, ‘제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격’은 ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’에서 정하여진 축산물을 포함한 모든 축산물에 다음과 같이 적용한다.

가. ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’이 정하여진 가공품은 그 기준 및 규격을 우선 적용하여야 하며, ‘제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격’을 함께 적용하는 것을 원칙으로 한다. 다만, 축산물의 특성을 고려할 때 ‘제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격’ 중 필요성이 희박하거나, 실효성이 적은 경우에는 그 중요도에 따라 선별 적용할 수 있다.

나. ‘제2.축산물별 기준 및 규격’이 정하여지지 아니한 축산물은 ‘제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격’을 적용하여야 한다. 다만, 6. 축산물의 성분규격 가. 일반규격 중 (3)식중독균, (4)항생물질 등의 잔류허용기준, (5)축산물의 방사선 조사기준 및 방사능 잠정허용기준은 위 가.의 단서 규정과 같이 선별 적용할 수 있다.

다. 나.의 규정에도 불구하고 ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’이 정하여지지 아니한 축산물 중 ‘병․통조림축산물’, ‘레토르트축산물’과 ‘제2. 축산물별 기준 및 규격 외의 축산물’은 6.축산물의 성분규격 중 각각의 ‘나. 병․통조림축산물의 성분규격’, ‘다. 레토르트축산물의 성분규격’, ‘라. 제2. 축산물별 기준 및 규격외의 축산물 규격’을 우선 적용하여야 하며, 축산물의 특성에 따라 6.축산물의 성분규격 중 ‘가. 일반규격’을 선별 적용할 수 있다.

라. 이 축산물의 가공기준 및 성분규격의 ‘제2. 축산물별 기준 및 규격’에서 그 기준 및 규격이 정하여진 가공품과 그 외의 축산물으로서 ‘병․통조림축산물’, ‘레토르트축산물’에 해당하는 가공을 한 경우에는 해당 축산물의 기준 및 규격과 함께 ‘병․통조림축산물’, ‘레토르트축산물’ 각각의 기준 및 규격을 적용하여야 한다. 다만, 기준 및 규격 항목이 중복될 경우에는 강화된 기준 및 규격 항목을 적용 (단, 병․통조림축산물, 레토르트축산물로 가공한 축산물의 성분규격 중 미생물 항목은  6. 축산물의 성분규격 중 각각의 ‘나. 병․통조림축산물의 성분규격’, ‘다. 레토르트축산물의 성분규격’에 의한다)하여야 한다.

마. 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에서 정하지 않은 기준 및 규격은 CODEX 규정에 따른다.

8. 보존 및 유통기준

가. 모든 축산물은 위생적으로 취급 판매하여야 하며, 그 보관 및 판매장소가 불결한 곳에 위치하여서는 아니된다.

나. 축산물의 취급장소는 비‧눈 등으로부터 보호될 수 있어야 하며, 인체에 유해한 화공약품, 농약, 독극물 등과 같은 것을 함께 보관하지 말아야 한다.

다. 이물이 혼입되지 않도록 주의하여야 하며 제품의 풍미에 영향을 줄 수 있는 다른 식품 및 식품첨가물 등과는 분리 보관하여야 한다.

라. 제품은 서늘한 곳에서 보관 유통하여야 하며 상온에서 7일 이상 보존성이 없는 식품은 가능한 한 냉장 또는 냉동 시설에서 보관 유통하여야 하며 냉동제품은 품질변화가 최소화할 수 있도록 냉동시켜야 하고 녹은 냉동제품을 재냉동 시켜서는 아니된다.

마. 우유류, 저지방우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 버터유류, 농축유류 및 유청류의 살균제품은 0～10℃에 보관하여야 하고, 발효유류는 0～10℃에서 냉장보관 또는 냉동제품은 -15℃이하에 보관하여야 하며, 자연치즈 및 가공치즈의 냉장제품은 0～10℃, 냉동제품은 -18℃이하에서, 버터류는 냉동 또는 냉장 보관하여야 한다.

바. 식육가공품 및 포장육의 보존온도는 냉장 제품은 -2～10℃, 냉동제품은 -18℃이하에서 보존 유통하여야 한다.  다만, 멸균식육가공품 또는 건조 식육가공품 등은 실온에서 보관할 수 있다.

사. 식용란은 가능한 한 냉소에, 알가공품은 10℃이하(다만, 액란제품은 5℃이하)에서 냉장 또는 냉동 보관 유통하여야 한다. 다만, 건조, 당장, 염장 등 부패를 막을 수 있도록 가공된 제품은 냉장 또는 냉동하지 않을 수 있다.

아. 즉석섭취(Ready-to-eat) 축산물 중 냉장제품의 권장 보관 및 유통 온도는 6℃이하로 한다.

자. 냉동 또는 냉장제품의 운반은 적절한 온도를 유지할 수 있는 냉동 또는 냉장차량이거나 이와 동등 이상의 효력이 있는 방법으로 한다.

차. 흡습의 우려가 있는 제품은 흡습이 되지 않도록 주의하여야 한다.

카. 축산물판매자는 평상시의 판매량 등을 고려하여 지나친 물량 구입을 자제하고, 먼저 가공한 제품을 우선으로 출하하거나 판매하여야 한다.

타. 소비자로부터 불량제품에 대한 신고를 받았을 때에는 그 원인을 조사하여 소비자 권익보호에 최선을 다하여야 한다.

파. 포장축산물은 재분할 판매하지 말아야 하며, 표시대상 축산물인 경우 표시가 없는 것을 구입하거나 판매하지 말아야 한다.

하. 보관과정 중의 부주의로 인하여 부패‧변질 또는 파손된 제품은 가공업소측에 반품교환 하거나 폐기처분 하여야 한다.

거. “유통기간”의 산출은 포장완료(단, 포장 후 가공공정을 거치는 제품은 최종공정을 마친)시점으로 하고 선물셋트와 같이 유통기한이 상이한 제품이 혼합된 경우에는 유통 기한이 짧은 제품을 전체 제품의 유통기한으로 정하여야 한다. 원료제품의 저장성이 변하지 않는 단순가공 처리만을 하는 제품은 원료제품의 포장시점을 유통기간 산출시점으로 하여야 한다.

너. 냉동제품을 해동시켜 실온 또는 냉장제품으로 유통시켜서는 아니된다.

더. 제품의 유통기간 설정은 당해제품의 축산물가공업영업자, 식육포장처리업영업자(수입축산물의 경우에도 정하여진 유통기간 내에서 수입자)가 포장재질, 보존조건, 가공방법, 원료배합비율 등 제품의 특성과 냉장 또는 냉동보존 등 기타 유통실정을 고려하여 위해방지와 품질을 보장할 수 있도록 정하여야 한다.

제2. 축산물별 기준 및 규격

1. 유가공품

유가공품이라 함은 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 가공한 우유류, 저지방우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터류, 치즈류, 분유류, 유청류, 유당, 유단백가수분해식품, 조제유류, 아이스크림류, 아이스크림분말류, 아이스크림믹스류등의 제품을 말한다.

가. 우유류

(1) 정의

우유류라 함은 원유 또는 원유에 비타민이나 무기질을 강화하여 살균 또는 멸균처리한 것이거나, 살균 또는 멸균 후 유산균, 비타민, 무기질을 무균적으로 첨가한 것 또는 유가공품으로 원유성분과 유사하게 환원한 것을 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 우유 : 원유를 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다(원유 100%).

(나) 강화우유 : 우유에 비타민 또는 무기질을 강화한 것을 말한다(원유 100%, 단, 강화제 제외).

(다) 환원유 : 유가공품으로 원유성분과 유사하게 환원하여 살균 또는 멸균처리한 것으로 유고형분(전지분유와 성분규격이 같은 것) 11% 이상의 것을 말한다.

(라) 유산균첨가우유 : 우유에 유산균을 첨가한 것을 말한다(원유 100%, 단, 유산균 제외).

(3) 성분규격

(가) 성상 : 유백색～황색의 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 비중(15℃) : 1.028～1.034

(다) 산도(%) : 0.18이하(젖산으로서)

(라) 무지유고형분(%) : 8.0이상

(마) 유지방(%) : 3.0이상

(바) 세균수 : 1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다. 단, 유산균첨가제품의 경우 유산균수를 제외한다)

(사) 대장균군 : 1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

(아) 포스파타제 : 음성이어야 한다(저온장시간 살균제품, 고온단시간 살균제품에 한한다).

(자) 유산균수 : 1㎖당 1,000,000이상(단, 유산균 첨가제품에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

나. 저지방우유류

(1) 정의

저지방우유류라 함은 원유의 유지방분을 부분 제거한 것, 이에 비타민이나 무기질을 강화한 것을 살균 또는 멸균처리한 것, 살균 또는 멸균 후 유산균, 비타민, 무기질을 무균적으로 첨가한 것, 또는 유가공품을 저지방상태로 환원하여 각각 살균 또는 멸균 처리한 것을 말한다

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 저지방우유

원유의 유지방분을 2%이하로 조정하여 살균 또는 멸균한 것을 말한다(원유 100%).

(나) 환원저지방우유

유가공품으로 저지방우유와 유사하게 환원한 것으로 무지유고형분(탈지분유와 성분규격이 같은 것)  8% 이상의 것을 말한다.

(다) 강화저지방우유

저지방우유에 비타민 또는 무기질을 강화한 것을 말한다(원유 100%, 단, 강화제 제외).

(라) 환원강화저지방우유

유가공품으로 저지방우유와 유사하게 환원한 것에 비타민, 무기질을 강화한 것으로 무지유고형분(탈지분유와 성분규격이 같은 것) 8% 이상의 것을 말한다.

(마) 유산균첨가저지방우유

저지방우유에 유산균을 첨가한 것을 말한다(원유 100%, 단, 첨가유산균 제외).

(3) 성분규격

(가) 성상 : 유백색～황색의 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 비중(15℃) : 1.030～1.045

(다) 산도(%) : 0.18이하(젖산으로서)

(라) 유지방(%) : 2.0이하

(마) 무지유고형분(%) : 8.0이상

(바) 세균수 : 1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판 배양법에 의할 때 음성이어야 한다. 단, 유산균 첨가제품의 경우 유산균수를 제외한다)

(사) 대장균군 : 1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

(아) 포스파타제 : 음성이어야 한다(저온장시간 살균제품, 고온단시간 살균제품에 한한다).

(자) 유산균수 : 1,000,000이상(단, 유산균첨가제품에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

다. 유당분해우유

(1) 정의

유당분해우유라 함은 원유, 우유 또는 저지방우유를 유당분해효소로 처리하여 유당을 분해 또는 유당을 물리적으로 제거한 것이나, 이에 비타민, 무기질을 강화한 것으로 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다(원유, 우유 또는 저지방 우유 100%).

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 유당분해우유 : 원유의 유당을 분해 또는 제거한 것이나, 이에 비타민, 무기질을 강화한 것으로 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다.

(나) 저지방유당분해우유 : 원유의 유당을 분해 또는 제거하여 유지방분을 2%이하로 조정한 것이나, 이에 비타민, 무기질을 강화한 것으로 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다.

(3) 성분규격

(가) 성상 : 유백색 내지 황색의 균질한 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 산도(%) : 0.18이하(젖산으로서)

(다) 유당(%) : 1.0이하

(라) 유지방(%) : 3.0이상(저지방유당분해 우유는 2.0이하 이어야 한다)

(마) 세균수 : 1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판 배양법에 의할 때 음성이어야 한다)

(바) 대장균군 : 1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

라. 가공유류

(1) 정의

가공유류라 함은 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는  식품첨가물 등을 가한 후 살균 또는 멸균 처리한 것을 가한 것이거나, 살균 또는 멸균처리 후 식품 또는 식품첨가물 등을 무균적으로 첨가한 것으로 무지유고형분(탈지분유와 성분규격이 같은 것) 4%이상의 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 가공유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 후 살균 또는 멸균 처리한 것이거나 살균 또는 멸균처리 후 식품 또는 식품첨가물 등을 무균적으로 첨가한 것을 말한다.

(나) 저지방가공유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 후 살균 또는 멸균 처리한 것이거나, 살균 또는 멸균처리 후 식품 또는 식품첨가물 등을 무균적으로 첨가한 것으로 조지방 2.0 %이하의 것을 말한다.

(다) 유음료 : 무지유고형분이 4%이상 함유된 음료로서 다른 유가공품에 해당되지 아니하는 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	가공유	저지방가공유	유음료
(가) 성상	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 무지유 고형분(%)	7.2이상	5.5이상	4.0이상
(다) 유지방(%)	2.7이상	2.0이하(조지방을 기준으로 한다)	-
(라) 세균수	1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)	1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)	1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)
(마) 대장균군	1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

마. 산양유

(1) 정의

산양유라 함은 산양의 원유를 살균 또는 멸균 처리한 것을 말한다(산양의 원유 100%).

(2) 성분규격

(가) 성상 : 유백색～황색의 균질한 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 비중(15℃) : 1.030～1.034

(다) 산도(%) : 0.20이하(젖산으로서)

(라) 무지유고형분(%) : 7.5이상

(마) 유지방(%) : 3.2이상

(바) 세균수 : 1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판 배양법에 의할 때 음성이어야 한다)

(사) 대장균군 : 1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

(아) 포스파타제 : 음성이어야 한다(저온장시간 살균제품, 고온단시간 살균제품에 한한다).

(3) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

바. 발효유류

(1) 정의

발효유류라 함은 원유 또는 유가공품을 유산균, 효모로 발효시킨 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 발효유 : 원유 또는 유가공품을 발효시킨 것으로 무지유고형분 3% 이상의 것을 말한다.

(나) 농후발효유 : 원유 또는 유가공품을 발효시켜 호상 또는 액상으로 한 것으로 무지유고형분 8% 이상의 것을 말한다.

(다) 크림발효유 : 원유 또는 유가공품을 발효시킨 것으로 무지유고형분 3% 이상, 유지방 8%이상의 것을 말한다.

(라) 농후크림발효유 : 원유 또는 유가공품을 발효시킨 것으로 무지유고형분 8%이상, 유지방 8%이상의 것을 말한다.

(마) 발효버터유 : 버터유를 발효시킨 것으로 무지유고형분 8%이상의 것을 말한다.

(바) 발효유분말 : 원유 또는 유가공품을 발효시켜 분말화한 것으로 유고형분 85%이상의 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	발효유	농후발효유	크림발효유	농 후 크림발효유	발효버터유	발효유분말
(가) 성상	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액상으로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	-	-	-	-	-	5.0이하
(다) 유고형분(%)	-	-	-	-	-	85이상
(나) 무지유 고형분(%)	3.0이상	8.0이상	3.0이상	8.0이상	8.0이상	-
(다) 유지방(%)	-	-	8.0이상	8.0이상	1.5이하	-
(라) 유산균수 또는 효모수	1㎖당 10,000,000이상	1㎖당 100,000,000이상 (단, 냉동제품은 10,000,000이상)	1㎖당 10,000,000이상	1㎖당 100,000,000이상 (단, 냉동제품은 10,000,000이상)	1㎖당 10,000,000이상	-
(마) 대장균군	음성이어야 한다	음성이어야 한다	음성이어야 한다	음성이어야 한다	음성이어야 한다	음성이어야 한다

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

사. 버터유류

(1) 정의

버터유류라 함은 우유의 크림에서 버터를 제조하고 남은 것을 살균 또는 멸균처리한 것이나, 이를 분말로 한 것을 말한다(원료버터유 100%).

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 버터유 : 우유의 크림에서 버터를 제조하고 남은 것을 살균 또는 멸균처리한 것을 말한다.

(나) 버터유분말 : 우유의 크림에서 버터를 제조하고 남은 것을 살균 또는 멸균 처리한 것을 분말로 한 것을 말한다

(3) 성분규격

유형 항목	버터유	버터유분말
(가) 성상 (나) 수분(%) (다) 유고형분(%) (라) 세균수 (마) 대장균군	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다. - 6.5이상 1㎖당 20,000이하 (멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다) 1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다. 5.0이하 95.0이상 1g당 20,000이하 음성이어야 한다

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

아. 농축유류

(1) 정의

농축유류라 함은 원유 또는 저지방우유를 그대로 농축한 것이거나 식품 또는 식품첨가물을 가하여 농축한 것을 말한다(원유 또는 탈지유 100%, 식품 또는 식품첨가물은 제외).

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 농축우유 : 원유를 그대로 농축한 것을 말한다.

(나) 탈지농축우유 : 원유의 유지방분을 0.5%이하로 조정하여 농축한 것을 말한다.

(다) 가당연유 : 원유에 당류를 가하여 농축한 것을 말한다

(라) 가당탈지연유 : 원유의 유지방분을 0.5%이하로 조정한 후 당류를 가하여 농축한 것을 말한다

(마) 가공연유 : 원유에 식품 또는 식품첨가물을 가하여 농축한 것으로 유고형분 22.0% 이상의 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	농축우유, 탈지농축우유	가당연유	가당탈지연유	가공연유
(가) 성상	유백색～황색의 균질한 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.	유백색～황색으로 균질하고 감미가 있는 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.	유백색～황색으로 균질하고 감미가 있는 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택을 가지고 균질하고 감미가 있는 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	-	27.0이하	29.0이하	32.0이하
(다) 유고형분(%)	22.0이상	29.0이상	25.0이상	22.0이상
(라) 유지방(%)	6.0이상(농축우유에 한한다)	8.0이상	-	6.0이상
(마) 산도(%)	0.4이하(젖산으로서 기준하며 농축우유에 한한다)	-	-	-
(바) 당분 (유당포함%)	-	58.0이하	58.0이하	58.0이하
(사) 세균수	1g당 20,000이하 (멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)	1g당 20,000이하	1g당 20,000이하	1g당 20,000이하
(아) 대장균군	1g당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	음성이어야 한다.	음성이어야 한다.	음성이어야 한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

자. 유크림류

(1) 정의

유크림류라 함은 원유 또는 우유에서 분리한 유지방분 또는 이에 식품이나 식품첨가물 등을 가한 것을 각각 살균 또는 멸균처리한 것이나 이를 분말화한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 유크림 : 원유 또는 우유에서 분리한 유지방분으로 유지방분 30%이상의 것을 말한다.

(나) 가공유크림 : 유크림에 다른식품 또는 식품첨가물등을 가하여 가공한 것으로 유지방분 18%이상의 것을 말한다.

(다) 분말유크림 : 유크림에 다른식품 또는 식품첨가물등을 가하여 분말화 한 것으로 유지방분 50% 이상의 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	유크림	가공유크림	분말유크림
(가) 성상	유백색～황색의 균질 한 유동성 액체 또는 반고형체로서 이미‧ 이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	-	-	5.0이하
(다) 산도(%)	0.20이하(젖산으로서)	-	-
(라) 유지방(%)	30.0이상	18.0이상	50.0이상
(마) 세균수	1g당 20,000이하	1g당 20,000이하 (멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할 때 음성이어야 한다)	1g당 20,000이하
(바) 대장균군	1g당 2이하	1g당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	음성이어야 한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

차. 버터류

(1) 정의

버터류라 함은 원유에서 유지방분을 분리한 것이나 발효시킨 것을 그대로 또는 이에 다른 식품이나 식품첨가물 등을 가하여 각각 교반, 연압한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 버터 : 원유의 유지방분을 분리하여 교반, 연압한 것으로 유지방분 80% 이상의 것을 말한다.

(나) 가공버터 : 원유의 유지방분을 분리하여 이에 식품이나 식품첨가물을 가한 후, 교반, 연압한 것으로 유지방분 30%이상(단, 유지방분의 함량이 제품의 지방함량에 대한 중량비율로서 50% 이상일 것)의 것을 말한다.

(다) 버터오일 : 버터 또는 크림에서 유지방 이외의 거의 모든 수분과 무지유고형분을 제거한 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	버터			가공버터	버터오일
(가) 성상	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.			고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	18.0이하			18.0이하	0.3이하
(다) 유지방(%)	80.0이상			30.0이상	99.6이상
(라) 산가	2.8이하			2.8이하	2.8이하
(마) 지방의 낙산가	20.0±2			-	20.0±2
(바) 타르색소	검출되어서는 아니된다			검출되어서는 아니된다	검출되어서는 아니된다
(사) 대장균군	n=5, c=2, m=0, M=10			n=5, c=2, m=0, M=10	n=5, c=2, m=0, M=10
(아) 산화방지제(g/kg) : 다음에서 정하는 이외의 산화방지제가 검출되어서는 아니된다
부틸히드록시아니졸 디부틸히드록시톨루엔 터셔리부틸히드로퀴논 몰식자산 프로필		0.2이하(병용할 때에는 부틸히드록시아니졸, 디부틸히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2이하) 0.1이하
(자) 보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다
데히드로초산 데히드로초산나트륨			0.5이하(데히드로초산으로서)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

카. 자연치즈

(1) 정의

자연치즈라 함은 원유 또는 유가공품에 유산균, 단백질 응유효소, 유기산 등을 가하여 응고시킨 후 유청을 제거하여 제조한 것을 말한다.

(2) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 대장균(E. coli) : n=5, c=1, m=10, M=100

(다) 유고형분 및 유지방

항 목 유 형	유고형분(%)	유지방(%)
경성치즈	60.0이상	24.0이상
반경성치즈	40.0이상	9.8이상
연성치즈	35.0이상	7.0이상
생치즈	18.0이상	3.6이상

(라)보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

데히드로초산 데히드로초산나트륨	0.5이하(데히드로초산으로서)
소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	3.0이하(소르빈산으로서 기준하며, 프로피온산칼슘 또는 프로피온산나트륨을 병용할 때에는 소르빈산 및 프로피온산의 사용량의 합계가 3.0이하)
프로피온산칼슘 프로피온산나트륨	3.0이하(프로피온산으로서 기준하며, 소르빈산, 소르빈산칼륨 또는 소르빈산칼슘을 병용할 때에는 프로피온산 및 소르빈산의 사용량의 합계가 3.0이하)

(3) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

타. 가공치즈

(1) 정의

가공치즈라 함은 자연치즈를 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 후 유화시켜 가공한 것이거나 자연치즈에 속하지 아니하는 치즈로 총 유고형분 중 자연치즈에서 유래한 유고형분이 50% 이상인 것을 말한다.

(2) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 대장균군 : 음성이어야 한다.

(다) 유고형분 및 유지방

종 류	유고형분(%)	유지방(%)
경성가공치즈 반경성가공치즈 혼합가공치즈 연성가공치즈	50.0이상 46.0이상 38.0이상 34.0이상	25.0이상 18.4이상 7.6이상 6.8이상

(라) 보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

데히드로초산 데히드로초산나트륨	0.5이하(데히드로초산으로서)
소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	3.0이하(소르빈산으로서 기준하며, 프로피온산칼슘 또는 프로피온산나트륨을 병용할 때에는 소르빈산 및 프로피온산의 사용량의 합계가 3.0이하)
프로피온산칼슘 프로피온산나트륨	3.0이하(프로피온산으로서 기준하며, 소르빈산, 소르빈산칼륨 또는 소르빈산칼슘을 병용할 때에는 프로피온산 및 소르빈산의 사용량의 합계가 3.0이하)

(3) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

파. 분유류

(1) 정의

분유류라 함은 원유 또는 탈지우유를 그대로 또는 이에 다른 식품이나 식품첨가물등을 가하여 처리‧가공한 분말상의 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 전지분유

원유에서 수분을 제거하여 분말화한 것을 말한다(원유 100%).

(나) 탈지분유

탈지유에서 수분을 제거하여 분말화한 것을 말한다(탈지유 100%).

(다) 가당분유

원유에 당류(설탕, 과당, 포도당)를 가하여 분말화한 것을 말한다(원유 100%, 가당량은 제외).

(라) 혼합분유

원유, 전지분유, 탈지유 또는 탈지분유에 곡분, 곡류가공품, 코코아 가공품, 유청, 유청분말 등의 식품 또는 식품첨가물을 가하여 가공한 분말상의 것으로 원유, 전지분유, 탈지유 또는 탈지분유(유고형분으로서) 50% 이상의 것을 말한다

(3) 성분규격

유형 항목	전지분유	탈지분유	가당분유	혼합분유
(가) 성상 (나) 수분(%) (다) 유고형분(%) (라) 유지방(%) (마) 당분(%, 유당 을제외한다) (바) 세균수 (사) 대장균군	담황색의 고운 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다 5.0이하 95.0이상 25.0이상 - 1g당 20,000이하 음성이어야 한다.	담황색의 고운 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다 5.0이하 95.0이상 1.3이하 - 1g당 20,000이하 음성이어야한다.	담황색의 고운 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다 5.0이하 70.0이상 18.0이상 25.0이하 1g당 20,000이하 음성이어야한다.	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다 5.0이하 50.0이상 12.5이상 (다만, 탈지분유를 원료로 한 제품은 제외한다) - 1g당 20,000이하음성이어야한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

하. 유청류

(1) 정의

유청류라 함은 원유, 우유 또는 저지방우유를 유산균으로 발효시켜 생산된 생유청, 효소 또는 산을 가하여 생산된 생유청을 살균․멸균 또는 농축한 것이거나 분말상태로 한 것을 말한다(생유청 100%).

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 유청 : 생유청을 살균한 것을 말한다.

(나) 농축유청 : 생유청을 농축한 것을 말한다.

(다) 유청분말 : 생유청에서 거의 모든 수분을 제거하여 분말상태로 한 것을 말한다.

(라) 유청단백분말 : 생유청에서 유당이나 무기질을 제거하고 거의 모든 수분을 제거하여 분말상태로 한 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 항목	유청	농축유청	유청분말	유청단백분말
(가) 성상	고유의 색택과 향미를 가진 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 액체로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가진 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	-	-	5.0이하	5.0이하
(다) 유고형분(%)	5.0이상	25.0이상	95.0이상	95.0이상 (유단백질은 유고형분의 35.0%이상이어야 한다)
(라) 세균수	1㎖당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)	1g당 20,000이하(멸균제품의 경우 55℃에서 1주 또는 30℃에서 2주 보관 후 표준평판배양법에 의할때 음성이어야 한다)	1g당 20,000이하	1g당 20,000이하
(마) 대장균군	1㎖당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	1g당 2이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	음성이어야 한다.	음성이어야 한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

거. 유당

(1) 정의

유당이라 함은 탈지우유 또는 유청에서 탄수화물 성분을 분리하여 분말화한 것을 말한다(원유 또는 유가공품 100%).

(2) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가진 분말로서 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 수분(%) : 5.0이하

(다) 유당(%) : 95.0이상

(라) 세균수 : 1g당 20,000이하

(마) 대장균군 : 음성이어야 한다.

(3) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

너. 유단백가수분해식품

(1) 정의

유단백가수분해식품이라 함은 유단백을 효소 또는 산으로 가수분해하여 식용에 적합하도록 가공한 것 또는 이를 원료로 하여 다른 식품 또는 식품첨가물과 혼합한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 유단백가수분해물

유단백을 가수분해하여 식용에 적합하도록 가공한 것으로 유단백가수분해물 100%의 것을 말한다.

(나) 유단백가수분해물가공식품

유단백가수분해물을 원료로 하여 가공한 것으로서 유가공품의 가공에 사용할 목적으로 가공된 것을 말한다.

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 수분(%) : 5.0이하

(다) 조단백질(%) : 표시함량이상이어야 한다.

(라) 아미노산질소(%) : 표시함량이상이어야 한다.

(마) 카제인포스포펩타이드(C.P.P)(%) : 표시한 경우 표시함량이상이어야 한다 (다만, 유단백가수분해물에 한한다).

(바) 세균수 : 1g당 20,000이하

(사) 대장균군 : 음성이어야 한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

더. 조제유류

(1) 정의

조제유류라 함은 원유 또는 유가공품을 주원료로 하고 이에 영유아의 성장 발육에 필요한 무기질, 비타민 등 영양소를 첨가하여 모유의 성분과 유사하게 가공한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 조제분유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 모유의 성분과 유사하게 가공한 분말상의 모유대용품으로 유성분(우유에서 유래된 수분 이외의 성분) 60.0% 이상의 것을 말한다.

(나) 조제우유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 모유의 성분과 유사하게 가공하여 그대로 먹을 수 있는 액상의 모유대용품으로 유성분 9.0% 이상의 것을 말한다.

(다) 성장기용 조제분유 : 생후 6개월 이상된 영‧유아용으로 가공한 분말상의 것으로 유성분 60.0% 이상의 것을 말한다.

(라) 성장기용 조제우유 : 생후 6개월 이상된 영‧유아용으로 가공한 액상의 것으로 유성분 9.0% 이상의 것을 말한다.

(마) 기타조제분유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 모유의 성분과 유사하게 가공한 분말상의 모유 대용품으로 유성분 60.0%이상인 것으로 조제분유 및 성장기용조제분유에 속하지 않는 것을 말한다.

(바) 기타조제우유 : 원유 또는 유가공품을 원료로 하여 모유의 성분과 유사하게 가공하여 그대로 먹을 수 있는 액상의 모유대용품으로 유성분 9.0%이상인 것으로 조제우유 및 성장기용조제우유에 속하지 않는 것을 말한다.

(3) 성분규격

유 형 항 목	조제분유‧조제우유	성장기용 조제분유‧성장기용 조제우유	기타조제분유․ 기타조제우유
(가) 성상	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 수분(%)	5.0이하 (단, 액상제품 제외)	5.0이하 (단, 액상제품 제외)	5.0이하 (단, 액상제품 제외)
(다) 조단백질(%)	9.0～20.0	12.0～27.5	-

유 형 항 목	조제분유‧조제우유	성장기용 조제분유‧성장기용 조제우유	기타조제분유․ 기타조제우유
(라) 조지방(%)	15.0～30.0 (리놀레산은 조지방함량의 9.0% 이상이어야 한다)	15.0～30.0 (리놀레산은 조지방함량의 9.0% 이상이어야 한다)	-
(마) 유성분(%)	60.0이상	60.0이상	-
(바) 비타민A (IU/100g)	1,250～2,500	1,250～3,750	-
(사) 비타민D (IU/100g)	200～400	200～600	-
(아) 비타민C (㎎/100g)	40이상	40이상	-
(자) 비타민B1 (㎎/100g)	0.20이상	0.20이상	-
(차) 비타민B2 (㎎/100g)	0.30이상	0.30이상	-
(카) 니코틴산 (㎍/100g)	1,250이상	1,250이상	-
(타) 비타민B6 (㎍/100g)	175이상	225이상	-
(파) 엽산 (㎍/100g)	20이상	20이상	-
(하) 판토텐산 (㎍/100g)	1,500이상	1,500이상	-
(거) 비타민B12 (㎍/100g)	0.5이상	0.75이상	-
(너) 비타민K1 (㎍/100g)	20이상	20이상	-
(더) 비타민E (IU/100g)	3.5이상	3.5이상	-
(러) 나트륨 (㎎/100g)	100～300	100～425	-
(머) 칼륨 (㎎/100g)	400～1,000	400이상	-
(버) 염소 (㎎/100g)	275～750	275이상	-

유 형 항 목	조제분유‧조제우유	성장기용 조제분유‧성장기용 조제우유	기타조제분유․ 기타조제우유
(서) 칼슘 (㎎/100g)	250이상	450이상	-
(어) 인 (㎎/100g)	125이상	300이상	-
(저) 마그네슘 (㎎/100g)	30.0이상	30.0이상	-
(처) 철 (㎎/100g)	1.25이상 (철분강화제품의 경우 5.0이상)	5.0～10.0	-
(커) 요오드 (㎍/100g)	25이상	25이상	-
(터) 구리 (㎍/100g)	300이상	-	-
(퍼) 아연 (㎎/100g)	2.5이상	2.5이상	-
(허) 망간 (㎍/100g)	25이상	25이상	-
(고) 인공감미료	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.
(노) 타르색소	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.
(도) 세균수	1g당 20,000이하(조제우유는 음성이어야 한다.)	1g당 20,000이하(성장기용 조제우유는 음성이어야 한다.)	1g당 20,000이하(성장기용 조제우유는 음성이어야 한다.)
(로) 대장균군	음성이어야 한다.	음성이어야 한다.	음성이어야 한다.
(모) 엔테로박터 사카자키	음성이어야 한다(조제분유에 한한다).	-	음성이어야 한다(기타조제분유에 한한다).
(보)탄화물(scorched particle)	100g당 7.5mg이하	100g당 7.5mg이하	100g당 7.5mg이하
(소)바실러스 세레우스	1g당 100이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	1g당 100이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)	1g당 100이하(멸균제품의 경우 음성이어야 한다)

※ 기타조제분유, 기타조제우유의 경우 영양소는 표시량이상이어야 한다. 다만 제한할 필요가 있는 영양소는 표시량 이하 또는 표시량 범위이내 이어야 한다.

주) 조제우유 및 성장기용조제우유의 성분규격 적용은 조제분유 및 성장기용 조제분유의 수분규격(5.0%)을 기준으로 하여 각각의 성분규격을 환산적용한다.

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

러. 아이스크림류

(1) 정의

아이스크림류라 함은 원유, 유가공품을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 후 냉동, 경화한 것을 말하며, 유산균함유제품은 유산균(유산간균, 유산구균, 비피더스균을 포함한다) 또는 발효유를 함유한 제품으로 표시한 아이스크림류를 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 아이스크림

아이스크림류이면서 유지방분(우유로부터 얻은 지방분을 말한다, 이하 같다) 6% 이상, 유고형분(유지방분과 무지유고형분을 합한 것을 말한다. 이하 같다) 16% 이상의 것을 말한다.

(나) 아이스밀크

아이스크림류이면서 유지방분 2% 이상, 유고형분 7% 이상의 것을 말한다.

(다) 샤베트

아이스크림류이면서 무지유고형분 2%이상의 것을 말한다.

(라) 저지방아이스크림

아이스크림류이면서 조지방 2%이하, 무지유고형분 10% 이상의 것을 말한다.

(마) 비유지방아이스크림

아이스크림류이면서 조지방 5%이상, 무지유고형분 5%이상의 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 구분	아이스크림, 저지방아이스크림	아이스밀크, 샤베트, 비유지방아이스크림
(가) 성상 (나) 유지방(%) (다) 세균수 (라) 대장균군 (마) 유산균수	고유의 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다. 6.0이상(단, 저지방아이스크림의 경우 조지방 2.0이하) 검사시료를 녹인 액체1㎖당 100,000이하(단, 유산균 함유제품, 발효유 함유제품의 경우 유산균수는 제외한다) 1㎖당 10이하 표시량 이상(단, 유산균함유제품에 한한다)	고유의 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다. 2.0이상(아이스밀크에 한한다) 검사시료를 녹인 액체1㎖당 50,000이하(단, 유산균 함유제품, 발효유 함유제품의 경우 유산균수는 제외한다) 1㎖당 10이하 표시량 이상(단, 유산균함유제품에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

머. 아이스크림분말류

(1) 정의

아이스크림분말류라 함은 원유 및 유가공품 등을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 후 건조 분말화한 것으로서 물을 가하여 냉동시키면 아이스크림제품류가 되는 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 아이스크림분말

아이스크림분말류로서 유지방분(우유로부터 얻은 지방분을 말한다. 이하 같다) 18% 이상, 유고형분(유지방분과 무지유고형분을 합한 것을 말한다. 이하 같다) 48% 이상의 것을 말한다.

(나) 아이스밀크분말

아이스크림분말류로서 유지방분 6% 이상, 유고형분 21% 이상의 것을 말한다.

(다) 샤베트분말

아이스크림분말류로서 무지유고형분 6% 이상의 것을 말한다.

(라) 비유지방아이스크림분말

아이스크림분말류로서 조지방 15% 이상, 무지유고형분 15% 이상의 것을 말한다

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 수분(%) : 5.0이하

(다) 유지방(%)

1) 아이스크림분말 : 18.0이상

2) 아이스밀크분말 : 6.0이상

(라) 세균수 : 1g당 50,000이하(단, 유산균함유제품, 발효유함유제품의 경우 유산균수를 제외한다)

(마) 대장균군 : 음성이어야 한다.

(바) 유산균수 : 1g당 3,000,000이상(단, 유산균 함유제품에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

버. 아이스크림믹스류

(1) 정의

아이스크림믹스류라 함은 원유 및 유가공품 등을 원료로 하여 이에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가하여 혼합, 살균 또는 멸균한 액상 제품으로서 냉동시키면 아이스크림제품류가 되는 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 아이스크림믹스

아이스크림믹스류로서 유지방분(우유로부터 얻은 지방분을 말한다. 이하 같다) 6% 이상, 유고형분(유지방분과 무지유고형분을 합한 것을 말한다. 이하 같다) 16% 이상의 것을 말한다.

(나) 아이스밀크믹스

아이스크림믹스류로서 유지방분 2% 이상, 유고형분 7% 이상의 것을 말한다.

(다) 샤베트믹스

아이스크림믹스류로서 무지유고형분 2% 이상의 것을 말한다.

(라) 저지방아이스크림믹스

아이스크림믹스류로서 조지방 2%이하, 무지유고형분 10% 이상의 것을 말한다.

(마) 비유지방아이스크림믹스

아이스크림믹스류로서 조지방 5% 이상, 무지유고형분 5% 이상의 것을 말한다.

(3) 성분규격

유형 구분	아이스크림믹스 저지방아이스크림믹스	아이스밀크믹스, 샤베트믹스, 비유지방아이스크림믹스
(가) 성상	고유의 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.	고유의 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.
(나) 유지방(%)	6.0이상(단, 저지방아이스크림믹스의 경우 조지방 2.0이하)	2.0이상(아이스밀크믹스에 한한다)
(다) 세균수	검사시료 1㎖당 100,000이하(단, 멸균제품은 음성이어야 하며, 유산균 함유제품, 발효유 함유제품의 경우 유산균수를 제외한다)	검사시료 1㎖당 50,000이하(단, 멸균제품은 음성이어야 하며, 유산균 함유제품, 발효유 함유제품의 경우 유산균수를 제외한다)
(라) 대장균군	1㎖당 10이하(단, 멸균제품은 음성이어야 한다)	1㎖당 10이하(단, 멸균제품은 음성이어야 한다)
(마) 유산균수	1㎖당 10,000,000이상(단, 유산균함유제품에 한한다)	1㎖당 10,000,000이상(단, 유산균함유제품에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

2. 식육가공품 및 포장육

식육가공품이라 함은 식육을 원료로 하여 가공한 햄류, 소시지류, 베이컨류, 건조저장육류, 양념육류, 분쇄가공육제품, 갈비가공품, 식육추출가공품, 식용우지, 식용돈지 등을 말한다.

가. 공통사항(다만, 식육추출가공품, 식용우지, 식용돈지를 제외한다)

(1) 용어의 정의

(가) 지육 : 머리, 꼬리, 발 및 내장 등을 제거한 도체(carcass)를 말한다.

(나) 정육 : 지육으로부터 뼈를 분리한 고기를 말한다.

(다) 내장 : 식용을 목적으로 처리된 간, 폐, 심장, 위장, 췌장, 비장, 콩팥 및 창자 등을 말한다.

(라) 기타부분 : 식용을 목적으로 도살된 가축으로부터 채취, 생산된 가축의 머리, 꼬리, 발, 껍질, 혈액 등 식용이 가능한 부위를 말한다.

(마) 멸균식육가공품 : 가열처리 등의 방법으로 가공기준에 적합하게 살균하여 상업성 멸균처리된 제품을 말한다.

(2) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택을 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 아질산 이온(g/kg) : 0.07이하(다만, 포장육은 제외한다).

(다) 타르색소 : 검출되어서는 아니된다(다만, 소시지류는 제외한다).

(라) 대장균군 : 음성이어야 한다(다만, 비가열식육가공품은 제외한다).

(마) 휘발성염기질소(㎎%) : 20이하(원료육 및 포장육에 한한다).

(바) 보존료(g/kg) : 다음에서 정하는 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	2.0이하(소르빈산으로서 기준하며, 포장육, 양념육류(육지물), 분쇄가공육제품, 갈비가공품은 검출되어서는 아니된다)

(사) 세균수 : 음성이어야 한다(다만, 멸균식육가공품에 한한다).

(아) 대장균 O157:H7 : 음성이어야 한다(원료용 분쇄육, 분쇄가공육제품 또는 포장육(분쇄)에 한한다).

(3) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

나. 햄류

햄류라 함은 식육을 부위에 따라 분류하여 정형 염지한 후 숙성․건조하거나 훈연 또는 가열처리한 것이거나 식육의 육괴에 다른 식품 또는 식품첨가물을 첨가한 후 숙성․건조하거나 훈연 또는 가열처리하여 가공한 것을 말한다.

(1) 햄 : 식육을 부위에 따라 분류하여 정형 염지한 후 숙성․건조하거나 훈연 또는 가열처리하여 가공한 것을 말한다(뼈나 껍질이 있는 것도 포함한다).

(2) 프레스햄 : 식육의 육괴를 염지한 것이나 이에 결착제 조미료, 향신료 등을 첨가한 후 숙성․건조하거나 훈연 또는 가열처리한 것(육함량 85% 이상, 전분 5% 이하의 것)을 말한다.

(3) 혼합프레스햄 : 식육의 육괴 또는 이에 어육의 육괴(어육은 전체 육함량의 10%미만이어야 한다)를 혼합하여 염지한 것이거나, 이에 결착제(전체 육함량중 10%미만의 알류를 혼합한 것도 포함), 조미료 및 향신료 등을 첨가한 후 숙성․건조하거나 훈연 또는 가열처리한 것(육함량 75%이상, 전분 8% 이하의 것)을 말한다.

다. 소시지류

소시지류라 함은 식육을 염지 또는 염지하지 않고 분쇄하거나 잘게 갈아낸 것이나 식육에 조미료 및 향신료 등을 첨가한 후 케이싱에 충전하여 숙성․건조시킨 것이거나, 훈연 또는 가열처리한 것(육함량 70% 이상, 전분 10% 이하의 것)을 말한다.

(1) 소시지 : 식육(육함량중 10%미만의 알류를 혼합한 것도 포함)에 조미료 및 향신료 등을 첨가한 후 케이싱에 충전하여 숙성․건조 시킨 것이거나, 훈연 또는 가열처리한 것을 말한다.

(2) 혼합소시지 : 식육(전체 육함량중 20%미만의 어육 또는 알류를 혼합한 것도 포함)을 염지 또는 염지하지 않고 분쇄하거나 잘게 갈아낸 것에 조미료 및 향신료 등을 첨가한 후 케이싱에 충전하여 숙성․건조 시킨 것이거나, 훈연 또는 가열처리한 것을 말한다.

라. 베이컨류

돼지의 복부육(삼겹살) 또는 특정부위육(등심육, 어깨부위육)을 정형한 것을 염지한 후 훈연하거나 가열처리한 것을 말한다.

마. 건조저장육류

식육을 그대로 또는 이에 조미료 및 향신료 등을 첨가하여 건조하거나 열처리하여 건조한 것을 말하며 수분 55%이하의 것을 말한다(육함량 85%이상의 것).

바. 양념육류(육지물)

식육에 식염, 조미료, 향신료등으로 양념하고 냉장 또는 냉동한 것으로 육함량 60%이상의 것을 말한다(뼈가 붙어 있는 것도 포함).

사. 분쇄가공육제품

식육(장기류는 제외한다)을 세절 또는 분쇄하여 이에 결착제, 조미료, 향신료 등을 첨가하여 혼합한 것을 성형하거나 또는 동결, 절단하여 냉장, 냉동한 것이나 훈연, 열처리 또는 튀긴 것으로서 햄버거패티류, 미트볼류, 까스류 등을 말하며 육함량 50%이상의 것을 말한다.

아. 갈비가공품

식육의 갈비부위(뼈가 붙어 있는 것에 한한다)를 정형하여 향신료 및 조미료등으로 양념하고 훈연하거나 열처리한 것을 말한다.

자. 식육 추출가공품

(1) 정의

식육추출가공품이라 함은 식용동물성소재를 원료로 하여 물로 추출한 것이거나 이에 식육이나 다른 식품 또는 식품첨가물 등 부원료를 가하여 가공한 것을 말한다. 다만, 따로 기준 및 규격이 정하여진 것은 제외한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 단순식육추출가공품 : 단일원료 또는 혼합원료를 그대로 추출한 것이나 이들 추출물을 단순 혼합한 것으로 원료 추출물 100%의 것을 말한다.

(나) 식육추출가공품 : 식육추출가공품에 식육이나 다른 식품 또는 식품첨가물 등 부원료를 가하여 가공한 것을 말한다.

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 수분(%) : 10.0이하(건조제품에 한한다)

(다) 타르색소 : 검출되어서는 아니된다.

(라) 세균수 : 1㎖당 100이하이어야 한다(직접 음용하는 제품에 한한다).

(마) 대장균군 : 음성이어야 한다(살균제품이나 직접 음용하는 제품에 한한다).

(바) 대장균 : 음성이어야 한다(다만, 살균제품이나 직접 음용하는 제품은 제외한다).

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

차. 식용우지

(1) 정의

우지라 함은 소의 지방조직으로부터 채취한 기름으로 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 원료우지 : 생지방(소의 지방조직으로 원료우지의 원료)을 가공하여 용출한 것으로 우지의 원료를 말한다.

(나) 식용우지 : 원료우지를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 비중(40℃/20℃) : 0.893～0.904 (원료우지는 제외한다)

(다) 굴절률(40℃) : 1.448～1.460 (원료우지는 제외한다)

(라) 수분(%) : 0.3이하 (원료우지일 경우 0.7 이하)

(마) 비비누화물(%) : 1.2이하 (원료우지는 제외한다)

(바) 산가 : 0.3이하 (원료우지일 경우 4.0이하)

(사) 비누화가 : 190～202 (원료우지는 제외한다)

(아) 요오드가 : 32～50 (원료우지는 제외한다)

(자) 산화방지제(g/㎏) : 다음에서 정하는 산화방지제는 아래 기준에 적합하여야 한다.

부틸히드록시아니졸 디부틸히드록시톨루엔 터셔리부틸히드로퀴논	0.2이하(병용할 때에는 부틸히드록시아니졸, 디부틸히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2이하)
몰식자산 프로필	0.1이하

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

카. 식용돈지

(1) 정의

돈지라 함은 돼지의 지방조직으로부터 채취한 기름으로 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 원료돈지 : 생지방(돼지의 지방조직으로 원료돈지의 원료)을 가공하여 용출한 것으로 돈지의 원료를 말한다.

(나) 식용돈지 : 원료돈지를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 비중(40℃/20℃) : 0.894～0.906 (원료돈지는 제외한다)

(다) 굴절률(40℃) : 1.448～1.461 (원료돈지는 제외한다)

(라) 수분(%) : 0.3이하(원료돈지일 경우 0.7이하)

(마) 비비누화물(%) : 1.2이하 (원료돈지는 제외한다)

(바) 산가 : 0.3이하(원료돈지일 경우 4.0이하)

(사) 비누화가 : 192～203 (원료돈지는 제외한다)

(아) 요오드가 : 45～70 (원료돈지는 제외한다)

(자) 산화방지제(g/㎏) : 다음에서 정하는 산화방지제는 아래 기준에 적합하여야 한다.

부틸히드록시아니졸 디부틸히드록시톨루엔 터셔리부틸히드로퀴논	0.2이하(병용할 때에는 부틸히드록시아니졸, 디부틸 히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2이하)
몰식자산 프로필	0.1이하

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

타. 포장육

판매를 목적으로 식육을 절단(세절 또는 분쇄를 포함한다)하여 포장한 상태로 냉장 또는 냉동한 것으로서 화학적 합성품 등 첨가물 또는 다른 식품을   첨가하지 아니한 것을 말한다(육함량 100%).

3. 알가공품

(1) 정의

알가공품이라 함은 알이나 알의 내용물에 다른 식품 또는 식품첨가물 등을 가한 것이거나 분리, 건조, 냉동, 가열, 발효‧숙성 등의 방법으로 가공한 난황액, 난백액, 전란분, 전란액, 난황분, 난백분, 알가열성형제품, 염지란, 피단등을 말한다.

(2) 축산물가공품의 유형

(가) 전란액 : 알의 전 내용물이거나 이에 식염, 당류 등을 가한 것 또는 이를 냉동한 것을 말한다(알내용물 80% 이상).

(나) 난황액 : 알의 노른자이거나 이에 식염 및 당류 등을 가한 것 또는 이를 냉동한 것을 말한다(알내용물 80% 이상).

(다) 난백액 : 알의 흰자이거나 이에 식염 및 당류 등을 가한 것 또는 이를 냉동한 것을 말한다(알내용물 80% 이상).

(라) 전란분 : 알의 전 내용물을 분말로 한 것을 말한다(알 내용물 90% 이상).

(마) 난황분 : 알의 노른자를 분말로 한 것을 말한다(알 내용물 90% 이상).

(바) 난백분 : 알의 흰자를 분말로 한 것을 말한다(알 내용물 90% 이상).

(사) 알가열성형제품 : 알의 응고온도 이상으로 가열, 살균 등의 열처리공정을 거쳐 성형시킨 것을 말한다(알 내용물 30% 이상).

(아) 염지란 : 알을 삶은 후 그대로 또는 할란하여 조미액에 일정시간 조리거나 조미료 및 향신료를 첨가하여 포장한 것을 말한다(알 내용물 50% 이상).

(자) 피단 : 알껍질 외부로부터 조미‧향신료 등을 알 내용물에 침투시켜 특유의 맛과 단단한 조직을 갖도록 숙성한 것을 말한다(알 내용물 90% 이상).

(3) 성분규격

(가) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지고 이미‧이취가 없어야 한다.

(나) 수분(%) : 10.0이하(분말제품에 한한다)

(다) 세균수 : 1g당 10,000이하(살균제품에 한한다)

(라) 대장균군 : 1g당 10이하(살균제품에 한하며, 피단의 경우에는 음성이어야 한다)

(마) 살모넬라균 : 음성이어야 한다 (살균제품 또는 피단에 한한다)

(4) 시험방법

축산물시험방법에 따라 시험한다.

제3. 축산물 시험방법

Ⅰ. 총    칙

1. 축산물의 검사는 별도의 규정이 없는 한 원칙적으로 이 방법에 따라 실시한다. 다만 여기서 일반시험법이라 함은 축산물의 전 검사방법중 대표적인 방법을 뜻한다.

2. 이 시험법에 규정되어 있지 않은 성분 또는 물질을 검사할 때는 그 검사방법에 관한 참고문헌 등을 기재하여야하며, 이 시험법을 변용했을 때도 그 사유와 변경내용을 성적서에 기재하여야 한다.

3. 계량 등의 단위는 국제 단위계(SI)에 따르며 다음의 약호를 쓴다.

가. 길이 : m, ㎝, ㎜, ㎛, ㎚

나. 용량 : ℓ, ㎖, ㎕

다. 중량 : ㎏, g, ㎎, ㎍, ng

라. 넓이 : ㎠

마. 열량 : kcal, kj

4. 중량백분율을 표시할 때에는 %의 기호를 쓴다. 다만, 용액 100㎖중의 물질함량(g)을 표시할 때에는 w/v%로, 용액 100㎖중의 물질함량(㎖)을 표시할 때에는 v/v%의 기호를 쓴다. 중량백만분율을 표시할 때에는 ㎎/㎏의 약호를 사용하며 ppm의 약호를 쓸 수 있으며, ㎎/ℓ 및 ㎖/㎥도 사용할 수 있다.

5. 온도의 표시는 셀시우스법(℃)을 쓴다.

6. 표준온도는 20℃, 상온은 15～25℃, 실온은 1～35℃, 미온은 30～40℃로 한다.

7. 따로 규정이 없는 한 찬물은 15℃이하, 온탕은 60～70℃, 열탕은 약 100℃의 물로 하며 “수욕상 또는 수욕중에서 가열한다”라 함은 따로 규정이 없는 한 그 가열온도를 약 100℃로 하되, 수욕대신 약 100℃의 증기욕을 쓸 수 있다.

8. 찬 곳(냉소)이라 함은 따로 규정이 없는 한 0～15℃의 장소를 말한다.

9. 냉동이라 함은 별도의 규정이 없는 한 -20℃의 온도를 뜻한다.

10. 시험에 쓰는 물은 따로 규정이 없는 한 증류수 또는 정제수로 한다.

11. 용액이라 기재하고 그 용매를 표시하지 아니하는 것은 수용액을 말한다.

12. 감압은 따로 규정이 없는 한 15㎜Hg이하로 한다.

13. 액성을 산성, 알카리성 또는 중성으로 표시한 것은 따로 규정이 없는 한 리트머스지 또는 pH 미터기(유리전극)를 써서 시험한다. 액성을 상세히   나타낼 때에는 pH값을 쓴다. 또한, 강산성은 pH3.0이하, 약산성은 pH3.0～5.0, 미산성은 pH5.0～6.5, 중성은 pH6.5～7.5m 미알카리성은 pH7.5～9.0,  약알카리성은 pH9.0～11.0, 강알카리성은 pH 11.0이상을 말한다.

14. 용액의 농도를 (1→5), (1→10), (1→100)등으로 나타낸 것은 고체시약 1g 또 는 액체시약 1㎖를 용매에 녹여 전량을 각각 5㎖, 10㎖, 100㎖등으로 하는 것을 뜻한다. 또한 (1+1), (1+5)등으로 기재한 것은 고체시약 1g 또는 액체시약  1㎖에 용매 1㎖ 또는 5㎖를 혼합하는 비율을 나타낸다. 용매는 따로 표시되어 있지 않으면 물을 써서 희석한다.

15. 혼액을 (1 : 1), (4 : 2 : 1)등으로 나타낸 것은 액체시약의 혼합용량비 또는  고체시약의 혼합중량비를 말한다.

16. 방울수(적수)를 측정할 때에는 20℃에서 증류수 20방울을 적하할 때 그 무게가 0.90～1.10g이 되는 기구를 쓴다.

17. 네슬러관은 안지름 20㎜, 바깥지름 24㎜, 밑에서부터 마개의 밑까지의 길이 20㎝의 무색유리로 만든 공전평저 시험관으로서 50㎖의 것을 쓴다. 또한 각 관의 눈금의 높이의 차는 2㎜이하로 한다.

18. 밀봉용기라 함은 취급 또는 저장중에 외기와 접촉하지 않도록 내용물을 보호하는 용기를 뜻한다.

19. 차광이라 함은 광선을 침투시키지 않는 것을 뜻한다.

20. 묽은 산 또는 알카리용액이라 함은 별도의 규정이 없는 한 약 2N농도의 산 또는 알카리용액을 뜻한다.

21. 시험에 있어 규정된 값(규격치라 한다)과 시험에서 얻은 값(실험치라 한다)과의 비교에 의하여 적부판정을 할 때에, 실험치는 규격치보다 한자리수까지 더 구하여 더 구한 한자리수를 사사오입해서 규격치와 비교판정한다. 또 규격치 a～b라고 기재된 것은 a이상 b이하임을 뜻한다.

22. 무게를 “정밀히 단다”라 함은 달아야 할 최소단위를 고려하여 0.1㎎, 0.01㎎ 또는 0.001㎎까지 다는 것을 말한다. 또 무게를 “정확히 단다”라 함은 규정된 수치의 무게를 그 자리수까지 다는 것을 말한다.

23. 검사시료를 취하는 양에 “약”이라고 한 것은 따로 규정이 없는 한 기재량의 90～ 110%의 범위내에서 취하는 것을 말한다.

24. 건조 혹은 강열할 때 “항량”이라고 기재한 것은 다시 계속하여 1시간 더 건조 혹은 강열할 때에 전후의 칭량치가 전회 측정한 무게의 0.1%이하임을 말한다. 다만, 칭량차가 화학천칭을 썼을 때 0.5㎎이하, 마이크로 화학천칭을 썼을 때 0.01㎎이하인 경우에 항량으로 본다.

25. 데시케이타의 건조제는 따로 규정이 없는 한 실리카겔로 한다.

26. 시험은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작후 30초 이내에 관찰한다. 다만, 온도의 영향이 있는 것에 대하여는 표준온도에서 행한다.

27. “타르색소”라 함은 타르색소의 알루미늄레이크를 포함한 것을 말한다.

28. 이 축산물의 가공기준 및 성분규격에 정하여진 가공기준 및 성분규격에 대한 적‧부판정은 이 축산물시험방법에서 규정한 시험방법으로 실시하여 판정하는 것을 원칙으로 한다. 다만, 이 축산물시험방법에서 규정한 시험방법보다 더 정밀하다고 인정된 때에는 그 방법을 사용할 수 있고, 특히 미생물 및 독소 등에 대한 시험에는 상품화된 Kit를 사용할 수 있으나, 그 결과에 대하여 의문이 있다고 인정될 때에는 규정한 방법에 의하여 시험하고 판정하여야 한다.

29. 이 축산물시험방법에서 정하여진 시험방법이 없는 경우에는 타법령에서 정했거나 공인시험방법(CODEX규정, AOAC의 시험방법 등)에 따라 시험할 수 있다.

Ⅱ. 검사시료의 채취 및 취급방법

1. 검사시료채취의 의의

검사시료의 채취는 축산물가공처리법에 따라서 검사관이 검사대상으로부터 일부의 검사시료를 채취하여 기준‧규격 적합여부, 오염물질 등에 대한 안전성검사를 실시하여 그 검사결과에 따라 행정조치 등이 이루어지게 되므로 검사대상 선정, 검사시료채취‧취급‧운반‧시험검사 등은 효율성을 확보하면서 과학적인 방법으로 수행하여야 한다. 따라서 검사시료를 취하여 축산물위생검사기관에 검사의뢰하는 것은 중요한 의의를 가지므로 검사관은 검사시료채취 및 취급방법 등에 대하여 충분한 지식을 가지고 그 직무를 수행하여야 한다.

2. 용어의 정의

가. 검    체 : 검사대상으로부터 채취된 시료를 말한다.

나. 검사시료단위 : 검사목적으로 채취되는 한 포장단위, 한 포장단위의 일부 또는 여러 포장단위를 합친 것으로서 검사시료발췌대상이 되는 단위를 말한다.

다. 검사대상 : 동일조건에서 생산‧처리‧가공되어 그 유형이 같은 축산물을 말한다.

라. 벌크(Bulk) : 최종소비자에게 그대로 유통 판매하도록 포장되지 아니한 검사대상을 말한다.

3. 검사시료채취의 일반원칙

가. 검사시료의 채취는 축산물가공처리법 제13조, 같은법 시행령 제14조 및 같은법 시행규칙 제19조에서 규정하는 자가 수행하여야 한다.

나. 검사시료는 검사목적, 검사항목 등을 참작하여 검사대상 전체를 대표할 수 있는 최소한도의 양을 수거하여야 한다.

다. 검사시료는 제조번호, 제조년월일, 유통기간이 동일한 것을 검사대상으로 하고 이와 같은 표시가 없는 것은 품종, 제조회사, 기호, 수출국, 수출년월일, 도착년월일, 적재선, 화차, 포장형태 및 외관 등의 상태를 잘 파악하여 그 축산물의 특성 및 검사목적을 고려하여 가능한한 동일한 검사시료를 채취하도록 한다.

라. 축산물을 포장하기전 또는 포장된 것을 개봉하여 검사시료로 채취하는 경우에는 이물질의 혼입, 미생물의 오염 등이 없도록 주의하여야 한다.

마. 채취한 검사시료는 봉인하여야 하며 파손하지 않고는 봉인을 열 수 없도록 하여야 한다.

4. 검사시료의 채취 및 취급방법

검사시료 채취시에는 검사목적, 대상축산물의 종류와 물량, 오염가능성, 균질여부 등 검사시료의 물리‧화학‧생물학적 상태를 고려하여야 한다.

가. 검사시료의 채취방법

(1) 검사대상축산물이 불균질할 때

검사시료가 불균질한 때에는 일반적으로 다량의 검사시료가 필요하나 검사의 복잡성, 효율성, 경제성등으로 부득이 소량의 검사시료를 채취할 수 밖에 없다. 따라서 이 경우에는 외관, 보관상태 등을 종합적으로 판단하여 의심스러운 것을 대상으로 검사시료를 채취할 수 있다.

(2) 검사항목에 따른 균질여부 판단

검사시료의 균질, 불균질은 검사항목에 따라 달라질 수 있다. 어떤 검사대상축산물의 선도판정에 있어서는 그 축산물이 불균질하더라도 이에 함유된 중금속, 식품첨가물 등의 성분은 균질한 것으로 보아 검사시료를 채취할 수 있다.

(3) 포장된 검사시료의 채취

(가) 깡통, 병, 상자 등 용기‧포장에 넣어 유통되는 축산물은 그대로 채취한다.

(나) 대형 용기‧포장에 넣은 축산물은 전체를 대표할 수 있는 일부를 채취한다.

(4) 냉장, 냉동 검사시료의 채취

냉장 또는 냉동 축산물을 검사시료로 채취하는 경우에는 그 상태를 유지하면서 채취하여야 한다.

(5) 미생물검사를 요하는 검사시료의 채취

(가) 검사시료를 채취‧운송‧보관하는 때에는 채취당시의 상태를 유지할 수 있도록 밀폐되는 용기‧포장 등을 사용하여야 한다.

(나) 검사시료를 소분 채취할 경우에는 멸균된 기구‧용기 등을 사용하여 무균적으로 행하여야 한다.

(다) 검사시료는 부득이한 경우를 제외하고는 정상적인 방법으로 보관‧유통중에 있는 것을 채취하여야 한다.

(6) 검사항목에 따른 검사시료 채취 주의점

(가) 수분

증발 또는 흡습 등에 의한 수분 함량 변화를 방지하기 위하여 검사시료를 밀폐 용기에 넣고 가능한 한 온도 변화를 최소화하여야한다.

(나) 산가 및 과산화물가

빛 또는 온도 등에 의한 지방 산화의 촉진을 방지하기 위하여 검사시료를 빛이 차단되는 밀폐 용기에 넣고 채취 용기내의 공간 체적과 가능한 한 온도 변화를 최소화하여야 한다.

나. 검사시료의 취급방법

(1) 채취된 검사시료는 오염, 파손, 손상, 해동, 변형등이 되지 않도록 주의하여 검사실로 운반하여야 한다.

(2) 검사시료가 장거리로 운송되거나 대중 교통으로 운송되는 경우에는 손상되지 않도록 특히 주의하여 포장한다.

(3) 냉동검사시료의 취급

(가) 냉동검사시료는 냉동상태에서 운반하여야 한다.

(나) 냉동장비를 이용할 수 없는 경우에는 드라이아이스 등으로 냉동상태를 유지하여 운반할 수 있다.

(4) 냉장검사시료의 취급

냉장온도를 유지하면서 얼지 않도록 하여야 한다.

(5) 미생물검사용 검사시료의 취급

(가) 부패‧변질 우려가 있는 검사시료

미생물학적인 검사를 요하는 검사시료는 멸균용기에 무균적으로 채취하여 당해 축산물의 냉장보관 온도(5±3℃)를 유지하면서 조속히 축산물위생검사기관에 운반하여 시료채취 후 36시간 이내에 검사를 실시하여야 한다. 부득이한 사정으로 저온을 유지할 수 없거나 조속히 운반하지 못하였을 때에는 재수거하거나 채취일시 및 그 상태를 기록하여 축산물위생검사기관에 검사 의뢰한다.

(나) 부패‧변질의 우려가 없는 검사시료

미생물검사용 검사시료일지라도 운반과정중 부패‧변질우려가 없는 검사시료는 반드시 저온에서 운반할 필요는 없으나 2차 오염, 검사시료의 파손 등에 주의하여야 한다.

(다) 얼음 등을 사용할 때의 주의사항

얼음 등을 사용하여 저온을 유지하는 때에는 얼음 녹은 물이 검사시료에 오염되지 않도록 주의하여야 한다.

5. 검사시료채취 기구 및 용기

가. 검사 대상축산물은 종류, 형상, 용기‧포장 등이 다양하므로 검사시료의 수거 목적에 적절한 기구 및 용기를 준비하여야 한다.

나. 용기‧포장은 운반, 세정, 멸균에 편리한 것이어야 하며 미생물검사를 위한 검사시료 채취의 기구‧용기중 검사시료와 직접 접촉하는 부분은 반드시 멸균 처리하여야 한다.

(1) 채취용 기구

핀셋, 가위, 칼, 캔따개, 나무망치, 전기톱 또는 톱, 드라이어, 피펫, 커터, 액체검사시료채취용 펌프 또는 튜브 등

(2) 채취용 용기‧포장

검사시료봉지(대, 중, 소), 검사시료채취병(광구병)등

(3) 소독용구

알코올램프, 알코올, 솜 등

(4) 기타

테이프, 아이스박스, 사진기, 필기구 등

다. 기구‧용기의 조건

(1) 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전 제6. 기구 및 용기‧포장의 기준‧규격에 적합한 것이어야 한다.

(2) 검사시료에 직접 접촉하는 기구 및 용기‧포장은 축산물의 검사결과에 영향을 미치지 않도록 살균, 멸균 등의 처리를 한 것이어야 한다.

Ⅲ. 일반시험법

1. 일반성분시험법

일반성분시험법은 축산물 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 축산물의 규격, 순도의 검사 및 영양가를 평가하기 위하여 수분, 회분, 질소화합물, 탄수화물(당질) 및 지질의 시험방법과 열량계산법에 대하여 기재한 것이다.

가. 수분

(1) 건조감량법

(가) 상압가열건조법

[기 구]

1) 칭량접시

상부직경 55㎜, 하부직경 50㎜, 높이 25㎜ 또는 상부직경 75㎜, 하부직경 70㎜, 높이 35㎜로서 뚜껑이 있으며 중량은 전자가 약 25g, 후자가 약 35g의 유리 또는 알루미늄으로 만들어진 것을 사용한다.

2) 유리봉

해사(정제) 20g을 칭량접시에 옆으로 삽입했을 때 적어도 1.5㎝이상 해사로부터 나와 있어야 하며 뚜껑을 닫을 수 있을 정도의 길이일 것.

3) 자동온도조절기가 달린 건조기 : 적어도 ±1℃이내의 온도조절이 가능해야 한다.

[시험방법]

미리 가열하여 항량으로 한 칭량접시에 검사시료 3～5g을 정밀히 달아(건조가 어려운 검사시료인 경우에는 20메쉬 정제해사 20g과 유리봉을 넣어 항량이 되게 하고 이에 검사시료를 넣어 잘 섞은 후 유리봉은 그대로 넣어 둔다), 뚜껑을 약간 열어 놓고 98～100℃건조기에 넣어 3～5시간 건조한 후 데시케이타(건조제 : 무수염화칼슘)중에서 약 30분간 식히고 무게를 단다.

다시 칭량접시를 1～2시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복한다. 일반적인 것은 1회에 4시간(유 및 유제품 등은 3시간) 건조하여 수분량을 측정한다.

b-c

수분(%)=──── ×100

b-a

a : 칭량접시의 무게(g)

b : 칭량접시와 검사시료의 무게(g)

c : 건조 후 항량이 되었을 때의 무게(g)

(나) 감압가열건조법

[기구]

1) 칭량접시 : 앞의 ①의 항과 같은 것을 사용한다.

2) 자동온도조절기가 붙은 감압건조기 또는 수욕식 감압건조기

[시험방법]

100～110℃로 건조하여 항량으로 한 칭량병에 검사시료 2～5g을 정밀히 달아 넣고 일정한 온도로 조절하여(일반적으로 98～100℃) 감압건조기에 넣어 25㎜Hg이하(육류, 치즈 및 분유는 100㎜Hg이하)로 감압하여 약 5시간 건조한다. 다음 세기병(황산)을 통하여 습기를 제거한 공기를 건조기 중에 조용히 넣어 기내가 상압으로 되었을 때 칭량병을 꺼내어 데시케이타에서 식힌 다음 무게를 단다. 다시 칭량병을 감압건조기에 넣고 한시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복한다. 연유, 생계란 등은 해사와 유리봉을 넣은 칭량병을 수욕상에서 미리 건조한 다음 실시한다.

(2) 증류법

검사시료를 수분과 혼합되지 않은 유기용매중에서 가열하면 검사시료중의 수분 또는  수분과 용매의 혼합증기가 증류된다. 이것을 냉각시켜서 눈금이 있는 냉각관에 모아서 유출된 수분의 양으로 한다.

[기구 및 시약]

(가) 증류식 수분정량 장치

(나) 용매 : 키실렌 혹은 톨루엔

[시험방법]

검사시료(육류, 달걀 및 유제품은 약 5～10g)를 정밀히 달아 용량 500㎖의 증류 플라스크에 넣은 다음 돌비를 방지하기 위하여 완전히 건조한 정제해사 소량을 넣는다. 검사시료가 잠길 수 있도록 충분한 양의 용매 150～200㎖를 넣은 후 그림과 같은 장치에 눈금이 있는 수기와  냉각기를 연결하여 가열하고 최초의 용매가 1초간에 2～3방울의 비율로 냉각기에서 떨어지도록 가열을 조절한다.

눈금이 있는 수기에 수분이 모이지

않을 경우에는 가열을 늘려서 용매가

1초간에 4방울 정도 떨어지도록 한다.

유출액으로부터  수분을 완전하게 수

집하기 위하여 냉각기의 상단에서 용

매로 씻어 내린 후에 가열을 중지하고

눈금이 있는 관이 냉각되면 수분의

양을 읽는다.

V

검사시료중의 수분의 양 = ── × 100

S

V : 눈금이 있는 관에 든 물의 양(㎖)

S : 검사시료의 채취량(g)

(3) 칼핏샤법

칼핏샤(Karl Fisher)법에 의한 수분정량은 피리딘 및 메탄올의 존재 하에 물이 요오드 및 아황산가스와 다음의 반응식과 같이 정량적으로 반응하는 것을 이용하여 칼핏샤시액으로 검사시료의 수분을 정량하는 방법이다.

H2O+I2+SO2+3C5H5N=2(C5H5N+H)I-+C5H5N․SO3

C5H5N․SO3+CH3OH=(C5H5N+H)O-SO2․OCH3

따라서 전체의 반응은

H2O+I2+SO2+3C5H5N+CH3OH=2(C5H5N+H)I-+(C5H5N+H) O-SO2OCH3로 된다.

[장치 및 시약]

(가) 적정장치 : 자동뷰렛 2개, 적정플라스크, 교반기 및 정전압 전류 적정장치로 되어 있다. 칼핏샤시액은 흡수성이 매우 강하므로 장치는 외부로부터 흡수되지 않도록 만들어져야 한다. 방습제는 실리카겔 또는 염화칼슘(수분측정용)등을 사용한다.

(나) 칼핏샤용 메탄올

메탄올 1ℓ에 마그네슘가루 5g을 넣어 염화칼슘관을 붙인 환류 냉각기로 1시간동안 환류하고 필요하면 염화제이수은 0.1g을 넣어 반응을 촉진시킨다. 가스발생이 멈춘 다음 습기를 피하면서 메탄올을 증류하여 습기가 들어가지 않도록 보존한다. 이 액 1㎖ 중의 수분은 0.5㎎이하이어야 한다.

(다) 칼핏샤용 피리딘

피리딘에 수산화칼륨 또는 산화바륨을 넣고 마개를 꼭 막고 수일간 방치한 후, 그대로 습기를 피하면서 증류하여 습기가 들어가지 않도록 저장한다. 이 액 1㎖중의 수분은 1㎎이하이어야 한다

(라) 칼핏샤시액

1) 조제

요오드 63g을 칼핏샤용 피리딘 100㎖에 녹이고 방냉한다. 다음에 건조 아황산가스를 통하여 증가한 양이 32.3g에 이르렀을 때 아황산가스를 통하는 것을 멈추고 칼핏샤용 메탄올을 넣어 500㎖로 하고 24시간 이상 방치한 다음에 사용한다. 이 시액은 경과함에 따라 변화하므로 쓸 때마다 표정한다. 차광하여 습기를 피하고 찬 곳에 저장한다.

2) 표정

조작법에 따라 칼핏샤용 메탄올 25㎖를 적정 플라스크에 취하고 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 물 50㎎을 정밀히 달아 적정 플라스크에 빨리 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정한다.

칼핏샤시액 1㎖에 해당하는 물(H2O)의 ㎎수 f를 다음과 같이 구한다.

f = 물(H2O)의 채취량/물(H2O)의 적정에 소비된 칼핏샤시액의 양(㎖)

(마) 물․메탄올 표준액

1) 조제

칼핏샤용 메탄올 500㎖를 1ℓ의 건조메스플라스크에 취하여 물 2.5㎖를 넣고 칼핏샤용 메탄올을 넣어 1ℓ로 한다. 이 표준액의 표정을 칼핏샤시액의 표정이 끝난 다음 곧 한다. 이 용액은 차광하여 습기를 피하여 찬 곳에 저장한다.

2) 표정

조작법에 따라 칼핏샤용 메탄올 25㎖를 건조 적정플라스크에 취하고 이것을 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 칼핏샤시액 10㎖를 정확하게 넣고 조제한 물․메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다.

f′=f×10/적정에 소비된 물․메탄올표준용액의 양(㎖)

[시험방법]

칼핏샤시액에 의한 적정은 습기를 피해야 하며 원칙적으로 이것을 표정했을 때의 온도와 같은 온도에서 적정하여야 한다. 적정플라스크 중의 용액에 2개의 백금전극을 담그고 가변저항기를 적당히 조절하여 일정한 전류(5～10마이크로암페아)를 통하여 두고 칼핏샤시액을 적하하면 적정이 진행됨에 따라 회로중의 마이크로암미터의 바늘이 크게 흔들려 수초내에 다시 원위치로 돌아온다. 적정의 종말점에 이르면 마이크로암미터의 흔들림(50～150마이크로암페아)이 30초간 또는 그 이상 지속된다. 이 상태가 되었을 때를 적정의 종말점으로 한다.

그러나 역적정일 때에는 칼핏샤시액이 과량으로 존재하는 경우 마이크로암미터의 바늘의 흔들림이 끊기고 종말점에 이르면 급히 원위치로 돌아온다. 마이크로암미터 대신 매직 아이(Magic eye)가 달린 전원차계를 쓸 수도 있다. 칼핏샤시액에 의한 적정은 따로 규정이 없는 한 다음의 어느 방법에 따라도 무방하다. 적정의 종말점은 보통 역적정을 할 때 명확하게 판별할 수 있다.

가) 직접적정

칼핏샤용 메탄올 25㎖를 건조적정플라스크에 취하여 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10～50㎎에 해당하는 검사시료를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 옮겨 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정한다.

검사시료가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하여 무게를 정밀하게 달아 신속하게 적정플라스크에 옮겨 습기를 피하면서 30분간 저은 다음 세게 흔들어 섞으면서 적정한다.

검사시료의 적정에 소비된 칼핏샤시액의 양(㎖)×f

수분(%)= ――――――――――――――――――――――――― × 100

검사시료의 양(㎎)

f : 시약의 역가

나) 역적정

칼핏샤용 메탄올 20㎖를 건조 적정플라스크에 취하여 미리 칼핏샤시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10～50㎎에 해당하는 검사시료(S ㎎)를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 넣고 과량의 칼핏샤시액 일정량(d ㎖)을 넣은 다음 세게 흔들어 섞으면서 물․메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다(소비량 e ㎖).

검사시료가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하고 무게를 정밀하게 달아 신속하게 적정플라스크에 옮겨 과량의 칼핏샤시액 일정량을 넣고 습기를 피하면서 30분간 저은 다음 세게 흔들어 섞으면서 적정한다.

df-ef′

수분(%)= ――― ×100

S

f, f′: 시약의 역가

나. 회분

(1) 회화용기의 항량

깨끗한 회화용기(자제 또는 백금도가니)를 전기로에서 600℃이상으로 여러시간 강하게 가열한 후 데시케이타에 옮겨 실온으로 식힌 다음 곧 화학천칭으로 칭량한다. 다시 2시간 강하게 가열하여 건조 칭량하고 이 조작을 항량이 될 때까지 반복한다.

(2) 검사시료의 전처리

검사시료를 회화용기에 정밀히 달아 넣고 수분함량이 많은 검사시료(액상검사시료는 수욕상에서 미리 증발 건조시킨 후)는 건조기 내에서 될 수 있는 대로 건조시킨다. 또한 회화에 앞서 이들 검사시료는 버어너의 약한 불로 주의하면서 탄화하든가 또는 전기곤로를 이용하여 탄화하고, 육류 등 고체시료는 알콜을 가하여 탄화시킨 다음 전기곤로상에서 충분히 탄화시킨다.

(3) 회화

위와 같이 전처리가 끝나면 용기를 그대로 회화로에 옮겨 550～600℃에서 여러시간(2～3시간) 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 계속한다. 회화가 끝난 후, 가열을 그치고 그대로 식혀 온도가 약 200℃로 되었을 때 데시케이타에 옮겨 식힌 후 칭량한다. 만일, 회화에 있어서 대량의 탄소가 남아 회백색의 회분을 얻을 수 없는 검사시료일 경우에는 얻은 흑회색의 회분을 식힌 다음 약 15㎖의 물을 가하여 탄 덩어리를 유리봉으로 부수어 수욕상에서 잘 가온하여 가용분을 침출하여 정량 여과지로 작은 비이커에 여과하고, 잔류물은 다시 물로 씻어, 씻은 액은 비이커에 넣는다. 여과지상의 잔류물은 여과지와 같이 먼저의 회화용기에 옮겨 건조후 550～600℃에서 회화시킨다. 비이커의 액은 수욕상에서 농축하여 잔류물을 회화한 먼저의 회화용기에 옮기고 소량의 물로 비이커를 씻고, 씻은 액도 회화용기에 넣는다. 다시 회화용기를 수욕상에서 증발건조하고, 500～600℃에서 2시간 가열하면 탄소가 함유되지 아니한 회분을 얻는다.

회화한 다음 데시케이타에 옮겨 식히고 실온으로 되면 곧 칭량하여 검사시료의 회분량(%)을 다음 식에 따라 산출한다.

W1-W0

회분(%)= ―――― × 100

S

W0 : 항량이 된 회화용기의 무게(g)

W1 : 회화 후의 회화용기와 회분의 무게(g)

S : 검사시료의 채취량(g)

다. 질소화합물

(1) 총질소 및 조단백

(가) 세미마이크로 킬달법

[장치 및 시약]

그림과 같은 장치를 쓴다. 전체가 경질유리를

사용하여야 하며, 접속부위는 갈아 맞춘 것으로

하여도 좋다. 장치에 쓰는 고무는 수산화나트륨

시액속에서 10～30분간  끓이고, 다음에 물에서

30 ～ 60분간 끓인 다음 물로 충분히 씻어서

쓴다(단, 동시험법의  원리를 이용한 기타의

장치 또는 자동․반자동기기를 사용할 수 있다).

A : 킬달플라스크

B : 수증기 발생기로서 황산 2～3방울을 넣은 물을 넣고 갑자기 끓는 것을 피하기 위하여 비등석을 넣는다.

C : 알칼리용액을 넣는 깔대기

D : 수증기 유도관

E : 내용물이 튀어 올라오는 것을 막는다.

F : 작은 구멍(관의 안지름과 거의 같다)

G, H : 갈아 맞춘 접속부위

I : 냉각기(바깥지름 200㎜, 안지름 350㎜, 아래 끝은 약 5㎜)

J : 흡수용플라스크

분해 촉진제 : CuSO4 : K2SO4(1 : 4)

부런스위크(Brunswik)시액 : 메틸레드 0.2g 및 메틸렌블루 0.1g을 에탄올 300㎖에 녹여서 여과하여 사용하고 갈색병에 보존한다.

[시험방법]

〈검사시료의 분해〉

1) 통상적으로 질소(N) 함량이 2～3㎎에 해당하는 양의 검사시료를 정밀히 취하여 킬달플라스크에 넣고 여기에 분해촉진제 약 0.5g을 넣은 후 플라스크 내벽을 따라 황산 3～5㎖를 넣은 다음 플라스크를 흔들어 주면서 30% 과산화수소 1㎖를 조금씩 조심하여 넣는다.

플라스크를 금망상에서 천천히 가열하고 검사시료의 탄화물이 보이지 않을 때까지 온도를 높여 끓이고 분해액이 투명한 담청색이 되면 다시 1～2시간 가열을 계속한다.

분해액을 냉각시킨 후 물 20㎖를 주의하여 가한 후 이 플라스크를 증류장치에 연결한다.

2) 비교적 많은 검사시료를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량이 약 20～30㎎에 해당하는 양의 검사시료를 정밀히 취하여 250～300㎖의 킬달분해 플라스크에 넣고 이에 분해촉진제 1～2g 및 황산 20～30㎖를 가하여 가열분해 시킨다.

분해액을 냉각시킨 후 물 약 100㎖를 가하고 200㎖ 메스플라스크에 옮겨서 냉각 후 물을 가하여 전량을 200㎖로 채워 그 20㎖를 세미마이크로 킬달분해 플라스크에 취하여 증류장치에 연결한다.

3) 질소(N)함량이 적어서 다량의 검사시료를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량 2～3㎎에 해당되는 검사시료를 정밀히 취하여 상기 2)의 조작과 같이 가열 분해하고 냉각 후 물 20㎖를 주의하여 가하고 킬달분해 플라스크를 증류장치에 연결한다.

〈증류 및 적정〉

증류장치의 흡수플라스크에 0.05N 황산 10.0㎖를 취하여 이에 부런스위크시액 2～3방울을 떨어뜨려서 냉각기의 끝부분을 액면 밑에 담그고 작은 깔대기로부터 30% 수산화나트륨용액 25㎖를 가한다.

다음에 수증기 발생기로부터 수증기증류를 하여 증류액 약 100㎖를 받은 후 냉각기의 끝을 액면에서 조금 떼어 다시 유액 수 ㎖를 유취하여 다시 냉각기의 끝을 소량의 물로 수기내에 씻어 넣는다. 수기내에 들어 있는 유액을 0.05N 수산화나트륨액으로 부런스위크시액이 녹색으로 변할 때까지 적정한다. 따로 같은 방법으로 공시험을 한다.

0.05N 황산 1㎖=0.7003㎎ N

[계 산]

100

질소(%)=0.7003 × (a-b) × ―――――――――――

검사시료의 채취량(㎎)

a : 공시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 ㎖수

b : 본시험에서 중화에 소요된 0.05N 수산화나트륨액의 ㎖수

계산식은 검사시료의 분해액을 전부 사용해서 적정했을 때의 식이므로 분해액의 일부를 사용할 때는 그 계수를 곱한다.

여기서 얻은 질소량에 질소계수(원유‧유가공품 : 6.38, 식육‧식육가공품‧알가공품제품 : 6.25)를 곱하여 조단백질의 양으로 한다.

조단백질(%)=N(%)×질소계수

(2) 아미노산질소

(가) 홀몰적정법(S　rensen법)

양성 전해질인 아미노산의 아미노기 또는 카르복실기의 산 또는 알칼리적정에 의한 정량은 그 수용액이 완충성을 가지고 있다는 점과 아미노기 또는 카르복실기의 적정반응 종말점이 거의 pH 11 및 1.5여서 적당한 지시약이 없다는 점 때문에 보통의 적정으로서는 불가능하다.

그러나 아미노산의 중성 또는 약알칼리성의 용액에 포름알데하이드를 가하여 하이드록실메틸 유도체를 생성하여 아미노기의 질소 원자의 염기성이 현저히 적어지기 때문에 알칼리에 의한 아미노기의 적정 종말점이 pH 9부근으로 옮겨진다.

따라서 포름알데하이드의 존재하에서 페놀프탈레인을 지시약으로하여 알칼리로 적정하므로써 아미노산을 정량할 수 있다.

[시  약]

1) 비교액

제일인산칼륨 9.078g 및 제이인산나트륨 11.876g을 각각 물에 녹여 1ℓ로 한다. 쓸 때에 양 액을 같은 양으로 섞어서 만든다(pH 6.8).

2) 중화홀몰액

30～40% 포름알데하이드 50㎖에 페놀프탈레인용액(0.5%) 1㎖를 가한 다음 엷은 홍색이 될 때까지 0.2N 수산화나트륨액을 가한다.

3) 대조액

끓여서 식힌 물 20㎖에 중화홀몰액 10㎖, 페놀프탈레인용액 1㎖ 및 적정소요량의 약 1/2가량의 0.2N 수산화나트륨액을 가한 다음 액이 엷은 홍색을 나타낼 때까지 0.2N 염산을 적하한다(pH 8.3 제1기). 다음에 0.2N 수산화나트륨액 5방울을 가하여 명확하게 홍색으로 한다 (pH 8.8 제2기).

[시험방법]

〈시험용액의 조제〉

인산, 탄산 및 다량의 암모늄염을 함유하지 않은 검사시료에 대해서는 묽은 염산 또는 수산화나트륨용액으로 pH 6.8로 조절한다(비교액을 동시에 청색 리트머스지상에 적하하여 그 정색도를 일치시킨다). 인산 또는 탄산을 함유한 검사시료는 그 50㎖를 100㎖의 메스플라스크에 취하여 페놀프탈레인용액 1㎖ 및 염화바륨 2g을 넣고 흔들어 녹인 후 지시약이 정색될 때까지 포화수산화바륨용액을 가한다. 다시 포화수산화바륨용액 5㎖를 추가하고 물을 가하여 100㎖로 하고 잘 섞어서 15분간 방치한다

이어서 건조여과지로 여과하고 그 여액 80㎖를 100㎖의 메스플라스크에 취하고 0.2N 염산으로 중화시켜 탄산이 없는 물을 가하여 100㎖로 해서 시험용액으로 한다. 암모늄염을 0.02M 이상 함유한 검사시료는 위의 수산화바륨처리를 한 여액 80㎖를 취하여 감압증류를하여 암모니아를 제거하고 1N 염산 수 ㎖를 가하고 탄산가스를 함유하지 아니한 공기를 통하여 탄산가스를 제거하고 중화하여 일정용량으로 한다.

[적  정]

시험용액 20㎖, 중화홀몰액 10㎖ 및 페놀프탈레인용액 1㎖를 가하고 대조액보다 조금 진하게 정색될 때까지 0.2N 수산화나트륨액을 가한 다음 0.2N 염산으로 대조액보다 약하게 정색시킨다.

다음 0.2N 수산화나트륨액을 적하하여 대조액(제2기)과 같은 색이 되도록 한다. 대조액(제2기)에 0.2N 수산화나트륨액 2방울을 더 넣어 진한 적색으로 하여(제3기 pH 9.1) 시험용액이 이와 같은 색이 될 때까지 0.2N 수산화나트륨액으로 적정한다. 이상의 조작은 신속하게 하여야 한다.

여기에 소비된 0.2N 수산화나트륨액의 총 ㎖수로부터 0.2N 염산의 ㎖수 및 대조액의 알카리 소비량(보통 0.1㎖)을 뺀 수치에 2.8배를 하면 홀몰적정 가능한 질소의 양이 얻어진다.

홀몰질소(㎎)=2.8×[VТ-(VH+Ve)]×f

VT : 제3기까지의 0.2N 수산화나트륨액의 총량(㎖)

VH : 가한 0.2N 염산용액에 상당하는 0.2N 수산화나트륨 용액의 양(㎖)

Ve : 대조액에 가한 0.2N 수산화나트륨액의 총량(㎖)

f  : 0.2N 수산화나트륨액의 역가

(나) 반스라이크법

A : 약 35㎖의 핀치콕크가 달린 깔때기

B : 아미노산을 분해시키는 용기(용량 40～45㎖)

C : 용량 10㎖의 뷰렛

D : 가스뷰렛

E : 헨펠가스피펫

F : 수준조

A와 B를 연결하는 관의 안지름과 핀치콕크 a의 구멍지름은 3㎜이며, 핀치콕크 b의 구멍지름은 될 수 있으면 큰 것이 좋다. B와 C의 접속부는 안지름이 8㎜이상, 핀치콕크 c의 구멍지름은 1㎜, d의 구멍지름은 1.5～2㎜로 하여야 하고 A, B 및 C에 있어서의 각 핀치콕크는 아라비아검․파라핀․와세린(1:1:2)을 혼합한 것을 발라 A와 B가 움직일 때에 가스가 새지 않도록 해야 한다.

과망간산칼륨용액 : 포화과망간산칼륨용액 1ℓ에 수산화칼륨 또는 수산화나트륨 25g을 가하여 녹인다.

[시험용액의 조제]

검체가 고체인 경우 그 일정량을 취하여 약 10배량의 물을 가해서 1시간 냉침한 후 흡인여과하고 다시 1회 침출을 되풀이 하고 잔류물은 다시 일회 처음과 같은 양의 물을 함께 끓인 후 여과하고 여액을 합해서 다시 끓여 단백질을 응고시킨다.

다음에 여과 세정하고 여액 및 세액을 합하여 증발시켜서 소량으로 하고 이에 약 5%가 되도록 10% 황산을 가한 후 인텅그스텐산용액을 가해 침전이 생기면 여과하고 이어서 5% 황산으로 세척하여 여액에 세액을 합한 후 물로써 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 검체가 액체인 경우에는 그 일정량을 취하여 끓여서 침전이 생성되면 여과하고 위와 같은 10% 황산을 가하여 약 5%로 하고 다시 인텅그스텐산용액을 가하여 침전이 생기면 이를 여과하고 여액을 일정량으로 해서 시험용액으로 한다.

이 시험용액에 대하여 염산 7～8㎖ 또는 황산 2～2.5㎖를 가해서 1.5～2시간 끓인 다음 석회유, 마그네시아 또는 알칼리에 가해 증발 건조시켜서 암모니아를 날려 보낸다. 잔류물을 끓인 물에 녹이고 필요하면 여과한다. 이 액은 분해가 쉽게 되므로 신속하게 시험하여야 한다.

[조작법]

1) 장치내의 공기제거

D로부터 물을 작은 관 d 및 g까지 채우고 다음에 A1의 표선(B의 용량의 1/5에 상당한다)까지 초산을 넣고 핀치콕크 a와 b를 열어서 B로 옮긴다. 다음에 30%(w/v) 아질산나트륨용액을 A2에 넣고 전과 같은 조작으로 이것을 B 중에 흘려 넣어서 B에 완전히 채우는 한편 그 소량은 A내로 남긴다.

다시 d를 막고 a를 열어 수초간 흔들어 NO가 발생해서 B의 상부에 모인다. d를 열어서 이를 i에 배제한 후, d를 막고 다시 B를 흔들어 발생하는 NO를 같은 방법으로 배치한다. 이 조작을 반복하여 협잡하는 공기를 완전히 제거한 후 B를 진동장치(H)에 연결하고 진동시켜 B중의 용액의 액면이 표선 20㎖가량 내려가면 핀치콕크 a를 닫고 핀치콕크 d 및 e를 열어 B와 D를 연결시킨다.

2) 반응

아미노산의 시험용액을 C에 넣고 c를 열어 그 소요량을 B중에 유입시키고 c를 막은 다음 흔들면 발생하는 N2가 NO와 함께 D내에 모인다. 만약 거품이 생길 경우에는 적당량의 아밀알코올을 C로부터 B중에 첨가한다. 반응은 2～5분간 끝난다. 다음에 이를 열어서 A중의 액을 B중에 흘려 넣어 B중의 가스를 전부 D내로 이행시킨다.

3) 질소(N)량의 측정

D중에 모인 가스를 알칼리성 과망간산칼륨용액을 가득 채운 헴펠가스피펫 E에 옮겨 진동장치를 연결하여 진동시켜서 협잡하는 NO를 흡수시킨 후 남은 N2를 재차 D내에 옮겨 그 양을 읽고 이것을 부표에서 찾아 N2의 양을 구하고 이를 1/2로 하여서 아미노산성질소의 총량으로 한다.

라. 지질

(1) 조지방

(가) 뢰제․곳트리브(Röse-Gottlieb)법

이 방법은 유가공품, 비교적 지방질의 함량이 많은 액상 및 우유류 또는 물을 가하여 액상 및 우유와 같은 모양으로 할 수 있는 축산물에 적용한다.

검사시료 1～10g을 정밀히 달아 뢰리히관, 마조니어관 또는 그 외 지방추출관에 넣어 물을 가하여 약 11㎖로 하고 40℃～ 50℃로 가온한 후 흔들어 완전히 혼화한 후 암모니아수 1.5㎖(액이 산성인 경우 2.0㎖)를 가하여 혼화한 후 알코올 10㎖를 가하여 잘 섞는다.

다음 에테르 25㎖를 가하여 가볍게 섞고 마개를 열어 에테르증기를 날려 보낸 후 다시 마개를 닫고 약 1분간 세게 흔든다. 필요하면 냉각 후 석유에테르 25㎖를 가하고 다시 1분간 격렬히 진탕한다(난류의 경우 전란은 약 3g, 노른자위는 약 2g, 흰자위는 약 5g을 작은 비커에 정밀히 달아 넣고 염산 10㎖를 소량씩 가하여 섞어 70℃ 수욕 중에서 약 30분간 가온한 다음 5분마다 흔들면서 30분간 끓인다. 이에 물을 가하여 약 20㎖로 하고 식힌 내용물을 뢰리히관에 옮기고 비커는 에테르 25㎖로 씻어 뢰리히관에 넣고 흔든 다음 석유에테르 25㎖를 가하여 흔든다.) 이를 600rpm에서 원심분리하거나 방치하여 상층액이 완전히 투명하게 되면 상층액을 미리 항량으로 한 삼각플라스크에 옮기고 관내의 남은 액에 에테르 및 석유에테르 각 15㎖씩으로 가하여 위와 같은 조작을 한다. 다시 석유에테르 및 에테르 15㎖씩으로 3회 추출한다. 다음 관의 마개 유출구 및 깔대기를 에테르-석유에테르의 같은 양의 혼액으로 깨끗이 씻고 여액 및 씻은 액을 삼각플라스크에 합쳐 수욕상에서 용매를 날려 보낸 후 100±2℃의 건조기에 넣고 항량이 될 때까지 건조하고 조지방의 함량을 산출한다.

(나) 바브콕(Babcock)법

이 방법은 원유 및 우유류에 적용한다.

[ 기구 및 시약 ]

Babcock 유지병

피 펫 : 17.6㎖(우유용), 17.5㎖(황산용)

원심분리기 : 700 rpm이상

항온수조 : 57～60℃로 조절가능한 것.

91.5%황산

[ 시험 ]

Babcock 유지병에 시료 및 황산 17.5㎖를 순차적으로 취하고 병을 흔들어 혼합시킨 다음 700rpm으로 5분간 원심분리한 후 끓는 물로써 병의 경부까지 채우고 잘 혼합한 다음 다시 2분간 원심분리한다. 끓는 물로써 그 액면이 최상부의 눈금 직하에까지 오게 하여 다시 1분간 원심분리한 후 항온수조에 넣어 시료의 온도가 57～60℃가 되면 지방층의 눈금을 읽는다. 즉, 지방층의 최저부에서부터 최상부까지의 표선눈금간격을 읽어 지방%로 한다.

(다) 속스렛(Soxhlet)법

이 방법은 주로 식육에 적용한다.

[ 기구 및 시약 ]

Soxhlet 지방추출장치 : 500㎖용 증류플라스크, 지방추출관 및 냉각관으로 구성되어 있고 전부 유리연결부로 된 것.

A : 지방추출관

B : 증류 flask

C : 냉각관

D : 원통여과지

<속스렛(Soxhlet) 추출장치>

항온수조

항온건조기 : 97±1℃로 조절가능한 것.

화학천평 : 소숫점이하 네자리까지 읽을 수 있는 것.

원통여과지 및 탈지면

에칠에텔

무수황산나트륨(Na2SO4)

[시험방법]

검사시료가 충분히 건조되어 있을 때는 그대로, 수분이 많이 함유되어 있는 시료는 예비건조하고, 지방분이 다량 함유된 것은 평량후 에텔로서 지방분의 일부를 제거한 다음 나중에 가산한다. 수분이 특히 많을 때는 모래나 무수황산나트륨을 넣고 건조시켜 사용한다.

검사시료 5～10g을 평량하여 무수황산나트륨 4～5g을 가하여 충분히 마쇄하고 98～100℃의 건조기속에서 2～3시간 건조시킨다.

원통여과지에 탈지면 소량을 넣고 그 위에 건조시료를 취한 다음 다시 탈지면으로 덮고 이것을 지방추출관에 넣는다. 증류 플라스크에 에칠에텔 150～200㎖를 취하고 추출관 및 냉각관을 연결하여 50～60℃의 수욕상에서 12～16시간 침출시킨다.

추출이 완료되면 증류 플라스크중의 에텔을 미리 건조시켜 평량된 평량병에 옮기고 항온수조상에서 에텔을 증발 건고시킨 다음 98～100℃에서 항량이 될 때까지 건조시켜 증가된 양을 지방량으로 한다.

(2) 물리적 시험

(가) 비중

비중이란 물질의 질량과 그것과 같은 체적의 표준물질과의 질량의 비를 말한다.

1) 액체지방

비중병(용량 10～100㎖의 병으로서 온도계를 붙이는 갈아 맞춘 마개와 눈금 및 갈아 맞춘 뚜껑을 가진 측관이 있는 것)을 미리 깨끗하게 씻고 건조하여 그 무게(W)를 단 다음 마개와 뚜껑을 빼고 검사시료를 가득 넣은 후 따로 규정이 없는 한 규정온도(25℃)보다 1～3℃낮게 하고 거품이 남지 아니하도록 주의하여 마개를 막는다.

다음 천천히 온도를 올려 온도계가 표준온도를 나타낼 때 눈금보다 상부의 검사시료를 측관으로부터 제거하고 측관에 뚜껑을 하여 외부를 잘 닦은 다음 무게(W1)를 단다. 다시 같은 비중병으로 증류수를 사용하여 위와 같이 조작하고 그 무게(W2)를 달아 다음 식에 따라 비중(d)를 구한다.

W1-W

d = ────

W2-W

2) 고체지방

미리 깨끗이 씻어 건조한 스프렝겔피크노메타(뚜껑 k가 2개 있는 것)의 무게를 단다. 다음에 뚜껑 k를 열어 b관의 부속관 r를 끼우고 a관에 흡입관 s를 끼우고 부속관 r의 끝을 용융지방중에 담그고 흡입관 s에서 흡인하여 지방은 가득 채운다. 100℃의 가온조에 피크노메타를 20～30분간 담그고 r과 s를 빼고 b관의 끝에 여과지를 대고 지방량을 a관내에 눈금에 닿게 한 다음 a, b관에

지방용피크노메타               뚜껑을 덮고 건조거즈로 깨끗이 닦고 식힌

스프렝겔․피크노메타         다음 무게를 단다. 같은 피크노메타에 25℃의

증류수를 써서 같은 조작을 하여 무게를 달고 체지방의 계산식에 따라 비중을 계산한다.

(나) 굴절률                    압베 굴절계의 A, B 2개의 금속상자 중

에서 각각 프리즘이 있어 D에서 E로 온탕을 흘려서 양프리즘을 일정한 온도로 가열한다. 프리즘을 열고 에테르로 적신면으로 프리즘의 면을 깨끗이 닦고(사용한 다음도 같다) 굴절계의 A, B를 닫고 OK에서 관찰하고 전체 반사의 경계선(명암의 경계)이 눈의 교차점에 오도록 J를 움직여 프리즘을 회전하고 그때의 S상의 눈금을 루우베 L에서 보고 직접 굴절률을 읽는다.

압베굴절계

(3) 화학적 시험

(가) 산가

산가라 함은 지질 1g을 중화하는데 필요한 수산화칼륨의 ㎎수이다. 검사시료 5～10g을 정밀히 달아 마개달린 삼각플라스크에 넣고 중성의 에탄올․에테르혼액(1 : 2) 100㎖를 넣어 녹인다. 이를 페놀프탈레인시액을 지시약으로 하여 엷은 홍색이 30초간 지속할 때까지 0.1N 에탄올성수산화칼륨용액으로 적정한다(다만, 검사시료가 착색되어 있을 때는 지시약은 1% 티몰프탈레인․알코올용액이나 2% 알칼리블루-6B 알코올용액을 사용하던지 또는 검사시료를 소량으로 하여 상기 용제를 증량하여 시험한다.

5.611×a×f

산가(㎎/g) =  ────────

S

S : 검사시료의 채취량(g)

a : 0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액의 소비량(㎖)

f : 0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액의 역가

(나) 비누화가

비누화가라 함은 지질 1g중의 유리산의 중화 및 에스테르의 검화에 필요한 수산화칼륨의 ㎎수이다. 검사시료 1～2g을 200㎖의 플라스크에 정밀히 달아 넣고 0.5N 수산화칼륨․에탄올용액 25㎖를 정확히 가하고 이에 갈아 맞춘 작은 환류냉각기 또는 공기 냉각기(길이 약 75㎝, 내경 7㎜의 유리관)를 달고 수욕중에서 때때로 흔들어 저으면서 30분간 가열한다. 다음 페놀프탈레인시액을 지시약으로 하여 즉시 0.5N 염산으로 과잉의 수산화칼륨을 적정한다. 따로 검사시료를 사용하지 않고 같은 방법으로 공시험을 한다.

비누화가(㎎/g)=28.05×(b-a)×f/S

a : 검사시료를 사용했을 때의 0.5N 염산의 소비량(㎖)

b : 공시험에 있어서의 0.5N 염산의 소비량(㎖)

S : 검사시료의 채취량(g)

f : 0.5N 염산의 역가

(다) 요오드가

요오드가라 함은 일정한 측정법으로 측정한 지질 100g에 흡수되는 할로겐의 양을 요오드의 g수로 나타낸 것이다.

1) 하누스법

[시  액]

브롬요오드시액 : 요오드 13.2g을 초산 1,000㎖에 가온하여 녹이고 이것을 25℃로 식힌 다음 20.0㎖를 취하여 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다. 요오드용액의 나머지에 그중에 함유되는 요오드의 양과 당량의 브롬(약 3㎖)을 가한다. 이 액은 차광한 공전병에 보존한다.

[시험방법]

검사시료의 요오드가를 감안하여 다음 표에 따라 0.1～0.8g을 작은 유리그릇에 정밀히 달고 250㎖의 마개달린 삼각플라스크 중에 유리그릇과 같이 넣는다.

클로로포름 10㎖를 가하여 녹이고 여기에 브롬요오드시액 25㎖를 정확히 가하고 밀전하여 잘 섞고 차광하여 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치한다. 다음에 1N 요오드칼륨액 30㎖를 가하여 흔들어 섞고 다시 물 100㎖를 가하여 유리한 요오드를 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 : 전분시액 1㎖). 따로 검사시료를 사용하지 않고 같은 방법으로 공시험을 한다.

요오드가(g/100g) : 1.269×(b-a)×f/S

a : 본시험에 있어서의 0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

b : 공시험에 있어서의 0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

S : 검사시료의 채취량(g)

f :  0.1N 티오황산나트륨액의 역가

이 시험에서 만약 브롬요오드시액의 반량 이상이 소비되었을 때에는 검사시료를 감량하여 그 측정을 되풀이 한다.

요오드가	검사시료채취량(g)
120이상 60～120 60이하	0.1～0.2 0.2～0.4 0.4～0.8

2) 위이스법

[시  액]

일염화요오드시액

재승화시킨 요오드 13g을 초산 1,000㎖에 녹이고 그 일부에 대하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 놓고, 이에 씻은 건조염소를 통하여 다시 일부에 대하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 그 양이 최초의 적정량의 2배가 되도록 한다. 요오드는 약간 과잉의 정도로 한다. 이 시액은 공전갈색병에 넣어 파라핀으로 봉하고 사용직전에 연다. 30일 이상 지난 시액은 사용하면 아니된다.

[시험방법]

검사시료의 요오드를 감안하여 적당량의 검사시료를 250㎖의 마개달린 삼각플라스크에 취하고 사염화탄소 15～20㎖를 가하고 일염화요오드시액 25㎖를 피펫으로 일정한 속도로 적가한다. 다음에 암소에 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치한 다음 1N 요오드칼륨액 20㎖ 및 물 100㎖를 가하여 흔들어 섞은 다음 유리한 요오드를  0.1N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 : 전분시액 1㎖). 같은 방법으로 공시험을 한다. 계산은 1) 하누스법에 따라 한다.

(라) 비비누화물

검사시료 약 5g을 정밀히 달아 300㎖의 플라스크에 넣고 1N 수산화칼륨․에탄올용액 50㎖를 가하여 이에 환류냉각기를 달고 수욕상에서 때때로 흔들어 주면서 1시간 온화하게 끓인다

다음에 수욕상에서 에탄올을 증발시키고 잔류물에 열탕 50㎖를 가하여 분액깔때기에 옮기고 플라스크는 열탕 25㎖씩으로 2회 씻어, 씻은 액은 먼저의 액에 합치고 상온으로 식힌 다음 에테르 50㎖씩을 2회 잘 흔들어 섞어 추출한다. 에테르추출액을 합쳐 다른 분액깔때기에 옮기고 0.1N 수산화나트륨액 20㎖씩으로 2회 씻는다. 다음 물 15㎖씩으로 씻은 액이 페놀프탈레인시액 2방울에 의하여 홍색을 나타내지 않을 때까지 씻는다.

에테르액을 무게를 단 유리용기에 넣고 분액깔때기는 에테르 10㎖씩으로 씻어, 씻은 액은 에테르액에 합쳐 주의하여 증발 건고한 다음 잔류물을 105℃에서 30분간 건조하고 데시케이타(황산)에서 방냉한 다음 무게를 달아 비비누화물의 양으로 한다.

(4) 지방산

(가) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량법

1) 장치

가스크로마토그래프 : 수소염이온화 검출기(FID)

2) 시약

가) 14% 트리플루오로보란메탄올(125g BF3/L MeOH)

나) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N)

수산화나트륨 2g을 메탄올 100㎖에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

다) 헵탄

3) 표준용액의 조제

지방산 표준품 약 100㎎을 100㎖ 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올 수산화나트륨용액을 약 4㎖ 가한다. 플라스크 위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3 약 5㎖를 환류냉각기를 통해 가하고 2분동안 계속하여 가열한다. 마지막으로 n-헵탄 5㎖를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다. 수욕조와 냉각기를 제거하고 수 ㎖의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목부분까지 올라오게 한다. 상층에서 약 1㎖의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

가) 지방 및 유지

검사시료를 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액을 가한다. 플라스크 위에 환류냉각기를 설치하고 5～10분간 수욕상에서 균질한 용액이 얻어질 때까지 가열한다. 그 후 14% BF3를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속하여 가열한다. 마지막으로 n-헵탄 2～5㎖를 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다. 수욕조와 냉각기를 제거하고 수 ㎖의 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 헵탄층이 플라스크의 목부분까지 올라오게 한다. 상층에서 약 1㎖의 헵탄을 취한 후 이에 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수시킨 것을 시험용액으로 한다.

나) 지방산

검사시료를 환저플라스크에 정밀히 취하고 14% BF3를 넣은 후 1) 지방과 유지의 “2분동안 계속하여 가열한다”. 이후의 과정과 동일하게 조작한 것을 시험용액으로 한다.

주 1. 이중결합이 2개 이상인 지방산을 분석하는 경우에는 질소가스를 사용하여 메탄올과 플라스크의 공기를 제거한 후 사용하며, 시험용액은 가능한 한 빨리 분석한다. 장기간 보관할 경우에는 앰플에 넣어 냉동보관하거나 0.005% BHT를 첨가한다.

주 2. 검사시료의 양은 정확히 채취하여야 하며, 검사시료의 크기에 따라 플라스크의 크기와 시약의 양을 달리하여야 한다.

검사시료(㎎)	플라스크(㎖)	메탄올수산화나트륨(㎖)	BF3시약(㎖)
100～250 250～500 500～750 750～1000	50 50 100 100	4 6 8 10	5 7 9 12

* 가스크로마토그래프 분석의 경우 약 350㎎ 정도가 적당하다.

5) 시험조작

가) 가스크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 5% DEGS/크로모솔브 W(AW)

- 주입부온도 : 230℃～ 240℃

- 칼럼온도 : 190℃～ 195℃

- 검출기온도 : 230℃～ 240℃

- 캐리어가스 및 유량 : 질소 40㎖/분

주 3. HP-1, Omegawax 등과 같은 모세관 칼럼(capillary column)을 사용할 수도 있다.

주 4. 탄소수가 12이하인 경우에는 칼럼온도가 더 낮아야 하며, 탄소수가 20이상인 경우에는 주입부, 칼럼, 검출기의 온도가 더 높아야 한다. 다양한 탄소수의 지방산을 한번에 분석할 경우에는 칼럼온도의 승온조작이 필요하다.

나) 정량시험

시험용액 및 지방산표준용액에 대하여 각각 1～5㎕를 주입하여 가스크로마토그래피를 행하고 이의 머무름시간을 비교하여 정성을 하고, 내부표준용액에 의거 정량을 한다.

마. 탄수화물

(1) 당질

(가) 환원당

1) 벨트란(Bertrand)법

가) 검액의 조제

환원당으로서 0.2～1.0g에 대응하는 검사시료(액상 검사시료는 수욕상에서 증발 건조하여 사용하고 검사시료가 다량의 지방질을 함유하였을 때는 에테르로 침출하여 탈지한다. 그리고 검사시료가 산성일 경우에는 탄산칼슘 적당량을 가하여 이에 중화한다)를 200㎖의 삼각플라스크에 취하고 80v/v% 에탄올 100㎖를 가하여 환류냉각기를 달고 1시간 수욕상에서 가온한다. 식힌 다음 이 내용물을 250㎖의 메스플라스크에 옮기고 삼각플라스크는 에탄올로 씻는다. 이에 에탄올을 넣고 전량을 250㎖로 하여 잘 흔든다. 이 상징액 100㎖를 비이커에 취하고 증발하여 2～3㎖가 되게 하고(에탄올을 완전히 날려 보낸다)물 약 30㎖를 가하여 잘 흔들고 중성초산납용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때까지 가하고 섞은 다음 약 15분간 방치하고 여과한다.  여과지상의 잔류물을 물 5㎖씩으로 3회 씻는다. 여액에 10% 황산나트륨용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때까지 가하여 납을 제거한 다음 건조여과지로 여과하고 잔류물은 물 5㎖씩으로 3회 씻고 여액에 물을 넣어 100㎖로 한다.

나) 시험방법

검액 20㎖(당량은 0.05～0.45%가 아니면 아니된다)를 200㎖의 삼각플라스크에 넣고 벨트란시액 A 및 B액 각 20㎖를 가하여 흔들어 섞은 다음 금망상에서 정확하게 3분간 조용히 끓인다.

식힌 후 아린관에 상징액을 기울여 넣고 조용히 흡인 여과한 다음 물 약 50㎖를 삼각플라스크의 내벽을 따라 조용히 주입하여 흔들어 아산화동의 침전을 씻어 다시 아린관에 흡인 여과한다.

이 조작을 3～4회 반복하여 침전을 완전히 씻은 다음 알칼리성이 없어질 때까지 더운 물로 씻는다. 이때 아산화동이 공기와 접촉하지 않도록 주의한다.

다음 받는 그릇을 교환한 후 벨트란시액 C액 약 20㎖를 삼각플라스크에 넣어 아산화동을 녹이고 이를 앞의 아린관에 3～4회로 나누어 조용히 흡인하면서 침전을 완전히 녹인다. 다음 더운 물 약 100㎖로 아린관을 여러번 씻은 후 이를 벨트란시약 D액으로 연한 홍색이 될 때까지 적정한다. 이에 소비된 벨트란시액 D액의 소비량(㎖)으로부터 구리의 양을 산출하고 부표중의 벨트란당류정량표에 의하여 당량을 구하여 다시 검사시료 중의 당량을 산출한다.

2) 레인․에이논(Lane-Eynone)법

가) 기구 및 시약

뷰렛 : 50㎖용

전기곤로

페링시액 A액 : Ⅶ시약‧시액‧표준용액 및 용량분석용 규정용액 2. 시액참고

페링시액 B액 : Ⅶ시약‧시액‧표준용액 및 용량분석용 규정용액 2. 시액참고

나) 시험방법

시료 일정량(유당 약 0.5g상당량)을 200㎖용 메스플라스크에 취하고 증류수로써 200㎖되게 희석한다. 그리고 200㎖용 삼각플라스크에 페링시액 A액 및 B액 각각 5㎖ 증류수 10㎖를 순차적으로 취하고 위의 희석 시료는 뷰렛에 취한다.

석면 금망상에 페링시액이 담긴 플라스크를 놓고 가열하여 끓기 시작하면 뷰렛의 시료를 적하하여 적정예정량의 대부분을 가하고 이 용액의 청색이 거의 소실될 때까지 가열한 후 메칠렌부루지시약 4적을 가하고 청색이 완전 소실될 때까지 계속적정한다.

이때의 적정은 3분 이내에 끝내도록 한다.

적정예정량을 정하기 위하여 예비시험을 실시하며 이 예비시험에 의하여 시료의 희석정도를 결정한다. 즉 소요적정액이 25～35㎖되게 희석정도를 조절한다. 유당량은 부표중의 레인․에이논 유당 정량표에 의하여 희석시료 100㎖중의 유당량을 구하여 페링시액 A액의 역가를 곱하여 보정하고 시료 100g의 유당량을 구하여 유당%로 한다.

희석시료 100㎖중의 유당량(㎎) × 희석배수 ×역가    100

유당(%) = ──────────────────────── × ───

시료채취량(g)                     1000

(나) 자당

1) 벨트란법

전항의 검액의 조제에 따라 0.5～1%의 자당이 함유되도록 만든 검액 100㎖를 250㎖의 삼각플라스크에 넣고 0.1N 염산 30㎖를 가하여 이에 유리관을 달고 비등 수욕중에서 30분간 가열한 후 식힌다. 다음 0.1N 수산화나트륨액 30㎖를 가하여 중화하고 물로서 전량을 250㎖로 한다. 이 용액 20㎖를 취하여 (가) 환원당 1) 벨트란법에 따라 전화당의 양을 구하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양으로 한다. 검사시료중에 환원당이 함유되어 있을 때는 (가) 환원당에 따라 산출한 구리의 양을 여기에서 얻은 구리의 양으로부터 감하여 그 나머지 구리의 양에 상당하는 전화당을 구하고 이에 0.95를 곱하여 자당의 양을 산출한다.

2) 레인․에이논(Lane-Eynon)법

[ 기구 및 시약 ]

항온수조 : 65±1℃로 조절가능한 것.

메스플라스크

1% 페놀프탈린․에탄올액

4N NaOH액

25% HCl액

기타 유당 정량(Lane-Eynon법)에 필요한 기구 및 시약

[시험방법]

시료 일정량(자당으로 0.5～1g상당량)을 200㎖메스플라스크에 취하고 물 50㎖를 가한 다음 25%  HCl액 2.5㎖를 가하여 65±1℃의 온탕중에서 20분간 가수분해하여 전화당으로 전화시킨 다음 직접 수냉한다. 여기에 페놀프탈린지시약 2～3적을 가하고 4N NaOH액을 엷은 홍색이 될 때까지 가하여 중화한 후 증류수로 희석하여 200㎖되게 한다.

위의 희석시료를 뷰렛에 취하고 200㎖삼각플라스크에 Fehling시액 및 증류수를 환원당정량법에서와 동일한 방법으로 가하고 적정한다. 이때 적정량이 16～25㎖되게 희석배수를 조절한다. 이 적정액의 량으로부터 유당정량법(Lane-Eynon법)에서와 동일한 술식으로 전화당%를 구하고 여기에서 유당량을 감한 값에 0.95를 곱하여 자당량(%)으로 한다.

(다) 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량

1) 장치

고속액체크로마토그래프

2) 표준용액의 조제

과당, 포도당, 설탕 등의 표준품을 각각 100㎖용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50㎖로 녹인 후 아세토니트릴로 100㎖까지 채운다.

3) 시험용액의 조제

검사시료 약 5g을 50㎖ 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25㎖를 가하여 녹인후 아세토니트릴로 50㎖까지 채운다. 이를 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래피 조건

① 칼럼 : 길이 300㎜, 안지름 4㎜, μ- Bondapak/Carbohydrate상당품

② 검출기 : 시차굴절계(RI)

③ 이동상 : 물 : 아세토니트릴(17 : 83)

④ 유속 : 1.0㎖/분

⑤ 칼럼온도 : 실온

나) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 당질의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음식에 의해 검사시료중 당의 함량(㎎/100g)을 산출한다.

a × b           100

당함량(㎎/100g)=S× ───────── × ───

검사시료채취량(g)    1000

S : 시험용액중의 당질의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 희석배수

바. 열량의 계산

축산물의 에너지는 에트워터 계수를 사용하여 검사시료 100g중의 조단백질, 조지방 및 탄수화물 또는 당질의 함량에 단백질4, 지방9, 당질4의 계수를 곱하여 각각의 에너지를 킬로칼로리(kcal)단위로 산출하고 그 총계로 나타낸다. 단위는 킬로칼로리 또는 킬로주울(KJ)로 하고 킬로칼로리 단위에서 킬로주울 단위로의 환산은 다음 식에 따른다.

1kcal = 4,184KJ

세계식량농업기구(FAO)를 중심으로 한 국제적 경향은 식품군을 군별로하여 그 군에 특유한 에너지 환산계수를 채용하고 있으므로 다음 표에 있는 축산물에 대해서는 FAO의 에너지 환산계수를 사용한다(단, 아래표의 (  )를 붙인 것은 다른 식품군 계수에서 전용 또는 그것에서 추정해서 얻은 것임).

축산물군별 에너지 환산계수(kcal/g)

구분 축산물군	FAO의 에너지 환산계수			FAO에 의한 축산물군명
	조단백질	조지방	탄수화물
유지류	4.27	8.79	3.87	버터
	(4.27)	9.02	-	우지‧돈지
육 류	4.27	9.02	a)	식육
유 류	4.27	8.79	3.87	유가공품

a) 뇌, 심장, 신장, 간장(및 조미료를 가한 가공품)의 탄수화물에 대한 계수는 3.87, 혀의 탄수화물에 대한 계수는 4.11

2. 무기물

가. 시험용액의 조제

〈건식분해〉

검사시료를 아래표에서와 같이 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550～600℃의 온도에서 여러시간 가열하여 백색～회백색의 회분이 얻어질 때까지 회화한다. 이 회분을 방냉후 주의하여 물로 적신후 염산용액(1→2) 약 10㎖를 가해 수욕상에서 완전 증발건고시킨다. 이 건고물에 염산용액(1→4) 약 8～10㎖를 가해 수 분 가열 후 100㎖ 메스플라스크에 여과한다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1→4) 약 2㎖를 가해 물 약 5㎖로 희석한 후 수욕상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100㎖ 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100㎖로 하여 시험용액으로 한다.

〈습식분해〉

검사시료를 아래표에서와 같이 200～300㎖ 분해 플라스크에 취하여 질산 5㎖를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다. 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1→2) 10㎖와 70% 과염소산 10㎖를 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다. 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면,  70% 과염소산 수 ㎖를 가하여 가열한다 . 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9㎝의 자제증발접시에 액을 씻어 옮기고 증발건고하여 과염소산을 증발시킨다. 잔류물에 염산용액(1→2) 약 10㎖를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100㎖메스플라스크에 옮겨 물을 가하여 전량을 100㎖로 하여 시험용액으로 한다.

〈검 체 채 취 량〉

무기물 종류	칼슘	채취량	인	채취량	철	채취량
유지류 육류 난류 유류	1～10a) 2～58 10～150 50～150	20～50 5～50 2～20 2～5	0～20a) 21～400 11～570 25～980	5～20 1～5 1～5 1～5	0.1～0.4a) 0.9～16.0 0.1～6.3 0.1～1.0	함유량이 10㎎이하의 것은 10g이상
a) 축산물 100g중에 함유한 ㎎수임

나. 칼슘

(1) 과망간산칼륨 용량법

(가) 시 약

1) 수산암모늄용액 : 수산암모늄〔(NH4)2C2O4〕3.0g을 물을 가하여 100㎖로 한다.

2) 메틸레드지시약 : 0.1% 메틸레드알코올용액

3) 요소 : 특급요소 70～80℃의 저온으로 건조한 다음 흡습하지 않도록 보존한다.

4) 세척용암모니아수(1→50)

5) 황산용액(1→25)

6) 0.02N 과망간산칼륨 용액

(나) 시험방법

무기물 시험용액 조제에서 얻은 시험용액 중에 40㎖(Ca 1～12㎎에 대응하는 양)를 200㎖의 비이커에 취하여 메틸레드시액 수방울 및 수산암모늄용액 10㎖를 가한 다음 요소 2～5g을 가해 녹인다. 비이커를 시계접시로 덮고 약하게 가열을 계속시킨다. 메틸레드시액을 색이 적색에서 등황색으로 (pH 약 5.6) 되었을 때 가열을 중지하고 방냉한다. 이를 2시간 이상(침전이 적을 때는 하룻밤) 실온으로 방치한다. 이때의 액량은 약 20～30㎖정도이다. 충분히 침전을 형성시킨 후 석출된 수산칼슘 결정을 유리여과기(15AG-4)로 흡입여과하고 세척용 암모니아수 30～40㎖를 수회 나누어 침전과 여지를 잘 씻는다. 세척이 끝나면 침전생성에 사용한 비이커를 앞의 유리여과기의 밑에 놓고 여과에 사용한 유리봉을 유리여과기에 넣어 미리 70℃이상으로 가온한 황산용액(1→25)을 유리여과기에 주입한다. 유리봉으로 교반하여 잠시 방치하고 수산칼슘을 용해한 다음 흡입한다. 다음 흡입을 그치고 가온한 황산용액(1→25) 약 5～7㎖를 유리여과기에 주입하고 유리봉으로 교반하여 내벽을 씻고 흡입한다. 이 조작을 2회 반복한다. 비이커를 여과장치에서 들어내고 65～80℃로 가열하여 0.02N 과망간산칼륨용액으로 적정한다. 공시험에 대하여도 같은 조작을 한다.

〔계산〕

(b-a)×0.4008×F×V×100

칼슘(㎎/100g) = ────────────

S

a : 공시험에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비㎖ 수

b : 검액에 대한 0.02N 과망간산칼륨용액의 소비㎖ 수

F : 0.02N 과망간산칼륨용액의 역가

V : 시험용액의 희석배수

S : 검사시료의 채취량(g)

(2) 원자흡광광도법

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제에 따라 처리한 검사시료를 물 대신 1N 염산 용액을 사용하여 칼슘 농도 1～5㎍/㎖가 되도록 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (1)원자흡광광도법에 따라 측정한다. 이 때 사용될 1N 염산 용액에는 La으로서 1,000ppm이 되도록 염화란탄(LaCl3)을 첨가하거나 또는 Sr으로서 5,000ppm이 되도록 염화스트론티움(SrCl2)을 첨가하여 사용한다.

(3) ICP법

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제에 따라 처리한 검사시료에 대하여 0.1N 염산 용액을 사용하여 칼슘 농도 1～5㎍/㎖가 되도록 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (2)ICP법에 따라 측정한다.

다. 인

(1) 모리브덴청 비색법

(가) 시 약

1) 모리브덴산암모늄용액

모리브덴산암모늄(NH4)6Mo7O24․H2O 25g을 물 300㎖에 녹인다. 따로 황산 75㎖를 물 200㎖에 희석하여 이것을 상기 용액에 가하고 여과한다.

2) 하이드로퀴논용액

하이드로퀴논(C6H6O2) 0.5g을 물을 가하여 100㎖로 한다. 여기에 황산 한 방울을 가하여 냉소에 저장한다. 만일 착색되면 다시 만들어 사용한다.

3) 아황산나트륨용액

약 10% 용액․무수아황산나트륨 5g을 물을 가하여 100㎖로 하여 여과한다. 사용할 때 새로 만든다.

4) 표준인용액

미리 데시케이타 중에서 건조해 놓은 산성인산칼륨(KH2PO4) 0.4394g을 물을 가하여 1ℓ로 한다. 이 액 50㎖를 취하여 다시 물을 가하여 200㎖로 한다. 이액 1㎖는 0.025㎎의 P를 함유한다.

(나) 시험방법

무기물 시험용액의 조제에서 얻은 시험용액 중의 1㎖를 25㎖ 메스플라스크에 정확히 취하고 따로 표준 인용액 2㎖를 25㎖ 메스플라스크에 취한다. 양쪽 플라스크에 모리브덴산암모늄용액 2㎖씩을 가하여 혼합하고 수분간 방치한다.

다음 양쪽에 하이드로퀴논용액 2㎖씩을 가하여 혼합한 후 아황산나트륨용액 2㎖를 가해 이때에 시간을 기록한다.

양쪽다 물을 가하여 25㎖로 하여 진탕 혼합한다.

정확하게 30분 방치한 후 즉시 분광광도계를 사용하여 파장 650㎚에서 흡광도를 측정한다.

공시험에 대하여도 같은 조작을 한다.

〔계산〕

A      1

인(㎎/100g) = 0.05 × ── × ── × V × 100

As     S

As : 표준용액의 흡광도

A  : 검액의 흡광도

S  : 검사시료의 채취량(g)

V  : 시험용액의 희석배수

(2) ICP법

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제에 따라 처리한 검사시료에 대하여 0.1N 염산 용액을 사용하여 인 농도 1～5㎍/㎖가 되도록 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7. 유해성금속시험법 나.측정 (2)ICP법에 따라 측정한다.

라. 철

(1) 올쏘 페난트로린 비색법

(가) 시 약

1) 페난트로린용액 : 올쏘 페난트로린 염산염(C12H8N2․HCl․H2O) 0.5g을 물을 가하여 200㎖로 하여 냉소에 보존한다.

2) 하이드로퀴논용액 : 하이드로퀴논(C2H6O2)을 물에 녹여 쓰며 사용할 때마다 새로 만들어야 한다(희석배수 1%).

3) 구연산나트륨용액 : 특급 구연산나트륨(Na3C6H5O7․H2O) 50g을 물을 가하여 200㎖로 한다. 필요하면 여과하여 냉소에 보존한다.

4) 브롬페놀블루시액 : 브롬페놀블루 0.1g을 0.05N 수산화나트륨액 3㎖로 녹이고 물을 가하여 250㎖로 한다.

5) 철표준액 : 특급 황산제1철 암모늄〔Fe(NH4)2(SO4)2․6H2O〕0.7021g을 약1%의 염산에 용해하여 1ℓ로 한다.

이 액 1ℓ중에는 철 0.1㎎을 함유한다.

(나) 시험방법

시험용액의 조제에서 얻은 시험용액중의 10㎖를 피펫으로 25㎖의 메스플라스크에 취하고 같은 10㎖를 시험관(혹은 작은 삼각플라스크)에 취한다.

후자는 pH조절용 대조액으로 쓴다. 시험관쪽에는 브롬페놀블루시액 4방울을 가하고 25㎖메스플라스크 쪽에는 하이드로퀴논용액 1㎖와 또 페난트로린용액 2㎖를 피펫으로 가한다. 구연산나트륨용액을 뷰렛 또는 5㎖ 메스피펫으로 취하여 시험관의 액중에 적가하고 액의 pH가 3.5가 되면 지시액을 가한 액의 색이 황색에서 황록색으로 변하는 점에서 적가를 그치고 이때까지 소요된 구연산나트륨용액의 ㎖수를 기록한다.

이와 같은 용량의 구연산나트륨용액을 메스플라스크쪽에 가하여 물로 25㎖의 표선까지 희석하여 20℃이상의 온도에서 1시간이상 방치한다. 하룻밤 방치해도 무방하다.

일단, 완전히 발색된 액은 적어도 48시간은 퇴색하지 않는다. 이를 분광광도계(Spectrophotometer)에서는 510㎚의 파장에서, 광전비색계에서는 녹색필터를 이용해서 발색액의 흡광도를 측정하여 비흡광계수를 구한다. 이것을 미리 작성하여 놓은 검량선과 대조하여 철의 양을 구한다.

검량선은 다음과 같이 하여 만든다. 즉 철표준액을 물로 정확히 10배로 희석한다. 1, 2, 5, 10, 15 및 20㎖를 각각 1조씩 25㎖의 메스플라스크와 시험관 또는 작은 삼각플라스크에 취한다. 10㎖가 안되는 것은 물을 추가하여 거의 10㎖로 만든다. 상기 발색조작과 동일하게 pH 3.5에서 각 메스플라스크에서 발색시켜 흡광도를 측정하며, 농도 흡광곡선을 작성하고 검사시료중의 철 함량은 다음 식에 따라 산출한다.

A

철(㎎/100g) = ── × V × 100

S

A : 흡광곡선에서 구한 철의 양(㎎)

S : 검사시료채취량(g)

V : 시험용액의 희석배수

(2) 원자흡광광도법

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제에 따라 처리한 검사시료를 물 대신 1N 염산 용액을 사용하여 철 농도 1～4㎍/㎖가 되도록 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (1)원자흡광광도법 (가)직접법에 따라 측정한다.

(3) ICP법

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제에 따라 처리한 검사시료에 대하여 0.1N 염산 용액을 사용하여 철 농도 1～4㎍/㎖가 되도록 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7. 유해성금속시험법 나.측정 (2)ICP법에 따라 측정한다.

마. 식염

(1) 회화법

식염 약 1g을 함유하는 양의 검사시료를 취하여 필요한 경우 수욕상에서 증발건고한 후 회화시켜 이를 물에 녹이고 다시 물을 가하여 500㎖로 한 후 여과하고 여액 10㎖에 크롬산칼륨시액 2～3방울을 가하고 0.02N 질산은 액으로 적정한다.

b

식염 = ──× f ×5.85(w/w%, w/v%)

a

a : 검사시료 채취량(g,㎖)

b : 적정에 소비된 0.02N 질산은 액의 양(㎖)

f : 0.02N 질산은 액의 역가

(2) 직접법

(1)에 따라 취하여 물로 희석하여 500㎖로 한 후 그 10㎖를 취하여 1)회화법에 따라 적정한다.

바. 나트륨

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제 〈건식분해법〉에 따라 얻어진 시험용액을 나트륨농도 1～10㎍/㎖되게 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (1)원자흡광광도법 또는 (2)ICP법에 따라 시험한다.

사. 칼륨

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제〈건식분해법〉에 따라 얻어진 시험용액을 칼륨농도 1～10㎍/㎖되게 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (1)원자흡광광도법 또는 (2)ICP법에 따라 시험한다.

아. 아연

Ⅲ.일반시험법 2.무기물 가.시험용액의 조제〈건식분해법에 따라 처리한 검사시료를 0.5N 질산용액 또는 0.1N 염산용액으로 아연농도 1～10㎍/㎖되게 조정하여 Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법 나.측정 (1)원자흡광광도법 또는 (2)ICP법에 따라 시험한다.

자. 요오드

(1) 이온 - 선택 전극법

(가) 시약

1) 3%(v/v) 초산 용액 : 빙초산 15㎖를 물로 희석하여 500㎖가 되게 한다.

2) 전극 보관 용액 : 요오드 표준원액을 물로 희석하여 1.0㎖/ℓ가 되게 한다. 요오드 전극을 이 용액에 담가서 보관하며 매주 새 용액으로 교환한다. 차광 보관하며, 3개월간 보존가능하다.

3) 이온강도 조절액(5M 질산나트륨 용액, ISA : ionic strength adjuster) : 질산나트륨 42.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

4) 2M 질산니켈 용액 : 질산니켈․6수화물 58.2g을 물에 녹여 100㎖가 되게 한다.

(나) 요오드 표준용액

1) 요오드 표준품(요오드 12.69g/ℓ, 0.1M) : 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 표준품을 사용한다. 실온에서 차광 보관하며, 개봉 후 6개월간 보존 가능하다.

2) 요오드 표준원액 : 요오드 표준품 8㎖를 물로 희석하여 1ℓ가 되게 한다(101.5㎍/㎖). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

3) 요오드 표준용액 Ⅰ : 요오드 표준원액 5.0㎖를 물로 희석하여 500㎖가 되게 한다(1㎍/㎖). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다.

4) 요오드 표준용액 Ⅱ : 요오드 표준용액 Ⅰ을 물로 10배 희석한다. 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다(0.1㎍/㎖).

5) 기지의 첨가 표준용액 : 요오드 표준원액 10.0㎖를 물로 희석하여 1ℓ가 되게 한다. 이액 100㎖에 이온강도조절액(ISA), 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩 첨가한 후 잘 혼합한다. 사용시 조제한다.

(다) 기구

1) 전극 : 요오드 전극, 기준 전극(Ag/AgCl전극)

2) pH 측정기

3) 마그네틱바

4) 여과지(Whatman. 541)

(라) 시험용액 조제

검사시료 100㎖(분말의 경우 10% 수용액)를 250㎖ 메스 플라스크에 넣고 3% 초산용액 10㎖를 가한 후 물로 정용한다. 이 액을 여과하고 처음 10㎖는 버린다.

(마) 시험조작

1) 전극 기울기 체크 : 전극을 요오드 표준용액 Ⅱ 100㎖에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E1값을 측정한다. 전극을 물로 씻고 건조시킨 후 요오드 표준용액 Ⅰ 100㎖에 담그고 ISA, 2M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0㎖씩을 가하고, 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E2값을 측정한다. 전극을 물로 씻고 건조시킨다. 전극의 기울기(S)는 E2-E1로 계산된다. 매 4시간마다 기울기를 측정하며, 직전에 측정한 기울기를 사용하여 요오드 함량을 계산하다.

2) 측정 : 시험용액 100.0㎖를 비이커에 넣고 마그네틱바로 저어주면서 ISA, 2M 질산니켈 용액, 진한 질산을 각각 1.0㎖씩 가하고 전극을 담근 후 약 2분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E3값을 측정한다. 이 액에 즉시 기지의 첨가 표준용액 10.0㎖를 가하고 약 2～5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때, E4값을 측정한다

〔계산〕

검사시료 중의 요오드 함량(C) 계산은 다음과 같다.

C(㎍/100g)=Q×0.9854×V×100

Q=0.0885/{antilog[(E4-E3)/S]-0.912}

0.9854 : 기지의 첨가 표준용액의 요오드 농도(㎍/㎖)

V : 희석 배수

0.0885 : 표준용액 첨가 ㎖수/(표준용액첨가 전 총 ㎖수+표준용액 첨가㎖수)=10/(103+10)

0.912 : 표준용액 첨가 전 총 ㎖수/(표준용액첨가 전 총 ㎖수+표준용액첨가 ㎖수)=103/(103+10)

S : E2-E1

3. 비타민류

가. 비타민 A

(1) 삼염화안티몬에 의한 비색정량법

(가) 시 약

1) 에테르 : 필요하면 증류한다. 초류액 및 마지막 유액 각 10%를 버린다.

2) 벤젠 : 필요하면 증류한다.

3) 무알데히드에탄올 : 에탄올 1ℓ에 50% 수산화칼륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류냉각기를 달아 가온한 후 증류한다. 단, 초류액 및 마지막 유액 각 10%를 버린다.

4) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨을 2시간 이상 120℃에서 가열한 것을 실리카겔 데시케이타중에 방냉한다(밀전해서 보존한다).

5) 초산 : 빙초산 1ℓ에 대해서 산화크롬 10g을 가해 2회 증류한다. 116℃이상의 증류액을 취한다.

6) 클로로포름 : 클로로포름 1ℓ를 황산 20～30㎖씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수 회 씻는다.

수세하여 황산을 제거하고, 15～20% 수산화나트륨용액 20～30㎖로 2～3회 씻은 후 수세한다. 여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수시켜 증류한다. 정제한 클로로포름은 갈색병에 넣어 냉장 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다.

7) 정색용액 : 삼염화안티몬 20g을 상기의 클로로포름 100㎖에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2㎖를 가해 콜크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다. 이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제후 1주간내에 사용한다.

8) 표준비타민A : 비타민A유[1g중 비타민A 10,000국제단위(I.U) 함유]를 사용한다.

9) 불활성가스 : 질소, 이산화탄소를 사용한다.

(나) 시험용액의 조제

1) 비누화 : 검사시료 채취량은 일반적으로 100～150단위에 상당하는 양을 비누화 플라스크에 취하고 피로갈롤 100㎎, 하이드로퀴논 100㎎을 가한다. 다음에 적어도 3㎖ 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히드에탄올을 가해 환류냉각기를 달아 비등 수욕상에서 때때로 플라스크를 흔들어 주면서 30분간 비누화 한다.

2) 추출 : 비누화 후 흐르는 물에 식혀 냉각시키고 실온으로 한 다음 정확히 벤젠 100㎖를 가한다. 유리마개를 하고 15초간 격렬하게 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다. 다음에 250～300㎖의 분액깔대기에 옮기고 비누화플라스크에 침전물을 남기고 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다. 분액깔대기에 1N 수산화칼륨액 100㎖를 가하여 15초간 격렬히 흔든 후 방치하여 분리시킨다. 혼탁된 물층은 버리고 벤젠층에 0.5N 수산화칼륨액 40㎖를 가해 진탕 혼합하고 다음에 벤젠층을 적어도 4회 물 40㎖씩 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 수세를 반복한다. (수세액에 페놀프탈레인 시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 행한다)

3) 탈수 : 분액깔대기를 수분간 방치해서 최후의 물 1방울까지 제거한다. 이 벤젠층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다.

4) 용제날림 : 상기의 벤젠중 50㎖를 100㎖ 증류 플라스크에 정확히 취해 약 45℃의 수욕상에서 수류 펌프의 감압하에 재빠르게 증발시킨다. 불활성가스로 플라스크 내부를 치환한다.

5) 시험용액의 조제 : 잔류물에 직접 클로로포름을 피펫으로 가해서 1㎖중에 비타민A가 10～20 단위가 되도록 희석하여 일정용량으로 한다.

(다) 시험방법

시험용액 0.3㎖와 클로로포름 0.3㎖를 정확히 셀에 취하여 정색용액 3㎖를 가한다. 대조셀에 클로로포름 0.6㎖를 정확히 취한 다음 정색용액 3㎖를 첨가한 후 약 5～20초간 사이에 파장 620nm에서 흡광도를 측정한다.

1) 검량선의 작성

표준비타민A를 위의 방법에 따라 처리한다. 클로로포름에 녹여서 1㎖중의 비타민의 2, 4, 6 및 10㎍을 함유하는 용액을 조제한다. 계속해서 조제한 표준용액마다 시험용액의 비타민A의 측정에 따라 조작한다.

표준용액으로부터 구한 흡광도로 검량선을 작성하고 함량을 구한다.

2) 계산

시험용액의 흡광도와 검량선으로부터 구한 시험용액 1㎖중의 비타민A의 양을 N㎍이라고 하면,

100

시료중의 비타민A(㎍/100g) = N × V × ───────── × 2

검사시료채취량(g)

V : 시험용액 전량(㎖)

(2) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

(가) 시  약

1) 무알데히드에탄올 : 에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화나트륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 초류액 및 마지막 유액 각 10%는 버린다.

2) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨(특급)을 2시간 이상 120℃에서 가열한 후 데시케이타 중에서 방냉한 후 보관한다.

(나) 표준용액의 조제

비타민A 아세테이트 결정을 비누화시켜 비타민A 알코올로 하여 국제단위(I.U) 또는 ㎍ 단위로 환산한다. 이를 이소프로판올(특급)로 희석하여 각각 1.0㎖중 5, 25, 50I.U가 함유되도록 한다. 사용시 제조한다.

(다) 시험용액의 조제

일반적으로 비타민A 20～30I.U(6～9㎍)에 상당하는 시료를 정밀히 달아 환저 플라스크에 넣는다. 에탄올 30㎖ 및 10% 피로갈롤에탄올 용액 1㎖를 가하여 잘 섞은 후 수산화칼륨용액(9→10) 3㎖를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화시킨다. 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 물 30㎖를 가해 갈색분액깔대기에 옮긴다. 플라스크는 물 10㎖로 씻고 이어서 석유에테르(특급) 30㎖로 씻은 후, 씻은 액은 분액깔대기에 합하여 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 별도의 갈색분액깔대기에 옮긴다. 물층은 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고, 전 석유에테르추출액을 합하여 물 10㎖ 1회, 이어 50㎖씩으로(페놀프탈레인시액으로 정색이 되지 않을 때까지) 씻는다. 분액깔대기중에서 물을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈수하고 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 이어 황산나트륨을 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 앞의 플라스크에 가한다. 석유에테르추출액을 모두 합하여 40～50℃에서 감압건고한 후 잔류물을 이소프로판올(특급)로 녹여 1.0㎖로 한 것을 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 역상분배형

- 이동상 : 에탄올 : 물 (95 : 5)

- 유  속 : 0.5㎖/분

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 340nm, 측정파장 460nm)

2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20㎕씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 A의 농도(I.U/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검사시료중 비타민 A의 함량(I.U/100g)을 산출한다.

a × b

비타민A(I.U/100g) = S × ───────── × 100

검사시료채취량(g)

S : 시험용액중의 비타민 A의 농도(I.U/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

나. 비타민 B1

(1) 브롬시안에 의한 티오크롬 형광법

(가) 시  약

1) 효소용액 : 사용시 다가디아스타제 0.5g에 0.1N 염산 0.5㎖ 및 물 10㎖를 가하여 용해한 후 여기에다 산성백토 0.2g을 첨가하여 30초간 진탕 혼합하여 이것을 여과 또는 원심분리해서 그 상층액을 사용한다.

2) 25% 염화칼륨 염산용액 : 0.1N 염산에 염화칼륨을 25%의 비율로 녹인다. 결정이 석출하면 가온하여 완전히 녹여 사용한다.

3) 퍼무티트 : 50～80메쉬의 퍼무티트를 플라스크에 취해 약 4배의 열탕을 가해서 혼합, 정치한다. 상등액을 경사하여 버린다. 이 조작을 수회 반복하여 상등액이 거의 깨끗해질 때까지 행한다. 다음에 3%의 초산 약 4배량으로 전과 동일하게 2회 씻는다. 다시 25% 염화칼륨 염산용액을 약 3배량 가해서 비등수욕중 약 25분간 저어주면서 처리한다. 또 다시 3% 초산으로 2회 씻어내고 수세의 조작을 반복한다. 이 세액에 5% 질산은 용액 2～3방울을 가해서 백탁되지 않을 때까지 행한다. 이것을 약 60℃에서 건조해서 보존한다. 다만, 퍼무티트 외에 엠버라이트 IRC 50을 사용할 수 있다.

4) 브롬시안용액 : 특급의 브롬시안 4%용액, 본액은 냉장고에 보존하여 그날 사용한다.

5) 무수황산나트륨 : 형광이 없는 것

6) 이소부탄올 : 무형광의 시판품을 사용하든가 형광이 인정되면 재증류 정제해서 사용한다.

7) 비타민B1 표준용액 : 표준품을 사용한다. 염산산성의 물(pH4.5 HCl액)로 희석해서 1㎍/㎖로 한다.

(나) 장치 및 기구

1) 칼럼관

경질 유리제 흡착관의 S부의 밑에 소량의 유리솜을 채워 넣어 물을 가득 넣고 별도로 퍼무티트 1.3～1.5g을 비이커에 취한다.

물 약 20㎖를 가해 약하게 진탕해서 퍼무티트에 부착하고 있는 기포를 제거한 다음 물과 함께 전부를 흡착관에 유입, 계속해서 3% 초산 10㎖ 및 물 20㎖를 각각 1분간에 1㎖의 유속으로 통해서 조정을 해 놓는다.

2) 추출병 : 50～150㎖까지 10㎖마다 표선을 그려놓은 것이 쓰기에 편리하다.

3) 형광광도계 : 분광식의 여기파장을 375nm, 수광부의 형광선택파장을 420nm에 조정해 쓴다.

(다) 시험용액의 조제

1) 추출

검사시료 1～10g을 추출병 또는 100㎖의 메스플라스크에 취해 물 약 20㎖를 가하여 혼합해 0.1N 염산 또는 0.1N황산 약 50㎖를 가하여 잘 섞은 후 끓는 수욕상에서 30분간 가열 추출한다.

2) 효소분해

추출액은 약 50℃에 냉각시켜 놓고 4M 초산나트륨액을 적가해서, pH를 약 4.5에 조정한다. 다시 한번 효소용액 약 2㎖를 가해서 40～50℃에 2～3시간 보온하든가 또는 톨루엔 5～6방울을 가해 37～40℃의 항온기에 넣어서 하룻밤을 방치한다. 다음에 15분간 비등수욕중에서 온침한다. 냉각 후 물을 가해서 100㎖로 하고 원심분리하든가 또는 여과해서 상등액을 취한다. 이것을 시료용액으로 한다.

3) 흡착

시료용액(pH 4.5)의 일정량(비타민 B1으로서

약 5㎍을 함유하는 액량)을 칼럼에 조용히

주입한다. 1분간 1㎖의 유속으로 흡착케 한다.

계속해서 pH 4.5의 염산 5㎖로 칼럼의 R부의

내면을 씻어버린다.

4) 수세

흡착이 끝났다고 생각되면 공존하는 형광물질을 제거한다. 칼럼에 끓는 물을 주입하고 1분간 3～4㎖(1초간에 약 1방울)의 유속으로 흡착층을 씻는다. 세액을 형광이 나타나지 않을 때까지 물로 계속 씻어준다.

5) 탈착

수세가 끝나고 칼럼 하부의 수기를 25㎖의 메스플라스크에 교환 칼럼이 따뜻할 동안에 비등 25%염화칼륨 염산용액 10㎖를 가한다. 1초간 1방울씩 나누어 액이 적하되도록 조절한다. 탈착액을 받아서 용출액이 퍼무티트의 상단까지 달하면 재차 비등 용출액 8㎖를 주입해 동일하게 조작한다. 최후에 동액 7㎖를 주입해서 탈착액의 전량을 약 25㎖로 하여 뚜껑을 닫아 놓는다. 뒤이어 메스플라스크를 실온에 방치한다. 냉각 후 물을 가해서 정확히 25㎖로 하여 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 산화 및 티오크롬의 추출

산화용액을 5㎖씩 T1, T2, T3 3개의 50㎖공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로 한다. T1에는 비타민B1표준액 1㎖(비타민B1, 1㎍)을, T2 및 T3에는 물 1㎖를 가한다. 계속해서 T1 및 T2에는 브롬시안용액 3㎖를 가해서 혼합한 후 30% 수산화나트륨용액 3㎖를 혼합한다.

이소부탄올 15㎖를 가해 밀전하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30%수산화나트륨용액 3㎖를 맨처음 가한 후 브롬시안용액을 혼합한다. T1, T2와 동일 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

2) 비형광측정 및 계산 : 전항의 이소부탄올액을 형광셀에 넣어 형광도를 측정한다.

검사시료중의 비타민B1(㎎/100g)

T2-T3   25    V2           100             1

= D × ─── × ──×──×────────── × ───

T1-T2    5    V1   검사시료의채취량(g)    1,000

D  : 첨가 비타민B1(㎍)

V1 : 시료용액의 채취량(㎖)

V2 : 시료용액 전량(㎖)

(2) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

(가) 시  약

1) 4M 초산나트륨용액 : 5.44g의 초산나트륨을 물에 녹여 10㎖로 한다.

2) 다카디아스타제용액 : 다카디아스타제를 물에 녹여 2%로 하여 퍼무티트(Purmutit)칼럼에 넣고 다카디아스타제중에 존재하는 비타민 B1을 제거한 후 사용한다. 사용시 제조한다.

3) 페리시안화칼륨․수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 30g을 물에 녹여 200㎖로 하고 이에 페리시안화칼륨 20㎎을 녹인다. 사용시 제조한다.

(나) 표준용액의 조제

순도가 보증된 비타민 B1 염산염을 비타민 B1으로 0.01～1.0㎍/㎖가 되도록 10% 삼염화초산용액에 녹인다. 이 비타민B1 용액(S ㎍/㎖), 4M 초산나트륨, 2% 다카디아스타제 용액을 각각 20:3:1의 비율로 혼합한 용액을 표준용액으로 한다.

(다) 시험용액의 조제

1) 일반적 시료

검사시료 1g을 정확히 달아 10% 삼염화초산용액 5㎖를 넣고 균질기로 균질화시킨다. 균질화한 용액을 10% 삼염화초산용액으로 10㎖로 한 후 고속원심분리관에 넣고 9,000rpm에서 30분간 원심분리한다. 이 상징액 200㎕를 시험관에 취하여 4M 초산나트륨용액 30㎕를 가한다(pH 4.5～4.7). 이에 2% 다카디아스타제 용액 10㎕를 주입하고 잘 교반하면서 37℃에서 8～10시간 방치하여 시험용액으로 한다.

2) 난용성 비타민 B1 염류 및 비타민 B1 유도체 강화시료

나.비타민 B1 (1)브롬시안에 의한 티오크롬 형광법의 시험용액의 조제에 따라 전처리된 시험용액을 사용한다.

(라) 시험방법

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 비타민 B1 분리용(polyglycerylmethacrylate. 구상. 15㎛)

- 이동상 : 0.1M 인산나트륨용액

- 유  속 : 0.7㎖/분

- 반응액 : 페리시안화칼륨․수산화나트륨용액(유속 : 0.7㎖/분)

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 : 375nm, 측정파장 : 450nm)

2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 50㎕씩 고속액체크로마토그래프에 주입하고, 칼럼에서 분리 용출시킨 비타민 B1을 반응액 송액펌프에서 보내진 반응액과 자동적으로 혼합시켜 형광물질(티오크롬)으로 변환한다. 이 형광물질을 형광분광광도계로 보내 얻어진 표준용액 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 이용하여 시험용액의 비타민 B1의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검사시료중 비타민 B1의 함량(㎎/100g)을 계산한다.

〔계산〕

a×b             100

비타민 B1의 양(㎎/100g)=S×────────── × ───

검사시료의채취량(g)     1000

S : 시험용액중의 비타민 B1의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

다. 비타민 B2

(1) 루미플라빈 형광법

(가) 시  약

1) 클로로포름 : 형광이 없는 것. 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다.

2) 비타민 B2표준용액 : 비타민 B2표준품을 온탕에 녹여서 40㎍/㎖로 한다. 그 100㎖에 초산 수 방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다. 사용시 희석해서 2㎍/㎖의 액을 만든다. 밝은 곳에 내놓지 않도록 주의한다.

(나) 장치 및 기구

1) 광분해장치 : 형광등에 반사경을 달아 시험용액을 양측으로부터 조사하든지 또는 상부에 형광등이 붙어 있는 측면에는 광을 난반사 하도록 한 상자모양의 것도 좋다.

2) 용기 : 갈색 유리기구를 쓴다.

3) 형광광도계 : 여기파장 430nm, 측정파장 530nm

(다) 시험용액의 조제

검사시료의 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기 또는 막자사발에 넣어 마쇄 한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지한다. 이것에 물 수 ㎖～수십 ㎖를 가해 수욕중에서 혼합 15～20분간 추출한다. 대부분의 것은 이 추출법으로 충분히 추출된다. 또는 비타민 B1 (1)브롬시안에 의한 티오크롬형광법 (다) 시험용액의 조제 2)효소분해까지 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출액은 냉각 후 1㎖중 0.05㎍이 되도록 일정 용량으로 하여 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 광분해

시험용액 일정량(0.2～1㎍비타민 B2를 함유하는 용액)씩을 3개의 공전시험관에 취한다. 그 한개를 첨가시험용으로 해서 비타민 B2의 일정량(0.2～1㎍)을 함유하는 용액을 가한다. 다른 두개 T2 및 T3는 T1에 가한 비타민 B2용액과 동량의 물을 가해서 T1, T2, T3를 같은 용량으로 한다. 이 시료용액에 1N 수산화나트륨액을 동량 가해 혼합한 후 T1(첨가시험) 및 T2(주시험)를 광분해장치로써 1시간 광분해 한다. T3(공시험)는 1시간 암소에 둔다. 광분해가 끝나면 각 시험관에 초산을 0.5㎖씩 가한다.

2) 산화 및 추출

광분해를 끝낸 산성용액에 4%과망간산칼륨용액 0.5㎖를 가해서 1분간 방치한다(필요하면 초산을 소량 가한다). 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가해서 탈색하고 클로로포름 10㎖씩을 가해서 뚜껑을 닫고 격렬히 2분간 진탕 혼합한다. 필요하면 원심분리를 행하고, 클로로포름층을 분취한다.

3) 측정 및 계산

클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 검사시료중의 비타민 B2의 함량을 다음 식에 따라 구한다.

T2-T3   V2           100           1

비타민 B2(㎎/100g) = D×────×──×──────────×───

T1-T2   V1   검사시료의 채취량(g)  1000

D : 첨가 비타민 B2(㎍)

V1 : 시험용액 채취량(㎖)

V2 : 시험용액 전량(㎖)

(2) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

(가) 시  약

1) 메탄올 : 고속액체크로마토그래피용

2) 10㎜ NaH2PO4 용액 : 1N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 조정한다.

(나) 표준용액의 조제

1) 리보플라빈 표준용액 : 다.비타민 B2 1)루미플라빈 형광법과 동일하게 조제하고 사용시 물로 희석하여 0.2㎍/㎖의 용액으로 만든다.

2) FMN(Flavin mononucleotide)표준용액 : FMN을 물에 녹여 0.2㎍/㎖(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

3) FAD(Flavin adeninedinucleotide)표준용액 : FAD를 물에 0.5㎍/㎖(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다.

(다) 시험용액의 조제

검사시료 일정량을 달아 소량의 물을 가해 균질기 또는 막자사발에서 가능한 한 미세하게 분쇄하고 지방이 많은 경우에는 미리 탈지한다. 이에 물을 가해 수욕중(70～80℃)에서 잘 혼합하여 12～20분간 추출한다. 추출액은 식힌 후 1㎖중 비타민 B2 0.05～0.5㎍이 되도록 일정용량으로 하여 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 역상분배형(μ-Bondapak C18, Micropak-CH, Cosmosil 5 C18, Develesil ODS 등)

- 이동상 : 메탄올 : 10㎜ NaH2PO4용액(pH5.5) (35 : 65)

- 유  속 : 0.8㎖/분

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 : 445nm, 측정파장 : 530nm)

2) 정량시험

시험용액 및 각 형의 표준용액을 각 10㎕씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 각 형의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민 B2의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검사시료중 비타민 B2 함량(㎎/100g)을 산출한다.

비타민B2 (리보플라빈 FMN, FAD)(㎎/100g)

a × b             100

= S× ────────── × ───

검사시료채취량(g)     1000

S : 시험용액중의 비타민 B2의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

라. 비타민 C

(1) 2,4-디니트로페닐하이드라진(DNP)에 의한 정량법

(가) 시  약

1) 메타인산-초산용액 : 메타인산 15g을 초산 40㎖ 및 물 200㎖로 잘 진탕 혼합하여 녹여서 물을 가해 250㎖로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관하면 1주간 사용할 수 있다.

2) 묽은메타인산-초산용액 : 메타인산-초산용액을 같은 양의 물로 혼합한다(사용시 조제).

3) 20% 메타인산용액 : 냉장고에 보존한다.

4) 10% 메타인산용액 : 냉장고에 저장하여 2주간 사용할 수 있다.

5) 5% 메타인산용액 : 사용할 때 조제한다.

6) 인도페놀용액 : 2, 6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 0.2g을 더운물에 녹여 100㎖로 한다. 필요하면 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하고 2주간 사용할 수 있다.

7) 메타인산-티오요소용액 : 10% 메타인산용액 50㎖에 티오요소 2g을 녹인다. 물을 가해 100㎖로 한다(사용시 조제).

8) 디니트로페닐하이드라진용액 : 2, 4-디니트로페닐하이드라진 2g을 9N 황산액 100㎖에 녹인다. 유리여과기로 여과 한다. 본 용액은 냉장고에 보존하면 2주간 사용할 수 있다.

9) 비타민 C 표준용액

비타민 C 표준품 100㎎을 정밀히 단다. 메스플라스크에 넣어 5% 메타인산용액을 녹여서 100㎖로 한다.

그 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5㎖를 각각 메스플라스크에 취해 5% 메타인산용액을 가해서 100㎖로 한다(사용시 조제).

(나) 시험용액의 조제

조작은 모두 신속히 행한다.

1) 추출

검사시료의 일정량을 정밀히 단다. 정확히 같은 양의 메타인산-초산용액을 잘 혼합해서 균등한 죽 상태로 한다. 환원형 비타민 C로서 1～5㎎ 함유되도록 균등한 죽상태의 일정량(Wg)을 100㎖의 메스플라스크에 옮기고 묽은메타인산-초산용액으로 100㎖로 한다. 이 용액을 여과하여 처음의 수 ㎖를 제거해서 그 후의 여액을 취하던가 또는 원심분리해서 상등액을 취하여 시험용액으로 한다.

(다) 시험방법

1) 산화

시험용액 2㎖를 시험관 T1, T2 및 T3에 취해 T1에 인도페놀용액 1방울을 혼합해서 이것이 적색을 나타내는지 확인하고, T1, T2 및 T3에 메타인산-티오요소용액 2㎖씩을 가한다.

2) 오사존의 생성 : 시험관 T1 및 T2에 디니트로페닐하이드라진용액 1㎖씩을 가해 37℃(±0.5℃) 항온수욕중에서 정확히 3시간 방치하고 T3과 함께 얼음물 중에 침지한다.

3) 오사존의 용해

얼음물 중에서 냉각하면서 T1, T2 및 T3에 85% 황산용액 5㎖를 조금씩 적가해서 1분간 얼음물 중에서 내용액을 잘 혼합 냉각한다. 다음에 차가운 상태에서 T3에 디니트로페닐하이드라진용액 1㎖를 혼합한다. T1, T2 및 T3의 내용액을 재차 혼합한 후 얼음물로부터 꺼내서 실온에서 30～40분간 방치한다.

4) 비색 : T1 및 T2의 내용액에 대해서 510～540nm에서 흡광도를 측정하고, T1 및 T2로 한다.  대조액은 T3로 한다.

5) 검량선의 작성 : 비타민 C 표준용액의 각 2㎖씩을 시험관에 취하고 위의 시험방법 1)～4)에 따라서 조작한다. 각각 흡광도를 구하고 검량선을 그린다.

6) 계산 : 시험용액 2㎖중의 총 비타민 C량 및 산화형비타민 C량을 각각의 환원형비타민 C량(㎍)으로 나타낸 수치를 검량선에서 찾아서 T1 및 T2에 대응하는 점으로부터 구하여 C1 및 C2로 한다. 검사시료중의 비타민 C 함량은 다음 식으로 구한다.

총 비타민 C(㎎/100g)

C1             검사시료채취량×2             100

= ───  ×  50 ×  ──────────  ×  ─────────

1,000                  W              검사시료채취량(g)

산화형비타민 C(㎎/100g)

C2             검사시료채취량×2           100

= ───  × 50 ×  ───────── × ─────────

1,000                  W            검사시료채취량(g)

환원형비타민 C(㎎/100g)

= 총 비타민 C(㎎/100g) - 산화형비타민 C(㎎/100g)

(2) 인도페놀적정법에 의한 정량

(가) 시  약

인도페놀용액 : 미리 탄산수소나트륨 약 50㎎을 더운물 약 150㎖에 용해하고 여기에 2, 6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 약 50㎎를 용해시키고 냉각 후 물로 200㎖로 한다. 여과 후 차광하여 냉소에 저장하면 일주간 사용할 수 있다. 다만, 다음 방법에 따라 사용할 때 표정한다.

표 정

비타민 C 표준품 100㎎을 정밀히 달아서 500㎖의 메스플라스크에 넣어 묽은메타인산-초산용액으로 500㎖로 한다. 그 5㎖를 정밀히 취하여 묽은메타인산-초산용액 5㎖를 가하고 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 여기에 적정된 인도페놀용액의 소비량을 T㎖로 한다.

(나) 시험방법

조작은 모두 신속히 행한다.

1) 환원형비타민 C의 적정

가) 2,4-디니트로페닐하이드라진법에서 조제한 시험용액 10㎖를 삼각플라스크에 정확히 취하여 즉시 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다.

이때 적정된 인도페놀용액의 소비량을 S㎖로 한다.

2) 계산 : 검사시료중의 환원형비타민 C는 다음 식에 의해 구한다.

환원형비타민 C(㎎/100g)

S            검사시료채취량×2          100

= A ㎎ × ──  × 10 ×  ──────── × ────────

T                W             검사시료채취량(g)

A ㎎ : 인도페놀용액 T㎖에 대응하는 아스코르빈산량

(3) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량법

(가) 시  약

1) 10% 메타인산용액 : 메타인산 10g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 불용물이 생기는 경우 여과하여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관할 수 있다.

2) 5% 메타인산용액 : 10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용시 조제한다.

(나) 표준용액의 조제

아스코르빈산 10.0㎎을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 100㎖로 한 것을 표준원액(100ppm)으로 한다. 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산용액을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용시 조제한다.

(다) 시험용액의 조제

검사시료 일정량(비타민 C 함량이 50㎎/100g 이상인 경우 2g 정도, 10㎎～50㎎/100g인 경우 5～10g 정도를 검사시료로 한다)을 정확히 달아, 동량의 10% 메탄인산용액을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% 메탄인산을 넣어 균질화한다. 균질화된 시료를 100㎖ 메스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메탄인산용액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100㎖로 한다. 그 후 3,000rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 5% 메탄인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 역상분배형(Jascopack Fine Sil-NH2, Lichrosorb NH2, 조건을 달리하여, Zipax SAX, Vydac SAX, Partisil-10SAX, μ - Bondapak C18, μ-Bondapak/CN, Pormaphase CPS등을 사용할 수 있다)

- 이동상 : 0.05M KH2PO4/아세토니트릴(60 : 40)

- 유  속 : 1.0㎖/분

- 검출기 : UV 254nm

2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민 C의 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 검사시료중 아스코르빈산의 함량(㎎/100g)을 산출한다.  L-아스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다.

a × b              100

비타민 C 함량(㎎/100g) = S × ──────────  × ───

검사시료채취량(g)     1000

S : 시험용액중의 아스코르빈산의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

마. 니코틴산(나이아신)

(1) 케니히 반응에 의한 비색법

(가) 시  약

1) 포화황산아연용액 : 황산아연(ZnSO4․7H2O) 800g을 물에 녹여서 1ℓ로 한다.

2) 브롬시안용액 : 특급 브롬시안을 물에 녹여 10%로 한다.

3) 니코틴산 표준용액 : 니코틴산 표준품 약 100㎎을 정밀히 달아 100㎖ 메스플라스크에 넣고 10N 황산액 1㎖를 가하여 녹인 후 물로 100㎖되게 한다. 이것을 원액으로 해서 차광하여 냉장고에 보존한다. 사용시 그 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 2.5㎖를 각각 취해 물을 가하여 100㎖로 희석한다.

4) 파라아미노 아세토페논용액 : 파라아미노 아세토페논 2g을 소량의 염산에 녹여서 물을 가하여 100㎖로 한다.

(나) 시험용액의 조제

1) 가수분해

100㎖의 비이커에 니코틴산 400㎍ 상당량의 검사시료를 취한다. 6N염산액 20㎖를 가해 비등수욕 중에 60분간 침출하여 가수분해 한다. 이것을 흐르는 물로 냉각시켜 100㎖ 메스플라스크에 옮겨 넣고 물로 100㎖로 하여 여과 또는 원심 분리하여 여액 또는 상등액을 검사시료용액으로 한다.

2) 중화

검사시료 용액 25㎖를 원심 침전관에 취하고 페놀프탈레인시액 2방울을 가해서 6N 수산화나트륨액 20㎖로 미산성이 될 때까지 중화한다.

3) 탈색

이 중화액에 포화 황산아연 용액 2㎖를 가해 소포제로서 아밀알콜 수방울을 가하고 다음에 수산화아연의 침전이 생길 때까지 잘 진탕 혼합하여 3M 수산화나트륨액과 1N 수산화나트륨액을 가하여 중화한다. 다음에 pH 6.5가 될 때까지 2N 황산액을 가하고 다시 물을 가하여 50㎖로 한다. 때때로 진탕 혼합하여 10분간 방치한 후 원심분리 또는 여과하여 이것을 시험용액으로 한다.

(다) 시험방법

1) 발색

시험용액 5㎖씩을 2개의 시험관에 취하고 여기에 브롬시안용액 2㎖씩을 가하여 60～70℃의 수욕 중에서 10～15분간 반응시킨다. 얼음물 중에서 냉각시키면서 한쪽에 파라아미노 아세토페논용액 1㎖를 가하여 다른 쪽을 대조액으로 하여 2개의 시험관에 물로 10㎖로 한다.

2) 비색 : 1)에서의 발색액은 얼음물 중에 냉각한 대로 암실에 10～15분간 방치한 후 대조액에 대하여 파장 420nm에서 흡광도 A를 측정한다.

3) 검량선의 작성 : 각 농도의 니코틴산 표준액의 1㎖를 취해 물 4㎖를 가해서 이하 정량조작 1), 2)에 따라서 검량선을 작성한다.

4) 계산 : 시험용액 5㎖중에 함유한 니코틴산량을 검량선에 나타난 A에 대응하는 점으로부터 구하여 X(㎍)로 한다.

100              1

검사시료중의 총 니코틴산(㎎/100g) = X × 40 × ────────── × ──

검사시료채취량(g)    1,000

(2) 미생물학적 시험법

(가) 시  약

1) 니코틴산 보존용액

미리 건조하여 데시케이타 중에서 건조한 니코틴산 표준품을 에탄올에 용해하고 그 1㎖가 니코틴산 100㎍을 함유하게 한다. 이 용액은 냉소에 보존한다.

2) 니코틴산 표준용액

니코틴산 보존용액을 물로 희석하여 그 1㎖가 니코틴산 0.1㎍을 함유하도록 한다. 사용할 때 조제한다.

3) 카제인 산분해 용액

배지작성에 대하여 각 비타민, 무기염류, 카제인 산분해물 등은 적당한 농도의 예제액을 만들어 냉장고 중에 보존하여 두면 편리하다. 이 보존액에 잡균이 혼합되지 않게 하고, 보존액에서 배지를 작성함에 있어 각 비타민의 보존액에 다른 비타민이 혼입되지 않게 특히 주의한다. 배지를 만들 때에는 일반적으로 각 성분을 혼합, 용해한 다음에 10% 염산용액 또는 수산화나트륨 용액으로 소정의 pH 3.5로 조정하고, 약 20분간 비등 수욕상에서 가온하고, 냉각 후 여과하여 물을 가해서 배양시의 2배 농도의 배지를 작성한다. 다음에 공통성분의 염류용액과 카제인산분해액의 제법을 참고한다.

4) 아데닌, 구아닌, 우라실 용액

아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% 염산용액 5㎖에 가열하면서 용해하고 냉각 후 물을 가하여 100㎖로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

5) 시스틴, 트립토판용액

L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 물 350～400㎖에 현탁하고 70～80℃에 가열하고 고형물이 용해할 때까지 20% 염산용액을 적가한다. 냉각후 물을 가하여 전량을 500㎖로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

6) 비타민 B1, 비타민 B2, 비오틴용액

비타민 B1 염산염, 비타민 B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 녹이고, 그 1㎖가 비타민 B1 염산염 10㎍, 비타민 B2 20㎍ 및 비오틴 0.04㎍을 함유하게 한다. 이 용액은 톨루엔 소량을 가하여 광을 피해서 냉소에 보존한다.

7) 파라아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민 B6 용액

이 용액의 1㎖가 파라아미노 안식향산 10㎍, 판토텐산칼슘 20㎍ 및 피리독신 염산염 40㎍을 함유하게 25% 에탄올에 녹인다.

8) 염류용액 A 및 염류용액 B

가) 염류용액 A

제 1인산칼륨(KH2PO4) 및 제 2인산칼륨(K2HPO4) 각 5g을 물에 용해하여 전량을 100㎖로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

나) 염류용액 B

황산마그네슘(MgSO4․7H2O) 2g, 염화나트륨(NaCl) 0.1g, 황산제1철(FeSO4․7H2O) 0.1g 및 황산망간(MnSO4․4H2O) 0.1g을 물에 용해하여 전량을 100㎖로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한다.

(나) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴, 트립토판용액 10㎖, 아데닌, 구아닌, 우라실용액 2㎖, 비타민 B1, 비타민B2, 비오틴용액 2㎖, P-아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민 B6 용액 2㎖, 염류용액 A 2㎖ 및 염류용액 B 2㎖를 혼합하고 여기에 포도당 4g 및 무수초산 나트륨 2g을 가하여 용해하고, 10% 수산화나트륨 용액으로 pH를 6～8로 조정한다. 다음 물을 가하여 전량을 100㎖로 한다. 필요하면 여과한다(또는 Niacin Assay Medium, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

(다) 접종용액의 조제

Lactobacillus plantarum의 보존균주

물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH 6.8로 조정한 다음, 수욕상에서 10～20분간 가열하고, 여과후 한천 1.5g을 가하고 한천이 용해될 때까지 수욕상에서 흔들어 혼화하면서 가열한다. 가열시 이 용액 약 10㎖씩을 시험관에 분주하고, 솜마개를 하고, 1㎏/㎠에서 10분간 가압 멸균하고 시험관을 수직의 위치에 보존하여 냉각한다. Lactobacillus plantarum ATCC, No8014의 보존균주로부터 멸균한 배지 10㎖에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양하고, 냉소에 보존한다. 보존균주는 매주 새로 조제한다.

1주 지난 것은 사용하여서는 아니된다(또는 Lactobacilli Agar, DIFCO사 제품을 사용할수 있다).

(라) 배지

기초배지 5㎖를 함유하는 시험관에 니코틴산 1㎍을 함유하게 하고 물을 가하여 솜마개를 하고 1㎏/㎠에서 10분간 가압멸균하여 방냉한다(또는 Lactobacilli broth AOAC, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다).

(마) 접종균액

Lactobacillus plantarum의 보존균주를  멸균한 배지 10㎖에 접종하고 37℃에서 16～24시간 배양한다. 여기에서 얻은 배양액을 잘 진탕 혼합한 다음 그대로 접종균액으로 하여 사용한다.

(바) 시험용액의 조제

시료 일정량을 적당한 크기의 플라스크에 취하고 다음의 어느 방법에 따라서 시험용액을 조제한다.

1) 염기성 물질 함량이 적은 고체 또는 반고체시료 :

시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 잘 혼합한다. 이 용액 1㎖는 니코틴산 5㎎이상을 함유하여서는 아니된다. 다음에 1N 황산으로 플라스크의 벽에 부착한 시료를 세척하여 떨어뜨린 다음 1㎏/㎠에서 30분간 가압 추출하고, 냉각 후 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH 6.5로 조정하고, 다음에 물을 가하여 용액 1㎖가 니코틴산 약 0.1㎍을 함유하게 희석하고, 필요하면 여과한다.

2) 염기성물질 함량이 많은 고체 또는 반고체시료

시료에 소량의 물을 가하여 잘 혼합하고, 여기에  1N 황산을 가하여 pH를 약 6으로 하고, 다음에 시료의 적어도 10배량의 1N 황산을 가하여 혼합하고 이하 1)에 따라서 조제한다.

3) 액체시료

시료에 1N 황산 또는 1N 수산화나트륨액을 가하여 pH를 약 6으로 조정하고 이하 2)에 준하여 조제한다.

(사) 시험방법

1) 산도적정법에 의한 정량

니코틴산 표준용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 2개씩에 니코틴산 표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 및 2㎖를 취하고 각 시험관에 기초배지 5㎖ 및 물을 가하여 전량을 10㎖로 한다. 따로 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.3, 0.6 및 0.9㎖를 가하고 다음에 각 시험관에 기초 배지 5㎖ 및 물을 가하여 전량을 10㎖로 한다. 양 계열의 시험관의 내용물은 잘 흔들어 혼합하고 솜마개를 하든가 또는 뚜껑을 한 다음 1㎏/㎠에서 10분간 가압 멸균하고, 냉각 후 각 시험관에 접종액 7㎕씩을 무균적으로 접종하고 37℃에서 72시간 배양기에 넣어서 배양한다. 배양 후 각 시험관 중에 생긴 산을 0.1N 수산화나트륨액으로 적정한다(지시약 : 0.1% 페놀프탈레인시액).

니코틴산 표준계열의 각 단계에 따른 측정치의 평균치를 각 시험관에 가한 니코틴산의 ㎍수에 대한 검량선을 작성한다. 다음에 이 검량선을 사용하여 내삽법에 따라서 시료 계열의 각 관중의 니코틴산 함량을 구한다. 이때의 측정치가 0.15㎍이상 및 0.025㎍이하의 것이 있으면 제외하고 남은 각 시험관에 대해서 시험용액 1㎖에 대한 니코틴산의 함량을 구한다. 6개 이상의 관으로부터 얻어진 각각의 치가 그의 평균치보다 ±10%를 초과하는 것이 없는 것을 확인한 다음에 다시 이것만의 평균치를 구하고, 다음에 시료중의 니코틴산 함량을 산출한다.

2) 탁도 측정에 의한 정량

탁도 측정에 의한 정량법은 산도측정에 비하여 정밀도는 약간 낮지만 결과를 신속히 알게되는 이점이 있다. 니코틴산의 검량선을 0～0.1㎍/4㎖로 하고, 시험용액 계열의 니코틴산 함량도 거기에 따라서 감해지면 좋다. 그러나 균의 배양시간은 20～40시간으로 한다. 탁도는 570～650㎚에서 흡광도를 측정한다.

바. 비타민 E

(1) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

(가) 시 약

1) 에탄올 : 에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화나트륨용액 5㎖ 및 아연분말 5g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다.

2) 헥산 : 스펙트로분석용

3) 무수황산나트륨 : 무수황산나트륨(시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시케이타(실리카겔)에서 방냉하고 밀전하여 보존한다.

4) α-, β-, γ-, δ-토코페롤 : d-α-, d-β-,  d-γ-, d-δ-토코페롤 순품

(나) 표준용액의 조제

1) 토코페롤동족체 표준용액

토코페롤동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)를 각각 100㎎씩 정밀히 달아 헥산을 가해 녹여 100㎖로 한 후, 각각의 5㎖를 취하여 헥산을 가하여 25.0㎖로 한다.

갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

2) 토콜표준용액

토콜 약 100㎎을 정밀히 달아 헥산을 가해 녹인 후 100㎖로 한다. 이 5㎖를 취해 헥산을 가해 25.0㎖로 한다. 공전 갈색병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).

(다) 시험용액의 조제

1) 축산물의 경우(버터등 유지류를 제외한다)

토코페롤로서 약 0.2㎎을 함유하는 시료를 검화플라스크에 정밀히 달아(Wg) 에탄올 30㎖ 및 10% 피로갈롤․에탄올 용액 1㎖를 가하고 이에 수산화칼륨용액(9→10) 3㎖를 가해 환류냉각기를 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화한다. 비누화후 즉시 냉각하여 실온으로 한 후 물 30㎖를 가해 갈색분액여두에 옮긴다. 플라스크는 물 10㎖, 석유에테르 30㎖로 씻어 넣고 잘 흔들어 혼합하고 방치한 후 석유에테르층을 분취한다. 물층은 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고 석유에테르액을 합하여 물 10㎖로 1회, 이어 물 50㎖로 페놀프탈레인 지시약이 분홍색이 되지 않을 때까지 씻는다. 분액여두중에서 물을 충분히 분리한 후 무수황산나트륨을 가해 탈수한 후 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 잔존하는 황산나트륨은 다시 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 모두 합한 다음 전 석유에텔추출액을 40～45℃에서 감압건조한 후 잔류물은 헥산 1.0㎖를 가하여 녹여 이를 시험용액으로 한다.

2) 버터등 유지류의 경우

검사시료가 유지인 경우에는 위의 조작중 비누화조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다. 이 경우에는 유지 약 1g을 정밀히 달아 (Wg) n-헥산으로 녹여 50㎖로 한 후, 그중 일정량(D㎖)을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼  럼 : 순상형 칼럼

- 이동상 : 헥산․이소프로판올(98 : 2)

- 유  속 : 0.5㎖/분

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 298㎚, 측정파장 325㎚)

2) 정량시험

시험용액 1.0㎖에 토콜표준용액 1.0㎖를 가해(S) 이의 10㎕를 고속액체크로마토그래프에 주입하여 얻은 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Ptoc) 및 토콜의 피크 넓이 또는 높이(Pint)를 구한다. 또한 토코페롤 동족체 각각에 대하여 각 토코페롤 표준용액 1.0㎖를 취해 이에 토콜표준용액  1.0㎖를 가해 이의 10㎕를 고속액체크로마토그래프에 주입하여 얻은 각 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)와 토콜의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)를 구하고, 이들의 중량(㎎)에서 토코페롤 동족체의 토콜에 대한 환산계수(F)를 구한다. 검사시료중 토코페롤 동족체의 함량(㎎/100g)은 다음 계산식에서 구한다.

〔계산〕

가)  일반시료의 경우(버터등 유지류를 제외한다)

Ptoc         100

토코페롤동족체의 양(㎎/100g) = S × ── × F × ───

Pint          W

S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(㎎)

S=V×C

V : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 양(㎖)

C : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 농도(㎎/㎖)

Ptoc : 시험용액중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이

Pint : 시험용액중 토코피크의 넓이 또는 높이

F   : 환산계수

Cst-toc      Pst-int

fα-δ =   ──── ×  ───

Cst-int      Pst-toc

Cst-toc : 표준용액중 토코페롤 동족체의 농도

Pst-toc : 표준용액중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이

Cst-int : 표준용액중 토콜의 농도

Pst-int : 표준용액중 토콜 피크의 넓이 또는 높이

W : 검사시료채취량(g)

나) 버터등 유지류의 경우

50     Ptoc          100

토코페롤 동족체의 양(㎎/100g) = S × ── × ── × F × ───

D      Pint          W

(2)α,α'-디피리딜에 의한 비색정량법

(가) 장 치

분광광도계

(나) 시 약

1) 정색용액 : 0.5% α,α'-디피리딜에탄올용액

2) 염화제이철에탄올용액 : 염화제이철 0.2g을 에탄올에 녹여 100㎖로 한다.

3) 석유에테르 : 석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH용액 및 물로 수세한다. 세정한 석유에테르층에 무수 황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 증류하여 30～60℃에서 유분을 취한다.

(다) 표준용액의 조제

α-토코페롤 약 20㎎을 정밀히 달아 에탄올을 가하여 녹여 100㎖로 한다.

(라) 시험용액의 조제

토코페롤로 0.5～1㎎에 해당하는 양의 검사시료를 환저플라스크에 취하고 에탄올 30㎖ 및 10% 피로갈롤에탄올용액 1㎖를 가하고 수산화칼륨용액(9→10) 1㎖를 가하여 환류냉각기를 붙이고 수욕상에서 30분간 비누화한다. 비누화 후 신속하게 냉각하여 실온으로 하고 물 30㎖를 가하여 갈색 분액깔대기에 옮기고 플라스크는 물 10㎖, 석유에테르 30㎖로 씻고 씻은 액을 분액깔대기에 옮기고 잘 진탕 혼합하고 방치하여 석유에테르층을 분취한다. 물층은 다음에 석유에테르 30㎖씩으로 2회 추출하고 석유에테르 추출액을 합하여 물 10㎖로 1회, 50㎖씩으로(페놀프탈레인 지시약이 정색되지 않을 때까지) 세척한다. 분액깔대기중에서 물을 충분히 분리한 후, 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수하고 석유에테르층은 갈색 플라스크에 옮긴다. 남은 무수황산나트륨은 석유에테르 10㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 합친다.

석유에테르추출액을 모두 합하여 60℃에서 감압건조하고 잔류물은 에탄올 5㎖로 녹여 25㎖의 갈색플라스크에 옮긴다. 플라스크는 추가로 에탄올 5㎖씩으로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 가하여 에탄올을 채워 25㎖로 하여 시험용액으로 한다.

(마) 시험방법

시험용액 5㎖와 비타민 E 표준용액 1㎖를 25㎖의 플라스크에 취하여 각각에 염화제이철에탄올용액 1㎖와 0.5% α,α'-디피리딜에탄올용액 1㎖를 가하고 다음에 에탄올을 가하여 25㎖로 한다. 따로 에탄올 1㎖를 취하여 같은 방법으로 조작한 것을 대조로 하여 시험용액과 표준용액을 액층 1㎝ 파장 520㎚에서 흡광도를 측정한다.

〈계산〉

T      25      100

총토코페롤 함량(㎎/100g) = C × ── × ── × ───

S       5       W

C : 비타민 표준용액의 토코페롤 농도(㎎/㎖)

T : 시험용액의 흡광도

S : 표준용액의 흡광도

W : 검사시료채취량(g)

사. 비타민 D

(1) 고속액체크로마토그래프를 이용한 정량

난황과 같이 지질함량이 많은 시료를 제외한 축산물에 적용한다.

(가) 시약

1) 에탄올 : 에탄올(특급) 1ℓ에 50% 수산화나트륨 용액 5㎖ 및 아연 분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다.

2) 벤젠 : 특급시약을 증류하여 사용한다.

3) 헥산 :  특급시약을 증류하여 사용한다.

4) 아세토니트릴 : 특급시약을 증류하여 사용한다.

5) 메탄올 : 고속 액체크로마토그래프용

6) Vit. D 표준용액 : 비타민 D2 및 D3가 1㎖중 4 IU(0.1㎍) 함유되도록 무알데히드 에탄올에 녹인다.

7) 고속액체크로마토그래피 이동상 : (ⅰ) 아세토니트릴․메탄올(특급) (1:1)

(ⅱ) 0.4% 이소프로파놀․헥산 용액

8) 고속액체크로마토그래피용 칼람충진제 : 역상분배형 및 순상분배형 충진제

(나)기구 및 장치

1) 고속액체크로마토그래프 : 254㎚ 또는 그 부근 파장의 자외부 흡수검출기가 부착된 2대의 고속액체크로마토그래프를 사용한다. 이중 1대는 제1단계(분취용)에, 다른 1대는 제2단계(분석용)에 사용한다.

2) 고속액체크로마토그래프용 칼럼 : 내경 7.5㎜, 길이 300㎜와 내경 4.6㎜, 길이 250㎜의 칼람에 각각 역상형 및 순상형충진제를 채운 것

3) 분획포집기 (Fraction collector)

(다) 시험용액의 조제

시료가 고체일 경우에는 초고속마쇄기 등으로 잘게 마쇄한 후 비타민 D로서 2 IU(0.05㎍) 이상을 함유하는 시료를 공전 검화플라스크에 정밀히 달아 피로가롤․에탄올(1→10)용액 40㎖를 가하여 가볍게 흔들어 현탁시킨다. 여기에 KOH용액(9→10) 10㎖를 가한 후 환류냉각기를 부착하여 끓는 수욕중에서 30분간 가열하여 검화한다. 검화가 완료된 후 재빨리 냉각시켜 실온에 이르게 하고 벤젠 100.0㎖를 가한 다음 유리마개를 하여 15초간 격렬히 진탕혼합한다. 이 때 침전이 생기면 침전이 가라 앉을 때까지 정치한다. 침전물은 검화용 플라스크에 남기고 액만을 250～300㎖용 분액여두에 옮긴다(침전물을 세척하여 옮길 필요는 없다). 분액여두에 1N KOH 용액 100㎖를 가하여 15초간 격렬히 진탕하여 섞고 정치하여 액이 분리되면(벤젠층은 투명하게 되지 않아도 됨)혼탁해진 수층은 버린다. 다시 벤젠층에 0.5N KOH 용액을 가하여 잘 흔들어 섞은 다음, 벤젠층을 적어도 4회 이상 물 40㎖씩으로 매회 15초간 진탕혼합하여 수세액이 페놀프탈레인 시약으로 알칼리 반응을 보이지 않을 때까지 행한다. 분액여두를 수분간 방치시켜 최종 물 한방울까지 완전히 분리시키고 제거한다. 칼로 잘라서 중심부가 파인 원형의 얇고, 단단한 종이(No. 2, 직경 9㎝) 2장을 분액여두 속에 넣어 벤젠층이 투명하게 될 때까지 진탕하면서 섞는다(약 10분간). 이 벤젠용액 80.0㎖를 환형 플라스크에 취하여 40℃이하에서 용매를 감압 건고 시킨다. 잔류물에 헥산 5.0㎖를 가하여 용해시켜 그 중 4.5㎖를 10㎖를 공전시험관에 취하여 같은 방법으로 감압 건고시킨 다음 잔류물에 아세토니트릴․메탄올(1:1) 500㎕를 정확히 가하여 녹여 검액으로 한다.

(라) 시험조작

1) 고속액체크로마토그래피 조건

가) 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래피

- 칼럼 : 역상형 칼럼(내경 7.5㎜, 길이 300㎜)

- 이동상 : 아세토니트릴 : 메탄올(1:1)

- 유속 : 2㎖/분

- 검출기 : 자외선(UV)

검출기(254㎚)

나) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토크래피

- 칼럼 : 순상형 칼럼(내경 4.6㎜, 길이 250㎜)

- 이동상 : 0.4% 이소프로판올․헥산용액

- 유속 : 1.6㎖/분

- 검출기 : 자외선(UV)

검출기(254㎚)

2) 정량시험

가) 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래피

시험용액 200㎕를 정확히 취해 제1단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 분획포집기로 비타민 D 분획을 분취한다(비타민 D 표준용액의 크로마토그램으로 비타민 D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 검출기에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조건을 준비한다.

나) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피

제1단계에서 얻은 비타민 D획분의 용매를 감압농축하여 잔류물에 0.4% 이소프로판올․헥산 200㎕를 정확히 가하여 녹인다. 이 용액 100㎕를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 얻어진 크로마토그램에 나타난 비타민 D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

다) 비타민 D 표준용액에 대한 조작

별도로 비타민 D 표준용액 1㎖에 대하여 상기의 시험용액의 조제 및 시험조작 제1단계, 제2단계의 조작에 따라 실행한 후 비타민 D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.

<계산>

Psa         S

검사시료 100g중의 비타민 D(IU) = ── ×──────── × 100

Pst   검사시료채취량(g)

S  : 비타민 D 표준용액의 농도(IU/㎖)

Pst : 비타민 D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적

Psa : 검사시료에 대한 피크의 높이 또는 면적

아. 비타민 K1

(1) 고속액체크로마토그래피에 의한 정량

(가) 시약

1) 용매 : 메탄올, 디클로로메탄, 이소옥탄, 아세톤 및 이소프로판올(고속액체크로마토그래피용)

2) Conditioning용액 : 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 한다.

3) 용출용매(이동상) : 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%가 되게 한다.

4) 암모니아수 (36%)

5) 무수황산나트륨

(나) 표준용액의 조제

비타민 K1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다(불활성형 cis형을 ≤ 20%정도 함유함). 암소에서 보관한다.

1) 표준용액 : 비타민 K1 표준품을 이소옥탄에 녹여 5㎍/㎖가 되게 한다.

2) 표준용액 : 표준용액을 이소옥탄으로 희석하여 0.7㎍/㎖가 되게 한다.

(다) 시험용액의 조제

1) 검사시료의 검화와 추출

검사시료 일정량(비타민 K1으로서 3.5㎍함유)을 정확히 취하여 500㎖ 분액여두에 넣고 암모니아수 4㎖를 가한 후 60초간 흔들어 혼합한다.  여기에 60㎖의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한 후 디클로로메탄 100㎖와 이소옥탄 50㎖ 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다. 층 분리 후 하층액을 1,000㎖ 환저플라스크에 옮긴다. 다시 디클로로메탄 100㎖와 이소옥탄 50㎖ 혼합액을 가하여 추출한 후 하층액을 합하고 이 액을 75℃이하에서 감압 농축한다. 환저플라스크를 아세톤 20㎖로 씻고 그 액을 농축시키는 조작을 3회 반복한 후 질소 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

2) 시험용액의 정제

정제 칼럼에 conditioning 용액 20㎖를 주입하고 천천히 용출시켜 그 액을 버린다. 잔류물을 conditioning 용액 10㎖로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민 K1을 흡착시킨다. 같은 용액으로 5㎖씩 2회에 걸쳐 환저 플라스크를 씻고, 씻은 액을 칼럼에 넣은 후 conditioning 용액으로 용출하여 그 액을 버린다. 이어 검사시료의 지방 함량에 따라 양을 달리하여 용출용매를 칼럼에 통과시킨다(검사시료의 지방함량이 0.72～0.80g이면 100㎖의 용매를, 0.72g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다). 용출액을 250㎖ 환저플라스크에 받아 75℃이하에서 감압농축한다. 이 농축액을 이소옥탄 1～2㎖로 몇 회 나누어 씻어 5㎖로 정용한다.

- 정제칼럼 : 60～200 메쉬 실리카 5.0g(100℃오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정제 칼럼 (1.0㎝ id×30㎝, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 2.0g(100℃오븐에서 하룻밤동안 활성화시킴)을 가한다.

(라) 시험조작

1) 고속액체크로마토그래피 조건

- 칼럼 : 5㎛실리카가 충전된 250×4.6㎜ id의 순상형 칼럼

- 이동상 : 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%,  0.02%가 되게 한다.

- 검출기 : 자외선(UV) 검출기(254㎚)

2) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20㎕씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 대해 구한 검량선을 사용하여 검사시료중 비타민 K1(C)의 함량을 구한다. 비타민 K1의 함량은 각 이성체의 농도의 합으로 계산하며 옥수수유를 포함하는 조제유류는 trans-비타민 K1만을 계산한다.

<계산>

Hs      V

C(㎍/100g) = Cstd ×F × ─── ×──× 100

Hstd     S

Cstd : 표준용액의 농도(㎍/㎖)

F : 비타민 K1 표준용액에서 각각의 이성체의 비율

Hs : 검사시료의 비타민 K1 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

Hstd : 비타민 K1 표준용액 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이

V : 희석배수

S : 검사시료 채취량(g)

자. 비타민의 미생물학적 분석법

(1) 일반정량조작법

(가) 장치 및 기구

1) 항온기

2) 건조기

3) 멸균기

4) 무균대

5) 시험관, 피펫 등 : 시험균의 증식은 유리기구에 부착된 미량의 비타민 또는 세정제에 의하여 쉽게 영향을 받기 때문에 유리기구는 적당한 계면활성제 등으로 하루 처리한 후 충분히 물로 닦아둔다.

(나) 시약

사용시약류는 가능한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준품은 표준비타민을 이용한다.

(다) 시험균의 보존

유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산 나트륨 1%, KH2PO4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 pH를 6.8～7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10㎖씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37℃, 효모는 30℃에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5℃에 보존하면서 1～3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 동결건조법에 의해 보존한다.

(라) 접종균액

유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산 나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16～24시간 정도 같은 배지에 2～3회 이식한다. 증식된 균체는 3,000rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5～100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다.

(마) 정량용 기초배지

1) 염류용액 A : KH2PO4와 K2HPO4 각 5g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

2) 염류용액 B : MgSO4․7H2O 2g, NaCl 0.1g, FeSO4․7H2O 0.1g 및 MnSO4․4H2O 0.1g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다.

3) 카제인 산분해용액 : 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100g을 95% 알코올로 2회 세정하여, 5배양의 20% HCl을 가해서 8～12시간 동안 가열환류 하거나 또는 멸균기에서 121℃로 8～12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200㎖를 가해 감압하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가하여 pH를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1ℓ로 만든다. 계속해서 활성탄 20g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용한다.

(바) 시험조작

특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5㎖ 또는 10㎖로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2～3개씩 4～8단계로 하며, 비타민 표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4～6개 준비한다. 총량이 5㎖일 경우 기초배지는 2.5㎖를 사용하고, 10㎖일 경우 기초배지는 5㎖를 가한 후, 물을 가해서 각각 5㎖ 또는 10㎖로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2～3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121℃의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준 용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2～3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30～37℃에서 16～24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10㎜ 직경의 흡수cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540～610㎚의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다.

(사) 탁도법에 의한 계산

검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ㎖수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시료의 g수 또는 시료용액 ㎖수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다.

이때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평형하는 부분에 관해서 시험용액 1㎖ 또는 시료 1g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료중의 비타민 함량을 산출한다.

비타민 함량 ＝ 시험용액의 비타민 함량 × [eqn: {희석농도} over {시료량}]

(2) 비타민 B6

(가) 시약

1) 비타민 B6 보존용액 : H2SO4를 넣은 감압 데시케이터에서 24시간 건조된 비타민 B6 표준품을 50㎎을 정밀하게 취하여, 500㎖의 메스플라스크에 넣고 1N HCl을 가하여 전량을 500㎖로 만든 후 갈색병에 넣어 냉소에 보관한다. 이 용액 1㎖는 피리독신염산염 100㎍을 포함한다.

2) 비타민 B6 표준용액 : 비타민 B6 보존용액을 물로 희석해서 1㎖에 피리독신염산염 5㎍을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다.

3) 카제인 산분해용액 : (1) 일반정량 조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

4) 비타민 B1 용액 : 비타민 B1 염산염 10㎎을 물에 용해해서 1,000㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 비타민 B1 염산염 10㎍을 포함한다.

5) 이노시톨용액 : 이노시톨 100㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 이노시톨 1㎎을 포함한다.

6) 비오틴용액 : 비오틴 25㎎을 물에 용해해서 1,000㎖로 만든 후 이중 40㎖를 취해 물을 가하여 1,000㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 비타민 1㎍을 포함한다.

7) 판토텐산칼륨용액 : 판토텐산칼륨 20㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 판토텐산칼륨 0.2㎎을 포함한다.

8) 니코틴산용액 : 니코틴산 100㎎을 물에 용해해서 100㎖로 만든다. 이 용액 1㎖는 니코틴산 1㎎을 포함한다.

9) 염류용액 : KH2PO4 2.2g, KCl 1.7g, CaCl2 0.5g, MgSO4․7H2O 0.5g,  MnSO4․4H2O 0.01g 및 FeCl3 0.01g을 물에 용해해서 전량을 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다.

10) 구연산완충액 : 구연산칼륨 10g과 구연산 2g을 물에 녹여 전량을 100㎖로 만든다.

(나) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 비타민 B1 용액 5㎖, 이노시톨용액 5㎖, 비오틴용액 2㎖, 판토텐산칼륨용액 2.5㎖, 니코틴산용액 0.5㎖, 염류용액 50㎖ 및 구연산완충액 10㎖를 혼합하고 여기에 포도당 10g을 가하여 녹인다. 10% NaCl 용액으로 pH를 5.0～5.2로 조정한 후 물을 가하여 전량을 100㎖로 만든다. 용해되지 않은 물질이 있으면 여과한다. Pyridoxine assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

(다) 접종균액의 조제

1) Saccharomyces pastorianus의 보존균주 : Saccharomyces  pastorianus ATCC 9080을 효모용 한천사면배지 또는 Wort Agar(Difco)에 접종하여, 30℃에서 16～24시간 배양 후 냉소에 보관한다. 보관균주는 2주 간격으로 새로 배양한다.

2) 배지 : 기초배지 100㎖에 피리독신염산염 1㎍을 포함한 물 100㎖를 가하여 접종균액 조제용 배지로 한다. 이 배지를 소시험관에 2㎖씩 분주하여 면전한 후 121℃에서 10분간 가압멸균하여 방냉한다.

3) 접종용액 : Saccharomyces pastorianus의 보존균주를 멸균된 배지에 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양균을 원심분리하여 취한 후 이를 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척하고, 0.9% NaCl용액을 이용해서 약 20배로 희석하여 접종용액으로 한다.

(라) 시험용액의 조제

시료 2g을 500㎖의 삼각플라스크에 취하여, 10N HCl 1㎖ 및 물 180㎖를 가하여 뚜껑을 하고 121℃에서 4시간 가압추출한다. 식힌 후 10% NaOH용액으로 pH를 4.5로 조정하고, 여기에 물을 가하여 전량을 200㎖로 만든다. 필요시 여과한다. 시험용액 1㎖가 비타민 B6 약 5㎍을 포함하도록 여액을 물로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

(마) 시험조작

비타민 B6 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 2개씩의 시험관에 비타민 B6 표준용액 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 및 4.0㎖를 각각 취하고, 각 시험관에 기초배지 5㎖ 및 물을 가해서 전량을 10㎖로 만든다. 특히 시험용액의 계열을 만들기 위해서 2개씩의 시험관에 시험용액 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0㎖를 가하고 각 시험관에 기초배지 5㎖ 및 물을 가해서 전량을 10㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합해서 면전한 후 100℃에서 10분간 멸균하여 식히고, 각 관에 접종용액 한방울씩을 무균적으로 접종하여 30℃에서 16～24시간 배양한다. 배양후 균의 증식을 정지시키기 위하여 100℃에서 5분간 멸균한 후 탁도법에 의하여 균의 증식을 측정한다.

(3) 엽산

(가) 시약

1) 엽산 보존용액 : P2O5를 넣은 데시케이터에서 건조시킨 엽산 표준품 50㎎을 정확하게 취하여 500㎖의 메스플라스크에 넣어 0.01N NaOH용액 약 30㎖로 녹이고, 물 약 300㎖를 가한 후 HCl로 pH를 7～8로 조정하고 물을 가하여 500㎖로 만든다.  톨루엔을 가하여 약 10℃로 보존한다. 이 용액 1㎖는 100㎍을 포함한다.

2) 엽산 표준용액 : 엽산 보존용액을 물로 희석해서 1㎖에 엽산 2㎍을 포함하도록 한다. 사용시 조제한다.

3) 시스틴-트립토판 용액 : L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g(또는 DL-트립토판 1g)을 350～400㎖의 물로 희석하여 70～80℃로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500㎖로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관한다.

4) 아데닌-구아닌-우라실 용액 : 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5㎖로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100㎖로 만든다. 톨루엔 소량을 가하여 10℃에 보관하다.

5) 카제인 산분해용액 : (1) 일반정량 조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

6) 염류용액 B : (1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

7) 크산틴 용액 : 물 약 80㎖에 크산틴 0.4g을 가하여 70℃로 가열하면서 10% 암모니아수 12㎖를 가하여 크산틴이 녹을 때까지 젓는다. 식힌후 물을 가하여 400㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

8) 비타민 용액 : 파라아미노안식향산 10㎎, 피리독신염산염 40㎎, 비타민 B1 염산염 4㎎, 판토텐산칼륨 8㎎, 니코틴산 8㎎ 및 비오틴 0.2㎎을 약 300㎖의 물로 녹이고, 여기에 비타민 B12 10㎎을 0.02N 초산으로 녹인 용액 200㎖를 가한다. 계속해서 무수초산나트륨 1.9g과 초산 1.6㎖를 40㎖의 물로 녹인 용액을 가한 후, 물을 가해서 2ℓ로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

9) 아스파라긴 용액 : L-아스파라긴 8g을 물에 용해해서 800㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

10) MnSO4 용액 : MnSO4․4H2O 2g을 물에 용해해서 200㎖로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다.

11) 폴리솔베이트 80 용액 : 폴리솔베이트 80(Polyoxyethylene sorbitan mono-oleate) 25g을 에탄올로 녹여 250㎖로 만든다.

(나) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴-트립토판 용액 20㎖, 아스파라긴 용액 3㎖, 아데닌-구아닌-우라실 용액 1㎖, 크산틴 용액 2㎖, 비타민 용액 20㎖, 염류용액 B 2㎖, MnSO4 용액 2㎖ 및 폴리솔베이트 80용액 0.1㎖를 잘 섞고, 여기에 포도당 4g, 인산이칼륨(K2HPO4) 0.64g 및 구연산나트륨 (C6H5O7Na3․2H2O) 5.2g을 가하여 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다. Folic acid assaymedium(Difco)을 사용할 수 있다.

(다) 접종균액의 조제

1) Streptococcus faecalis의 보존균주 : 물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고 여기에 포도당 0.5g을 무수초산나트륨 0.5g을 가하여 pH를 6.8로 조정한다. 수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한 후 한천 1.5g을 가하여 한천이 용해 될 때까지 수욕상에서 세게 혼합하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10㎖씩을 시험관에 분주하여 면전하고 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 수직으로 세워 식힌다. Streptococcus faecalis ATCC 8043의 보존균주를 멸균된 배지 10㎖에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 배양하고 1주를 넘은 것은 사용하지 않는다.

2) 배지 : 한천을 제외한 보존배지로 조제한 액체배지 2㎖를 소시험관에 분주하여 면전한 후, 121℃에서 10분간 가압멸균하여 방냉한다.

3) 접종균액 : Streptococcus faecalis의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종하여, 37℃에서 16～24시간 배양 후 증식된 균체를 무균적으로 원심분리하고, 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척한 후, 0.9% NaCl 용액 약 2㎖를 가해서 접종균액으로 한다.

(라) 시험용액의 조제

일정량의 시료를 플라스크에 넣고, 여기에 적어도 시료의 10배량의 물을 가한다. 이때 이액 1㎖는 엽산 1㎎ 이상을 포함하여야 한다. 여기에 약 10% 암모니아수를 100㎖당 2㎖의 비로 가해서 잘 섞고, 가압멸균기에 넣어 121℃에서 약 15분간 가열한 후 식혀, 물을 가해 일정량으로 하여 여과 또는 원심분리하여 투명한 용액으로 만든다.

다음에 pH를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1㎖는 엽산 약 2㎍을 포함하도록 조제한다.

(마) 시험조작

엽산표준용액의 계열을 만들기 위해서 시험관 2개씩에 엽산표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75 및 2.0㎖를 취하여 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가해서 각각 4㎖로 만든다. 시험용액의 계열은 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0 및 1.5㎖를 가하고 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가하여 4㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 섞어 면전하고 121℃에서 5분간 가압멸균하여 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 20～24시간 배양한다. 탁도법에 의하여 균의 증식도를 측정한다.

(4) 판토텐산

(가) 시약

1) 판토텐산칼륨 보존용액 : P2O5를 넣은 데시케이터중에서 건조시킨 판토텐산칼륨 표준품 50㎎을 정확하게 취하여, 1ℓ의 메스플라스크에 넣고 약 500㎖의 물을 가하여 용해한다. 여기에 0.2N 초산10㎖, 2% 초산나트륨 100㎖ 및 물을 가해서 1,000㎖로 만든다. 톨루엔을 소량 가하여 냉소에 보관한다. 판토텐산칼륨 보존용액 1㎖에는 판토텐산칼륨 50㎍을 포함한다.

2) 판토텐산칼륨 표준용액 : 판토텐산칼륨 보존용액을 희석하여 1㎖당 판토텐산칼륨 0.5㎍을 포함하도록 한다. 사용시 조제한다.

3) 카제인 산분해용액 : (1) 일반정량 조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

4) 시스틴-트립토판 용액 : L-시스틴 2g 및 L-트립토판 0.5g을 350～400㎖의 물로 녹이고 70～80℃로 가열하여 고형물이 완전히 녹을 때까지 20% HCl을 떨어뜨린다.  식힌 후 물을 가해서 전량을 500㎖로 만들고 톨루엔 소량을 가하여 약 10℃에서 보존한다.

5) 아데닌-구아닌-우라실용액 : 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1g을 20% HCl 5㎖로 가열하면서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100㎖로 만든다. 톨루엔 소량을 가해서 약 10℃로 보존한다.

6) 비타민 B1-비타민 B2-비오틴용액 : 비타민 B1 염산염, 비타민 B2 및 비오틴을 0.02N 초산에 용해하여, 그 1㎖에 비타민 B1 염산염 10㎍, 비타민 B2 20㎍ 및 비오틴 0.04㎍을 포함하도록 한다. 톨루엔을 소량 가하여 빛을 차단하고 냉소에 보관한다.

7) 염류용액 A : (1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

8) 염류용액 B : (1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

9) 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민 B6용액 : 보존용액 1㎖에 파라아미노 안식향산 10㎍, 니코틴산 20㎍ 및 피리독신 염산염 40㎍을 포함하도록 25% 에탄올로 용해하여 냉소에 보관한다.

(나) 기초배지의 조제

카제인 산분해용액 10㎖, 시스틴-트립토판용액 10㎖, 아데닌-구아닌-우라실용액 2㎖, 비타민 B1-비타민 B2-비오틴용액 2㎖, 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민 B6용액 2㎖, 염류용액 A 2㎖ 및 염류용액 B 2㎖를 혼화하여 여기에 포도당 4g 및 무수초산나트륨 2g을 가해서 녹이고, 10% NaOH용액으로 pH를 6.8로 조정한 후 물을 가해서 전량을 100㎖로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다. Pantothenate medium(Difco)을 사용할 수 있다.

(다) 접종균액의 조제

1) Lactobacillus plantarum의 보존균주 : 물 100㎖에 효모엑기스 2g을 녹이고, 여기에 포도당 0.5g, 무수초산나트륨 0.5g을 가해 pH를 6.8로 조정한 후 수욕상에서 10～20분간 가열하여 여과한다. 한천 1.5g을 가해 한천이 녹을 때까지 수욕상에서 세게 진탕하면서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10㎖씩 시험관에 분주하여 면전하고, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 똑바로 놓고 식힌다.

Lactobacillus plantarum ATCC 8014의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한 후 37℃에 16～24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 조제하고 1주가 넘은 것은 사용하지 않는다.

2) 배지 : 기초배지 5㎖를 넣은 시험관에 판토텐산칼륨 0.2㎍을 포함한 물 5㎖를 가하고 면전을 하여, 121℃에서 10분간 가압멸균한 후 식힌다. Bacto micro inoculum broth(Difco)를 사용할 수 있다.

3) 접종균액 : Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균된 배지 10㎖에 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다. 배양액을 잘 진탕 혼합한 후 그대로 접종균액으로 사용한다.

(라) 시험용액의 조제

시료에 10배 용량의 물을 가하여 잘 섞으면서 초산 및 초산나트륨 용액으로 pH를 5.6～5.7로 조정한다. 이를 가압멸균기에 넣고, 121℃에서 약 5분간 가열한 후 식힌다. 필요하면 10% HCl을 가해 pH를 4.0～4.5로 조정하여 단백질 등을 침전, 제거시키고 투명한 액으로 만든다. 다음에 NaOH용액을 가해서 pH를 6.8로 조정하고 물을 가하여 용액 1㎖에 판토텐산 약 0.05㎍을 포함하도록 희석한다.

(마) 시험조작

판토텐산칼륨 표준용액의 계열을 만들기 위해서, 시험관 2개씩에 판토텐산칼륨 표준용액을 각각 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 및 2㎖를 취하고, 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가해서 전량을 4㎖로 만든다. 시험용액을 만들기 위해서는 시험용액을 각각  0.5, 1.0 및 1.5㎖를 취하고 각 시험관에 기초배지 2㎖ 및 물을 가하여 전량을 4㎖로 만든다. 시험관의 내용물을 잘 혼합한 후 면전하여 121℃에서 5분간 가압멸균하고 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여, 37℃에서 20～24시간 배양한다. 배양 후 각 시험관의 내용물을 잘 진탕 혼합하여 균일한 부유액으로 만든후 540～660㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다.

판토텐산칼륨 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 이 검량선을 이용하여 시료계열의 각 시험관의 판토텐산칼륨 함량을 구한다. 이때 값이 0.09㎍이상 또는 0.01㎍ 이하의 것이 있으면 제외하고, 남은 각 관에 대하여 시험용액 1㎖에 대한 판토텐산칼륨의 함량을 계산한다. 6개 이상의 시험관으로부터 얻어진 각각의 값이 그들의 평균치보다 10%이상 벗어나지 않은 것을 확인한 다음에 이 값만의 평균치를 구하여 시료중의 판토텐산칼륨의 함량을 산출한다. 그 다음에 여기에서 얻은 값으로 환산계수 0.916을 곱해서 판토텐산 함량을 구한다.

(5) 비타민 B12

(가) 시약

1) 시아노코발아민 보존용액 : 데시케이터 중에서 건조시킨 시아노코발아민 표준품을 시아노코발아민의 양이 50～60㎍에 해당되도록 정확히 칭량하여 25% 알코올을 가한 후 ㎖당 100ng의 농도가 되도록 표준용액 농축액을 만든다. 농축액은 10℃에 보관한다.

2) 시아노코발아민 표준용액 : 이 용액에 일정량의 증류수를 가하여 500㎖로 희석한다. 이 표준용액의 농도는 ㎖당 0.01～0.04ng에 해당하는 농도로서, 시료의 농도와 유사하도록 한다. 같은 방법으로 시료중의 비타민 B12농도보다 높은 농도 및 낮은 농도(예 : 0.010ng/㎖와 0.020ng/㎖)의 표준용액을 준비한다.

3) 아데닌-구아닌-우라실 용액 : 아데닌황산염, 구아닌염산염, 우라실 1.0g을 50㎖의 가온한 HCl로 용해하고(1+1) 물을 가하여 1ℓ로 만든다.

4) 아스파라긴 용액 : L-아스파라긴 10g을 물로 녹이고 1ℓ로 만든다.

5) 폴리솔베이트 80 용액 : 폴리솔베이트 80 25g을 알코올로 녹여 250㎖로 만든다.

6) 염류용액 A : (1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

7) 염류용액 B : (1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

8) 비타민 용액 Ⅰ : 비타민 B2 25㎎, 비타민 B1 염산염 25㎎, 비오틴 0.25㎎, 나이아신 50㎎을 0.02N 초산으로 녹이고 1ℓ로 만든다.

9) 비타민 용액 Ⅱ : 파라아미노벤조산(PABA) 50㎎, 판토텐산 25㎎, 피리독신 염산염 100㎎, 피리독살염산염 100㎎, 피리독사민염산염 20㎎, 엽산 5㎎을 25% 알코올로 녹이고 1ℓ로 만든다.

10) 부유배지(Suspension medium) : 기초배지 5㎖를 동량의 물로 희석하여 시험관에 넣고 면전하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 빨리 식힌다. 10℃의 암소에 저장한다.

11) 크산틴용액 : 크산틴 1.0g을 150～200㎖의 물로 녹이고 약 70℃로 가열하면서, 30㎖의 NH4OH(2+3)를 넣고 완전히 녹을 때까지 저은 후 물을 가하여 1ℓ로 만든다

12) 카제인 산분해용액 :(1) 일반정량조작법 (마) 정량용 기초배지에 따른다.

(나) 기초배지

비타민 B12가 포함되어 있지 않은 2배 농도의 기초배지 1ℓ를 준비하기 위하여 다음의 물질들을 순서대로 첨가한다. 아데닌-구아닌-우라실용액 20㎖, 아스파라긴용액 20㎖, 염류용액 A 20㎖, 염류용액 B 20㎖, 비타민용액 Ⅰ 40㎖, 비타민용액 Ⅱ 40㎖, 크산틴용액 20㎖, 폴리솔베이트 80 용액 20㎖를 넣은 후 증류수를 가하여 약 800㎖로 만든다. 계속해서 다음 물질들을 순서대로 가한다. 산가수분해카제인 10g, L-시스틴 0.4g, DL-트립토판 0.4g을 최소량의 묽은 염산(236㎖ 진한염산/ℓ)으로 녹인 용액과 포도당 40g, sodium acetate trihydrate 33.2g, 아스코르빈산 4g을 넣는다. 아스코르빈산을 가한 후에는 강하게 교반하지 않아야 한다. 모든 고형분이 완전히 녹을 때까지 가볍게 젓는다.  HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정한다. 지시약을 사용할 때는 지시약이 폴리솔베이트를 흡수하기 때문에 pH를 조정한 후 폴리솔베이트 용액을 넣는다. Vitamin B12 assay medium(Difco)을 사용할 수 있다.

(다) 접종균액의 조제

1) Lactobacillus leichmannii의 보존균주: Lactobacillus leichmannii ATCC 7830은 배양배지에 천자배양(stab culture)한다. 37℃에서 6～24시간 배양하여 10℃의 암소에서 저장한다. 분석하기전 1～2주 간격으로 계속 배양하고, 최소한 1주일에 1번 정도로 새로 준비한다.

2) 액체배양배지 : Peptonized milk 15g, 효모엑기스 5g, 포도당 10g, KH2PO4 2g을 600㎖의 물로 용해한다. 여기에 여과한 tomato juice 100㎖를 가한 후 NaOH로 pH를 6.5～6.8로 조정한다. 저으면서 10㎖의 폴리솔베이트 80을 첨가하고 물로 희석하여 1ℓ로 만든다. Lactobacilii broth AOAC(Difco)를 사용할 수 있다. 1㎖당 1ng의 비타민 B12를 포함하도록 동량의 물로 희석하여 시험관에 10㎖씩 분주한 후, 면전하여 121℃에서 15분간 멸균하여 빨리 식히고 냉장고에 보관한다.

3) 배양배지 : 액체배양배지 500㎖에 5～7.5g의 Agar를 넣고 Agar가 녹을 때까지 수욕상에서 젓는다. 뜨거운 상태에서 10㎖를 취하여 시험관에 넣고 121℃로 15분간 멸균한 후 똑바로 세워 빨리 식히고 10℃의 암소에 저장한다. Lactobacilli Agar AOAC(Difco)를 사용할 수 있다.

4) 접종균액 : L. leichmannii의 보관균주를 2개의 액체배양배지에 접종하여 37℃에서 6～24시간 배양 후 원심분리하여 상등액은 버리고 0.9% NaCl용액 또는 부유배지 10㎖로 3회 세척한다. 부유배지를 100% T로 고정하고 이에 대하여 판독할 때, 시험관당 0.50～0.75의 건조량에 상응되는 T 값이 주어지도록 0.9% NaCl용액 또는 부유배지로 일정량을 희석한다. 이렇게 준비한 것을 접종액으로 한다.

(라) 시험용액의 조제

Na2HPO4 1.3g, 구연산 1.2g, sodium metabisulfite(Na2S2O5) 1.0g을 넣은 용액 100㎖를 사용전에 준비한다. 비타민 B12의 농도가 50～100ng이 되도록 시료의 양을 취한 후 ㎖당 0.01에서 0.04ng의 비타민 B12 최종분석 농도에서 추출용액을 sodium metabisulfite의 농도가 ㎖당 0.03㎎을 넘지 않도록 첨가한다. 액상으로 시료용액을 완전히 분산시키고 물로 비이커의 아래부분을 세정하여 혼합물을 121℃에서 10분간 멸균하여 식힌다. 만일 덩어리가 생기면 입자가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 젓는다. 세게 흔들면서 pH를 4.5로 조정하고, 비타민 B12의 농도가 ㎖당 0.2ng이 되도록 물로 희석하여 여과한다. pH를 6.0으로 조정한 후 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1㎖는 비타민 B12 0.014ng을 포함하도록 조제한다.

(마) 시험조작

비타민 B12의 표준용액과 분석용액의 계열을 다음과 같이 준비한다.  두 개의 시험관에 표준용액을 0(비접종 blank), 0(접종 blank), 1.0, 2.0, 3.0, 4.0과 5.0㎖씩 넣는다.

분석시료는 2개 시험관에 분석용액을 1.0, 2.0, 3.0, 4.0㎖씩 넣는다. 표준용액과 분석용액의 각 시험관에 물을 넣어 5㎖로 만든 후, 5㎖의 기초 배지를 넣고 잘 섞는다. 면전하여 121℃에서 10분간 고압멸균하여 빨리 식힌다. 비접종 공시험용 시험관을 제외한 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37℃에서 16～24시간 배양한다.

각 시험관의 내용물을 완전히 혼합하여 흡수 cell에 옮기고, 비접종 시험관의 투과도를 100%로 고정하여 각 시험관의 투과도를 구한다. 시아노코발아민 표준 계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 표준곡선으로부터 분석 용액의 각 시험관의 비타민양을 정한다. 표준용액의 T값이 0.5㎖이하 또는 4.5㎖이상으로 관찰되면 무시한다. 시험에 사용한 분석용액의 농도(비타민함량/㎖)를 계산한다. 각 시험관 결과의 평균을 구하되, 평균으로부터 10%이내의 오차를 보이는 결과만을 취하여 계산한다. 분석용액의 4단계에 사용한 시험관 중 2/3미만이 적합한 결과를 보인 경우, 이 결과는 시료의 비타민 B12 함량 결정에는 불충분하다. 2/3이상의 시험관의 결과가 적합한 경우라면, 그 평균값으로부터 시료의 역가를 구한다.

4. 발색제 및 보존료 시험법

가. 발색제

(1) 아질산이온(NO2-) 및 그 염류

(가) 정성시험

1) 시  약

가) Sulfanilic acid용액 : Sulfanilic acid 0.5g을 20%초산 100㎖에 용해 시킨다.

나) α-Naphthylamine액 : α-Naphthylamine 0.2g을 20% 초산 100㎖에 용해시킨다(상기의 양 시액을 Griess시약이라 한다).

2) 시험방법

가) 액체시료

시료 2～5㎖를 증류플라스크에 취하고 증류수 100㎖ 및 10% 황산액 10㎖를 넣고 증류하여 100㎖ 메스시린다에 증류액을 받는다.

이때 메스시린다에는 증류수 20㎖ 및 1N H2SO4액 1㎖을 넣고 냉각기의 끝이 잠기게 하여 증류한다.

이 증류액이 약 90㎖정도 되면 증류를 중지하고 증류수로써 100㎖되게 한 다음 이것 50㎖에 Griess 시약 각각 2㎖씩을 넣고 잘 혼합한 다음 40℃의 수욕중에서 15분간 가온한다.(아질산이 존재하면 홍색을 나타낸다.)

나) 고체시료

수용성 시료는  2～5g을 증류수 100㎖ 및 10% H2SO4액 10㎖를 넣어 액체시료 가)에서와 동일한 방법으로 시험한다.

시료가 불용성이면 잘 분쇄하여 혼합한 다음 5g을 100㎖의 비이커에 취하고 증류수 50㎖를 가하여 균등히 혼합한 다음(산성일때는 2% Na2CO3액으로 중화한후) 15분간 40℃의 수욕상에서 유리봉으로 잘 혼합하면서 가온한다. 이것을 500㎖ 메스플라스크에 옮기고 비이커 및 유리봉을 증류수로 수회 세척하여 총량이 약 300㎖되게 하고 약 80℃의 수욕중에서 때때로 흔들면서 2시간동안 침출한다.

이 침출액에 포화 HgCl2액 5㎖를 가하고 잘 혼합한 후 상온에서 냉각하고 증류수로써 500㎖되게 한다.

이것을 건조여과지로 여과하고 그 여액 50㎖에 대하여 Griess시약 각각 2㎖씩을 넣어 때때로 흔들면서 40℃의 수욕상에서 15분간 가온한다(아질산이 존재하면 홍색을 나타낸다). 이때 시료 자체가 착색되어 있거나 침출액이 혼탁되어 있을 경우는 여액 100㎖에 10% H2SO4액 10㎖를 가하여 액체시료에서와 동일하게 증류하고 발색한다.

(나) 정량시험

Ⅴ.가공품시험법 2.식육가공품 (1)아질산이온 (가)디아조화법에 따라 시험한다.

나. 보존료

(1) 솔빈산(Sorbic acid) 및 그 염류

[제1법 : 자외선흡수스펙트럼에 의한 정량]

(가) 기구 및 시약

1) 스펙트로포토메타

2) 분액깔대기

3) 증류장치

4) 인산염완충용액 : 0.1N(KH2PO4)용액 32㎖에 0.1N(Na2HPO4)용액 1㎖를 가하여 혼합시킨다. 이 용액의 pH는 약 5.2이다.

5) 에칠 에텔 : 재증류하여 사용한다.

6) 솔빈산표준용액 : 솔빈산 표준품(특급)을 인산염완충용액에 용해시켜 그 함량이 1～5㎎/㎖되게 한다.

(나) 시험방법

1) 예비시험용액의 조제

잘 분쇄한 시료 1～5g(솔빈산 0.5～2㎎ 상당량)에 산화마그네슘(MgO) 50g을 가하고 잘 혼합한다.

이를 200㎖용 증류플라스크에 취하고 증류수 50㎖를 가한 후 금망상에서 직화로 가열하여 증류액이 40～50㎖로 되고 마그네슘이 다량 석출되기 시작하면 가열을 중지하고 방냉한다.

다시 50㎖의 증류수를 가하고 증류하여 전체의 증류액이 90～100㎖ 될때까지 증류한다. 냉각기를 소량의 온수로 씻어 증류액과 합치고 인산염 완충액을 가하여 총량이 500㎖되게 한다.

2) 본 시험용액의 조제

상기의 예비시험용액 100㎖를 300㎖용 분액깔대기에 취하고 10% 염산액 5㎖, NaCl 30g을 가하고 에텔 70㎖로써 추출한 후 다시 50㎖씩으로 2회 반복 추출하고 전체의 추출액을 증류수 15㎖로서 세척한다. 에텔 추출액에 0.2N NaCl액 10㎖를 가하고 추출하여 수층을 취한다. 이 조작을 2회 반복하여 수층을 합친다음 인산염 완충용액을 가하여 총량이 100㎖되게 한다.

3) 측  정

인산염 완충용액을 대조로 하여 예비시험용액의 흡광도를 파장 235～280㎚에서 측정할 때 256㎚에서 최대흡광도를 보이면 솔빈산이 존재한다. 본 시험용액에 대하여 파장 256㎚에서 흡광도를 측정하고 표준용액에 의한 검량선을 작성하여 시료용액의 농도를 측정한다.

[제2법 : 고속액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량]

가) 시약

① 이동상 : 메탄올 : 50mM 인산완충액(pH 5.0)〔40:60〕

② 표준용액 : 살리실산, 소르빈산, 안식향산 20㎎을 물에 녹여 250㎖로 한다. 사용할 때 이 액을 적당량 취하여 메탄올로 희석한다.

③ 0.005M CTA 용액

25% Cetyltrimethyla㎜onium chloride용액을 희석하여 조제한다.

나) 장치

① 검출기 : 자외부검출기 (UV), 230nm

② 칼럼 : Spheri-5 ODS 또는 그에 상응한 것

③ 용매여과기 : Solvent Clarification Kit나 그와 동등한 것

다) 시험용액의 조제

시료 5g을 취하여 물로 25㎖가 되게 희석한 후 이 액 5㎖를 취해 1N 염산 0.5㎖와 0.005M CTA용액 0.5㎖를 가하여 섞어준 후 메탄올 10㎖, 0.005M CTA 용액 10㎖로 차례로 흘려 씻어준 Sep-Pak C18Ⓡ카트리지에 시험용액을 2㎖/분의 속도로 가한다. 이어서 물 10㎖로 카트리지를 씻고 메탄올 10㎖로 용출시켜 전량을 메탄올로 10㎖가 되게 한다. 이 액을 0.45μm 의 여지로 여과하여 시험용액으로 한다.

라) 시험방법(고속액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

- 유속 : 0.8～1.2㎖/분

- 시험용액 주입량 : 10～20㎕

- 감도 : 0.05AUFS

시험용액 및 표준용액 10～20㎕를 앞의 조건에 따라 고속액체크로마토그래피칼럼에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 다음 식에 따라 검사시료 중의 살리실산, 소르빈산 및 안식향산의 양을 산출한다.

PA    50      1

보존료(g/kg) = 각 표준용액의 농도 (㎎/kg) × ── × ─ × ───

PS    SA    1,000

PS : 표준용액의 높이 또는 면적

PA : 시험용액의 높이 또는 면적

SA : 검사시료의 무게(g)

(2) 데히드로초산(DHA) 및 그 염류

(가) 기구 및 시약

1) Spectrophotometer

2) 환류냉각장치

3) Salicylaldehyde용액 : 새로이 증류한 거의 무색의 Salicylaldehyde 20g을 95% Ethanol에 녹여 100㎖되게 한다.

4) 초산동용액 : Cuppric acetate 13.3g을 초산 5㎖ 및 증류수 195㎖을 가하여 용해한다.

5) 표준용액 : 정제 DHA 100㎎에 증류수 50㎖와 0.2N NaOH액 4㎖의 혼합액을 넣어 용해시킨 다음 증류수로 100㎖되게 희석한다.

6) 10% Trichloroacetic acid액

7) Phenol red 지시약

8) 무수 Na2SO4

(나) 시료제조법

1) 치  즈 : 시료 10g을 클로로포름 50㎖와 혼합하고 균질기로 약 3분간 균등히 섞은 다음 200㎖ 플라스크에 옮기고 클로로포름 약 20㎖로써 용기를 세척하여 위 액과 합한 후 환류냉각기를 부착하고 수욕상에서 10～15분간 가온한다. 이것을 냉각한 후 건조여지로 흡인여과한 후 잔사를 여지와 함께 균질기에 넣고 클로로포름을 가하여 충분히 혼합한 다음 다시 여과하고 클로로포름으로 용기를 세척하여 상기 여과액과 합친다.

이 클로로포름액을 0.2N NaOH액 50㎖씩으로 4회 추출한다.

2) 버  터 : 시료 10g을 100㎖의 삼각플라스크에 취하고 클로로포름 50㎖를 가하고 환류냉각기를 부착하여 때때로 흔들어 주면서 10～15분간 가온 한다. 이 액을 분액깔때기에 옮기고 클로로포름 약 30㎖로써 용기를 세척하여 분액 여두에 합하고 0.2N NaOH액 50㎖씩으로 4회 추출한다.

상기의 0.2N NaOH액을 클로로포름 20㎖씩으로 2회 세척한후 10%HCl액 약 25㎖와 Phenol red 지시약 3방울을 넣고 다시 액이 미홍색이 될때까지 10% HCl액을 가하고 즉시 송풍하여 잔류클로로포름을 제거한 다음 10% Trichloroacetic acid액 15㎖를 가하고 잘 진탕하여 상온에서 잠시 방치한 후 전량을 250㎖로 하고 건조여과지로 여과한다.

위의 여액 230㎖를 분액깔대기에 옮기고 10% NaOH액 약 3.5㎖로써 중화한 후 여기에 10% 초산 8㎖를 넣어 산성(pH 3.6)으로 한 다음 에텔, 석유에텔 동량 혼합액 약 80㎖씩으로 4회 추출하여 추출액을 합친다. 이 에텔추출액을 증류수 20㎖씩으로 2회 세척한 다음 무수Na2SO4 3g을 가하여 탈수한다. 이 추출액을 수욕상에서 조용히 증발 건고시키고 잔류물을 송풍하여 완전히 제거한 다음 0.1N NaOH액을 가하고 약하게 가온하여 잔류물을 녹인 후 전량을 25㎖되게 한 다음 여과한다. 공시험용액은 시료를 사용하지 않고 동일하게 처리한 것으로 한다.

3) 정성시험

상기의 검액 1㎖를 시험관에 취하고 Salicylaldehyde액 1㎖ 및 10% NaOH액 1㎖를 넣어 마개를 헐겁게 한 다음 수욕상에서 20분간 가열  할 때 적색 내지 동적색을 나타내면 DHA가 존재한다.

4) 정량시험

50㎖ 메스플라스크 2개에 상기의 검액 1㎖ 및 공시험용액 1㎖를 취하고 여기에 Salicylaldehyde액과 10% NaOH액 1㎖씩을 정확히 가한 다음 정성시험에서와 동일하게 조작하고 증류수를 가하여 50㎖되게 한 후 510㎚에서 흡광도를 측정하고 미리 작성된 검량선에 의하여 함량을 구한 다음 여기에 27.175(250÷230×25)를 곱하면 시료 10g중의 DHA함량(㎎)이 된다. 검량선은 표준액 0.2～1㎖를 50㎖ 메스플라스크에 취하고 증류수로 1㎖되게 한후 이하 동일하게 조작하여 그 흡광도를 구한다.

(3) 데히드로초산, 소르빈산 및 그 염류

(가) 박층크로마토그래피에 의한 정성

1) 시험용액의 조제

액체검사시료는 10～20㎖, 고체검사시료는 분말로 한 다음 10～20g(알코올을 함유한 검사시료는 1% 수산화나트륨용액으로 pH 약 7～7.5로 한 다음 가열하여 알코올을 제거한다)을 취하여, 물을 적당량 넣고 이를 15% 주석산용액으로 산성(pH 약 2)으로 한 후 염화나트륨 30g을 가한다. 이를 수증기 증류하여 유액 100㎖를 받는다(유출속도는 1분간 약 10㎖).

유액을 10% 수산화나트륨용액으로 알칼리성으로 하여 에테르 30㎖로써 중성 물질을 추출제거하고 물층은 10% 염산으로 산성으로 하여 에테르 30㎖로 추출한다. 다시 에테르층을 물 5㎖씩으로 3회 씻고, 에테르층을 분취해서 무수황산나트륨을 넣어 약 15분간 방치한다. 이를 여과하여 에테르를 감압하에서(20～30o) 농축하고, 잔류물을 에탄올 0.1～0.3㎖에 녹여 시험용액으로 한다.

2) 박층의 조제

폴리아마이드 또는 실리카겔G(박층크로마토그래피용)에 이소프로판올 또는 물을 가하여 잘 섞어서 호상(풀모양)으로 하여 일반적인 방법에 따라 0.25㎜의 박층을 만들고 이를 바람에 말린 다음 60～70℃(실리카겔은 110℃)에서 30분간 건조하여 사용한다.

3) 시험방법

박층에 시험용액 및 각 보존료표준용액을 0.2～1㎕를 약 10㎜ 간격으로 찍어서 전개용매 Ⓐ～Ⓒ를 사용하여 전개한다. 바람에 말려 자외선 아래서 확인한 다음 발색시약 Ⓐ～Ⓓ를 선택 분무하여 정색시킨다. 단, 발색시약 Ⓒ는 재차 10% 수산화나트륨용액을 분무하여 정색시킨다.

〔전개 용매〕

Ⓐ 헥산 : 초산(20 : 0.7)

Ⓑ 벤젠 : 초산(20 : 0.5)

Ⓒ 벤젠 : 메탄올 : 초산 ( 20 : 0.2 : 0.5  또는 20 : 0.5 : 0.3 )

〔발색 시약〕

Ⓐ 2% 황산제이철용액

Ⓑ 0.1% 브롬크레졸그린․에탄올용액

Ⓒ 디아조설파닐산용액 : 설파닐산 1g에 염산 8㎖를 가하여 가열하여 녹인다. 여기에 물 100㎖를 넣는다. 이 용액에 동등량의 0.7% 아질산나트륨용액을 가한다.

Ⓓ 0.05% 로다민 B 메탄올용액

(나) 자외선흡수스펙트럼에 의한 정량

1) 시험용액의 조제

액체검사시료 : 보존료의 함량에 따라 검사시료 30～100g을 비이커에 취하여 10% 수산화나트륨용액 또는 10% 염산으로 중화하고 이를 500㎖～1ℓ의 환저플라스크에 옮기고 이에 15% 주석산용액 5㎖, 염화나트륨 약 80g 및 실리콘수지 한방울을 가한 후, 전량을 물로 150～200㎖로 한다. 이를 수증기 증류기에 연결하여 증류하고 유액은 매분 약 10㎖의 속도로 하여 500㎖를 취하여 시험용액으로 한다.

고체검사시료 : 검사시료를 잘게 썰거나 갈아서 보존료의 함량에 따라 30～100g을 취하여 물 50～100㎖를 가하여 잘 섞은 후 이하 액체검사시료와 동일하게 처리하여 시험용액으로 한다.

시험용액 및 각 보존료의 표준용액 각 50㎖를 각각 분액깔때기에 취하여 이에 10%염산 4㎖, 염화나트륨 10g을 가하여 에테르 40, 30 및 30㎖로 3회 추출한다.

에테르추출액을 모두 합쳐서 소량의 물로 2회 씻고, 씻은 액은 버린 다음 에테르추출액에 1% 탄산수소나트륨용액 20㎖를 가하여 흔들어 섞고 물층과 에테르층으로 분리한다. 다시 이 조작을 1회 되풀이하여 물층을 모두 합쳐 이를 에테르 15㎖로 씻고 에테르층은 먼저 분리한 에테르층에 합친다.

물층은 수욕상에서 에테르를 날려보낸 후, 10% 염산으로 중화하고 물을 가하여 전량을 50㎖로 한다. 이들의 각 10㎖를 메스플라스크에 취하고 각각의 완충액(2M 염화칼륨용액 50㎖ 와 2N 염산 10.6㎖를 혼합하고 물을 가하여 200㎖로 한다. pH 0.6) 2㎖와 물을 가하여 20㎖로 하고 잘 흔들어 섞은 후 액층 10㎜에서 각 보존료의 측정파장인 230nm, 265nm, 303nm 또는 308nm 부근의 각 극대파장에서 흡광도를 측정하고 검액에서 얻은 흡광도를 A(230), A(265), A(303) 또는 A(308)로 하고 표준용액에서 얻은 흡광도를 As(230), As(265), As(303) 또는 As(308)로 한다.

대조액은 완충액 1에 물 9를 혼합한 것을 쓴다. 검사시료 중 보존료가 단독으로 존재할 때의 각 보존료의 함량(g/㎏)은 다음식에 따라 구한다.

A(265)     1           1

소르빈산(g/㎏) = 5 × ──── × ─ × ─────────

As(265)    2    검사시료채취량(g)

A(308)     1          1

데히드로초산(g/㎏) = 20 × ──── × ─ × ─────────

As(308)    2    검사시료채취량(g)

(다) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

1) 시 약

가) 내부표준물질용액 : 0.1% 아세트아닐라이드의 아세톤용액

나) 보존료표준용액 : 각 보존료 표준품을 내부표준물질용액에 녹여 0.5～1.0㎎/㎖의 용액을 만든다.

다) 고정상담체 : 크로모솔브 W(60～80메쉬)

라) 칼럼충전제 : 고정상담체에 Ⓐ디에칠렌글리콜석시네이트폴리에스텔(DEGS)을 2～5% 및 인산을 1% 입힌다(Coating). Ⓑ네오펜틸글리콜석시네이트폴리에스텔(NPGS)을 10% 및 인산을 1%입힌다.

2) 장 치

가) 수소염이온화 검출기(FID)

나) 구테루나다니쉬 농축기

다) 칼럼 : 길이 1～2m, 안지름 3～4㎜ 스테인레스틸관

3) 시험용액의 조제

(나)자외선흡수스펙트럼에 의한 정량 1)시험용액의 조제에 따라 수증기 증류한 유액 일정량(각 보존료 5～10㎎ 함유량)을 분액깔대기에 넣고 염화나트륨 10g, 10% 염산 5㎖를 가하여 에테르 40, 30 및 30㎖씩으로 3회 추출한다. 에테르 추출액을 합하여 소량의 물로 씻고 에테르층을 분취한다. 여기에 무수황산나트륨을 넣고 잠시 방치한 다음 구테루나다니쉬 농축기에서 에테르를 유거한다. 잔류물에 내부표준물질이 1㎖중에 1.0㎎을 함유하도록 첨가하여 아세톤으로 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.

(가스크로마토그래피의 측정조건 예)

① 주입부온도 : 210～230℃

② 칼럼온도 : 140～200℃

③ 검출기 온도 : 230～ 250℃

④ 캐리어가스 및 유량 : 질소 60㎖/분

4) 시험방법

시험용액 및 해당하는 표준용액 각각 1～5㎕를 앞의 조건에 따라 가스크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크의 머무름시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고 또 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액중의 각 보존료의 함량을 정량한다.

(4) 프로피온산 및 그 염류

(가) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

1) 시약

가) 강산성 이온교환수지 : 100～200메쉬의 도웩스(Dowex) 50X8 또는 암버라이트 (Amberlite) CG120을 H형으로 하고 물로 씻는다.

나) 가스크로마토그래프 칼럼 충전제 : Ⓐ크로모솔브 W(80～100메쉬) 에 AT-1200을 8～10% 및 인산을 1% 입힌다. Ⓑ 크로모솔브101(80～100메쉬).

다) 내부표준물질용액 : 1% 트란스크로톤산 용액(사용시 조제)

라) 프로피온산표준용액 : 프로피온산 0.1g을 달아 내부표준물질용액 10㎖에 녹이고 물을 가하여 10㎖로 한다(사용시 조제).

프로피온산표준용액 1㎖=1.0㎎ C3H6O2

2) 장 치

가) 수소염이온화검출기 (FID)

나) 가스크로마토그래피용칼럼 : 길이 1～3m, 안지름 3～4㎜ 유리관 또는 스테인레스스틸관

다) 이온교환수지칼럼 : 유리관(10㎜×10～15㎝)에 높이 25～30㎜로 충전한다.

3) 시험용액의 조제

잘게 썰은 검사시료 30～50g(프로피온산으로서 100～200㎎)을 1ℓ 증류플라스크에 넣고 물 200㎖, 염화나트륨 80g, 10% 인산용액 10㎖ 및 실리콘수지 한 방울을 가한 다음 수증기 증류를 하여 유액 500㎖를 받는다. 이때 수지는 1% NaOH 20㎖를 가해 냉각기 끝이 잠기도록 한다. 유액 25㎖를 정확히 취하여 감압하에서 농축건조한 다음 잔류물을 물 1㎖로 녹여 이온교환수지칼럼의 상부에 넣고 유출액은 내부표준물질용액 1.0㎖를 넣은 10㎖ 메스플라스크에 받는다. 물 1㎖씩으로 잔류물을 녹여서 이 조작을 되풀이 하여 유출액의 전량을 10㎖로 하여 시험용액으로 한다.

(가스크로마토그래피의 측정조건의 예 )

① 주입부온도 : 200～240℃

② 칼럼온도 : 160～200℃(크로모솔브 101)

110～120℃(AT-1200)

③ 검출기온도 : 200～250℃

④ 케리어가스 및 유량 : 질소 30～60㎖/분

4) 시험방법

시험용액 1～5㎕를 가스크로마토그래프칼럼에 주입하고 얻어진 머무름시간(Retention time)과 프로피온산표준용액의 피크와 비교해서 정성을 하고 또 내부표준법에 따라 정량을 한다.

(5) 동시분석법(스크리닝검사법)

(가) 시약 및 용액

1) 아세토니트릴 : 고속액체크로마토그래피용

2) 에탄올․무수 : 시료전처리용

3) 인산 : 고속액체크로마토그래피용

4) 이동상 : 이동상 A : 1% 인산

이동상 B : 아세토니트릴

5) 표준용액 : 소르빈산, 안식향산은 25㎎, 데히드로초산, 파라옥시안식향산에스테르류는 50㎎을 물에 녹여 100㎖로 한다. 사용할 때는 이 액을 적당량 취하여 에탄올로 희석한다.

(나) 분석조건

1) 컬 럼 : Capcell pak C18, 250x4.6㎜, 5㎛ 또는 이와 동등한 컬럼을 사용한다.

2) 검출기 : 235㎚

3) 유 속 : 1.0㎖/min

4) 이동상(기울기용매조건)

시간(분)	이동상 A	이동상 B
0	90	10
5	80	20
12	70	30
20	50	50
22	50	50
23	90	10

(다) 시험용액의 조제

시료1g을 취하여 50㎖메스플라스크에 넣은 후 에탄올 40㎖을 가한다. 30분간 초음파로 처리한 후 에탄올로 용량을  맞추고, 50㎖ 원심분리관에 옮긴다. 이를 원심분리(3500rpm, 10분)한 후 상층액을 취하여 0.45㎛로 여과하여 시험용액으로 한다.

(라) 정량시험

1) 시험용액 및 표준용액을 각각20㎕을 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 각 보존료별 농도(㎕/㎖)를 구하고, 다음 식에 의거 검사시료 중 보존료 양을 구한다.

S × a

보존료의 양(㎍/g) =  ────────

검사시료채취량

S : 시험 용액중의 각 보존료의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 희석배수

2)  부적합 시는 개별 분석법에 따라 반드시 확인검사를  실시한다.

5. 산화방지제 시험법

가. 부틸히도록시아니졸(BHA), 디부틸히도록시톨루엔(BHT)

(1) 가스크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

(가) 시약

1) 내부표준물질용액 : 후루오렌 또는 벤조페논 50㎎을 디클로로메탄에 녹여 100㎖로 한다.

2) 표준용액 : BHA, BHT 각 50㎎을 디클로로메탄에 녹여 100㎖로 한다. 사용시 이 액 10㎖와 내부표준물질용액 10㎖를 취하여 디클로로메탄으로 50㎖로 한다.

3) 칼럼충전제 : 60～80메쉬의 규조토(크로모솔브 W, 가스크롬 Q등)에 OV17(5%)또는 SE-30(5～10%)을 각각 입힌다.

(나) 장치

1) 수소염이온화 검출기(FID)

2) 칼럼 : 길이 2m, 안지름 3～4㎜, 스텐인레스스틸관 또는 유리관

3) 구테루나다니쉬 농축기

(다) 시험용액의 조제

1) 버터 등

검사시료를 40℃에서 가온하여 녹이고 그 5g을 달아 펜탄 15㎖를 넣어 혼합한 다음 28% 암모니아수 5㎖를 넣고 10분간 진탕하여 펜탄층을 취한다. 물층은 펜탄 10㎖로 씻고 펜탄층을 합친다. 다음에 무수황산나트륨 5g을 가하여 10분간 방치한 다음 여과한다. 잔사를 펜탄 10㎖로 씻고 여액을 합친다. 여액을 펜탄포화아세토니트릴 100㎖로 3회 추출하여 추출액을 합치고 구테루나다니쉬 농축기로 농축한다. 130℃에서 15시간(또는 600℃에서 4시간, 800℃에서 2시간)활성화한 후로리실 5g을 칼럼관(10㎜ x 30cm)에 넣은 다음 아세토니트릴 약 20㎖를 유출시켜 씻는다. 이 칼럼에 앞의 농축액을 가하고 농축용 수기에 1분간에 2㎖의 유출속도로 칼럼상부에 용액이 소량 남을 정도까지 유출시키고 다음에 앞의 농축용기를 아세토니트릴 2㎖로 3회 씻어 칼럼에 넣고 다시 아세토니트릴 10㎖를 가하여 유출시킨다. 유출액을 감압 농축하고 1～2㎖로 한 다음 내부표준물질용액 1.0㎖ 및 디클로로메탄으로 전량을 5.0㎖로 하여 시험용액으로 한다.

<가스크로마토그래피 측정조건의 예>

- 주입부온도 : 200℃

- 칼럼온도 : 150～180℃

- 검출기온도 : 180～210℃

- 캐리어가스 및 유량 : N2 30～60㎖/min

(라) 시험방법

시험용액 및 표준용액에 대하여 4.발색제 및 보존료시험법 4)의 ④에 따라 시험한다.

나. 몰식자산프로필

(1) 정성시험

검사시료 약 30g을 비이커에 취해(필요시 약간 가온한다) 석유에테르 약 60㎖에 녹여 분액깔때기에 옮기고 물 15㎖를 가하여 1분간 진탕한 후 물층을 다른 분액깔대기에 취한다. 석유에테르층은 물 15㎖로 2회 같은 조작을 하고 물층을 합한 다음 물층에 에테르 15㎖를 가한다. 1분간 진탕하고 에테르층을 비이커에 취하여 증발 건조시킨 후 잔류물에 50% 알코올용액 4㎖를 가하여 잘 섞고 암모니아 수 1㎖을 가한다. 이때 적색을 띠면 몰식자산 프로필이 존재한다(변색이 불안정하므로 수분 후에 사라진다).

(2) 정량시험

(가) 시약

1) 석유에테르

증류범위 30～60℃의 석유에테르 1용량과 증류범위 60～100℃의 석유에테르 3용량을 잘 섞은 후 그 양의 1/10량 만큼의 황산을 가해 5분간 진탕한 후 방치하고, 산층은 버리고 석유에테르층을 취해 물로 여러번 씻어낸 후, 1% 암모니아수로 한번 씻은 다음 알카리층은 버리고 석유에테르층을 취해 물로 중성이 나타날때까지 씻어 증류 정제한다.

2) 초산암모늄용액

1.25, 1.67 및 10% 초산암모늄수용액을 만들고 필요시 5% 알코올용액으로 1.67% 초산암모늄용액도 만든다.

3) 주석산제1철용액

황산제1철 0.100g 및 주석산칼륨나트륨 0.500g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 만든 후 3 시간 안에 사용해야 한다.

4) 몰식자산프로필표준용액 : 50㎎의 몰식자산프로필을 물에 녹여 1ℓ로 한다(50㎍/㎖).

(나) 시험용액 조제

검사시료 약 40g을 정밀히 달아 석유에테르에 녹여 250㎖가 되게한 다음 그중 100㎖를 분액깔대기에 취하고 1.67% 초산암모늄용액 20㎖씩으로 3회 추출하여 물층은 100㎖ 메스플라스크에 합한다. 석유에테르층은 물 15㎖를 가하고 30초간 진탕한 후 물층을 다시 합하여 10% 초산암모늄용액 2.5㎖를 가하고 물로 100㎖가 되게 한 다음 여과하여 시험용액으로 한다(유화가 심한 검사시료는 추출전에 N-옥탄올 2㎖을 가하여 5% 알코올용액을 사용하여 만든 1.67% 초산암모늄용액으로 추출한다).

(다) 시험방법

시험용액은 20㎖이하, 대조액은 1.25% 초산암모늄용액 20㎖를 각각 25㎖메스플라스크에 취하여 주석산 제1철용액 1㎖를 가하고 물로 채워 잘 흔들어 섞은 후 3분안에 540㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선으로부터 몰식자산프로필양을 계산한다. 따로 몰식자산프로필 표준용액1, 2, 4, 6, 8㎖를 25㎖ 메스플라스크에 취해 물로 약 17.5㎖가 되도록 가하고 검사시료와 동일하게 처리하여 검량선을 작성한다.

다. 히드록시아니졸(BHA), 디부틸히드록시톨루엔(BHT), 터셔리부틸히드로퀴논(TBHQ) 및 몰식자산프로필(PG)

(1) 액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량

(가) 시약

1) 이동상 ; 물 : 아세토니트릴 : 초산(35 : 60 : 5)

2) 표준용액

BHA, TBHQ 각 50㎎과 PG 25㎎, BHT 100㎎을 이소프로판올 및 아세토니트릴혼액 (1 : 1)에 녹여 50㎖로 한다. 사용시 이액 10㎖를 취하여 위의 혼액으로 100㎖로 한다.

(나) 장치

1) 검출기 : 자외선검출기(UV), 280㎚

2) 칼럼 : μ-Bondapak C18 또는 Lichrosorb RP-18

3) 용매여과기

Solvent Clarification Kit나 그와 동등한 것.

(다) 시험용액의 조제

1) 버터 등

검사시료를 60℃에서 가온하여 녹인 후, 그 2.5g을 비이커에 달아 5㎖아세토니트릴포화헥산이 들어있는 125㎖ 분액깔대기로 옮기고, 아세토니트릴포화헥산 17.5㎖로 여러번 나누어서 비이커를 씻어 분액깔대기에 합친다. 여기에 헥산포화아세토니트릴 50㎖씩으로 3회 추출하고(만약 유탁형태가 일어나면 뜨거운 물에 분액깔대기를 5～10초 동안 담구어서 분리한다), 추출액을 250㎖ 둥근바닥플라스크에 모은다. 이액을 농축수기에 서서히 옮겨 40℃이하의 수욕에서 회전농축기를 사용하여 3～4㎖로 농축하여 눈금이 있는 용기에 옮기고 씻어 전량을 5㎖로 한 후, 이소프로판올 5㎖로 수기를 씻어 전량을 10㎖로 하여 시험용액으로 한다.

(라) 시험방법(액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

- 유속 : 1.0～1.5㎖/분

- 시험용액주입량 : 10～20㎕

- 감도 : 0.05AUFS

시험용액 및 표준용액 10～20㎕를 앞의 조건에 따라, 액체크로마토그래프칼럼에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 다음 식에 따라 검사시료중의 BHA, BHT, TBHQ 및 PG의 양을 산출한다.

PA     10

산화방지제(㎎/kg) = 각 표준용액의 농도(㎎/kg) × ── × ───

PS    SA[g]

PS : 표준용액의 높이 또는 면적

PA : 시험용액의 높이 또는 면적

6. 착색료 시험법

가. 타르색소(산성색소)

(1) 모사염색법에 의한 분리․정성법

(가) 시약

1) 탈지양모

가) 법 : 백색양모 100g을 강암모니아수 1～4㎖를 적당히 물로 희석한 용액 중에 담그고 가끔 저으면서 45℃에서 30～60분간 방치한 다음 건져내어 가볍게 짜고 다음에 희석한 암모니아수(1→100)에 잠시 방치하였다가 건져내어 처음에는 온탕, 다음에는 냉수로 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

나) 법 : 속시레추출기에서 석유 에테르로 백색양모를 충분히 탈지한 다음 에테르를 실온에서 증발시켜 물로 충분히 씻고 가볍게 짜서 바람에 말린다.

2) 실리카겔(5% 황산칼슘을 함유한 것) 또는 폴리아마이드

4.발색제 및 보존료시험법 나.보존료 (3)(가), 2)박층의 조제에 따라 만든다.

(나) 시험용액의 조제

1) 추출 : 다음의 한 방법에 따라 색소추출액을 만든다.

가) 액상검사시료

착색의 정도에 따라 검사시료 20～200㎖를 취하여 적당히 물을 가하여 시험용액으로 한다. 알코올을 함유한 것은 중화한 다음 수욕상에서 알코올을 증발시키고 물을 보충하여 색소추출액으로 한다.

나) 식육가공품(햄, 소시지 등)

검사시료를 착색의 정도에 따라 20～200g을 취하여, 검사시료를 큰 여과지나 비이커에 취하여 에테르로 몇번 씻어 탈지하고 에테르를 실온에서 날려 보낸 다음, 검사시료에 약 3～5배량의 온탕을 가하여 잘 저은 다음 잠시 두었다가 유리솜 또는 석면으로 여과하든가 원심분리하여 고형물을 제거하여 색소추출액으로한다. 이 방법으로 색소가 추출되지 않을 때에는, 검사시료에 80v/v% 에탄올을 약 4～5배량 가하여 가끔 흔들어 섞으면서 2～3시간 방치하고 상징액을 취하여 약 1% 암모니아수를 함유한 70 v/v% 에탄올로 되풀이하여 추출한다. 상징액은 앞의 상징액에 합치고 6% 초산으로 중화한 다음 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다. 검사시료가 아직 현저하게 착색되어 있을 때에는 1% 초산을 함유한 70v/v% 에탄올로 되풀이하여 추출하여 상징액을 취하여 10% 암모니아수로 중화하고 끓여 에탄올을 증발시키고 물을 가하여 색소추출액으로 한다.

2) 정제

색소추출액 5㎖에 1% 초산 1㎖를 가하고 탈지양모 0.1g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 수욕중에서 30분간 가온한 다음 양모를 건져내어 양모가 염색되지 않으면 불검출로 하고, 양모가 염색되면 이 염색양모를 1% 암모니아 용액 5㎖ 중에 넣고 30분간 가온한 다음 양모를 건져내고 초산으로 중화하고 약 1%의 농도로 조제하여 시험용액으로 한다.

(다) 시험방법

1) 여지크로마토그래피

크로마토그래피용 여과지의 끝에서 40㎜의 곳에 연필로 줄을 긋고 그 위에 시험용액과 색소표준용액을 각각 20㎜의 간격으로 미량 피펫 또는 모세관으로 직경 약 5㎜의 원이 되게 찍고 말린다. 이 여과지를 규정의 전개용매를 넣은 용기에 여과지가 기벽에 닿지 않도록 주의하여 수직으로 매달고 하단 약 10㎜를 전개용매중에 담구어 뚜껑을 닫아 방치한다. 용매가 반점에서 13～25㎝의 높이까지 상승하였을 때 여과지를 건져내어 말린 다음, 시험용액과 색소표준용액으로부터 전개된 반점의 위치와 색을 처음에 자연광, 다음에 자외선(약 365㎚)에서 비교 관찰한다.

<전개용매>

가) 아세톤 : 이소아밀알코올 : 물(6 : 5 : 5)

나) n-부탄올 : 무수에탄올 : 1% 암모니아수(6 : 2 : 3)

다) 25% 에탄올용액 : 5% 암모니아수(1 : 1)

2) 박층크로마토그래피

실리카겔 또는 폴리아마이드 박층의 하단에서 2㎝의 일직선상에 시험용액 및 색소표준용액을 직경 약 3㎜로 1㎝의 간격으로 찍고 말린다. 이를 박층의 하단 0.5～1㎝를 전개용매에 담그고 8～15㎝ 전개시킨다. 전개가 끝나면 시험용액과 색소표준용액에서 얻은 반점의 위치와 색을 자연광 및 자외선(약 365㎚)조사하에서 비교관찰한다.

<전개용매(실리카겔 박층)>

가) 초산에틸 : 메탄올 : 28% 암모니아수(4.5 : 1 : 1 또는 3 : 1 : 1)

나) 아밀알코올 : 에탄올 : 28% 암모니아수( 10 : 10 : 1)

다) 메틸에틸케톤 : 에틸렌글리콜모노메틸에테르 : 에탄올 : 28% 암모니아 (20 : 15 : 12 : 1)

<전개용매(폴리아미드 박층)>

가) 메탄올 : 에탄올 : 이소아밀알코올 :  28% 암모니아수(15 : 10 : 5 : 3)

나) 피리딘 : 메탄올 : 28% 암모니아수 : 물(5 : 6 : 1 : 16)

나. 유용성 색소(유용성 타르색소 포함)

(1) 시험용액의 조제

(가) 수분이 많은 검사시료

검사시료 5～20g(착색의 정도에 따라 채취량을 증감한다)에 약 5배량의 60v/v% 에탄올을 가하여 흔들어 섞으면서 30～60분간 방치하고 상징액은 분액깔때기에 취한다.

검사시료가 아직 착색이 되어 있을 때에는 점차적으로 에탄올의 농도를 높여 상징액이 착색되지 않을 때까지 앞의 조작을 되풀이 한다. 상징액은 앞의 상징액에 합치고 여기에 같은 양의 물 및 석유에테르 100㎖를 가하여 추출하고 잠시 방치한 다음 석유에테르층을 분취하여 시험용액으로 한다.

(나) 수분이 적은 검사시료

검사시료 5～10g(착색의 정도에 따라 채취량을 증감한다)을 200㎖의 공전플라스크에 취하고 석유에테르 100㎖를 가하여 때때로 흔들면서 방치한 다음 색소를 추출하고 이 액을 여과하여 시험용액으로 한다.

(2) 시험방법

(가) 용제에 의한 분리법

시험용액 30㎖를 분액깔때기에 취하고 같은 양의 N,N-디메틸포름아마이드를 가하여 추출한 다음 방치한다. 아래층의 N,N-디메틸포름아마이드용액을 분취하여 석유에테르 10㎖씩으로 3회 씻고 석유에테르를 버린다. 다음 물 30㎖를 가하여 혼합하고 잠시 방치하여 식힌 다음 클로로포름 10㎖를 가하여 흔들어 섞고 잠시 방치할 때, 클로르포름층이 황색으로 착색하면 유용성 색소의 존재가 추정되므로 다음의 (나)여지크로마토그래피에 의한 방법으로 시험한다.

(나) 여지크로마토그래피

(가)항에서 얻어진 클로로포름용액을 물로 씻은 다음 무수황산나트륨으로 탈수하고 저온에서 농축(약 0.1%의 농도)하여 시험용액으로 하고 크로마토그래피용 여과지(5%유동파라핀․석유에테르 중에 30분간 담근 다음 바람에 말린 것 400x60㎜)및 다음의 전개용매를 이용하여 이하 위의 가. 타르색소 (다)시험방법 1)여지크로마토그래피에 따라 시험한다.

<전개용매>

1) 메탄올 : 초산 : 물(16 : 1 : 3)

2) 아세톤 : 물(7 : 3)

(다) 박층크로마토그래피

(나)항의 시험용액으로 박층크로마토그래피용 실리카겔(100℃에서 60분간 가열하여 활성화시킨 것) 및 다음의 전개용매를 이용하여 가.타르색소 (다)시험방법 (나)박층크로마토그래피에 따라 시험한다.

<전개용매>

1) 키실렌

2) 1,1,2-트리클로로에탄

3) n-헥산 : 클로로포름(6 : 4)

4) 초산이소아밀 : n-헥산(15 : 100)

7. 유해성금속 시험법

가. 시험용액의 조제

(1) 황산-질산법

이 방법은 Zn, Cd, Cr, Sn, Cu, As 등의 시험에 적합하다. 검사시료(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)을 분해 플라스크에 취해 물 50～70㎖, 질산 10～40㎖를 넣고 혼합하여 방치한다. 다음에 조용히 가열하여 격렬한 반응이 그치면 식힌 다음 황산 5～20㎖를 넣고 다시 조용히 가열한다. 내용물이 암색이 되기 시작하면 질산 2～3㎖씩을 추가하면서 가열을 계속하여 내용물이 미황색～무색이 되었을 때 분해가 끝난 것으로 한다. 분해액을 식힌 후 물 30～50㎖, 포화수산암모늄용액 10～25㎖를 가해서 황산의 흰 연기가 발생할 때까지 가열하고 식힌 다음 물로 일정량으로하여 시험용액으로 한다. 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다.

(2) 황산-질산환류법

이 방법은 Hg의 시험에 적합하다.

검사시료(건조물로서 5～10g에 상당하는 양)를

분해플라스크에 취하고, 물 10㎖ 및 질산 20㎖를

넣어 혼합하여 잠시 방치한 다음 황산 20㎖를

천천히 넣는다. 환류냉각기를 연결하여 주의하면서

NO2의 발생이 끝날때까지 가열한다. 분해액이

담황색으로 투명하게 되지 않을 때에는 식힌 다음

질산 5㎖를 넣어 다시 가열한다. 필요하면 질산

5㎖의 추가를 되풀이 하여 분해액이 담황색으로

투명하게 되고 NO2의 발생이 끝나면 식힌 다음

물 50㎖ 및 10% 요소용액 10㎖를 넣어서 10분간

끓이고 식혀 과망간산칼륨 1g을 넣고 10분간

때때로 흔들어 섞는다. 자홍색이 없어지면 다시      수은분해장치의 예

과망간산칼륨 1g을 넣고 흔들어 섞는다.

이 조작을 자홍색이 남을 때까지 되풀이 하고 20분간 끓여 액의 자홍색이 없어지면 식힌 다음 과망간산칼륨 1g을 넣고 다시 20분간 가열한다.

이때 액의 자홍색이 없어지면 과망간산칼륨의 첨가 및 가열조작을 다시 2회 되풀이 하고 식혀 용액이 무색 투명하게 될 때까지 10% 과산화수소용액을 주의하여 적가한다. 다만, 비색의 경우에는 과산화수소 대신 20% 염산히드록실아민용액을 이용한다. 식힌 다음 장치의 내부 및 연결부분을 황산(1→100) 20㎖로 씻고 플라스크에 합쳐 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 지방분이 많은 검사시료는 헥산 20㎖씩으로 3회 추출하여 수용액을 시험용액으로 한다.

(3) 건식회화법

검사시료(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450～550℃에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산(1+1) 또는 50% 질산마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40g 및 질산칼륨 20g을 물 100㎖에 녹인 액 2～5㎖로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2～5㎖를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2～4㎖를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 다음 염산 1～2㎖ 또는 각 시험법에서 지정한 용매(원자흡광광도법에 의한 직접법의 경우 Sn은 1N 염산, 그밖의 금속은 0.5N 질산)를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 다만, 회화보조제로서 염산, 산화마그네슘, 탄산나트륨 등을 사용해도 좋으나 Sn의 시험에 있어서는 질산염 또는 질산을 사용해서는 아니되며 그밖의 금속의 경우에도 시험방법에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다.

(4) 초고압초음파법

고체축산물은 잘게 세절하고 액체축산물은 적절한 방법을 이용하여 충분히 균질화한다. 초고압초음파분해용기에 적량(0.5-1g)의 시료를 채취한 다음 질산용액(20%, v/v) 일정량 (10ml)을 가한다. 시료의 형태와 물성을 고려하여 선정된 분해조건(별표)에 따라 초고압초음파분해장치를 이용하여 분해한다. 분해가 완료되면 분해용기를 완전히 냉각시키고 충분히 흔들어 분해액을 균질화시킨 다음 여과하여 검액으로 한다.

별표 1. 고체축산물의 초고압초음파 분해조건

Instrument condition	Digestion stage
	Stage Ⅰ	Stage Ⅱ
Running time(min)	30	30
Magnetic power(W)	900	900
Initial pressure(PSI)	0	250
Finish pressure(PSI)	250	400
Initial temperature(℃)	22	170
Finish temperature(℃)	170	180

별표 2. 액체축산물의 초고압초음파 분해조건

Instrument condition	Digestion stage
	Stage Ⅰ	Stage Ⅱ
Running time(min)	10	10
Magnetic power(W)	700	700
Initial pressure(PSI)	0	150
Finish pressure(PSI)	150	300
Initial temperature(℃)	22	165
Finish temperature(℃)	150	170

나. 측정

(1) 원자흡광광도법

이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자증기화하여 생성한 기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정 등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 검사시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염방식이 있다.

(가) 직접법

이 방법에는 화염원자흡광법은 Zn, Cd, Cu, Pb, Mn, Ni, Co, Sn, Fe 등을, 무염원자흡광법은 이들 9원소와 Sb, Cr, Se, Bi, As, V 및 Be 등의 측정에 쓰인다.

1) 시험방법

시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다음 원자흡광광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

(나) 용매추출법

이 방법은 Zn, Cd, Cu, Pb, Mn, Ni 및 Fe등의 측정에 쓰인다.

1) 시험방법

시험용액 및 공시험용액을 각각 10～50㎖ 취하여 각각에 25% 구연산암모늄용액 2～10㎖ 및 BTB시액 2방울을 가하여 액의 색이 황색에서 연한녹색이 될 때까지 암모니아수로 중화하고 이에 40% 황산암모늄시액 2～10㎖ 및 물을 가하여 일정량으로 한다.

여기에 10% DDTC용액 2～10㎖를 넣고 혼합하여 수분간 방치한 다음 MIBK 10～20㎖를 가하여 격렬히 흔들어 섞는다.

이를 정치하여 MIBK층을 분취하여 원자흡광광도계에 주입하여 각각의 원소측정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 따로 표준용액 및 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하고 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다.

(2) ICP법

이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 프라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다.

(가) 직접법

이 방법은 Pb, Cd, Cu, Zn, Mn, Ni, Co, Sn, Fe, As, Sb, Cr, Se, Bi, V, Be등의 대부분의 금속의 측정에 쓰인다.

1) 시험방법

표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다.

다. 금속별 시험

(1) 비소

(가) 굿짜이트(Gutzeit)법

1) 시약

가) 염화제1주석용액

염화제1주석(SnCl2․2H2O) 4g을 염산 125㎖에 녹이고 물을 가해서 250㎖로하여 공전병에 보존한다. 만든 후 1개월 이내에 사용한다.

나) 아연(무비소) : 약 20～30메쉬(600～850㎛)

다) 요오드화칼륨용액 : 요오드화칼륨 16.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 차광하여 보존한다.

라) 초산납유리솜 : 유리솜을 약 2～5㎜로 잘라 이를 초산 한방울을 가한 물에 초산납 9.5g을 녹여 100㎖로 한 용액에 담근 다음 꺼내어 과량의 액을 제거하고 건조한다.

마) 브롬수은지

크로마토그래피용 여과지를 지름 약 18㎜의 원형으로 끊어 이를 브롬제2수은(HgBr2) 5g을 에탄올(95v/v%) 100㎖에 녹인 액에 담그어 때때로 흔들어 주면서 1시간 이상 어두운 곳에 둔 다음 여과지 위에 수평으로 얹어 자연 건조시켜 마개달린 갈색병에 보존한다. 정색하는 부분에 손을 대어서는 아니된다.

바) 아비산표준용액

아비산(최순품)을 미세한 분말로 하여 105℃에서 4시간 건조한 다음 0.10g을 정확하게 달아 수산화나트륨용액(1→5) 5㎖에 녹인다. 이 액을 황산(1→20)으로 중화하고 다시 황산(1→20)10㎖를 추가한 다음, 새로 끓여서 식힌 물을 넣어 1,000㎖로 하여 표준원액으로 한다.

이 표준원액 10㎖에 황산(1→20)10㎖를 넣고 새로 끓여서 식힌 물을 넣어 1,000㎖로 한다(쓸 때 만들어 마개달린 병에 보존한다).

아비산표준용액 1㎖=1.0㎍ As2O3

2) 장치

다음 그림과 같다(단위 : ㎜).

A : 발색병 : 용량 약 60㎖로서 40㎖에 표선이 있다.

B : 안지름 약 6.5㎜의 유리관

C 및 D : 접속부가 안지름 6.5㎜, 바깥지름

약 18㎜로서 갈아 맞춘 것이며

유리관의 접속부에서 내연과 외연이

동심원으로 된 것.

E : 고무마개

F : 유리관 B의 오목한 부분으로서 이에 유리솜을 채운다.

G : 고무관

H : 크립

유리관(B)에는 유리솜을 F으로부터 약 30㎜ 높이까지 채우고 초산납시액 및 물을 같은양의 혼액으로 고르게 적시고 관의 하단으로부터 조용히 흡인하여 유리솜 및 기벽에서 과량의 액을 제거한다. 사용 직전에 C관 및 D관의 접속부에 브롬 제2수은지를 끼우고 크립 H로 고정한다.

3) 시험방법

시험용액 25㎖이하(As2O3로서 0.2～2.0㎍)를 발색병에 넣고 브롬페놀블루시액 1 방울을 가하여 암모니아수로 중화한 다음 염산(1→2) 5㎖, 요오드화칼륨용액 5㎖ 및 염화제일주석용액 5㎖를 각각 넣고 10분간 방치한 다음 물을 가하여 40㎖로 한다. 이에 아연 2g을 넣고 즉시 장치를 연결하여 25℃의 물에 발색병(A)을 약 3/4까지 담그어 1시간 방치한 다음 정색한 브롬수은지를 따로 아비산표준용액 0.0, 0.2, 0.5 및 1.0㎖씩을 취해 시험용액과 같은 양의 공시험용액을 넣은 다음 시험용액과 동일하게 조작한 것과 색을 비교하여 비소(As2O3)의 함량을 구한다.

(나) 디에틸디티오카아바민산은(Silver diethyl dithiocarbamate)법

1) 시약

가) 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액

디에틸디티오카아바민산은 1g을 피리딘(특급) 200㎖에 녹인다. 차광해서 냉암소에 보존한다.

나) 아연(무비소) : 20～30메쉬의 아연을 1% 황산동 용액에 검게 될 때까지 담근 다음 물로 씻어 건조한다.

다) 염화제일주석용액, 아비산표준용액, 요오드화칼륨용액 및 초산납유리 솜은 (가)굿짜이트법의 시약과 같다.

2) 장치

다음 그림과 같다(단위 : ㎜)

A : 발색플라스크(내용량 100～125㎖)

B : 흡수관(초산납유리솜)

C : 가스유도관(내경 2, 배출구 0.5)

D : 흡수수기

3) 시험방법

시험용액 25㎖이하(As2O3로서 2～10㎍)를 발색플라스크에 취하고 브롬페놀블루시액 1방울을 가하여 암모니아수로 중화한 다음 물을 가하여 25㎖로 한다. 이에 염산(1+1) 5㎖, 요오드화칼륨용액 2㎖ 및 염화제일주석용액 5㎖를 넣고 실온에서 15분간 방치한다. 흡수수기에 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액 3㎖를 넣는다.

발색플라스크에 아연 3g을 넣고 즉시 흡수관 및 가스유도관을 연결하고 가스유도관의 끝의 흡수수기의 밑부분에 오게해서 기포가 작고 연속적으로 나오도록 조절한다.

다음에 20～25℃에서 1시간 방치한 다음 장치를 풀고 가스유도관의 내벽에 부착한 액을 흡수수기내의 액과 잘 섞는다. 이 흡수액을 1㎝의 흡수 Cell에 취해 30분 이내에 디에틸디티오카아바민산은 피리딘용액을 대조액으로 하여 파장 525㎚ 부근에서 흡광도를 측정한다. 따로 아비산표준용액을 0.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 10.0㎖를 취하여 이에 시험용액과 같은 양의 공시험액을 가해서 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 비소(As2O3)의 함량을 구한다.

(다) ICP법

위의 나.측정 (2)ICP법에 따라 시험한다.

(2) 납

(가) 디티존에 의한 정량법

1) 시약

가) 디티존클로로포름용액

디티존 0.03g을 달아 클로로포름 100㎖에 흔들어 섞어서 녹이고 암모니아수(1→100) 100㎖를 가하여 잘 흔들어 섞고 물층을 분리해서 취한다. 다시 클로로포름층을 암모니아수(1→100) 100㎖씩을 2회 같은 조작을 하고 물층을 합하여 클로로포름 20㎖씩으로 3회 씻는다.

물층에 염산(1→2)을 가하여 산성으로 한 다음 클로로포름 200㎖씩으로 2회 추출한다. 클로로포름추출액을 합쳐서 클로로포름으로 전량을 약 1,000㎖로 하여 원액으로 한다. 차광해서 냉암소에 보존한다.

나) 디티존․벤젠용액

디티존 약 1g을 클로로포름 100㎖에 녹이고 불용물이 있으면 여과한다. 이 여액을 암모니아수(1→100) 100㎖씩으로 4회 추출하여 물층을 합하여 탈지면으로 여과한다.

이 여액에 염산(1→2)을 가하여 산성으로 한 다음 침전물을 클로로포름 20㎖씩으로 2회 추출한다. 클로로포름추출액을 합하여 소량의 물로 2～3회 씻고 비이커에 취하여 수욕상에서 용매를 완전히 증발하기 직전까지 유지시킨 다음 50℃이하의 감압에서 1시간 건조한다. 건조물은 차광 마개를 하여 보존한다. 사용 시 벤젠 1,000㎖에 디티존이 20㎎ 함유되도록 조제한다.

다) 구연산암모늄용액

구연산암모늄 45g을 물 100㎖에 녹이고 암모니아수를 가하여 pH 8～9로 한다. 이 액을 디티존클로로포름용액 20㎖씩으로 디티존용액이 고유의 녹색을 가질 때까지 추출한 다음 물층을 클로로포름 50㎖씩으로 2회 추출하여 물층을 분리하여 취한다.

라) 아황산나트륨용액

아황산나트륨(무수)15g에 물을 가하여 100㎖로 한다(사용시 조제). 이 용액을 디티존클로로포름용액으로 앞항 다)항에 따라 처리한다.

마) 시안화칼륨용액

시안화칼륨 50g에 물을 가하여 100㎖로 한다. 이 액을 디티존클로로포름용액으로 앞항 다)항에 따라 처리한다. 다만, 용액중에 잔존하는 디티존을 제거하기 위해 클로로포름으로 10～20회 조작을 되풀이하고 수용액에 물을 가하여 5배 용량으로 한다.

바) 묽은 시안화칼륨용액

시안화칼륨용액 10㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다. 사용시 조제한다.

사) 납표준용액

질산납 0.1598g을 질산(2.5→100)에 녹여 100㎖로 해서 보존액으로 한다. 사용시 질산(1→100)으로 100배 또는 1,000배로 희석하여 표준용액으로 한다.

납표준용액 1㎖=10㎍ 또는 1㎍ Pb

2) 시험방법

시험용액 및 공시험용액 각 일정량을 취하여 구연산암모늄용액 2㎖ 및 메틸레드시액 2방울을 가하여 액이 황색이 될 때까지 암모니아수를 가하고 물을 가하여 전량을 약 100㎖로 한다. 이에 시안화칼륨용액 10㎖ 및 아황산나트륨용액 10㎖를 가하여 혼합하고 수욕상에서 10～15분간 가열한다. 식힌 다음 암모니아수 1.5㎖를 넣고 분액 깔대기에 옮겨 디티존․벤젠용액 10㎖를 정확히 가하여 1분간 강하게 흔들어서 분리한 물층을 제거한다. 다시 묽은 시안화칼륨용액 40㎖를 넣고 30초간 강하게 흔든 다음 물층을 버리고 벤젠층을 건조여과지로 여과한다. 벤젠층을 525㎚ 부근의 최대흡수 파장에서 흡광도 A 및 Ab를 측정한다.

동시에 납표준용액 10㎖(Pb 10㎕) 및 물 10㎖에 대해서 같은 조작을 하고 벤젠을 대조액으로 하여 흡광도 As 및 Ao을 측정한다.

A-Ab     시험용액전량(㎖)                 1

납(㎎/㎏)=10×──── × ─────────  ×  ───────────

As-Ao     검사시료의 양(g)      시험용액의 일정량(㎖)

(나) 원자흡광광도법에 의한 정량

시험용액 및 공시험용액 각 일정량에 대하여 위의 나.측정 (1)원자흡광광도법에 따라 시험한다. 측정파장은 283.3㎚이다.

(다) ICP법에 의한 정량

위의 나.측정 (2)ICP법에 따라 시험한다.

(3) 주석

(가) SATP법

1) 시약

가) SATP용액 : 아스코르빈산 1g을 소량의 물에 녹여 에탄올을 넣고 100㎖로 한다. 이 용액에 살리실리덴아미노 -2-티오페놀(Salicylidenamino-2-thiophenol) 0.1g을 가열하여 녹인다(쓸 때 만든다).

나) 디니트로페놀용액 : 2, 4-디니트로페놀용액(2, 4-Dinitrophenol) 0.25g을 50v/v% 에탄올 100㎖에 녹인다.

다) 젖산용액 : 젖산(특급) 20㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다.

라) 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 1g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

마) 티오황산나트륨액 : 티오황산나트륨 1g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

바) 주석표준용액 : 금속 Sn 0.500g에 염산 30㎖를 가하여 수욕상에서 가열하여 녹인다. 식힌 다음 30% 과산화수소 1㎖를 넣고 1N 염산으로 500㎖로 한다. 이액 1㎖를 1N 염산에 넣어 100㎖로 한다.

주석표준용액 1㎖=10㎍ Sn

2) 시험방법

시험용액 1.0～2.0㎖를 마개달린 시험관에 취하고 1N 염산을 넣어 10㎖로 한다. 이에 디니트로페놀용액 2방울을 가하여 10% 수산화나트륨용액으로 중화한 다음 물을 가하여 20㎖로 하고 20%(v/v) 젖산용액 2㎖를 넣는다. 다음에 1% 티오황산나트륨용액 1㎖, SATP용액 5㎖를 가하여 잘 섞고 20분간 정치한 다음 키실렌 10㎖를 가하여 격렬하게 흔들어 추출한다. 키실렌층을 취하여 공시험용액을 대조로 해서 파장 415㎚ 부근의 흡광도를 측정한다. 따로 주석표준용액 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0㎖를 공전시험관에 취하고 1N 염산을 넣어 10㎖로 해서 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 주석의 양을 구한다.

(가) ICP법

위의 나.측정 (2)ICP법에 따라 시험한다.

(4) 동

(가) 디에틸디티오카아바민산에 의한 정량법

1) 시약

가) 카아바메이트용액

디에틸디티오카아바민산나트륨(Sodium diethyl dithiocarbamate) 1g을 물에 녹여 100㎖로 하여 여과한다.

나) 구연산․EDTA용액

구연산 제2암모늄 20g 및 에틸렌디아민 4초산 2나트륨(Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt) 5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 동의 흔적을 제거하기 위해 카아바메이트용액 0.1㎖를 가하고 사염화탄소 10㎖로 추출한다. 이 추출을 사염화탄소층이 무색이 될 때까지 되풀이 한다.

다) 티몰블루시액

티몰블루 0.1g을 물에 녹이고 청색이 될 때까지 0.1N 수산화나트륨액을 가한 다음 물을 가하여 100㎖로 희석한다.

라) 동표준용액

금속 동(표준품) 0.200g을 삼각플라스크에 취하여 질산(1→5)15㎖를 넣고 플라스크를 시계접시로 덮고 약간 가온하여 녹인다. 발연이 없을 때까지 끓인 다음 200㎖로 한다. 이 용액 10.0㎖에 물을 가하여 100㎖로 하고 그 5.0㎖를 취하여 2N 황산을 가해서 200㎖로 한다.

동표준용액 1㎖=2㎍ Cu

2) 시험방법

시험용액 25㎖를 분액깔대기에 취하고 구연산․EDTA용액 10㎖ 및 티몰블루시액 2방울을 넣은 다음 녹색 또는 청녹색이 될 때까지 6N 암모니아수를 적가한다. 식힌 다음 카아바메이트용액 1㎖ 및 사염화탄소 15㎖를 넣고 2분간 격렬하게 추출하여 사염화탄소층을 탈지면으로 여과하고 여액을 파장 400㎚에서 흡광도를 측정한다. 따로 작성한 검량선으로부터 동(Cu)의 함량을 구한다. 검량선은 표준용액 0.0, 1.0, 2.5, 10, 15, 20 및 25㎖를 각각 분액깔대기에 취하고 2N 황산으로 25㎖로 하여 이하 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 흡광도를 측정하여 만든다.

(나) 원자흡광광도법에 의한 정량

위의 나.측정 (1)원자흡광광도법에 따라 시험한다. 다만, 측정파장은 324.7㎚이다.

(다) ICP법에 의한 정량

위의 나.측정 (2)ICP법에 따라 시험한다.

(5) 수은

(가) 디티존법

1) 시약

가) 물 : 이온교환수지관을 통과한 정제수로 한다.

나) 황산․질산용액(1+1) : 질산에 같은 양의 황산을 가하여 혼합한다.

다) 클로로포름

클로로포름을 1/20용량의 진한 황산과 흔들어 섞어 황산층이 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이 한다. 다음에 1/5용량의 10% 수산화나트륨 용액으로 2회 씻고 다시 물로 씻은 다음 소량의 산화칼슘(CaO)을 가해서 증류한다. 이에 약 1/5용량의 0.5% 염산히이드록실아민용액을 넣고 흔들어 섞은 다음 클로로포름층을 취하여 1/100 용량의 에탄올을 가해서 냉암소에 보존한다.

라) 디티존․클로로포름용액

디티존을 클로로포름에 녹여 디티존 100㎎/ℓ의 용액을 만들어 갈색병에 넣어 보존한다. 사용시 클로로포름으로 희석하여 Hg2+ 0～10㎍의 정량에 대하여 디티존 5～6㎎/ℓ의 용액을 만든다.

마) 수은표준용액

염화제2수은 0.6767g을 달아 물 100～200㎖ 및 염산 5㎖를 가하여 녹이고 물로 500㎖로 한다. 사용시 이를 물로 500배로 희석한다.

수은표준용액 1㎖=2㎍ Hg2+

바) 1.5% 티오황산나트륨용액 : 사용시 만든다.

사) 과염소산나트륨용액 : 유효염소 5%

2) 시험방법

시험용액 및 공시험용액을 500㎖의 분액깔때기에 취하고 디티존․클로로포름용액(5～6㎎/ℓ)10㎖를 넣어 1분간 추출한다. 클로로포름층을 분취하여 0.1N 염산 50㎖와 20% 염산히드록실아민용액 5㎖를 넣은 제2의 100㎖ 분액깔때기에 옮긴다. 다시 제1의 분액깔때기에 디티존․클로로포름용액 5㎖씩을 넣어 추출을 2회 되풀이하고 클로로포름층을 제2의 분액깔때기에 넣는다. 제2의 분액깔때기를 1분간 추출하여 클로로포름층을 0.1N 염산 50㎖를 넣은 제3의 100㎖ 분액깔때기에 옮긴다. 제2의 분액깔때기중의 용액을 클로로포름 1～2㎖로 씻고 씻은 액은 제3의 분액깔때기에 넣는다. 다음 제3의 분액깔때기에 티오황산나트륨용액 2㎖를 가해서 1분간 추출한 다음 클로로포름층을 버린다. 다시 클로로포름 1～2㎖로 물층을 씻고 클로로포름층을 제거한다.

물층에 과염소산나트륨용액 3㎖를 가해서 1분간 잘 흔들어 섞고 이에 20% 염산히이드록실아민용액 5㎖를 분액깔때기의 입구 부분을 주의하여 씻으면서 흘려 내리고 1분간 잘 흔들어 섞는다. 분액깔때기 안에 가스상태로 남아 있는 Cl2를 송풍기(Blower)로 바람을 보내어 제거하고 30% 초산 3㎖ 및 클로로포름 2～3㎖를 가해서 1분간 흔들어 섞은 다음 클로로포름층을 제거한다. 이에 디티존․클로로포름용액(5～6㎎/ℓ) 10.0㎖를 가하여 1분간 잘 흔들어 섞고 분액깔때기의 스톱코크(Stopcock) 및 그 밑부분의 내부의 수분을 둥굴게 한 작은 여지로 제거하고 탈지면을 분액깔때기의 밑부분에 끼워 넣어 디티존추출액을 모은 다음 파장 490㎚에서 클로로포름을 대조액으로 하여 흡광도를 측정한다. 따로 작성한 검량선으로부터 수은(Hg)의 함량을 구한다.

다만, 수은의 양이 10㎍이상의 경우에는 제3의 분액깔때기의 내용액에서 검량선 범위에 들어가는 양을 취해 비색한다. 검량선 100㎖의 분액깔때기에 0.1N 염산 50㎖, 20% 염산히드록실아민용액 5㎖ 및 30% 초산용액 3㎖와 수은표준용액 각각 0, 1, 2, 3, 4, 및 5㎖를 넣고 이에 클로로포름 2～3㎖씩을 가하여 1분간 잘 흔들어 섞고 클로로포름층을 가능한 한 완전히 제거한다. 이에 디티존․클로로포름용액(5～6㎎/ℓ) 10㎖를 가하여 1분간 추출하고 이를 시험용액의 경우와 동일하게 조작해서 흡광도를 측정한다.

(나) 원자흡광광도법에 의한 정량

1) 환원기화법

가) 시약

① 염화제일주석용액 : 염화제일주석 10g에 0.5N 황산을 가하여 녹여 1,000㎖로 한다.

② 수은표준용액

염화제이수은 0.135g을 10% 질산 100㎖에 녹이고 물을 가하여 1,000㎖로 한다. 사용시 이 용액을 1% 질산으로 1,000배 희석하여 표준용액으로 한다.

나) 시험방법

시험용액 및 공시험용액을 20%(v/v) 황산농도로 조절하여 각 100㎖를 시험용액병에 취하여 환원기화장치에 연결한 다음 염화제일주석용액 10㎖를 가하여 즉시 마개를 막고 다이아프램펌프(diaphram pump)에 의해 공기를 흡수셀 중에 순환시켜 파장 253.7㎚에서 흡광도를 측정한다. 수은표준용액 0, 5, 10, 15, 20㎖에 물을 가해서 100㎖로 하여 시험용액과 같은 조작을 한 다음 각각의 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 수은(Hg)의 함량을 구한다.

2) 금아말감법

가) 시약

① 수은표준원액 : 염화제이수은 135.4㎎을 0.001% L-시스테인 용액에 녹여 1.000㎖로 한다.(어두운 곳에서 1～2개월간 보존) 1㎖=100㎍ Hg

② 수은표준용액 : 수은표준용액을 0.001% L-시스테인 용액으로 희석하여 0～20㎍/㎖로 한다.(쓸 때에 만든다)

③ 첨가제 : (a) 산화알루미늄 (b) 수산화칼슘+탄산나트륨(1:1 혼합물)을 쓸때에 950℃에서 30분간 활성화시킨다.

나) 장치

시료의 연소에서 금아말감에 의한 포집, 냉원자흡광법에 의한 측정까지를 자동화한 수은 측정장치를 쓴다.

다) 시험방법

첨가제 (a) 약 1g을 도가니에 고르게 펴고 고체 검사시료는 그 위에 세절 또는 균질화한 시료를 10～300㎎, 액체검사시료는 0.1～0.5㎖를 첨가제 (a)에 완전히 스며들게 하고, 그 위에 첨가제 (a) 약 0.5g, (b) 약 1g을 차례로 고르게 펴 층을 이루게 한다.

도가니를 연소부에 넣고 공기 또는 산소를 0.521ℓ/min를 통과하면서 약 900℃로 가열하여 수은을 유지시켜 포집관에 수은을 포집한다.

포집관을 약 700℃로 가열하여 수은증기를 냉원자흡광분석장치에 보내고, 흡광도를 측정하여 A로 한다. 따로 도가니에 첨가제만을 취해 같은 조작을 되풀이하여 흡광도를 측정하여 Ab로 한다.

다음 수은표준용액을 써서 같은 조작을 되풀이하여 얻어진 홉광도에서 검량선을 작성하여 A-Ab 값을 검량선으로부터 검사시료 중의 수은량을 산출한다.

(다) ICP법에 의한 정량

위의 나.측정 (2)ICP법에 따라 시험한다.

라. 중금속

(1) 시약

(가) 납표준용액 : 위의 다.금속별시험 (2)납 중의 납표준용액과 같다.

(2) 시험

시험용액 5～20㎖를 비색관에 취하고 따로 비색관에 납표준용액 1, 2, 3,…10㎖를 가한 다음 각각 암모니아수로 중화하고 염화암모늄 1g, 10% 초산용액 3㎖ 및 황화나트륨시액 1～2방울을 각각 가한 다음 물을 가하여 50㎖로 하여 비색하여 중금속의 함량을 구한다.

8. 이물시험법

가. 일반시험

(1) 체분별법

검사시료가 미세한 분말일 때 비교적 큰 이물을 체로 포집하여 육안으로 검사한다. 필요에 따라 이물의 종류를 확인하고자 할 때는 현미경으로 약 40배 정도의 저배율로 보고 국제적으로 인정될 수 있는 동정방법을 적용할 수 있다. 이하 이물시험에 있어서는 모두 이와 같다.

(2) 여과법

검사시료가 액체일 때 또는 용액으로 할 수 있을 때 그 용액을 신속여과지로 여과하여 여과지상의 이물을 검사한다.

(3) 와일드만 라스크법

곤충 및 동물의 털과 같이 물에 잘 젖지 아니하는

가벼운 이물은 물과 혼합되지 않은 용매와 저어

섞음으로서 유기용매층에 떠오르게 하여 취할

수 있다. 와일드만플라스크 중에 검사시료를 물

및 기타 지정액(1ℓ의 플라스크에서는 600㎖,

2ℓ에서는 900㎖)과 섞어 다시 휘발유(무색 투명

하고 납을 함유하지 아니하는 것), 피마자유 등

물과 섞이지 않는 포집액을 넣어 플라스크를

약 45°기울여 교반봉으로 1분에 약 200～250회

저어 섞는다(이때 공기의 기포가 들어가지 않도록 주의한다). 그 후 20분간은 수분마다 저어 섞고 약 30분간 방치한 다음 두 액층의 경계가 그림에서와 같은 위치에 올 때까지 물 또는 지정액을 조용히 부어 넣고 고무마개로 플라스크의 기벽을 긁어 부착해있는 기름 방울을 부상시켜 더욱 손잡이를 급속도로 회전시켜 고무마개에 부착된 검사시료와 기름을 털어내고 마개를 끌어 올려 플라스크의 목에 밀착시키고 이물을 포함한 기름층을 소량의 하층액과 함께 비이커에 기울여 취하고 알코올 및 물로 막대기, 고무마개 및 플라스크 내벽을 씻어 그 씻은 액을 비이커에 합쳐 그 액을 흡인 여과하여 여과지상에 이물이 있는가를 검사한다.

현미경으로 검사하고자 할 때는 글리세린․알코올혼액(1:1) 약 5㎖를 담은  페트리접시에 여과지를 옮겨 잘 적신 후 검사한다. 다시 와일드만플라스크에 포집액 10～20㎖를 넣어 잘 저어 섞고 때때로 하층액을 저으면서 약 10～20분간 방치한 다음 먼저와 같이 조작하여 이물을 검사한다. 기울여 따라 포집한 액이 다량의 식품조직을 함유할 때 또는 여과지에 식물조직이 다량 부착되어 현미경 검사가 어려울 때는 다시 새로운 와일드만플라스크에 옮겨 물로 잘 혼합시켜 먼저와 같이 포집하고 식물조직을 하층액에 옮겨 포집액을 여별한다. 다만, 이 조작은 이물의 손실을 초래할 염려가 있으므로 처음의 포집조작에서 가급적 검사시료가 떠오르지 않게 하는 것이 중요하다.

하층액으로서 포화식염수 또는 수성알코올을 사용하면 식물 조직의 떠오름을 어느정도 방지할 수 있다.

(4) 침강법

쥐똥, 토사 등의 비교적 무거운 이물의 검사는 검사시료에 클로로포름(또는 4염화탄소, 에테르 또는 메탄올 등을 가하여 그 비중을 1.49로 한 것)을 가하여 저어 섞으면 이물은 용기의 밑에 가라앉는다.

바닥의 이물이 떠오르지 않게 조심하여 상층액을 기울여 버리고 바닥에는 클로로포름 소량과 이물만 남게하고 이를 흡인 여과하여 여과지상에 이물이 있는가를 검사한다. 현미경검사를 하고자 할 때는 글리세린․알코올 혼액(1:1)을 넣은 페트리접시에 여과지를 옮겨 잘 적신 후 검사한다.

나. 품목별 이물시험

(1) 우유, 살균산양유, 탈지유, 가공유, 발효유 등.

(가) 검병법

검사시료가 투명한 것은 광원(태양광선 또는 전등)을 향하여 백색 또는 흑색지를 배경으로 하여 병을 조용히 거꾸로 하여 투시한다. 이물이 있으면 상징액을 이물이 흘러나가지 않게 기울여 버리고 잔사를 잘 섞어서 흡인 여과하거나 원심침전하여 여과지상의 잔류물 또는 원심침전한 경우는 병밑의 침전물을 모세관피펫으로 빨아올려 이물의 종류를 확인한다. 또한 투명한 것일지라도 색이 진한 것이나 점조성으로 인하여 위의 방법으로 침전물의 검사가 되지 않는 것은 다음의 (나)희석법에 따른다.

(나) 희석법

침전물이 있는 것 및 혼탁된 것은 검사시료를 대형비이커에 옮기고 물을 가하여 적당히 희석하고 조용히 저으면서 광원을 향해 이물의 유무를 검사한다. 이물이 있을 때는 다음 (다)분리법의 1) 또는 2)의 방법에 의하여 분리한다.

(다) 분리법

1) 클로로포름에 의한 분리(주로 광물성 이물)

병속에 검사시료 전부를 원심침전하여 상징액을 기울여 버리고 침전을 비이커에 옮겨 건조하고 클로로포름을 가하여 잘 섞는다. 다음에 30분간 때때로 침전을 유리봉으로 조용히 저어 정치한 후 상층 및 클로로포름층을 기울여 버리고 비이커에 남은 이물을 다시 클로로포름으로 수회 씻고 클로로포름으로 브후나깔때기 혹은 힐슈깔때기로 흡인 여과하여 여과지상의 이물을 검사한다.

2) 염산분해에 의한 분리(주로 동․식물성 이물)

검사시료 전부를 원심침전하고 상징액을 기울여 버리고 침전을 삼각플라스크에 옮겨 1% 염산용액 약 200～300㎖를 가하여 약 1시간 끓인다. 식힌 후 브후나깔때기 혹은 힐슈깔때기로 흡인여과하여 여과지상의 이물을 검사한다.

(2) 버터 등

검사시료 100g을 1ℓ의 비이커에 넣고 2% 염산용액 200㎖를 가하여 섞은 후 가열하여 검사시료가 완전히 녹으면 여과지로 여과한다. 따로 열탕을 준비하여 여과지에 지방이 응고되어 잘 여과되지 아니할 때, 이 열탕으로 완전히 녹여 여과한 후 여과지에 부착된 이물을 검사한다.

(3) 아이스크림분말, 무당연유, 가당연유, 가당탈지연유, 전지분유, 탈지분유, 가당분유 및 조제분유

검사시료 100g을 1ℓ의 비이커에 넣고 2% EDTA용액 100㎖를 가하여 잘 섞어서 덩어리가 없도록 한 후 저으면서 2% EDTA용액 400㎖를 천천히 가한다.

저어 섞는 동안에 차차 황색의 반투명한 액체가 되며 약 30분 방치하면 완전히 녹는다. 이를 브후나깔때기 또는 힐슈깔때기로 흡인 여과하여 여과지상의 이물을 검사한다.

탄화물 등 이물검사에 사용되는 여과지는 Milk Sediment Disk를 이용하고 검사결과는 미국 ADPI의 분유제품 검사기준에서 정하고 있는 표준판과 비교한다.

(4) 식육가공품(납탄검사)

검사시료 50g을 사방 약 7㎜의 크기로 잘라서 와일드만플라스크에 넣고 1% 염산용액 300㎖를 가하여 끓인 다음 수산화나트륨용액으로 pH 6으로 하고 다시 제3인산나트륨용액으로 pH를 7～8로 하여 온도를 40℃로 한 후 판크레아틴용액 50㎖를 가하여 충분히 섞어 40℃에서 30분간 방치한다.

다음에 pH를 7～8로 조정하고 하룻밤 40℃항온기에 넣어 소화시킨다.

소화후 일단 끓이고 식혀서 휘발유 25㎖를 가하여 위의 가.일반시험 (3)에 따라 시험하고 침전물이 있을 때는 수분을 제거한 후 (4)에 따라 시험한다.

판크레아틴용액 : 판크레아틴 5g에 물 50㎖를 가하여 5～15분간 저어 섞은 후 가볍게 물로 적신 탈지면으로 여과하여 여액을 쓴다. 사용 직전에 만든다.

(5) 아이스크림류

녹였을 때 투명한 액체일 때는 청량음료수에 따르고 아이스크림의 경우에는 검사시료 50g에 물을 가하여 100㎖로 하고 이에 4% EDTA용액을 가하여 이하 아이스크림 분말 시험법에 따른다.

(6) 통조림

검사시료 약 350g을 깨끗한 용기에 옮겨 관 내면을 물로 잘 씻고 다시 물로 내용물이 부서지지 않게 주의해서 충분히 씻어 이 씻은 액을 브후나깔때기 혹은 힐슈깔때기로 흡인여과하여 여과지상의 이물을 검사한다. 만일 작은 조직이 많을 때는 씻은액을 와일드만 플라스크에 옮겨 휘발유를 가하여 위의 가.일반시험중의 (3)에 따라 시험하고 무거운 이물이 있을 때는 (4)에 따라 시험한다.

9. 미생물시험법

가. 일반사항

축산물의 미생물시험에 있어서 제일 유의하여야 할 점은 검사시료중의 미생물의 상황이 시시각각으로 변하여 증식하거나 사멸하는 수가 있으며 원래 검사시료 중에 함유되어 있던 미생물 외에 별개의 미생물이 시험방법중 오염될 수 있다는 것이다. 이와같은 시험상의 오염을 방지하기 위하여 시험방법은 원칙적으로 무균조작이어야 하며 동시에 실험실내는 청결을 유지하여야 한다.

(1) 채취용기

(가) 장갑, 검사시료(이하 “시료”라 한다)채취 용액, 시료채취용 스폰지 또는 가아제 등 모든 준비물은 반드시 멸균된 것을 사용해야 한다.

(나) 시료 채취기구인 핀셋, 스푼, 가위 등을 미리 몇 개씩 건열 및 화염멸균을 한 다음 시료 1건 마다 바꾸어 가면서 사용해야 한다.

(다) 소, 돼지의 도체 표면에서 시료채취시는 금속, 알루미늄 호일 또는 골판지 등으로 된 시료채취틀이 필요하다. 금속틀을 재사용할 경우 소독수에 담근 후 증류수로 세척 및 건조시켜 사용하고 알루미늄 호일, 골판지 등은 종이로 포장하여 멸균한 후 1회용으로 사용한다.

(라) 시료채취틀은 항상 오염이 안되도록 보관하며 시료채취용 스폰지 또는 가아제를 댈 부분은 함부로 손을 대지 말 것이며 스폰지 또는 가아제 이외의 것이 묻지 않도록 한다.

(2) 시료채취

시료채취시에 특히 주의할 것은 환경, 손, 옷, 수송용기, 시료채취 도구 등에 묻어 있는 미생물에 의해 시료가 오염되어 결과의 오류를 가져올 수 있으므로 무균적으로 시료를 채취하는 것이 가장 중요하다.

(가) 미생물학적 검사를 위한 검사시료의 채취는 반드시 모든 과정이 무균적으로 수행되어야 하며, 시료채취장소로 이동하기 전에 깨끗한 실험복으로 갈아 입는다.

(나) 시료채취시에 사용할 테이블은 미리 준비한 0.05%(500ppm) sodium hypochlorite나 다른 소독제 등을 수건에 묻혀 깨끗이 닦아내어야 한다.

(다) 시료채취전에 항균비누로 손을 팔꿈치부터 완전히 수세하고, 가능하면 50ppm염소액으로 손을 소독한 후 종이수건으로 완전히 건조시킨다.

(라) 일정한 장소에서 시료를 채취하되 스테인레스스틸로된 테이블 및 작은 손수레를 이용하면 시료채취가 용이하다.

(마) 멸균장갑을 반드시 착용하여야 하며, 시료채취용기의 외부는 오염되어 있다는 것을 명심하고 채취용기의 내부를 함부로 만지지 않도록 한다.

(바) 멸균 시료채취 희석용액은 오염되지 않은 것인지를 확인하고 오염된 것은 버려야 한다.

(사) 시료채취를 시작하기 전에 시료채취용기에 유성잉크등으로 시료채취장소, 시료의 종류, 채취일자등을 명확히 표시하고, 만약 종이 테이프를 사용할 경우 테이프가 떨어지지 않도록 주의한다(용기를 차가운 곳에 오래 보관하면 종이 테이프가 떨어지는 경우가 있으므로 주의해야 한다).

(아) 시료가 균질일 때에는 어느 일부분을 채취하여도 무방하나 불균질일 때에는 교반한 후에 채취하여야 하며, 여러 부위(최소 3개부위)에서 약 300g(㎖)이상의 시료를 채취하여야 한다.

(자) 미생물학적검사를 하는 검사시료는 잘 섞어도 균질화가 어렵기 때문에 실제와는 다른 검사결과를 가져올 경우가 많다. 예를 들면 우유 한병(180㎖)에서 시료 1㎖를 취하여 대장균군 시험을 할 때 이 한병 중에 90개의 대장균군이 있어도 검출되지 않을 확률이 60.7％나 된다. 그러므로 가능한 한 검사시료를 잘 섞어 균질에 가깝도록 하여 검사시료를 채취하여야 한다.

(차) 칼, 도마 및 식기류등의 기구에서 시료를 채취할 때에는 멸균한 탈지면 또는 가아제등에 멸균시료채취용액을 적셔 검사하고자 하는 기구의 표면을 완전히 닦아낸 탈지면을 멸균시료채취 용기에 넣어 시료로 사용한다.

(3) 운송

(가) 미생물의 증식을 막기 위하여 깨지지 않는 용기에 담아서 냉장상태를 유지하여 수송한다. 아이스박스에 시료를 담은 후 시료 위에 골판지를 덮고 그 위에 얼음 팩을 놓는다. 얼음팩이 직접 시료에 닿지 않도록 한다.

(나) 일부세균들은 저온에 민감하므로 너무 차게 수송해서는 안된다. 시료는 반드시 냉동이 아니라 냉장상태(5±3℃)로 수송해야 한다. 다만 냉동제품은 냉동상태로 운송하고 미생물학적 검사용 시료일지라도 분유와 같이 건조되어 변질 또는 부패될 우려가 없는 시료는 냉장상태에서 운반할 필요는 없으나 2차오염을 방지하기 위하여 밀봉 또는 밀폐하여야 한다.

(다) 냉장운반을 위하여 얼음을 사용할 때에는 2차오염을 방지하기 위하여 얼음이나 그 녹은 물이 시료에 직접 접촉되지 않도록 주의하여야 한다.

(라) 부득이 저온으로 시료를 유지할 수 없거나 즉시 운반이 곤란할 경우에는 반드시 채취일시 및 채취 당시의 시료 상태를 상세히 기록하여야 한다.

(4) 검사

(가) 시료는 반드시 채취당일 검사를 실시해야 하며 불가피하게 수송 등으로 당일 검사가 불가능할 경우 냉장상태로 보관하되 최소한 채취 후 36시간 이내에 검사를 실시해야 한다.

(나) 시료는 실험직전에 잘 균질화한 다음 검사를 실시하고, 액상시료인 경우에는 강하게 진탕하여 균질화하며 고형 및 반고형인 시료는 균질기(Homogenizer 또는 Stomacher)를 이용하여 적당량의 희석액과 혼합하여 균질화 한다.

(5) 기타사항

(가) 배지 및 시약의 조제는 각 미생물시험법에서 정한 바에 따르며, 또는 이에 상응하는 제품을 구입하여 사용할 수 있다.

(나) 식중독균의 검출효율을 높이기 위하여 균분리방법에 면역자기분리법(IMS:immunomagnetic separation) 등을 이용할 수 있다.

(다) 균의 확인을 위한 각종 생화학적 성상시험은 API킷트 또는 Vitek등의 미생물동정기를 이용할 수 있다.

(라) 일반세균수, 대장균군 또는 대장균의 정량시험에 사용되는 용어는 다음과 같다.

1) n : 검사하기 위한 시료의 수

2) c : 허용기준치 보다 크고 최대허용한계치 보다 적거나 같은 최대허용시료수

결과가 m보다 크고 M보다 적거나 같은 (> m and ≤M) 경우 c에   따라 적합 또는 부적합으로 판정

3) m : 허용기준치로서 시료가 “만족(satisfactory)"으로 간주되는 미생물    기준 수치로 결과가 m 이하인 제품은 적합으로 판정

4) M : 최대허용한계치(acceptability threshold)로서 시료가 “불만족    (unsatisfactory)"으로 간주되는 미생물기준 수치로 결과가 M초과인    제품은 부적합으로 판정

나. 시료채취 및 준비

(1) 시료채취 및 방법

(가) 멸균 비닐봉지, 멸균 비닐장갑, 끈 등의 모든 채취도구는 작업하기에 편리한 곳에 두며 미리 어떤 시료를 채취할 것인가를 먼저 결정한 후에 시작한다.

(나) 소 및 돼지 등의 도체는 표면(10cm X 10cm)의 3개 부위에서 채취하여 검사하는 것을 원칙으로 하고 부득이한 경우에 1개 부위(흉부표면)에서 채취하여 검사할 수도 있으며, 닭의 도체는 1마리 전체를 세척하여 검사함을 원칙으로 한다.

(다) 식육, 가공육 등은 원칙적으로 3개 부위 이상에서 약 300g(㎖)이상을 채취하며, 기타 포장된 제품의 경우 무작위로 3개 이상을 채취한다.

(라) 원유 등 액상시료는 충분히 교반한 후 300㎖이상을 채취하며, 공정중인 것은 멸균 피펫이나 채취관으로 채취하여 멸균시료병에 넣는다.

(마) 채취한 시료는 무균적으로 멸균비닐봉지에 넣은 다음 완전히 묶고, 봉지를 다시 다른 봉지안에 넣은 다음 냉장상태(4.4℃이하)로 유지시킨다.

(2) 시험용액의 조제

(가) 미생물검사용 시료는 25g(㎖)을 대상으로 검사함을 원칙으로 한다. 다만 시료량이 적을 경우나 필요에 따라서 10g(㎖) 또는 그 이하의 양으로 검사할 수도 있다.

(나) 채취한 시료는 희석액을 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1000배… 등 희석용액을 만들어 사용할 수 있다.

(다) 희석액은 인산염완충희석액(Butterfield's phosphate buffered dilution water : BPD)을 사용함을 원칙으로 하고, 멸균생리식염수등을 사용할 수 있으며, 또한 수송용액으로 1% Peptone water, Buffered peptone water(BPW) 등을 사용할 수 있다.

(라) 검사시료를 용기 포장한대로 채취한 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10㎝의 부근까지 70% 알콜탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다.

(마) 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.

(바) 시험을 실시하기 직전에 검사시료에 따라 다음와 같이 시험용액을 조제한다.

1) 액상검사시료

채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

2) 반유동상검사시료

채취된 시료를 멸균유리봉 등의 교반용기로 잘 혼합한 후 그 일정량(10～25㎖)을 멸균용기에 취해 9배량의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

3) 고체검사시료

채취된 시료의 일정량(10～25g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른후 희석액 9배량을 가해 균질기로 균질화하여 시험용액으로 한다.

4) 고체표면검사시료

검사시료표면의 일정면적(보통 100㎝²)을 일정량(5㎖～10㎖)의 희석액으로 습한 멸균가아제와 면봉등으로 씻거나 문질러 일정량(45～90㎖)의 희석액이 있는 시료채취용기에 넣고 세게 진탕하여 부착균의 현탁액을 조제하여 시험용액으로 한다.

5) 분말상검사시료

시료를 멸균유리봉 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10～25g)을 멸균용기에 취해 9배량의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

6) 버터와 아이스크림류

버터와 아이스크림류는 40℃이하의 온탕에서 15분 내에 용해시켜 10～25㎖를 취한 후 희석액을 가하여 100～225㎖로 한 것을 시험용액으로 한다.

7) 냉동축산물

냉동축산물은 냉동상태의 검사시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 가능한 한 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올솜으로 잘 닦은 후 시험용액을 조제한다.

8) 기타 축산물

검사시료의 일정량(10～25g)을 취한 후 9배량의 희석액을 가해 균질기를 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

다. 세균수

세균수 측정법은 일반세균수를 측정하는 표준평판배양법을 원칙으로 하며 건조필름법도 사용할 수 있다. 기타 세균수 측정법으로는 총균수를 검사하는 직접현미경법, 저온에 성장하는 세균을 측정하는 저온세균수 측정법, 호기성의 아포형균을 측정하는 내열성세균수 측정법 및 자동화된 기기를 이용하는 방법 등이 있다.

직접현미경법은 시료를 슬라이드글라스위에 일정 면적으로 도말하고 건조시켜 염색한 후 현미경으로 검경하고 염색된 세균수를 측정하여 현미경 시야 면적과의 관계에 따라 검사시료중에 존재하는 총균수를 측정하는 방법이다.

저온세균은 보통 20～25℃의 저온에서 비교적 신속하게 발육하는 세균을 말하며, 25±1℃에서 72±3시간동안 배양하여 발육한 집락의 수를 저온세균수로 한다.

내열성 세균수는 호기성 아포형균의 집락수로부터 산출된 수를 말하며, 시료 25㎖를 멸균시험관(18×170㎜)에 넣고 끓는 물속에 10분간 넣어 가열한 후 35±1℃에서 48±3시간동안 배양하여 발육한 집락의 수를 내열성세균수로 한다.

(1) 일반세균수

(가) 표준평판배양법(Aerobic Plate Count)

일반세균수는 시료 중에 존재하는 세균 중 표준한천평판배지에 시료를 혼합 응고시켜 배양 후 형성한 세균의 집락수를 계수하여 시료중의 생균수를 산출하는 방법이다.

1) 기구 및 재료

가) 멸균기(건열 및 고압증기)

나) 인큐베이터(부란기)

다) 항온수조(40 ～ 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

라) 냉동 및 냉장고

마) 집락계산기(Tally register)

바) 수소이온농도측정기(pH meter)

사) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

아) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

자) 시험관 및 희석병(150㎖ 및 15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

차) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

2) 배지 및 시액

가) Standard Plate Count Agar(표준한천평판배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 부.에 따라 제조한다.

나) 희석액 : Butterfield's phosphate buffered dilution water(BPD)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

3) 시험방법

가) 배양

채취한 시료액 10㎖(g)와 희석액(BPD 또는 멸균생리식염수) 90㎖를 혼합하여 10진 희석법으로 희석하여 각 단계 희석액(10-2, 10-3, 10-4) 1㎖씩을 멸균 샤레(2매 이상)에 무균적으로 취한다.

약 45℃로 유지한 표준한천평판배지(Plate count Agar) 약 15㎖를 무균적으로 분주하고 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘섞고 응고시킨다. 확산집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3～5㎖를 가하여 중첩시킨다.

응고시킨 샤레는 거꾸로 하여 35±1℃에서 약 48시간(시료에 따라서는 30±1℃에서 약 72시간)배양한다.

나) 집락수 산정

배양후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 부득이 할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다. 집락수의 계산은 확산집락이 없고 1개의 평판당 25～250(또는 30～300)개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전체 평판에 250개 이상 집락이 발생한 경우 250에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 계산하며, 전체 평판에 25개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다.

다) 기록

평판배양법에서 산정된 균수의 기록은 둘째 자리이하는 “0”로 처리한다. 만약 3번째 자리의 숫자가 6이상과 4이하인 경우는 반올림하고, 5일경우는 2번째 자리수가 홀수일때는 위로 반올림하고, 짝수일경우는 “0”로 처리한다. 예를들면 15,500인 경우는 16,000으로 기록하고, 14,500인경우는 14,000으로 표기한다.

① 25 - 250CFU/ plate 인 경우

N =  [eqn: SUM] C / < ( 1 × n1 ) + ( 0.1 × n2) > × (d)

N = 식육 g 또는 ㎖당 세균 집락수

[eqn: SUM] C = 모든 평판에 계산된 집락수의 합

n1 = 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판수

n2 = 두번째 희석배수에서 계산된 평판수

d  = 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판의 희석배수

구 분	희 석 배 수		CFU/ g(㎖)
	1:100	1:1,000
집 락 수	232 244	33 28	24,000

N = (232 + 244 + 33 + 28) / <(1×2) + (0.1×2)> × 10-2

= 537/0.022  = 24,409

= 24,000

② 25 CFU / plate 이하인 경우

구 분	희 석 배 수		CFU/ g(㎖)
	1:100	1:1,000
집 락 수	18 10	2 1	<2,500

③ 250 CFU /plate 이상인 경우

구 분	희 석 배 수		EAPC/ g(㎖)
	1:100	1:1,000
집 락 수	TNTC TNTC	630 650	640,000

TNTC : too numerous to count

EAPC : estimated aerobic plate count

라) 세균수 산출

소 및 돼지 도체의 경우 균수는 도체 표면적당 집락수(CFU/㎝2)로서 환산되어야 한다. 희석배수 × 10( 배지 접종량이 0.1㎖일 경우) × 집락수 × 25(재료 채취 용량)/10㎝ × 10㎝( 1개부위 채취인 경우, 단 3개부위를 채취할 경우는 300㎝2로 나누어 준다)로 산출한다. 닭의 경우는 ㎖당으로 집락수를 환산한다. 기타 시료는 집락수 × 희석배수로 ㎖당 또는 g당 세균수를 산출한다.

(나) 건조필름법

1) 배지 및 시액

가) 세균수 건조필름배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 디. 에 따라 제조한다.

나) 희석액 : Butterfield's phosphate buffered dilution water(BPD)

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 1. 시액 나.에 따라 제조한다.

2) 시험방법

나. 시료채취 및 준비 (2)의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 세균수 건조필름배지에 접종 한 후 잘 흡수시키고35±1℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반 세균수로 한다.

3) 기록

세균수는 Ⅲ. 일반시험법 9. 미생물 시험법 다 세균수 (1) 일반세균수 (가) 표준평판배양법 다) 기록의 방법과 같이 기록한다.

(2) 총균수

주로 원유 중 오염된 세균을 측정하기 위하여 일정량의 우유를 슬라이드글라스위에 일정 면적으로 도말하고 건조시켜 염색한 후 현미경으로 검경하고 염색된 세균수를 측정한다. 측정된 세균수를 현미경 시야 면적과의 관계에 따라 검사시료중에 존재하는 총균수를 측정하는 방법(직접현미경법 : Breed method)이다.

(가) 기구 및 재료

1) 마이크로피펫(0.01㎖용) 또는 금속제 주사기

2) 건조상자 : 시료의 도말표본을 40 ～ 50℃에서 건조시킬수 있는 건조기

3) 유도판(Guide Plate) : 슬라이드글라스상에 1㎝2의 면적으로 시료를 도말하기 위하여 원형 또는 정사각형의 표식이 있는 것

4) 도말침

5) 대물측미계 : 1㎜를 백등분하여 0.01㎜까지 측정할 수 있는 것.

6) 현미경 : 유침대물렌즈가 달린 현미경으로 접안렌즈의 하나는 300,000 현미경 계수에 사용할 수 있도록 되어 있어야 한다.

7) 계수기(Tally register)

(나) 배지 및 시액

1) 뉴만 염색액(NewMan Stain)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 차.에 따라 제조한다.

2) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(다) 시험방법

채취된 시료를 약 30㎝ 진폭으로 7초에 25회 이상 흔들어 멸균 마이크로피펫으로 적량(100㎕)을 흡입하고 깨끗한 가아제로 피펫의 외벽에 부착된 시료를 잘 제거한 다음 슬라이드글라스 위에 적하한다. 도말침을 사용하여 1㎠ 면적에 고르게 도말하고 약 5분간 가온하여 건조시킨 다음, NewMan 염색액중에 순간적으로 적셔서 염색하고 남은 액을 즉시 흔들어 떨어뜨린 다음 건조시킨 후 물로 수세하여 다시 건조시킨다.

시료의 도말면적과 현미경의 시야면적과의 비, 즉 현미경 계수를 구한다. 유침렌즈를 사용하여 대물측미계로써 시야의 반경을 구하고 이 반경에 의하여 현미경시야의 면적을 구한다. 따라서 현미경 계수는 아래의 식에 의하여 구할 수 있다.

현미경계수 =	10,000(㎜2)
	r2 × 3.1416

r : 시야의 반경(㎜)

이 현미경 계수에 100을 곱하면 시료 1㎖에 대한 실 현미경 계수가 된다. 이러한 현미경계수하에서 16개 이상의 대표적인 시야를 검경하고 이 평균치에 실 현미경계수를 곱하면 시료 1㎖ 중의 총균수가 된다.

라. 세균발육시험

통조림 등 멸균제품에서 세균의 발육 유무를 검사할 때 사용된다.

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 항온수조(40 ～ 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

(라) 냉동 및 냉장고

(마) 집락계산기(Tally register)

(바) 수소이온농도측정기(pH meter)

(사) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(아) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖등

(자) 시험관 및 희석병(150㎖ 및 15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

(차) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) Fluid Thioglycollate Medium(치오글리콜린산염배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 어.에 따라 제조한다.

(나) 희석액 : BPD

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험용액의 준비

가온보존시험결과 음성인 검사시료는 개봉부의 표면을 70% 에칠알코올 탈지면으로 잘 씻고 멸균한 기구를 이용하여 개봉하고 내용물(내용물의 전부 또는 일부가 고형상인 경우는 멸균 균질기 등을 이용하여 잘게 자른다)의 전부를 무균적으로 혼합한 후 25g(또는 10g)을 무균적으로 채취하고 인산염완충희석액 225㎖(또는 90㎖)를 가하여 균질화시킨다. 이액의 1㎖를 멸균 피펫을 이용하여 멸균시험관에 채취하고 희석액 9㎖를 가한 후 잘 혼합하여 이것을 세균발육시험의 시험용액으로 한다.

(4) 시험방법

(가) 가온보존시험

검사시료를 인큐베이터에서 35.0±1℃로 14일간 보존하는 동안 용기의 팽창 유무 또는 내용물이 새는가의 유무를 관찰한다. 이 경우 팽창유무는 약 20℃에서 1일간 방치한 후 관찰하고 용기 포장이 팽창 또는 새는 것은 세균발육 양성으로 한다. 가온보존시험에서 음성인 것은 세균발육시험을 실시한다.

(나) 세균발육시험

시험용액을 1㎖씩 5개의 Fluid Thioglycollate Medium에 접종하여 35.0±1℃에서 48±3시간 배양하여 어느 배지에서도 균의 증식이 확인된 것은 양성으로 한다.

마. 대장균군수(Total coliforms)

대장균군이라 함은 그람음성, 무아포성 간균으로서 유당을 분해하여 가스를 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성세균을 말한다. 대장균군 시험에는 대장균군의 유무를 검사하는 정성시험과 대장균군의 수를 검사하는 정량시험이 있다. 대장균군수는 3개(또는 5개) 시험관을 이용한 최확수(MPN : most probable number)법으로 검사함을 원칙으로 하며, 선택배지를 이용한 평판배양법으로 검사할 수 있다.

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 항온수조(40 ～ 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

(라) 냉동 및 냉장고

(마) 집락계산기(tally register)

(바) 수소이온농도측정기(pH meter)

(사) 광학현미경

(아) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(자) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(차) 시험관 및 희석병(150㎖ 및 15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

(카) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(타) 발효관(듀람(Durham tube), Smith 발효관 등)

(2) 배지 및 시액

(가) Lactose Broth(유당부이온배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 커.에 따라 제조한다.

(나) Brilliant Green Lactose Bile Broth(BGLB배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 사.에 따라 제조한다.

(다) Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 퍼.에 따라 제조한다..

(라) Endo Agar (Endo배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 머.에 따라 제조한다.

(마) EMB Agar(EMB 배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 버.에 따라 제조한다.

(바) MacConkey Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 로.에 따라 제조한다.

(사) Desoxycholate Lactose Agar (DCLA:데스옥시콜레이트 유당한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 거.에 따라 제조한다.

(아) Violet Red Bile Agar(VRBA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 쿠.에 따라 제조한다.

(자) 대장균군 건조필름배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 리.에 따라 제조한다.

(차) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험용액 준비

시료는 최대량을 가한 발효관의 대다수 또는 전부에서 가스를 발생하거나 최소량을 접종한 발효관의 전부 또는 대다수가 가스를 발생하지 않도록 적당히 희석하여 사용한다.

(4) 시험방법

(가) 정성시험

1) 유당(Lactose)첨가 액체배지 이용법

대장균군의 정성시험은 추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로 나눈다. 시험관의 수는 각 희석액에 따라 3개(또는 5개씩)를 사용한다.

가) 추정시험

희석 시험용액 1㎖, 0.1㎖ 및 0.01㎖를 각각 3개(또는 5개)의 BGLB배지(또는 LST broth, Lactose broth배지)에 접종한다. 시료를 접종한 배지를 35±1℃에서 24±2시간 배양하여  발효관 내에 가스가 발생하면 추정시험 양성이고, 만약 24±2시간내에 가스가 발생하지 아니하였을 때에는 더 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 이 때까지 가스가 발생하지 않았을 때에는 추정시험 음성이고 가스발생이 있을 때에는 추정시험 양성이며 다음의 확정시험을 실시한다.

나) 확정시험

추정시험에서 가스발생이 있는 발효관으로 부터 BGLB배지등에 이식하여 35±1℃에서 48±3시간동안 배양하였을 때에 가스발생 양성이거나 가스를 발생한 BGLB배지로부터 EMB배지(또는 MacConkey Agar, Endo배지)에 이식하여 35±1℃에서 24±2시간 배양 후 전형적인 대장균군집락이 확인될 경우에는 확정시험 양성으로 하고 비전형적인 집락의 경우에는 완전시험을 실시한다.

다) 완전시험

대장균군의 존재를 완전히 증명하기 위하여 위의 평판상의 집락이 그람음성, 무아포성 간균임을 확인하고, 유당을 분해하여 가스의 발생여부를 재확인한다. 확정시험때 EMB배지(또는 MacConkey Agar, Endo배지)에서 전형적인 집락을 인정하였을 때에는 1개 또는 비전형적인 집락일 경우에는 2개이상을 따서 각각 BGLB배지와 EMB배지에 이식하여 35±1℃에서 48±3시간동안 배양한다. 가스를 발생한 발효관에 해당되는 EMB배지의 집락에 대하여 그람염색을 실시하였을 때에 그람음성, 무아포성 간균이 증명되면 완전시험은 양성이며 대장균군 양성으로 판정한다.

2) 평판한천배지 이용법

평판한천배지는 VRBA배지(또는 DCLA배지)를 사용한다. 각 단계 희석액 1㎖씩을 2매이상의 샤레에 취하고 미리 가온 용해하여 약 50℃에 보존한 VRBA평판배지 약 15㎖를 무균적으로 분주하고 배지가 샤레 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 혼합한 후 냉각응고 시킨다. 응고후 배지 표면에 동일한 배지를 3 ～ 5㎖ 가하여 중첩시킨다(중첩과정은 생략할수도 있다). 이것을 35±1℃에서 20±2시간동안 배양하여 전형적인 암적색의 집락을 인정하였을 때에는 1개이상의 집락을, 의심스러운 집락일 경우에는 2개이상을 EMB배지(또는 MacConkey Agar, Endo배지)에 획선 분리배양한다. 이것을 35±1℃에서 24±2시간 배양 후 전형적인 대장균군 집락이 확인될 경우에는 확정시험 양성으로 하고 비전형적인 집락의 경우에는 완전시험을 실시한다.

(나) 정량시험

1) 최확수법(MPN)

최확수법이란 수단계의 연속한 동일희석배수의 시료를 3개(또는 5개)씩 BGLB배지(또는 LST배지)에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수(MPN)로 표시하는 방법이다. 최확수는 이론상 가장 가능한 수치를 말하며, 10진 희석한 시료를 각각 3개(또는 5개)씩의 발효관에 가하여 배양 후 얻은 결과를 최확수표(부표7 또는 8)에 의하여 시료 ㎖(g)중에 존재하는 대장균군수를 표시하는 것이다.

시험방법은 시료액을 10진 희석하여 3단계이상 희석시료에 대하여 3개(또는 5개)의 BGLB (또는 LST배지) 발효관에 접종하여 35±1℃에서 48±3시간 배양한다. 가스발생 발효관 각각에 대하여 추정, 확정, 완전시험을 행하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표(부표7 또는  8)로부터 시료 ㎖(g)중의 최확수를 구한다.

예로써 대장균군의 최확수법에 의한 희석시료 각각에 대해 발효관을 3개씩 사용하여 다음과 같은 결과를 얻었다면 최확수표(부표7)에 의한 시료중 MPN은 150이 된다. 이때 시료접종량이 10배 희석되었다면 150×10 = 1,500으로 기록한다.

시료접종량	0.1㎖	0.01㎖	0.001㎖	MPN
가스양성수	3	2	1	150

검사시료를 5개 발효관에 3단계 이상으로 접종하였을 때에는 다음 표와 같이 취급한다. 이때의 숫자는 양성관수, ○ 내의 숫자는 유효숫자이다.

접종량 예	1㎖	0.1㎖	0.01㎖	0.001㎖
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ	5 ⑤ □ ( 5 ⑤	⑤ ④ ① 3 ③	② ③ □ 1 ②	□ 0 0 1 )

예 Ⅰ, Ⅱ : 5개 양성을 표시한 최소접종량으로부터 시작한다.

예 Ⅲ : 양성을 인정한 접종량을 중간으로 한다.

예 Ⅳ : 최소유효 접종량(이 경우는 0.01㎖)보다 1단계 적은 접종량(0.001㎖)일 때에는 양성관을 인정할 경우 최초 접종량에 의한 양성관수(이 경우 1)를 상단위에 가한다. 즉 접종량 0.01㎖양성관수 1에 접종량 0.001㎖의 양성관수를 가하여 2로 한다.

2) 평판배양법

VRBA 또는 DCLA배지를 사용하여 시료원액 및 희석액(10-1 , 10-2 ) 각 1㎖에 대하여 일반세균수의 평판배양법에서와 같은 조작으로 35±1℃에서 24±2시간 배양한 후 전형적인 대장균군 집락(직경 0.5㎜이상의 암적색 집락)을 산출한다. 생성된 집락중 전형적인 집락 또는 의심스러운 집락에 대하여 정성시험때와 같은 조작으로 대장균군의 유무를 검사한다.

3) 건조필름법

나. 시료채취 및 준비 (2)의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 대장균군 건조필름배지에 접종한 후 잘 흡수시키고, 35±1℃에서 24±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고, 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군수를 산출한다.

바. 대장균수(Generic E. coli)

축산물의 종류에 따라 대장균의 검출이 대장균군보다 정확한 오염의 지표가 되는 경우가 있다. EC-MUG(또는 LST-MUG) assay는 24시간이내 대장균의 존재를 추정할 수 있는 방법으로서 대장균이 산생하는 β-glucuronidase효소 존재하에서는 MUG(4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide) substrate가 분해되어 4-methylumbelliferon(MU)을 방출하므로서 장파장의 자외선(UV 365nm) 조사하에 MU는 푸른형광을 나타내므로 대장균이 존재함을 알 수 있다. 대장균군은 유당으로부터 가스를 산생하며, 대장균은 MUG를 분해하여 자외선조사에서 형광을 확인함으로써 대장균수를 추정할 수 있다.

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 항온수조(40 ～ 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

(라) 냉동 및 냉장고

(마) 집락계산기(Tally register)

(바) 수소이온농도측정기(pH meter)

(사) 광학현미경

(아) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(자) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(차) 시험관(15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

(카) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(타) 발효관(듀람(Durham tube), Smith 발효관 등)

(2) 배지 및 시액

(가) EC broth (EC 배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 더.에 따라 제조한다..

(나) EC - MUG 배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 러.에 따라 제조한다.

(다) BGLB 배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 사.에 따라 제조한다.

(라) LST 배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 퍼.에 따라 제조한다.

(마) EMB Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 버.에 따라 제조한다.

(바) MacConkey Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 로.에 따라 제조한다.

(사) 대장균 건조필름배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 미.에 따라 제조한다.

(아) 희석액 : BPD

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 최확수법

최확수법(3개 또는 5개 시험관을 이용한 MPN법)으로 대장균군수 검사에서 사용한 BGLB배지에서 가스산생 양성인 시험관으로부터 EC-MUG배지(또는 BGLB-MUG, LST-MUG)에 접종하여 44.5℃에서 24시간 배양한 후 자외선조사하에 푸른 형광이 관찰되는 시험관을 대장균 양성으로 판정하고 최확수표(부표 7 또는 부표 8)에 근거하여 대장균수를 산출한다.

(나) 대장균 확인시험

최확수법에서 가스생성과 형광이 관찰된 것은 대장균 추정시험 양성으로 판정하고 대장균의 확인시험은 추정시험 양성으로 판정된 시험관으로부터 EMB배지(또는 MacConkey Agar)에 이식하여 37℃에서 24시간 배양하여 전형적인 집락을 관찰하고 그람염색, MUG시험, IMViC시험, 유당으로부터 가스생성시험 등을 검사하여 최종확인한다. 대장균은 MUG시험에서 형광이 관찰되며, 가스산생, 그람음성의 무아포간균이며, IMViC시험에서 “ + + - - ”의 결과를 나타내는 것은 대장균(E. coli) biotype 1로 규정한다.

(다) 건조필름법

나. 시료채취 및 준비 (2)의 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖를 대장균 건조필름배지에  접종한 후 잘 흡수시키고, 35±1℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 푸른 집락중 기포를 주위에 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균수를 산출한다.

사. 유산균수

발효유 또는 유산균음료 중의 유산균수를 측정하기 위하여 실시한다.

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 항온수조(40 - 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

(라) 냉동 및 냉장고

(마) 집락계산기(Tally register)

(바) 수소이온농도측정기(pH meter)

(사) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(아) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

(자) 시험관(15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

(차) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) Plate Count Agar with Brom Cresol Purple(BCP첨가 평판측정용배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 호.에 따라 제조한다.

(나) BL Agar (BL한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 다.에 따라 제조한다.

(다) BS 배지

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 라.에 따라 제조한다.

(라) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 유산간균 및 구균

유산균수의 측정방법은 다.세균수 (1)일반세균수의 표준평판배양법에 준하여 시험하고 검사시료의 희석액은 멸균생리식염수를 사용한다. 다만, 배지는 BCP첨가 평판측정용배지를 사용하여 35 ～ 37℃에서 72±3시간 호기 또는 혐기배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균수의 집락으로 계측한다.

(나) 비피더스균(Bifidobacterium)

1) 검사시료 10g(㎖)에 희석액을 가하여 100㎖이 되게 하고 균질기에서 균질화한다(10-1용액).

2) 검액(10-1용액) 1㎖에 희석액을 가하여 10㎖되게 하고 10-2검액을 만든 후 동일하게 조작하여 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7검액을 조제한다.

3) 각 희석검액 0.05㎖씩을 각각 BL한천배지상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다.

4) 시료가 접종된 샤레를 혐기성상자에 넣고 37℃에서 48～72시간 배양한다. 배양 후 균집락수를 측정하고 희석배수를 곱하여 검사시료 g당 생균수를 산출한다(접종량도 희석배수에 고려해야한다). 단, 1평판당 30～300개 집락의 희석검사시료만 측정한다. 또 집락수가 1평판당 30～300개의 범위에 있는 희석검사시료가 없는 경우에는 희석배수를 변경하여 재측정한다.

5) 배양후 BL한천평판상의 균 성장

가) Bifidobacterium longum

유갈색～황갈색의 반구상으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 약 1.0～2.0㎜의 집락을 형성한다.

나) Bifidobacterium bifidum

유갈색～회색으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 0.5～1.5㎜정도의 원형집락을 형성한다.

다) Bifidobacterium breve

유백색～유갈색의 반구형으로 중심부가 융기된 직경 1.0～2.0㎜의 원형 집락을 형성한다.

(다) 유산균과 비피더스균의 혼합제품

(가)의 유산균수와 (나)의 비피더스균의 시험방법에 따라 시험한 후 유산균수와 비피더스균수를 합하여 산출한다. 단, 이때에 비피더스균의 시험시에는 BS배지를 사용한다.

아. 진균수(효모 및 사상균수)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(25℃)

(다) 항온수조(40 ～ 80℃로 자동온도 조절 가능한 것)

(라) 냉동 및 냉장고

(마) 집락계산기(Tally register)

(바) 수소이온농도측정기(pH meter)

(사) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(아) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

(자) 시험관(15㎖ 용량으로서 경질초자의 마개가 있는 것)

(차) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) Potato Dextrose Agar(PDA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 구.에 따라 제조한다.

(나) Sabouraud's Dextrose Agar(SDA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 두.에 따라 제조한다.

(다) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

진균수의 측정방법은 다.세균수 (1)일반세균수의 표준평판배양법에 준하여 시험한다. 다만, 배지는 PDA배지(또는 SDA배지)를 사용하여 22 ～ 25℃에서 5 ～ 7일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 진균수로 한다. 집락수는 평판당 10 - 150개사이가 계수하기 적당하다.

자. 탄저균(Bacillus anthracis)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 광학현미경

(바) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(자) 기니픽

(2) 배지 및 시액

(가) Nutrient Broth(보통부이온 배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 조.에 따라 제조한다.

(나) Nutrient Agar (보통한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 초.에 따라 제조한다.

(다) Blood Agar (혈액한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 마.에 따라 제조한다.

(라) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

식육 및 식육가공품의 경우 시료 25g에 희석액 225㎖을 가하여 유제액을 제조한 후 식염을 첨가하지 않는 Nutrient Agar(보통한천배지)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한다. 탄저균은 그 균의 특이한 회백색의 축모상 혹은 곰보유리모양의 집락을 형성하며 혈액한천배지에서는 용혈성이 거의 없고 액체배지에서는 침전하여 발육하며 상층부는 투명하고 균막을 형성하지 않는다. 의심되는 집락을 도말하여 염색하면 그람양성의 대간균으로서 양단이 직각으로 갈라져 있고 낚시대 모양의 연쇄상을 나타낸다.

상기의 유제를 신선한 경우는 그대로, 그렇지 않은 경우는 80℃에서 30분간 가열한 후 guinea pig(250-300g 체중)의 복강내에 0.5 ～ 1.0㎖를 접종하면 양성인 경우 24시간 후 접종부위에 부종이 생기고 점차 복부내에 퍼져 수일후에 폐사한다. 이를 해부하여 병리학적 소견을 관찰하고 도말하여 협막염색을 실시하여 협막형성균을 검경으로 확인한 후 다시 균을 분리동정한다.

차. 결핵균

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 광학현미경

(바) 원심분리기

(사) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(아) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

(자) 기니픽

(차) Hexadecyl Pyrinium Chloride(HPC)

(2) 배지 및 시액

(가) 3% Okawa 배지(3% KH2PO₄배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 코.에 따라 제조한다.

(나) Ziehl-Neelsen 염색액

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 파.에 따라 제조한다.

(다) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

우유와 같은 액상의 시료는 그대로 사용하고, 식육 및 식육가공품은 시료 25g에 희석액 225㎖을 가한 후 유제액을 제조하여 사용한다. 시료 25㎖를 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층부를 새 시험관에 취하고 침전물에서 1백금이를 취하여 도말표본을 만들고 Ziehl-Neelsen법으로 항산성염색을 실시하여 항산성균을 검경으로 확인한다.

상청부에는 동량의 8% NaOH액을, 침전물에는 그의 약 10배량의 4% NaOH액을 가하여 잘 혼합한 후 각각 0.1㎖씩을 3% Okawa배지에 적하하고 37℃의 부란기내에서 배지를 옆으로 눕혀놓고 대부분의 검액이 흡수되기를 기다렸다가 배지의 시험관을 밀봉하여 2개월간 배양을 계속하면서 때때로 균집락의 발생을 관찰한다. 또한 시료 5㎖에 1% HPC용액 15㎖을 가하여 실온에서 1일간 방치한 다음 상층액을 4,000g에서 10분간 원심침전시켜 결핵균을 분리하는 방법을 사용할 수 있다.

배양하고 남은 시료는 Bromthymol blue(0.2%)를 가한 염산수용액을 적하하여 중화시킨 후 1 ～ 2㎖씩을 guinea pig의 피내에 접종한다. guinea pig은 Tuberculin 피내반응 음성인 것으로서 체중 300g 이상인 것을 사용하며 접종후 2주간부터 가끔 Tuberculin 반응과 체중을 조사한다. 결핵균에 감염을 받은 경우에는 보통 2 ～ 5주간부터 피내반응 양성으로 나타나고 체중은 점차로 감소하며 접종한 국소에 경결 또는 괴양이 생기며 국소 임파절이 종장한다. 4 ～ 8주후에 guinea pig은 죽고 부검하여 임파절 및 각 장기의 결핵성 변화를 관찰한다. 병변부위의 장기를 무균적으로 채취하여 1% NaOH로 유제를 만들고 그 0.1㎖씩을 1% Okawa배지에 배양하여 다시 결핵균을 확인한다.결핵균의 항산성염색 방법은 다음과 같다.

(가) 도말표본을 가열하여 고정한다.

(나) Ziehl's carbol fuchsin으로 가열하면서 3분간 염색하고 증류수로 수세한다.

(다) Acid alcohol로 2분간 탈색한 다음 수세한다.

(라) Alkaline brilliant green으로 3분간 염색한 다음 세척한다.

(마) 현미경으로 항산성균을 관찰한다.

카. 부루세라균(Brucella spp.)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(10% CO2 부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(바) 원심분리기

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(자) 기니픽 및 마우스

(2) 배지 및 시액

(가) Serum Dextrose Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 무.에 따라 제조한다.

(나) Liver Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 허.에 따라 제조한다.

(다) MacConkey Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 로.에 따라 제조한다.

(라) Blood Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 마.에 따라 제조한다.

(마) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

우유의 경우는 25㎖를 3,000rpm으로 30분간 원심분리하여 유지부와 침전물을 직접도말 배양하고 두 마리 이상의 guinea pig(250 ～ 300g 체중)에 3 ～ 5㎖씩을 복강내에, 세 마리 이상의 마우스(12 ～ 15g)의 피하에 0.25 ～ 0.5㎖씩을 주사한다.

고체시료는 시료 25g에 희석액 225㎖를 가한후 유제액을 조제하여 직접도말 배양하고 또한 유제액을 멸균가아제로 여과한 후 그 여액 또는 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 실험동물에 접종한다. 실험동물 접종 3주 후에 채취한 혈청에 대해 부루세라항체가 형성되었는지 여부를 검사하고 비장에서 부루세라균을 분리배양한다.

부루세라균의 분리용 배지는 Serum Dextrose Agar(또는 Liver Agar)배지를 사용하며 10% 탄산가스 조건하에 37℃에서 3 ～ 5일간 배양한다. 이때 형성된 집락은 소원형으로서 다소 융기되어 있고 투명한 빛깔이 있으며 착색되어 있지 않으나 시일이 경과된 집락은 약간 불투명하고 갈색을 띈 회백색을 보인다. 염색하여 검경하면 그람음성의 단간균으로서 구균처럼 보인다.

액체배지에서 37℃로 24시간 배양하면 균일 혼탁하게 발육하고 10일이상 경과하면 더욱 혼탁하여지면서 적조한 균괴가 균막과 같이 표면으로부터 관벽에 엉긴다. 이 균은 운동성이 없으며 당류도 거의 분해하지 않고 혈액배지에서 용혈성이 없다. MacConkey Agar에서 성장하지 않으며, urease 음성, citrate 음성이다. 또한 최종확인을 위하여 표준항혈청으로 응집반응을 실시하여 확인한다.

타. 병원성 대장균(Pathogenic E. coli)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(바) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(사) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(아) 대장균 표준항혈청(O 및 H)

(2) 배지 및 시액

(가) mEC broth (mEC 배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 모.에 따라 제조한다.

(나) mTSB

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 보.에 따라 제조한다.

(다) MacConkey Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 로.에 따라 제조한다.

(라) Sorbitol MacConkey Agar(SMAC)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 소.에 따라 제조한다.

(마) Fluorocult E.coli O157:H7 Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 서.에 따라 제조한다.

(바) EMB Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 버.에 따라 제조한다.

(사) TSB (Tryptic Soy Broth)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 주.에 따라 제조한다.

(아) TSI(Triple Sugar Iron) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 추.에 따라 제조한다.

(자) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 대장균 O157:H7

대장균 O157:H7검출은 분리동정법을 원칙으로 하고 신속하게 검출하기 위하여 공인된 검사킷트를 이용한 EIA, PCR법등을 병행할 수도 있다.

1) 증균배양

채취한 시료액 25㎖(g)를 mEC broth(novobiocin 20㎍/㎖) 또는 mTSB배지(novobiocin(20㎍/㎖)) 225㎖에 37℃또는 42℃에서 18 ～ 24시간 증균배양 한다. 균 검출효율을 증진시키기 위하여 동일한 배지를 사용하여 2회 연속 증균배양을 실시할 수 있다.

2) 분리배양

증균배약액을 Cefixime (0.05㎍/㎖) 및 Potassium tellurite(2.5㎍/㎖)가 첨가된 SMAC 및 Fluorocult E. coli O157 Agar에 직접 또는 적절히 희석(102 - 103)한 다음 도말하여 37℃에서 24시간 배양한다. 배양후 솔비톨을 분해하지 않는 집락 즉, SMAC에서는 무색, Fluorocult E.coli O157배지에서 녹색인 집락에 대해 각 평판당 5개 이상씩 MacConkey Agar 및 EMB Agar에 획선하여 24시간 배양한다.

3) 확인시험

MacConkey Agar에서 lactose 분해균 및 EMB Agar에서 녹색성의 금속광택 집락에 대해 O157항혈청을 이용한 응집반응을 실시한다. 응집이 일어나는 균에 대해서는 TSI, IMViC시험으로 대장균임을 확인한다. TSI에서 A/A(노란색/노란색)의 형성균을 대상으로 Indol(+), MR(+), VP(-), Citrate(-), Urease(-). Arabinose(+), Lysine(+), MUG(-), KCN(-), Cellobiose 분해능(-) 등의 시험으로 대장균임을 확인한다. 생화학성상시험은 API킷트 또는 Vitek등의 미생물동정기를 이용할수 있다. 대장균으로 확인동정된 것은 O157등의  O항혈청과 H7의 H 항혈청을 이용하여 혈청학적검사를 실시하여 혈청형을 확인한다. 대장균의 베로톡신산생능 검사는 베로세포를 이용한 cytotoxicity assay방법이나 PCR법으로 실시할 수 있다.

(나) 기타 병원성 대장균

이 실험은 필요하다고 인정될 때 병원성 대장균을 검사할수 있으며, 대장균은 장관병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli ; EPEC), 장관독소원성 대장균(Enterotoxigenic E. coli ; ETEC), 장관침입성 대장균(Enteroinvasive E. coli ; EIEC), 장관출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E.coli ; EHEC)등 여러 가지로 분류하고 있다.

병원성대장균의 분리는 대장균 O157:H7 시험법과 동일하게 실시한다. 다만 분리배양에서 MacConkey Agar를 사용하고 유당을 분해하는 집락, 즉 붉은색 집락에 대해서 생화학적 성상검사를 실시하여 대장균임을 확인하고 O26, O111등의 O항혈청과 H1, H11등의 H항혈청을 이용하여 혈청형을 확인한다. 필요하다고 인정될 때에는 베로톡신 산생 등의 병원성 시험을 실시한다.

파. 살모넬라균(Salmonella spp.)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 광학현미경

(바) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(자) 살모넬라 표준항혈청( O 및 H)

(2) 배지 및 시액

(가) Selenite Cystine(SC) Broth

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 루.에 따라 제조한다.

(나) Tetrathionate(TT) Btoth

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 수.에 따라 제조한다.

(다) Rappaport Vassiliadis(RV) Broth

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 누.에 따라 제조한다.

(라) Bismuth Sulfite(BS) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 나.에 따라 제조한다.

(마) Desoxycholate Citrate Agar(DCA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 너.에 따라 제조한다.

(바) Xylose Lysine Desoxycholate(XLD) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 투.에 따라 제조한다.

(사) Hektoen Enteric(HE) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 처.에 따라 제조한다.

(아) TSI(Triple sugar iron) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 추.에 따라 제조한다.

(자) Christensen’s Urea Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 파.에 따라 제조한다.

(차) Christensen’s Citrate Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 하.에 따라 제조한다.

(카) BPW(Buffered peptone water)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 다.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 증균배양

시료액 25㎖(g)에 225㎖의 BPW를 첨가하여 36±1℃에서 18 ～ 24시간 배양한 후 이 배양액을 2종류의 증균배지, 즉 10㎖의 TT broth 또는 SC broth에 1㎖를 첨가함과 동시에 10㎖의 RV broth에 0.1㎖를 첨가하여 각각 36±1℃및 42±0.5℃에서 20～24시간동안 증균배양한다.

(나) 분리배양

각각의 증균배양액을 BS Agar 및 XLD Agar (또는 DCA, HE Agar, BS Agar)배지에 도말한 후 36±1℃에서 20 ～ 24시간 배양한다. 평판별로 의심되는 집락〔(유당 비분해(무색) 및 황화수소(H2S) 산생으로 검은색)〕을 선택하여 집락표면의 중심부로 부터 3개 이상을 취하여 특성검사를 실시한다.

(다) 확인시험

의심스러운 집락에 대해 TSI Agar 또는 LIA 사면배지에 천자하여 37±1℃에서 20 ～ 24시간 배양한다. TSI 및 LIA 검사결과 살모넬라균으로 추정되는 균에 대해서는 그람음성의 간균임을 확인하고, Indol(-), MR(+), VP(-), Citrate(+), Urease(-), Lysine(+), KCN(-), malonate(-) 시험등의 생화학적 검사를 실시한다.

생화학적으로 확인된 살모넬라균은 혈청학적 검사(O항원 및 H 항원 응집반응)를 실시한다. 살모넬라진단용 항혈청을 사용한 응집반응 결과에 따라 균종을 결정한다. 먼저 살모넬라 O혼합혈청 시험으로서 다가 O항혈청을 사용하여 슬라이드 응집반응검사를 실시한 후 살모넬라 O인자 혈청시험 즉 A, B, C, D, E군 등의 인자 항혈청으로 슬라이드 응집반응을 실시하여 O혈청형을 결정한다. H인자 혈청시험은 편모(H)항혈청 즉 a, b, c, d, e, h, g, k, l , r, y, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 등에 대해 시험관 응집반응을 실시하여 결정한다.

하. 리스테리아균(Listeria monocytogenes)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 광학현미경

(바) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(자) 표준항혈청

(2) 배지 및 시액

(가) Listeria Enrichment Broth (LEB)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 도.에 따라 제조한다.

(나) Fraser Broth

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 저.에 따라 제조한다.

(다) PALCAM(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 포.에 따라 제조한다.

(라) Oxford Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 토.에 따라 제조한다.

(마) Lithium Chloride-Phenylethanol-Moxalactam(LPM) Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 고.에 따라 제조한다.

(바) Tryptic Soy Agar(TSA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 우.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 증균배양

채취한 시료액 25㎖(g)를 LEB (또는 PALCAM Broth, Fraser Broth) 225㎖에 접종시켜 35 ± 1℃(또는 30℃)에서 24 ～ 48시간 동안 증균 배양한다.

(나) 분리배양

선택배지 LPM Agar, Oxford Agar 또는 PALCAM Agar에 증균 배양균액을 획선 접종시켜 35 ± 1℃(또는 30℃)에서  48 ± 2 시간 배양 후 리스테리아균의 전형적인 집락모양인 진한 갈색 또는 검은색 환으로 둘러싸인 집락을 선택한다.

(다) 확인시험

유사한 집락에 대해서는 그람염색으로 그람양성 간균을 확인하고, 생화학성상시험을 실시한다. Catalase 양성, β-용혈성을 나타내며, 운동성이 있고, CAMP test 결과 Staphylococcus aureus에서 양성, Rhodococcus equi에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의 결과를 보일 경우 리스테리아균(Listeria monocytogenes) 양성으로 판정하고 혈청학적 검사(O 및 H)를 추가적으로 실시한다.

거. 캠필로박터균(Campylobacter jejuni/coli)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(바) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(사) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) Campylobacter enrichment broth(CEB)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 아.에 따라 제조한다.

(나) Campylobacter blood free selective Agar(CBFA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 자.에 따라 제조한다.

(다) Campy cefex Agar(CCA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 차.에 따라 제조한다.

(라) Blaser's Campylobacter Agar(BCA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 바.에 따라 제조한다.

(마) TSI

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 추.에 따라 제조한다.

(바) MacConkey Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 로.에 따라 제조한다.

(사) Campylobacter supplement (A)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 라.에 따라 제조한다.

(아) Campylobacter supplement (B)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 마.에 따라 제조한다.

(자) Ninhydrin 용액

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 차.에 따라 제조한다.

(차) 0.1% Peptone water

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 카.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

캠필로박터균의 모든 배양은 미호기적으로 산소를 적게하고 CO2를 증가 시키거나 또는 혐기성 jar에 CO2 Gas Pack 또는 Campy Pack을 넣어 CO2상태를 유지하는 미호기적 배양을 실시한다.

(가) 증균배양

시료 25㎖(g)을 Stomacher bag에 무균적으로 취하여 Campylobacter supplement (A)(유가공품의 경우는 Campylobacter supplement(B))가 첨가된 CEB배지 225㎖을 넣고 균질화한 후 4 ～ 5시간 동안 37℃에서 미호기적 조건으로 전 배양한다. 전 배양후 항생제 중 Cefoperazone(4㎖/ℓ)을 더 첨가(유가공품일 경우는 Rifampicin(4㎖/ℓ)을 더 첨가)하여 42℃에서 24-48시간 미호기적 조건으로 배양한다.

(나) 분리배양

배양액을 CBFA(또는 CCA Agar, BCA)배지에 획선도말하여 42℃에서 24 ～ 48시간 미호기적 조건으로 암소에서 배양한다. 분리배양용 배지는 무균적으로 건조시켜 사용한다.

(다) 확인시험

캠필로박터균의 집락은 원형이거나 불규칙적이며 가장자리는 완만하다. 또한 두꺼운 반투명의 흰색 집락으로 자라거나 분산되어 필름모양의 투명한 집락으로 보이기도 한다. 의심스러운 집락에 대해서는 항생제를 넣지 않은 CBFA (또는 BCA)배지에 신속히 배양하여 다음의 확인시험을 실시한다.  염색은 대비염색(contrast stain)을 실시하는데, 한 집락을 취하여 식염수에 현탁한 후 1방울의 contrast stain(10㎖ 식염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 것)으로 염색하여 cover slip을 덮고 현미경으로 검경한다. 대비염색으로는 carbol fuchsin을 사용한다. 모든 캠필로박터는 그람음성으로 구부러진 지그잭형의 사슬모양이며 길이는 1.5 ～ 5㎛로 관찰된다. 배지에서 배양된 집락을 이용하여 catalase와 oxidase시험을 실시하여, catalase, oxidase 시험 양성을 확인한다. 기타 생화학적 성상시험을 아래와 같이 확인한다. 모든 시험은 C. jejuni(hippurate와 그외의 실험)와 C. lari(항생제 내성실험)를 대조균으로 사용한다.

1) Hippurate 분해시험

Nonselective 또는 antibiotic inhibition plate에 배양한 집락을 1% hippurate수용액 0.4㎖에 접종한 후 37℃ 수조에서 2시간 배양하여 ninhydrin용액 0.2㎖을 첨가하고 잘 혼합한 후 10분간 더 배양한다. C. jejuni는 양성(violet 또는 pale purple)을 보인다.

2) TSI 반응시험

혈액배지에서 배양한 집락을 TSI 사면배지에 접종하여 35 ～ 37℃에서 5일간 미호기적으로 배양한다. 모든 Campylobacter는 alkaline/alkaline 반응을 보이며, C. jejuni는 H2S를 생산하지 않는다.

3) Glucose 이용능 시험

혈액배지에 배양한 집락을 Glucose가 포함된 O-F medium과 Glucose가 들어있지 않은 O-F medium 시험관에 각각 접종 후 35 ～ 37℃에서 4일간 미호기적으로 배양한다. Campylobacter는 glucose 또는 그 외의 당을 분해하지 않는다.

다음의 생화학 시험은 0.1% peptone water 5㎖에 시험집락을 McFarland No.1의 농도로 현탁한 후, 현탁액을 이용하여 실험을 실시한다.

4) 항생제 억제시험

항생제를 넣지 않은 CBFA에 현탁액을 도말하여 nalidixic acid와 cephalothin disc를 놓은 후 37℃에서 24-48시간 미호기적으로 배양한다. 크기에 상관없이 저지환의 확인은 감수성을 나타낸다.

5) 온도에 의한 생장시험

3개의 CBFA에 현탁액을 획선도말하여 각각 25℃, 35 ～ 37℃, 42℃에서 미호기적으로 3일간 배양하여 25℃에서는 비생장, 35 ～ 37℃와 42℃에서는 생장되는 것을 확인한다.

6) MacConkey Agar에서 생장시험

MacConkey Agar 배지에 획선하여 미호기적 조건으로 35 ～ 37℃에서 3일간 배양하여 생장되는 것을 확인한다.

7) Brucella Semisolid Agar에서 생장시험

Brucella Semisolid Agar에 접종하여 35 ～ 37℃에서 3일간 배양하여 배지의 윗 표면에 narrow band가 형성된 것을 확인한다.

8) 1% glycine, 3.5% NaCl에서 생장을 확인하고, Nitrate reduction을 확인한다.

너. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 현미경

(바) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) Mannitol Salt-Egg Yolk Agar(난황첨가 만니톨 식염한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 오.에 따라 제조한다.

(나) Baird - Parker medium

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 가.에 따라 제조한다.

(다) Nutrient Agar(보통한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 초.에 따라 제조한다.

(라) Blood Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 마.에 따라 제조한다.

(마) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 균수시험

황색포도상구균수 시험은 다.세균수 (1)일반세균수 시험에 따르며, 배지는 Baird-Parker배지를 사용하고, 35 ～ 37℃에서 48시간 배양한 다음 직경 1.0 ～ 1.5㎜ 크기의 black, shiny, convex한 집락주위에 약 2 ～ 5㎜의 opaque region이 관찰되는 것을 계수한다. 집락수는 평판당 20 ～ 200개가 적정하다. 의심되는 집락 5개 이상에 대해 그람양성 구균 및 catalase양성임을 확인하고 coagulase검사를 실시한다.

(나) 균분리 시험

1) 증균배양

증균배양이 필요하다고 인정될 경우에는 시료 10㎖를 90㎖의 10% NaCl을 첨가한 Tryptic Soy Broth에 접종하여 35 ～ 37℃에서 18시간 증균배양한다.

2) 분리배양

시료를 직접 또는 증균 배양액을 Baird-Parker배지 또는 난황첨가 만니톨 식염한천배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한다. Baird-Parker배지에서 집락형태는 직경 1.0 ～ 1.5㎜, black, shiny, convex colony 주위에 약 2 ～ 5㎜의 opaque region이 관찰되는 것이 특징이다. 난황첨가 만니톨 식염한천배지에서는 황색 불투명 집락(만니톨분해)을 나타내고 집락주변에 혼탁한 백색환(난황반응 양성)이 있는 집락을 나타낸다.

3) 확인시험

분리배양된 집락을 보통한천배지에 옮겨 37℃에서 18 ～ 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포도상의 배열을 갖는 그람양성 구균을 확인하고, 혈액배지에서 용혈성을 검사한다. 포도상의 배열을 갖는 그람양성구균이 확인된 것은 coagulase test를 실시한다. 토끼혈청(신선혈청은 5%, 건조혈청의 용액은 10%)을 가한 멸균생리식염수를 멸균한 시험관에 0.5 ～ 1㎖씩 무균적으로 분주한다. 여기에 분리배지상의 집락에서 직접 또는 보통한천배지에서 순수배양시킨 균 1백금이를 접종하여 37℃에서 배양한다. 배양 후 3, 6, 24시간의 각 시간에 응고의 유무를 판정하여 어느시간 후에도 응고 또는 섬유소(fibrin)가 석출된 것은 모두 coagulase 양성으로 하며 이상과 같이 확인된 것은 황색포도상구균 양성으로 판정한다. 혈장은 멸균된 5% 구연산나트륨용액 1용량에 건강한 토끼에서 채혈한 혈액 4용량의 비율로 혼합하고, 즉시 1,500rpm에서 10분간 원심하여 무균적으로 분리시킨 것 또는 시판 건조혈장을 이용한다. 또 토끼혈장을 이용하는 것이 좋지만 부득이한 경우는 사람의 혈장을 대용할 수도 있다. 이외의 생화학적 검사로  Lysostaphin sensitivity 양성, Thermostable nuclease production test 양성(Coagulase 2+에 대한 보조 시험) 등을 실시하며, 엔테로톡신 산생능은 microslide gel double diffusion 방법 또는 PCR법으로 검사할 수 있다.

더. 클로스트리디움

(1) 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

(가) 기구 및 재료

1) 멸균기(건열 및 고압증기)

2) 인큐베이터(부란기)

3) 냉동 및 냉장고

4) 수소이온농도측정기(pH meter)

5) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

6) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖ 등

7) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(나) 배지 및 시액

1) Clostridium perfringens Agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 카.에 따라 제조한다.

2) Cooked Meat Medium

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 타.에 따라 제조한다.

3) Fluid Thioglycollate Medium

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 어.에 따라 제조한다.

4) 0.1% Peptone Water

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 카.에 따라 제조한다.

(다) 시험방법

1) 균수 측정

시료중 크로스트리디움균(Cl. perfringens)의 균수를 측정하고자 할 경우는 시료를 70℃에서 20분간 처리한 다음 Clostridium perfringens Agar에서 35℃에서 48시간 배양하여 균수를 측정한다. 무균적으로 시료를 0.1% Peptone Water를 사용하여 10-1부터 10-5까지 공기유압이 적게 잘 희석한다. Clostridium perfringens Agar배지 6 ～ 7㎖씩을 샤레에 붓고 굳힌 후 희석한 시료 1㎖를 배지표면에 골고루 분산되게 한다. 이때 한 희석 배율에 대해 2개의 평판을 사용한다. 다시 15 ㎖의 Clostridium perfringens Agar (45～46℃)를 중층한다. 배지가 굳은 후 샤레를 뒤집지 않은 채 혐기배양기내에 넣는다. gas pack을 사용할 때는 밀봉 후 37℃항온기에서 24시간 배양하며, 이때 혐기배양기내의 혐기상태를 알기 위해 methylene blue 용액을 넣어 탈색이 되는가를 확인한다. 배양 후 집락을 계산한 후 이중 5～10개의 집락을 확정검사(confirmatory test)를 하기 위해 Fluid Thioglycollate Medium에 각각 접종 후 일반 인큐베이터에서 37℃, 20시간 배양한 다음 그람양성 간균임을 확인한다.

2) 균 분리시험

가) 증균배양

검사시료액 25㎖(g)를 225㎖의 Cooked Meat Medium의 배지 아래부분에 접종하여 35℃에서 18 ～ 24시간 혐기배양한다.

나) 분리배양

증균된 균액을 Clostridium perfringens Agar에 도말하여 37℃에서 18 ～ 24시간 혐기배양한다.

다) 확인시험

의심되는 집락에 대해 그람염색, Lecithinase test, Lactose 이용능 등을 검사하고 킷트를 이용하여 toxin type을 확인한다. Cl. perfringens는 EY-free TSC Agar에서 H2S를 생성하여 흑색을 나타내며, 유당으로 부터 가스와 산을 생성하고, 짧고 굵은 아포형성의 그람양성 간균이다. 이러한 균에 대해 Lactose Gelatine Medium, Motility-Nitrate(MN) Agar등의 배지에 접종하여 37℃일반 인큐베이터에서 20시간 배양한다.  C1. perfringens는 비운동성균으로 접종한 곳에만 자라며, gelatin의 액화는 44시간내 일어나며, nitrate 환원능력 있다.

(2) 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)

(가) 기구 및 재료

1) 멸균기(건열 및 고압증기)

2) 인큐베이터(부란기)

3) 냉동 및 냉장고

4) 수소이온농도측정기(pH meter)

5) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

6) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

7) 샤레(직경 85mm, 깊이 15mm 이상)

(나) 배지 및 시약

1) 젤라틴 인산완충액

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 하.에 따라 제조한다.

2) Nitrite 지시약

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 거.에 따라 제조한다.

3) Cooked Meat Medium

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 타.에 따라 제조한다.

4) TPGY배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 푸.에 따라 제조한다.

5) Liver-Veal 난황한천배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 후.에 따라 제조한다.

6) 혐기성 난황한천배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 기.에 따라 제조한다.

7) GAM 당분해용 반유동 배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 니.에 따라 제조한다.

(다) 시험방법

1) 증균배양

고형 또는 반고형물 검체는 동량의 젤라틴 인산완충액을 첨가하고 균질화하여 시험용액으로 하며, 액상 검체는 그대로 사용한다. 1 ～ 2g 또는 1 ～ 2㎖의 시료를 2개의 Cooked Meat Medium 15㎖에 접종하여 35℃에서 18 ～ 24시간 배양하고, 2개의 TPGY배지에 같은 방법으로 접종하여 26℃에서 7일간 배양한다. 단, 접종전 각 배지는 10 ～ 15분간 중탕하여 탈산소한 후 빨리 냉각하여 사용하며, 시료는 배지 아래부분에 천천히 접종하여 교반하지 않는다. 배양 7일 후 검경하여 전형적인 클로스트리디움이 관찰되면 다음의 분리배양을 실시하고, 관찰되지 않은 경우에는 추가적으로 10일간 더 배양한다.

2) 분리배양

증균배양액으로 1 ～ 2㎖와 동량의 여과 제균한 알코올을 잘 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후, Liver-Veal 난황 한천배지 또는 혐기성 난황 한천배지에 접종하여 35℃에서 48시간 혐기적으로 배양한다. 배양후 융기되거나 평평하며, 표면에 매끈하거나 거친 집락으로, 약간 퍼져 있거나 불규칙한 것을 선택하여 약 10개를 취한다. 경우에 따라서는 집락 주위에 혼탁한 환이 생긴다.

3) 확인시험

분리 균에 대하여 Gram 양성의 간균과 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰하고, 호기조건으로 37℃에서 2 ～ 3일간 배양하였을 경우 균이 발육되지 않는 것을 확인한다. 0.1%의 glucose를 첨가한 GAM배지에 접종하여 37℃로 1 ～ 4일간 배양하여 운동성이 있는 것을 양성으로 판정하며, 질산염환원능이 없으므로 glucose 0.1%, KNO3 0.3%를 가한 GAM 당분해용 반유동배지에 접종하여 37℃에서 2일간 배양한 후 Nitrite지시약을 가하였을 경우 색의 변화가 없어야 한다. FeSO4 7H2O 0.1%를 첨가한 우유(pH 6.8)에 균을 접종하여 37℃로 배양한 후 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정(각 독소 type에 따라 분해능이 다름)한다.

4) 독소확인시험

○ 시험

시험용액을 4℃, 10,000g에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 pH6.0으로 조정한 후, 동량의 2% trypsin용액을 가하여 37℃에서 30 ～ 60분간 반응시킨 후, 이 용액 1ml당 100U의 penicillin과 100㎍의 chloramphenicol을 첨가한다. 중량 15 ～ 20g의 ICR계 마우스 5군(1군당 2～3수)을 준비하여 위의 시료액을 다음과 같은 5가지 방법으로 복강내 주사한다.

① 시험용액 0.5ml를 그대로 주사한다.

② 시험용액을 100℃로 10분간 가열한 후 0.5ml씩 주사한다.

③ 시험용액에 A형 항독소혈청(1 ～ 2unit/ml)을 시험관 내에서 동량으로 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시킨 후 0.5 ml씩 주사한다.

④ ③과 같은 방법으로 B형 항독소혈청을 혼합하여 반응시킨 후, 0.5ml씩 주사한다.

⑤ ③과 같은 방법으로 E형 항독소혈청을 혼합하여 반응시킨 후, 0.5ml씩 주사한다

○ 판정

①～⑤군의 마우스를 1주간 관찰한 후 다음에 의해서 판정한다.

가) ①군의 마우스가 사망하지 않았다면 음성으로 판정한다.

나) ①군 마우스가 특정한 중독증상(복벽함몰, 사지마비, 호흡곤란)을 보이면서 사망하고 ②군은 생존하였을 경우,

i) ③ ～ ⑤군 중 한군이 생존하였다면 생존군에 사용한 항혈청유형의 독소를 양성으로 판정한다.

ii) ③ ～ ⑤군 모두 또는 각 군의 일부가 사망하였다면 시험용액을 희석하여 재시험하고 기타유형(C1, C2, D, F, G형)의 항독소혈청을 사용하여 중화시험을 실시한다.

러. 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기)

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(PH meter)

(마) 광학현미경

(바) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 1㎖, 5㎖, 10㎖

(아) 샤레 (직경 85㎜, 깊이 15㎜ 이상)

(2) 배지 및 시액

(가) TCBS(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose)한천배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및배지 2. 배지 비.에 따라 제조한다.

(나) TSI(Triple Sugar Iron)사면배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 추.에 따라 제조한다.

(다) LIM배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 노.에 따라 제조한다.

(라) Nutrient Agar(보통한천배지)

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 초.에 따라 제조한다.

(마) VP 반유동배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 시.에 따라 제조한다.

(바) Purple Broth base 배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 이.에 따라 제조한다.

(사) Moeller Basal 배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 지.에 따라 제조한다.

(아) ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) 배지

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 치.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 증균배양

검체 25g 또는 25㎖를 취하여 225㎖의 펩톤수(Peptone 1%, NaCl 2%, pH 8.6)에 가한 후 35℃ 에서18∼24시간 증균배양한다.

(나) 분리배양

증균배양액을 TCBS한천배지에 접종하여 35℃에서 18∼24시간배양 한다. 배양결과 직경 2∼4mm인 청록색의 서당 비분해집락에 대하여 확인 시험을 실시한다.

(다) 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 TSI사면배지의 사면과 고층부의 사면과 고층부, LIM배지, 보통한천배지에 각각 접종한 후 35℃에서 18∼24시간 배양한다. 장염비브리오는 TSI사면배지에서 사면부가 적색(유당, 서당 비분해), 고층부는 황색(포도당발효), 가스 비생성, 유당 및 서당 비분해(사면부가 적색), 황화수소 비생성(고층부가 흑색화되지 않음), LIM배지에서 lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성,,Oxidase시험양성이다. 위 시험에서 장염비브리오로 추정된 균은 0, 3, 8 및 10% NaCl을 가한 Peptone 수에 의한 내염성시험, VP 시험,, Mannitol 이용성 시험(Purple Broth Base,1% Mannitol 첨가), Arginine 및 Ornithine 분해시험(Moeller Basal Broth, 1% Arginine 또는 1% Ornithine 첨가), ONPG시험을 실시한다. 장염비브리오는 0% 및 10% NaCl을 가한 Peptone수에서 발육 음성, 3% 및 8% NaCl을 가한 Peptone수에서 발육 양성, VP 음성, 만니톨에서 산생성 양성, Ornithine 분해양성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 음성, 3%NaCl을 가한 Nutrient Broth, 42℃에서 발육 양성이다.

머. 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii) 주1)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기) 또는 항온수조

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 0.1mL, 10mL 등

(아) 샤레 (직경 85 mm, 깊이 15 mm 이상)

(자) 루프(백금이) : 직경 3 mm

(2) 배지 및 시액

(가) Enterobacteriaceae enrichment broth(EE broth)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 키.에 따라 제조한다.

(나) Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(CESA)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 티.에 따라 제조한다.

(다) E. sakazakii medium

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 피.에 따라 제조한다.

(라) TSA(Tryptone soy agar)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 우.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 증균배양

시료 100g을 무균적으로 채취하여 900 mL의 멸균증류수에 접종하여 36 ℃에서 18시간 증균배양한다. 이 배양액 10 mL를 90 mL의 Enterobacteriaceae enrichment broth(EE broth)에 첨가하여 36℃에서 18시간 증균배양한다.

(나) 분리배양

증균 배양액을 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(CESA)와 E. sakazakii Medium 2장에 접종하여 36 ℃ 에서 24 ± 2 시간 배양한다. Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(CESA)에서 청록색이고 E. sakazakii Medium에서는 장파장의 자외선(366nm) 조사하에 형광을 나타낸다.

(다) 확인시험

5개의 분리배양된 집락을 취하여 Tryptone soy agar(TSA)에 옮겨 25℃에서 48 ～ 72시간 배양한 후 yellow-pigmented colony를 확인하고 해당 집락에 대한 생화학적 시험 결과 Oxidase(-), L-Lysine decarboxylase(-), L-Ornithine decarboxylase(+), L-Arginine dihydrolase(+), sucrose(+), dulcitol(-), adonitol(-), raffinose(+), D-sorbitol(-), x-methyl-D-glucoside(+), D-arabitol(-)의 결과를 보일 경우 Enterobacter sakazakii 양성으로 판정한다.

주1. : 이 검사법은 FDA의 Ent. sakazakii의 MPN 검사법을 변경한 것임

버. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)

(1) 기구 및 재료

(가) 멸균기(건열 및 고압증기)

(나) 인큐베이터(부란기) 또는 항온수조

(다) 냉동 및 냉장고

(라) 수소이온농도측정기(pH meter)

(마) 균질기 : 스토마커(Stomacher) 및 Stomacher bag

(사) 피펫 : 0.1mL, 10mL 등

(아) 샤레 (직경 85 mm, 깊이 15 mm 이상)

(자) 루프(백금이) : 직경 3 mm

(2) 배지 및 시액

(가) Bacillus cereus Supplement

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 너.에 따라 제조한다.

(나) MYP agar

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2.배지 히에 따라 제조한다.

(다) Nutriet Agar(보통한천배지)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지 초.에 따라 제조한다.

(라) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1. 나.에 따라 제조한다.

(3) 시험방법

(가) 정성시험법

① 분리배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 멸균 인산완충희석액에 가하여 균질화한 검액을 MYP한천배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한다. 배양 후 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별한다. 이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰한다.

② 확인시험

MYP 한천배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한다. 배양 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 운동성, nitrate환원능, VP, β-hemolysis, 혐기배양시 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시한다.

(나) 정량시험법

① 균수측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 멸균 인산완충희석액에 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 한다. 멸균 인산완충희석액을 사용하여 10-2에서 10-6까지의 10배 단계 희석액을 만든다. MYP 한천평판배지(배지46)에 단계별 희석용액 0.2 mL씩 5장을 도말하여 총 접종액이 1 mL이 되게 한 후 30℃에서 24시간 배양한 후 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수한다.

② 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 머. 바실러스 세레우스 (1) 정성시험법 (나) 확인시험에 따라 확인시험을 실시한다.

③ 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예로 10-1 희석용액을 0.2 mL씩 5장 도말 배양하여 5장의 집락을 합한 결과 100개의 전형적인 집락이 계수되었고 5개의 집락을 확인한 결과 3개의 집락이 바실러스 세레우스로 확인되었을 경우 100×(3/5)×10= 600으로 계산한다.

10. 체세포수 검사법

원유중 체세포수 측정은 아래의 방법(직접현미경검사법)에 따라 시험하여야 하며, 이 방법과 95%이상의 상관관계를 나타내는 기기이용법을 적용할 수도 있다.

가. 기구 및 재료

(1) 마이크로피펫(0.01㎖용) 또는 금속제 주사기

(2) 건조상자 : 시료의 도말표본을 40 ～ 50℃에서 건조시킬수 있는 건조기

(3) 유도판(Guide Plate) : 스라이드 그라스상에 1㎝2의 면적으로 시료를 도말하기 위하여 원형 또는 정사각형의 표식이 있는 것

(4) 도말침

(5) 대물측미계 : 1㎜를 백등분하여 0.01㎜까지 측정할 수 있는 것.

(6) 현미경 : 유침대물렌즈가 달린 현미경으로 접안렌즈의 하나는 300,000의 현미경 계수에 사용할 수 있도록 되어 있어야 한다.

(7) 계수기(tally register)

나. 배지 및 시액

(1) 뉴만 염색액(NewMan stain)

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 자.에 따라 제조한다.

(2) 희석액 : BPD 등

VIII.미생물시험용 시액 및 배지 1.시액 나.에 따라 제조한다.

다. 시험방법

(1) 시료(우유) 0.01㎖을 채취하여 슬라이드 상의 1㎠씩 구획된 원 또는 정사각형 내에 떨어뜨린다.

(2) 구획된 칸에 우유가 고르게 분포하도록 펼친다.

(3) 40℃에서 약 5분간 슬라이드를 건조시킨다.

(4) 염색액(NewMan stain)으로 2분동안 염색한 다음 여과지를 사용하여 염색액을 제거하고 완전히 건조시킨 후 슬라이드를 37 ～ 43℃의 물에 약 3 ～ 4회 담갔다가 꺼내어 공기중에 재건조시킨다.

(5) 현미경 검사는 체세포의 숫자에 따라 계측해야 할 시야수를 결정한다. 대개 25개 ～ 100개 시야를 조사한다.

(6) 계산방법

시료의 도말면적과 현미경의 시야면적과의 비, 즉 현미경 계수를 구한다. 유침렌즈를 사용하여 대물측미계로써 시야의 반경을 구하고 이 반경에 의하여 현미경시야의 면적을 구한다. 따라서 현미경 계수는 아래의 식에 의하여 구할 수 있다.

현미경계수 =	10,000(㎜2)
	r2 × 3.14

r : 시야의 반경(㎜)

이 현미경 계수에 100을 곱하면 시료 1㎖에 대한 실 현미경 계수가 된다. 이러한 현미경 계수하에서 16개 이상의 대표적인 시야를 검경하고 이 평균치에 실 현미경계수를 곱하면 시료 1㎖ 중의 총 체세포수가 된다.

11. 축산물 중 잔류물질 시험법

가. 식육 및 식육가공품중의 잔류물질 시험법

식육 및 식육가공품의 잔류물질 검사는 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에 따라 시험한다. 다만, 식육의 항생물질 간이시험법은 다음의 간이시험법을 적용할 수 있다.

(1)  EEC 4-plate법

(가) 시험재료

1) 시험균 : Bacillus subtilis BGA(이하 “B.s”라고 한다)

Micrococcus luteus ATCC 9341(이하 “M.l”이라 한다)

2) 배지

가) 계대용 : Nutrient Agar

나) 아포조제용(B.s) : AK #2 sporulating Agar 혹은 Nutrient Agar(MnSO4.H2O 0.005% 첨가)

다) 증균용(M.l) : Triptic soy broth(TSB)

라) 시험용 : 증류수 1ℓ당 peptone 6.9g, NaCl 5.1g, KH2PO4 1.0g 및 Agar 13.0g 혹은 항생물질 시험용배지(pH 6.0, 7.2 및 8.0, Merck 등 동등규격품)

3) 디스크(filter paper disc)

가) 시험용평판 검사용 : 직경 6㎜(Schleicher & Schuell No. 15100 혹은 Adventec No. 1995203 등 동등규격품)

나) 지육검사용 : 직경 10㎜(Adventec No. 1995210 등 동등규격품)

4) 페트리디쉬 : 87x15㎜

5) 기타

캘리퍼스 혹은 눈금자, 배양병(Roux bottle), 멸균유리구슬(4㎜), 멸균원심분리관(50㎖), 원심분리기, 혼합기, 항온수조(65℃), 배양기(45℃), 외과용 메스(No. 22)등

(나) 시험균액의 조제

1) B. s 아포액

증류수 1ℓ에 해당하는 Nutrient Agar에 MnSO4․H2O 0.005% 및 Agar 0.5%를 추가하여 끓인 후 배양병에 250-300㎖를 분주하여 121℃, 15분간 고압증기멸균한 다음 굳힌다. Nutrient Agar 사면배지에 37℃에서 하룻밤 배양한 종균을 멸균증류수 2-3㎖로 집균하여 배양병 평판에 이식하여 37℃, 18-24시간 배양한 후 실온에 6일간 방치한다. 유리구슬과 멸균증류수 25㎖를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균원침관에 옮긴 후 65℃ 항온수조에서 30분간 가열한다. 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 일정량의 멸균증류수를 넣어 혼합기로 부유시켜 원심분리한다. 이 세척과정을 총 3회 반복한다. 마지막으로 원심분리하여 상층액을 버리고 남은 잔사를 20 ㎖의 멸균증류수로 재부유시켜 70℃, 30분간 가열한다. 이 아포액을 Plate Count Agar(PCA) 혹은 Nutrient Agar로 아포의 농도를 측정하여 멸균증류수로 107-108 spores/㎖가 되도록 조정한 “stock solution” 상태로 4℃ 냉장보관하면서 6-8개월간 사용한다.

2) M. l 균액

시험일 하루 전 Triptic soy broth 20㎖에 계대 보존균을 직경 2㎜ 백금이로 1 loopful을 접종하여 32℃항온수조에서 16시간 진탕배양(약 80rpm)한다. 이 균액 1㎖를 19㎖의 멸균증류수에 희석하여 사용하며(이때 균농도는 약 2x107 CFU/㎖), 이 희석균액은 4℃냉장보관하면서 약 1주일간 사용할 수 있다.

(다) 시험용평판 조제

검사할 시료의 수와 소요될 한천평판의 수를 산출하여 필요한 배지량을 결정한 후 증류수 1ℓ당 Peptone 6.9g, NaCl 5.1g, KH2PO4 1.0g 및 Agar 13.0g을 평량하여 삼각플라스크에 취한다. 증류수로 녹여 끓인 배지를 고압증기멸균한 다음 4개의 삼각플라스크에 동일한 양을 분주한다. 멸균한 배지를 48-50℃항온수조에 약 2시간 동안 방치한 후 1N NaOH, 1N HCl을 사용하여 pH를 조정한다(B.s: pH 6.0, 7.2, 8.0, M.l: 8.0). 필요한 수량의 페트리디쉬를 준비하여 균주명, pH, 제조일 등을 기입한다. B.s 아포액이 사용되는 세종류의 배지에는 아포액 “stock solution”을 65℃항온수조에서 30분간 가열한 후 증류수 ㎖당 2x106으로 희석한 아포액을 배지 100㎖당 1㎖씩을 첨가한다. 이때 B.s, pH 7.2 평판에는 희석한 아포액을 첨가함과 동시에 TMP 10.0㎍/㎖ 용액(10㎎의 TMP를 100㎖의 용량플라스크에 취해 10㎖의 메탄올로 녹인 다음 멸균증류수로 표시선까지 맞추어 다시 이 용액을 10배 희석한 용액)도 함께 배지 100㎖당 1㎖를 첨가한다(0.1㎍ TMP/㎖ Agar). M.l pH 8.0 배지에는 증류수 ㎖당 약 2x107CFU로 희석한 균액을 동일한 비율로 첨가한다. 이 때 배지 ㎖당 시험균의 최종농도는 B.s 2x104, M.l 2x105의 균수가 된다. 시험균액을 첨가한 후 약 1분간 잘 혼합하여 피펫으로 6㎖씩(이때 배지두께는 약 1㎜) 페트리디쉬에 분주하여 뚜껑을　살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 평판은 4℃냉장보관하면서 2-3일간 사용할 수 있다.

(라) 시험용 평판 및 시료의 검사

1) 표준용액 조제

Penicillin G(PG) 용액은 일정 단위(unit)의 PG Na 혹은 K 10㎎을 100㎖의 용량플라스크에 취해 멸균증류수로 표시선까지 맞춘 다음 다시 1 IU/㎖이 되도록 희석하여 사용한다(PG 1 unit= 0.6 ㎍).

Sulfamethazine(SMZ) 용액은 100㎎의 SMZ를 100㎖의 용량플라스크에 취해 10㎖의 methanol로 녹인 다음 멸균증류수로 표시선까지 맞추어 혼합하고(1.0 ㎎/㎖) 다시 동일한 용량플라스크에 이 용액 5.0㎖를 취해 희석하여 사용한다(50.0 ㎍/㎖).

Streptomycin(SM) 용액은 100㎎의 SM을 100㎖의 용량플라스크에 취해 멸균증류수로 표시선까지 맞추어 혼합하고(1.0 ㎎/㎖) 다시 동일한 용량플라스크에 이 용액 5.0㎖를 취해 희석하여 사용한다(50.0 ㎍/㎖).

2) 시험용 평판의 검사

시험용평판을 검사하기 위한 항균물질과 표준용액농도는 아래 표와 같다. 시험용평판에 시험용평판 검사용 디스크(직경 6㎜)를 올려놓은 다음 미리 준비한 항균물질 표준용액을 각 10㎕씩 취해 흡수시킨 후 32℃에서 16시간 배양하여 시험균의 발육억제대를 관찰한다. 이때 발육억제대의 크기는 시험용평판별로 최소주변억제대가 6㎜ 혹은 8㎜ 이상이어야 한다.

<평판의 검사조건>

시험용평판	항균물질	표준용액농도	디스크당 함량	최소주변억제대
B.s, pH 6.0 B.s, pH 7.2 B.s, pH 8.0 M.l, pH 8.0	Penicillin G-Na Sulfamethazine Streptomycin Streptomycin	1 iu/㎖ 50㎍/㎖ 50㎍/㎖ 50㎍/㎖	0.01iu 0.5㎍ 0.5㎍ 0.5㎍	6㎜이상 6㎜이상 8㎜이상 6㎜이상

3) 시료의 검사

가. 디스크법

가능한한 외과용 메스를 사용하여 무균적으로 근육(살코기부분)을 절개한 후 핀셋으로 시료당 지육검사용 디스크(직경 10㎜) 4개씩을 삽입하여 30～60분간 체액을 흡수시킨다. 이후 디스크를 제거하여 4종류의 검사용 평판에 하나씩 올려 놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약 30분간 방치하여 32℃배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다. 이 때 배양기에는 비이커에 물을 담아 두어 습도를 유지하면서 평판의 건조를 막는다.

나. 직접법

시료를 가능한 한 무균적으로 사방 1cm 두께 2mm 정도로 잘라 4종류의 검사용 평판에 각각 올려놓고 실온에서 약 30분간 방치한 후 페트리접시를 도치하지 않고 32℃ 배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다. 이때 배양기는 디스크법과 동등한 방법으로 습도를 유지한다.

(마) 시험결과 판정

1) 양성여부 판정

캘리퍼스 혹은 눈금자를 이용하여 시험균의 발육억제대를 측정한 결과, 디스크 직경 10㎜를 포함하여 억제대가 14㎜(최소주변억제대 2㎜)이상인 평판이 하나 또는 그 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다.

2) 양성시료의 항균물질 계열 추정

이 시험법으로 각 항균물질의 표준용액을 각 disc당 75㎕씩 흡수시킨 다음 배양했을 경우 아래 표와 같이 4종의 평판에서 억제대가 형성되는 양상을 비교함으로써 잔류항균물질의 계열을 어느정도 추정할 수 있다. 다만, 잔류량이 높을 경우나 여러 항균물질이 복합적으로 잔류할 경우 이와 같은 항균물질의 계열추정이 어려우므로 방사성동위원소면역분석법(미생물수용체분석법) 등의 방법을 이용하여 확인동정이 필요하다.

<EEC 4-plate법에 의한 항균물질의 계열별 억제 유형>

억제유형별	B.s 평판 pH 6.0	B.s 평판 pH 7.2	B.s 평판 pH 8.0	M.l 평판 pH 8.0	추정항균물질계열
Ⅰ형 Ⅰa Ⅰb Ⅱ형 Ⅲ형 Ⅳ형 Ⅴ형	+ + - - + ±	+ - + ± + +	+ - + + - -	+ ± - + - -	베타락탐계 페니실린계 세팔로스포린계 아미노글리코사이드계 마크로라이드계 테트라사이클린계 설폰아마이드계

나. 원유 및 유가공품중의 잔류물질 시험법

원유 및 유가공품의 잔류물질 검사는 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에 따라 시험한다. 다만, 원유의 경우 항생물질 등 세균발육억제물질 검사는 다음의 간이검사법에 따라 시험할 수 있다.

(1) 개량 TTC 테스트(TTC-II)

(가) 시험재료

1) TTC 용액

가) TTC(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride)와 멸균증류수를 1:25의 비율로 용해한다(4% 수용액)

나) TTC 용액은 7℃이하의 냉암소에서 보존한다.

다) 가)를 냉장보관하면서 사용하되 2주이내에 사용한다.

2) TMP 용액

가) 50.0㎎의 TMP(trimethoprim)를 100㎖ 용량플라스크에 취해 메탄올 10㎖에 녹이고 멸균증류수로 눈금표시선까지 맞춘다(500㎍/㎖).

나) 가)를 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한 50㎍/㎖용액을 시험용액으로 사용한다.

다) 가)를 냉장보관하면서 나)의 농도로 사용하되 2주이내에 사용한다.

3) PABA 용액

가) 500㎎의 PABA(p-aminobenzoic acid)를 100㎖ 용량플라스크에 취해 멸균증류수 약 50㎖를 가하여 녹인 다음 멸균증류수로 표시선까지 맞춘다(5㎎/㎖).

나) 가)를 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한 500㎍/㎖용액을 시험용액으로 사용한다.

다) 가)를 실온에 보관하면서 사용하되 2주이내에 사용한다.

4) Penicillinase 용액

Penicillinase(1,000 IU, Sigma 등 규격품)를 멸균증류수 1㎖로 녹여 시험용액으로 사용한다.

5) 공시균주

Streptococcus thermophilus ATCC 14485

6) 배지

항균물질이 없는 10% 멸균탈지유배지를 공시균주 배양용 배지로 사용한다.

7) 시험용 배양균액

가) Streptococcus thermophilus 균주를 10% 멸균탈지유배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한다.

나) 10% 멸균탈지유배지를 따로 준비한다.

다) 가)와 나)를 1:1의 비율로 혼합한다.

라) 이와 같이 준비된 시험용 배양균액은 즉시 사용한다.

8) 기타

항온수조 혹은 배양기(37℃), 항온수조(82±2℃), 마개달린 시험관(18 x 180㎜), 혼합기, 마이크로피펫(100㎕ 및 1000㎕), 피펫(1㎖ 및 10㎖) 등

(가) 시험방법

1) 스크리닝법

가) 마개달린 멸균시험관 2개에 유성펜으로 Zero control(TMP 무첨가 음성대조) 및 TMP control(TMP 첨가 음성대조)이라 표기하고 검사할 시료당 1개의 시험관에 시료번호를 기입한다

나) 검사할 시료의 멸균시험관에 시료(우유)를 각각 8㎖를 취한다.

※ 이때 대조용으로 사용할  Zero 및 TMP control 시험관에는 항균물질이 들어 있지 않는 우유* 각 8㎖를 취한다.

※ 대조용 시료 :  사료첨가약제 혹은 치료약제 등을 투여하지 않은 원유를 채취하여 4℃냉장보관하면서 사용하며 2∼3일내 사용하지 못할 경우 -20℃혹은 -80℃에 보관하여 필요시 해동하여 사용한다. 탈지우유를 검사할 경우 대조용 시료로는 항균물질이 들어 있지 않은 10% 멸균탈지우유를 사용한다.

다) Zero control에는 멸균증류수 1㎖를 첨가하고, TMP control 및 검사할 시료의 시험관에는 TMP 용액(50㎍/㎖) 각 1㎖씩 첨가하여 혼합한다.

라) 82±2℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에 담구어 37℃이하로 급냉시킨다.

마) 시험용 배양균액(1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1㎖씩 접종하여 혼합하고 37±0.5℃의 항온수조에서 2시간동안 배양한다.

바) 0.3㎖의 TTC 용액을 첨가한 후 37±0.5℃에서 30～60분동안 반응시킨다.

※ TMP control 시료가 음성대조 시료의 색상과 동일한 정도로 발색되는 시점을 반응 종료시간으로 한다.

사) TMP control을 기준으로 하여 시료의 색상이 TMP control 시료의 도홍색보다 현저히 옅을 경우 양성으로 판정하고 같거나 진하면 음성으로 판정한다.

시료가 양성인 경우 아래의 2)확인시험법으로 설파제 및 페니실린계 항생물질을 확인할 수 있다.

2) 설파제 및 페니실린계 항생물질 확인시험

가) 검사할 양성시료마다 마개달린 멸균시험관 3개에 유성펜으로 TMP tube, PABA tube 및 Penase tube로 기입하고 시료번호를 기입한다.

나) 표기한 3개의 시험관에 해당양성시료 각 8㎖를 취한다.

※ 이때 대조용 시료(Zero 및 TMP control)는 가)(1)(나)와 동일한 시료를 사용한다.

다) TMP tube(TMP 용액 첨가용 시험관)와 Penase tube(TMP 용액 및 Penicillinase 용액 첨가용 시험관)에는 TMP 용액(50㎍/㎖) 각 1㎖를 첨가하고, PABA tube (PABA용액 첨가용 시험관)에는 PABA용액(500㎍/㎖) 1㎖를 첨가하여 혼합한다.

라) 82±2℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에 담구어 37℃이하로 급냉시킨다.

마) Penase tube에만 Penicillinase 용액 100㎕를 첨가하여 혼합한다.

바) 시험용 배양균액(1:1 희석균액)을 무균적으로 각각 1㎖씩 접종하여 혼합하고 37±0.5℃의 항온수조에서 2시간동안 배양한다.

사) 300㎕의 TTC 용액을 첨가한 후 37±0.5℃에서 30～60분동안 반응시킨다.

※ TMP control 시료가 음성대조시료의 색상과 동일한 정도로 발색되는 시점을 반응종료시간으로 한다.

아) TMP control의 색상을 기준으로 하여 가)시험방법 (1)스크리닝법 (사)와 같이 판독하고 다음과 같이 결과를 판정한다.

<판 정 기 준>

TMP tube	Penase tube	PABA tube	결과 판정
음성	음성	음성	음성
양성	양성	음성	설파제
양성	음성	양성	페니실린계
양성	양성	양성	페니실린계 및 설파제 이외의 항균물질*

* 단, 항균물질이 복합적으로 잔류될 경우 설파제나 페니실린계 항생물질도 동시에 검출될 수 있다.

12. 내용량시험법

가. 용량표시제품

검사시료의 내용물을 메스실린더에 완전히 옮겨 측정한다. 다만, 점성 등이 있어 내용물을 완전히 옮기기 어려운 검사시료에 대해서는 내용물이 들어 있는 용기에 물을 가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하고, 용기의 내용물을 제거하여 물 또는 적당한 용매로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 물을 가하여 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하여 전후의 용량차로 계산한다(검사시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다).

나. 중량표시제품

내용물이 들어있는 용기 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 측정후, 내용물을 완전히 제거하고 물 또는 용매 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 용기의 무게를 달아 전후의 무게차로 계산한다(검사시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다). 다만, 내용량에 포함된 흡습제 등 비가식 대상은 제외한다.

다. 소포장제품

내용물이 소포장으로 20개 이하일 경우에는 전체를, 20개 이상일 경우에는 20개를 무작위로 취해 위와 같이 실험하여 평균값을 구한 후 전체 갯수를 곱하여 총량으로 계산한다.

라. 아이스크림류

중량(g)으로 표시된 경우는 나.항에 따라 구하고, 부피로 표시된 경우는 다음과 같이 구한다(검사시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다).

(1) 용기에 담겨 있는 경우

내용물이 담겨 있는 부분을 표시한 후 이를

제거하고 건조한 후 4℃의 물을 표선까지

적가하여 소요된 물의 양(㎖)을 구한다.

(2) 직육면체의 경우

내용물의 가로, 세로 높이를 재어 체적(㎤)을

구한다.

(3) 부정형의 경우

다음 그림과 같은 용기에 4℃로 냉각시킨 석유

(Kerosene)를 가득 채워 과잉을 흘려보내고

냉동된 내용물을 집어 넣고, 용액 표면 위로

뜨는 부분은 시약스푼으로 표면까지 잠기게 눌러준다. 출구에서 흘러나오는 석유를 눈금이 정확한 실린더에 받아 액온을 4℃로 하여 눈금을 읽어 구한다.

마. 통조림

내용물이 들어있는 관 외면을 깨끗이 닦고 무게(A)를 정밀히 단후 뚜껑의 일부분이 관에 붙어 있게 개관한다. 관(액즙이 응고한 경우에는 20℃로 가온하여 액을 용해한 관)을 비이커에 2분간 비스듬히 올려 놓아 액즙이 충분히 흘러내리게 한 후 내용물이 든 관의 무게(B)를 단다. 다음에 내용물을 완전히 제거하고 물 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻어 말린 후 무게(C)를 달아(A)와 (C)의 무게차 및 (B)와 (C)의 무게차를 각각 내용량 및 고형량으로 한다(검사시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량 및 고형량으로 한다). 다만, 내용량이 관용적을 기준(예 : 관용적의 90%이상)으로 하여 관용적을 계산할 필요가 있을 때에는 원체부의 높이가 변하지 않도록 관의 뚜껑을 제거하여 내용물을 완전히 비운 후 4℃의 물을 관의 최상면에서 수직으로 4.76㎜(2중 권체내면)까지 채운 양을 관용적으로 한다. 이 때 고형량의 계산(예 : 내용량의 70% 이상등)은 내용량 기준에 대한 계산을 말한다.

13. 진공도시험법

오른손의 엄지와 인지 사이에 진공계를 잡고 진공계의 침(고무가 부착된 부분)을 관 뚜껑 역륜(Expansion Ring)의 볼록한 부분에 밀착 삽입시켜서 진공도를 측정한다. 이 때 진공계의 끝이 관 뚜껑에 밀착하도록 주의하고 측정시의 통조림의 온도는 15℃에서 한다.

다만, 타원형 혹은 사각형의 통조림에 있어서는 관 내용물이 진공계의 침공을 폐쇄시킬 수 있으므로 이때는 관을 세워 그 타원의 한쪽을 위로해서 그 중심부에 진공계의 침을 밀착 삽입시켜서 그 진공도를 측정한다.

14. 성상시험법(관능시험법)

축산물고유의 색깔, 풍미, 조직감 및 외관을 다음의 성상 채점기준에 따라 채점한 결과가 평균 3점이상이고 1점 항목이 없어야 한다.

항 목	채 점 기 준
색 깔	1. 색깔이 양호한 것은 5점으로 한다. 2. 색깔이 대체로 양호한 것은 그 정도에 따라 4점 또는 3점으로 한다. 3. 색깔이 나쁜 것은 2점으로 한다. 4. 색깔이 현저히 나쁜 것은 1점으로 한다.
풍 미	1. 풍미가 양호한 것은 5점으로 한다. 2. 풍미가 대체로 양호한 것은 그 정도에 따라 4점 또는 3점으로 한다. 3. 풍미가 나쁜 것은 2점으로 한다. 4. 풍미가 현저히 나쁘거나 이미․이취가 있는 것은 1점으로 한다.
조직감	1. 조직감이 양호한 것은 5점으로 한다. 2. 조직감이 대체로 양호한 것은 그 정도에 따라 4점 또는 3점으로 한다. 3. 조직감이 나쁜 것은 2점으로 한다. 4. 조직감이 현저히 나쁜 것은 1점으로 한다.
외 관	1. 병충해를 입은 흔적 및 불가식부분 제거, 제품의 균질 및 성형상태와 포장상태 등 외형이 양호한 것은 5점으로 한다. 2. 제품의 가공상태 및 외형이 비교적 양호한 것은 그 정도에 따라 4점 또는 3점으로 한다. 3. 제품의 가공상태 및 외형이 나쁜 것은 2점으로 한다. 4. 제품의 가공상태 및 외형이 현저히 나쁜 것은 1점으로 한다.

15. 유전자재조합식품(GMO) 함유 축산물 검사법(스크리닝검사법)

가. 시료의 분쇄

시료의 균질성 확보를 위하여 시료 5g을 잘게 썰어 일반분쇄기에 넣어 가능한 한 미세하게 분쇄한다.

나. DNA 추출 및 정제

계면활성제인 세틸트리메틸암모니움브로마이드(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, CTAB)와 페놀클로로포름 혼합액을 사용한 CTAB법과 시판되고 있는 DNA추출 키트를 사용할 수 있다. 시판 DNA추출 키트로는 실리카겔 막 형태, 실리카를 베이스로 한 레진 형태, 이온교환수지 형태, 자기흡착 bead형태가 있으며, 이들 키트를 사용하여 축산물가공품으로부터 PCR에 이용할 수 있는 DNA를 추출․정제할 수 있다.

분석시료에 대하여는 DNA 추출 lc PCR 시험은 2회 반복 실험하여 결과를 판정한다.

(1) CTAB법

(가) 시약의 조제

1) CTAB완충액

비이커에 0.5M EDTA(Ethylenediamine Tetraacetic Acid)용액(pH 8.0) 8㎖, 1M Tris-염산 완충액(pH 8.0) 20㎖, 5M 생리식염수 56㎖를 넣고 증류수로 약 150㎖가 되도록 한 후  CTAB 4g을 가하여 완전히 용해시킨다. 증류수를 넣어 전체 양을 200㎖로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

2) 페놀-클로로포름 혼합액

1 M Tris-염산용액(pH 8.0)으로 포화한 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜을 25:24:1(v/v)로 혼합한다.

3) 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액

클로로포름과 이소아밀알콜을 24:1(v/v)로 혼합한다.

4) TE 완충액

클로로포름각 최종농도가 10mM Tris-염산용액(pH 8.0), 1mM EDTA용액(pH 8.0)이 되도록 증류수를 사용하여 조제한다.

(나) DNA 추출방법

시료 5g을 분쇄기로 균질하게 분쇄하여 분석에 사용하고, 남은 시료는 냉동 보관한다. 분쇄한 시료 1g을 50㎖ 튜브에 넣고, CTAB완충액 1.5㎖를 가하여 혼합기(vortex mixer)로 혼합한 후, 추가로 CTAB완충액 4.5㎖을 넣고 재 혼합한다. 이를 55℃에서 30분간 정치한 후, 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1)용액 5㎖를 가하여 잘 혼합하고 14,200 X g(12,000rpm)에서 15분간 실온으로 원심 분리한다. 상층액을 새로운 50㎖ 튜브에옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜(24:1)용액 5㎖를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합하고, 다시 14,200 X g에서 15분간 실온으로 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 50㎖ 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 첨가하여 손으로 반전시키면서 혼합한 후, 14,200 X g에서 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500㎕의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 14,200 X g에서 1분간 원심분리하고, 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 상층액을 마이크로피펫으로 제거한 후 침전물을 건조시킨다. 정제하기 위하여 위의 용액에 RNase A(10㎎/㎖) 5㎕을 가하여 37℃에서 30분간 정치한다. 200㎕의 CTAB완충액을 가한 후, 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250㎕를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 14,200 X g로 15분간 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴다. 200㎕의 이소프로필알콜을 가하여 잘 혼합한 후, 14,200 X g로 10분간 4℃에서 원심 분리한다. 마이크로피펫으로 상층액을 버리고, 200㎕의 70%에탄올을 벽면으로 조심스럽게 가하여, 다시 피펫으로 상층액을 제거한다. 그리고 14,200 X g로 1분간 4℃에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 피펫으로 제거하고침전물을 건조시킨다. 건조한 침전물에 50㎕의 멸균수를 가하여 15분간 실온에서 방치하고 때때로 잘 섞어서 완전히 용해되도록 하여 이를 DNA시료 원액으로 한다.

다. DNA 추출액의 순도확인

DNA시료 원액 2㎕를 TE완충액으로 50배 희석하여 230nm, 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정한다. O.D260의 측정값 1을 DNA농도 50ng/㎕으로 하여 DNA농도를 계산한다. 한편 단백질유래 불순물에 대해 O.D260/O.D280의 비율이 1.7～2.0이고, 탄수화물유래 불순물에 대해 O.D260/O.D230의 비율이 0.8이상일 경우 PCR에 적합한 DNA가 정제된 것으로 판단한다. DNA시료 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR반응에 필요한 DNA 농도가 되도록 증류수로 희석하여 DNA 시험액으로 하고, 20㎕씩 0.5㎖ 튜브에 분주하여 -20℃이하에서 냉동 보존한다. 분주한 DNA시험액은 용해하여 사용한다. 추출된 DNA시료 원액의 농도가 PCR을 실시하기 위한 최저 농도 이하일 경우에는 농축하여 사용한다. 농축방법은 3M sodium acetate(pH5.2)를 DNA 용액량의 1/10배 [혹은 10M ammonium acetate를 사용할 경우에는 1/5배를 첨가]를 첨가, 냉 에탄올 2배량을 첨가 후 15분간 원심분리(12,000rpm)한다. 그리고 상층액을 버린 후 70%에탄올로 세척하여 멸균 증류수 적당량으로 침전물을 녹인 후 사용한다.

라. PCR(Polymerase Chain Reaction)법

PCR법에 의한 유전자재조합식품의 검출방법에 사용되는 프라이머는 GMO 검출키트 또는 자체적으로 제작한 프라이머를 이용할 수 있다. PCR에서는 주형 DNA가 소량 존재하여도 증폭되므로 목적이외의 DNA(특히 PCR증폭산물)가 혼입 되지 않도록 실험에 사용되는 기구 및 시약은 물론 실험실 환경의 관리에 주의해야한다. 또한, DNA는 인간의 피부표면에서 분비되고 있는 DNA분해효소에 의해 분해될 수 있기 때문에 이러한 효소의 혼입을 방지하기 위하여 사용하는 모든 튜브와 팁은 사용하기 전에 121℃에서 20분 이상 멸균처리하고 1회용품으로 사용한 후 버린다. 용액 등도 열에 불안정한 것은 제외하고 모두 121℃에서 15분 이상 멸균처리하여 사용한다. 멸균수나 TE 완충액에 DNase가 혼입하면 피해가 확산되므로 실험자별로 별도로 제조하여, 새로 만들어 사용한다. DNA를 취급할 때에는 clean bench를 사용함과 아울러, 실험대 위를 에탄올로 소독하며, 반드시 고무장갑(polyglove)을 착용하고, 작업 중에도 빈번히 에탄올로 소독한다. 고무장갑은 분말가루가 없는(powderless) 것을 사용하거나 분말가루를 세척하여 제거 후 사용한다.

(1) 시액의 조제

(가) 표준 DNA 용액의 조제

표준시료(2%)에서 DNA를 추출하여 표준 DNA용액을 조제한다.

(나) PCR 프라이머 준비

유전자재조합식품 함유 축산물가공품 검사용 프라이머

대상유전자	Primer명	염기서열(5'→3')	증폭크기	비고
p35S	P35S1-5' P35S1-3'	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T	101bp	재조합유전자 (전사개시유전자)
NOS ter	NOD ter 2-5' NOS ter2-3'	GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T	152bp	재조합유전자 (전사종결유전자)
Lectin gene	N-Lec-1 N-Lec-2	TGG GAC AAA GAA ACC GGT AG GTC AAA CTC AAC AGC GAC GA	201bp	콩의 내재성유전자
RRS	N-RRS-1 N-RRS-2	CCC CAA GTT CCT AAA TCT TCA A AGG CTG TAG CCA CTG ATG CT	148bp	콩의 재조합유전자 (구조유전자)
Zein gene	N-Zein-1 N-Zein-2	TTT CTG CAA GTG CTG CTA CG AGG GCT GAT GAT TGT TGG AG	199bp	옥수수의 내재성유전자
BT11	N-Bt11-1 N-Bt11-2	GCG TTC TCC ACC AAG TAC TT TAG GAA GTT CGG TTG CAC TG	108bp	옥수수의 재조합유전자 (구조유전자)
Event176	N-E176-1 N-E176-2	ACC AGA TCG GCC TGA AGA C TGG TTC CTG ATC GAT GAC TG	120bp	〃
Mon810	N-M810-1 N-M810-2	TGC TTC TCT TAC ATA CGT ATC TTG C CGT TGA TGT TTG GGT TGT TG	131bp	〃
GA21	GA21 3-5' GA21 3-3'	GAA GCC TCG GCA ACG TCA ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT	133BP	〃
T25	T25 1-5' t25 1-3'	GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT CCT	149BP	〃

(다) PCR 반응 시약의 조제

PCR 반응에 필요한 시약은 Taq polymerase (내열성 DNA 합성효소), dNTPs (deoxynucleotides 용액), PCR buffer, MgCl2 , 프라이머(목적별로 합성한 합성품 이용가능)이며, PCR 반응액의 일반적 조성을 다음과 같다.

성 분	최종농도	Stock용액농도	1회용량
Taq polymerase	0.625U/tube	5U/㎕	0.125㎕
PCR buffer	1 ×	10 x	2.5㎕
MgCl2	1.5mM	25mM	1.5㎕
dNTPs	200μM	2.5mM	2㎕
각 프라이머	0.5μM	100μM	0.125㎕ x 2
주형DNA	25～50ng/tube	50ng	1㎕
증류수	반응 총액이 25㎕가 되도록 첨가		17.625㎕
전체량	25㎕		25㎕

한편 PCR반응의 음성 대조군으로 반드시 프라이머를 첨가하지 않은 반응액과 DNA시험액을 첨가하지 않은 것을 동시에 조제하여 반응시킨다. 또한 시험액내 DNA가 추출되어 있음을 확인하기 위해 각 DNA 시험액마다 특정 유전자재조합식품 검출용 프라이머 조합 대신 양성대조군용 프라이머 조합을 사용하여 동시에 PCR증폭을 실시한다.

(2) PCR 반응

PCR의 조건은 프라이머 별로 정하며, 일반적으로 반응조건은 95℃에서 10분간 방치하여 최초의 변성을 일어나게 한 후, 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초간 유전자 결합(annealing), 72℃에서 30초간 증폭반응(extension)이 일어나도록 하는 것을 1회로 하여, 40회를 반응시킨다. 40회 반응이 이루어진 후 72℃로 7분간 연장반응(elogation)을 한 후 4℃에서 보존되도록 설정한다.

(3) 전기영동

PCR 증폭산물의 예상크게에 맞춰 아가로스겔 농도(0.8～2%정도)를 결정하여 겔을 제작한다. PCR 증폭산물에 1/6배의 염색액(Gel loading buffer)을 가하여 제작한 겔의 각 홈에 시료를 주입 후, 약 100V의 전압에서 약 30분～1시간동안 전기 영동한다. 이티디움 브로마이드용액(0.5㎎/㎖)염색액에 영동을 끝낸 겔을 넣은 후, 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 증류수에서 탈색시킨다.

(4) 결과 판정

내재성유전자에 대응하는 증폭산물이 얻어지고, 또한 특정의유전자재조합식품(GMO)에 대응하는 증폭산물이 얻어지는 경우 GMO가 검출된 것으로 판정한다. 내재성유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 2회(PCR의 반복건수) 모두 인정되지 않은 시료에 대해서는 한번 더 추출해서 재분석한다. 재분석에서도 내재성유전자가 검출되지 않는 시료는 시험불가로 판정한다. 2회 중 1회에서만 내재성유전자에 대응하는 증폭산물이 인정되고 또한 유전자재조합원료에 대응하는 증폭산물이 인정된 경우에는 유전자재조합원료가 검출된 것으로 한다.

Ⅳ. 원유․식육․원료알의 시험법

1. 원유의 시험법

가. 관능검사

원유에 대한 관능검사는 원유를 충분히 잘 교반한 후 청결한 시험관에 10㎖ 정도의 시료를 취하여, 밝고 냄새가 없는 장소에서 실시한다.

검사결과 우유 고유의 색이 아닌 적색․청색․황색 등의 이상유이거나 이상한 맛․냄새․색택등이 나타난 경우에는 부적합한 원유로 판정한다.

나. 이화학적 시험법

(1) 시료채취법

(가) 용기중의 우유를 잘 섞어서 균일하게 하고 3개소 이상에서 채취하여 전량을 600㎖이상으로 한다.

(나) 보존은 0～4℃에서 하되 필요에 따라 일정한 온도를 가온하여 시험한다.

(다) 채취일시, 장소, 우유의 온도, 방부제 유무 등 필요한 사항을 기재한다.

(라) 장시간 보존할 때는 우유 1ℓ에 대하여 중크롬산 칼륨 1g, 승홍정 1개(HgCl2로서 0.5g 상당량) 혹은 포르마린 1㎖를 가한다. 그러나 중크롬산 칼륨이나 승홍정을 가한 우유는 회분정량에, 포르마린을 가한 우유는 지방(Gerber 법) 및 유당정량에 사용할 수 없다.

(2) 시험법

(가) 수분 측정법

시료 약 5㎖를 정밀히 취하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

(나) 지방 정량법

Ⅴ. 가공품시험법 1.유가공품 가.우유류 (4)조지방(Gerber법), 또는 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)Röse-Gotllieb법 또는 (나)Babock법에  따라 시험한다.

(다) 회분 정량법

시료 5～10㎖를 정밀히 취하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 나.회분에 준하여 시험한다.

(라) 단백질 정량법

시료 약 5㎖를 정밀히 취하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 다.질소화합물 (1)총질소 및 조단백 (가)Semimicro-Kjeldahl법에 준하여 시험하고 전 질소량에 6.38을 곱하여 단백질량으로 한다.

(마) 유당 정량법

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 마.탄수화물 (1) 당질 (가)환원당 또는 (다)  기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 시험한다.

(바) 유고형분 정량법

시료 100g에서 수분함량을 감한 값을 유고형분 %로 하나, 이는 유지방, 단백질, 유당, 회분량을 합한 값으로부터 산출할 수도 있다.

(사) 무지유고형분 정량법

시료 100g에서 수분 및 지방함유량을 감한 값으로부터 산출할 수 있으나, 이는 단백질, 유당, 회분량으로부터 산출할 수도 있다.

(아) 유해성금속 시험법

Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법에 준하여 시험한다.

(자) 신선도 시험법

1) 알코올법

시료 2㎖를 시험관 또는 알코올 시험관에 취하고 70%(v/v)에탄올 동량을 가하여 수회 잘 혼합한 후 응고여부를 관찰한다. 이때 응고물이 생성되면 신선하지 않은 것으로 판정한다.

2) 자비법

시료 10～20㎖를 시험관에 취하여 끓인 후 동량의 증류수를 가하여 희석하였을 때 응고물의 생성여부를 검사한다. 이때 응고물이 생성되면 신선하지 않은 것으로 판정한다.

(차) 산도 시험법

Ⅴ.가공품시험법 1.유가공품 가.우유류 (2)산도의 시험방법에 따라 시험 한다.

(카) 비중 측정법

Ⅴ.가공품시험법 1.유가공품 가.우유류 (1)비중의 시험방법에 따라 시험 한다.

(타) 순수유지방 정량법(낙산가 측정법)

순수 분리된 지방의 양이 0.500～0.550g되게 시료를 채취하여 Röse-Gotllieb법에 준하여 지방을 추출 건조하고 이 지방 0.500～0.550g을 50㎖용 삼각 플라스크에 취하여 이하 Ⅴ. 가공품시험법 1.유가공품 차.버터류 (4)지방의 낙산가 시험법에 따라 시험한다.

(파) 진애 시험법(Sediment test)

진애검사기(Sediment tester)에 소정의 진애 시험용 여과지를 부착하여 시료 500㎖를 여과한 후 국립수의과학검역원장이 지정한 표준판과 비교한다. 생유의 경우는 진애량이 2.0㎎ 이하이어야 한다.

상기의 진애검사기외에 진애시험용 여과지의 크기에 적합한 초자 여과기에 여과지를 넣고 흡인 여과하여 시험할 수 있다.

(하) 중화유 감별법(Luckenbach법)

1) 시약 및 기구

가) Colloid철액 : 10% 염화제2철(F2Cl3․6H2O)액 40㎖를 플라스크에 취하고 빙수로 냉각하여 잘 저어주면서 10% NH4OH 35㎖를 가한다. 이 때 처음은 소량씩 넣어 침전이 생기는 것을 확인하고 NH4OH 용액을 추가하여 완전히 침전을 용해시킨 다음 35㎖ 전량을 가한다. 이 용액이 투명하게 되면 이것을 투석하는데 가끔 주위 용액 소량씩을 취하여 HNO3 및 AgNO3액으로 시험하여 염소이온의 반응이 없을 때 투석을 중지한다. 이 용액에 증류수를 가하거나 40℃이하에서 감압 농축하여 비중이 1.041～ 1.045 되게 한다.

나) pH 3.2 완충용액 : 구연산 21.008g을 증류수에 녹이고 1N NaOH액 200㎖를 넣고 다시 1ℓ되게 희석한다. 이 액 43㎖에 0.1N HCl 57㎖를 혼합한다.

다) 0.01% Methyl yellow ethanol 지시약

라) 25～50㎖용 뷰렛

2) 시험방법

산도 시험의 적정 결과 생성된 미홍색의 시료용액에 Colloid 철액 38㎖를 넣어 혼합하고 15분간 정치한 후 여과하여 투명한 여과액(유청) 20㎖를 시험관(2.5 X 13㎝)에 취하고 0.1N NaOH액으로 적정하여 미홍색이 재차 나타나게 한다. 따로 동일한 크기의 시험관에 pH 3.2의 완충액 20㎖를 가하고 양 시험관에 0.01% Methyl yellow ethanol 지시약 0.3㎖씩을 첨가하여 유청액을 0.1N HCl 로서 적정하여 완충용액의 색깔과 같게 한다. 여기에 소요된 0.1N HCl액의 양(㎖)에서 0.17을 빼고 그 남은 수치로부터 우유 100㎖에 대한 수치를 산출하여 이것에 해당하는 산도를 부표 6. 산도환산표에서 구한다.

본 시험에 의하여 구한 산도가 일반 산도 시험법에 의하여 구한 산도와 비교하여 1이상 차이가 없으면 중화유가 아니나, 그 차이가 1～2이면 중화의 의심이 있고 그 이상이면 중화유로 판정된다.

(거) 가수유 감별 시험법

1) 유청의 비중에 의한 방법

300㎖의 공전 삼각 플라스크에 시료 200㎖를 취하고 사염화탄소 20㎖를 가하여 잘 혼합한 후 20% 초산 4㎖를 가하여 잘 혼합하고 원심분리하여 유청을 취하고 그 비중을 측정한다(시료의 양이 적을 때는 비중 천평을 이용한다). 이 때 유청의 비중이 1.026이하이면 가수한 것으로 의심한다.

2) 유청의 굴절율 측정에 의한 방법(Ackermann 법)

50㎖의 공전 시험관에 시료 30㎖를 취하고 염화칼슘(CaCl2)액 0.25㎖를 가하여 잘 혼합한 후 마개를 닫고 끓는 수욕 중에서 15분간 가열한 다음 냉수로 17.5℃되게 냉각하여 상층에 분리된 유청의 굴절계수를 소숫점 이하 첫째자리까지 측정한다. 정상 우유의 굴절율은 38.0～40.0의 범위이나 산도가 높거나 유청이 혼탁되어 있는 것은 측정할 수 없다. 이때 CaCl2액은 비중이 1.1375되게 증류수에 녹이고 그 10배 희석액의 액침 굴절계수가 26인 용액을 사용하여야 한다.

3) 빙점측정에 의한 방법

빙점은 우유에 원래 존재하지 않은 외부로부터 첨가된 물의 비율을 계산하는데 이용된다. 멸균공정 또는 진공멸균공정이 우유의 빙점에 영향을 미칠 수 있으므로 우유의 산도가 0.18%이상인 우유는 원래 시료의 빙점 측정용으로 가치가 없으므로 유의하여야 한다.

가) 서미스트빙점측정기법(Thermistor cryoscope method)

① 기기사용법, 점검, 보정 등은 사용설명서에 따른다.

② 가수여부 판정

빙점이 －0.508℃(－0.525°H)보다 높은 온도는 가수된 것으로 추정하며, 가수여부는 아래의 방법에 따라 확인한다. 즉 가수를 알아보기 위해서는 집합원유 또는 우유에 대한 하루중 빙점의 최대차를 확인해둔다. 집합원유의 가수여부를 확인하기 위해서는 72시간이 경과하기 전의 동일 우군의 집합유에 대한 빙점을 측정한다. 이때의 시료는 감시하에(오전이나 오후를 택하여, 앞서의 착유시작시점을 기준으로 11시간 경과 전이나 13시간 후에 착유한 집합원유는 제외) 착유시스템으로부터 완전히 모은(착유시스템의 헹굼이나 세척전까지) 벌크탱크로부터 채취한다. 이 시료와 앞서 빙점을 측정한 가수의심 시료간에 빙점의 차이가 0.010℃이하면 가수하지 않은 것으로 판정한다. 우유의 경우는 가공공장에서 수유한 모든 집합원유들에서 채취한 시료들의 빙점을 측정하고 그 가중평균을 구해 가수확인을 요하는 우유의 빙점과 비교하여 그 차이가 0.010℃이하면 가공중에 가수되지 않은 것으로 판정한다. 진공저온살균법으로 처리한 우유는 빙점이 0.005℃상승한다.

나) 하트벹빙점측정기법(Hortvet cryoscope methed)

① 기기사용법, 점검, 보정 등은 사용설명서에 따른다.

② 가수여부 판정

이 방법에 의해 얻어진 빙점(°H)은 아래의 공식에 따라 보정하여 가)서미스트빙점측정기법(Thermistor cryoscope methed) 나)가수여부 판정에 따른다.

℃ = {[0.1915×(－°H)]－0.0004785}/0.199

°H = {[0.199×(－℃)]＋0.0004785}/0.1915

℃  : 섭씨빙점,      °H : Hortvet 도수빙점

(너) 두유감식 시험법

1) 시약 및 기구

가) Erdmann시약

증류수 100㎖에 농질산 10적을 넣은 다음 이용액 10적을 농황산 20g에 혼화한다.

나) Froede시약

A㎜oniun molybdate 또는 Sodium molybdate 0.01g을 황산 1㎖에 용해 시킨다.

다) 원심분리기

라) 진공 건조기

마) 항온 수조

2) 시험방법

시료 100㎖에 묽은 염산 2㎖를 가하여 잘 혼합한 다음 여러개의 원심 분리관에 분주하여 40～45℃의 수욕중에서 수분간 가온하고 5분간 1,500rpm 이상으로 원심분리한다. 상등액을 경사하여 버리고 침전은 묽은 염산으로써 씻어 2개의 원심분리관에 모으고 총액이 약 25㎖ 되게 상기의 염산액으로 씻어 넣는다. 이액을 다시 원심분리하여 상등액을 버린 다음 수회 이 조작을 반복한다. 상등액이 청명하게 되면 침전물을 메탄올 100㎖로써 씻어 유리병 중에 모은 다음 NaCl 2g을 넣어 40～50℃의 수욕중에서 5분간 가온하였다가 냉각한 후 여과하고 그 여액에 묽은 NH4OH수를 넣어 중화한 후 감압하에서 증발 건고시킨다. 이 건고물을 에텔 20㎖ 씩으로 3회 탈지하고 에텔을 여과지로 여과한다. 탈지잔사에 무수 에탄올 10㎖를 넣어 잘 혼합하고 수분간 침지하여 다시 에텔 여과시 시용한 여지로 여과하고 에탄올 5㎖로 반복침지 여과한다. 이 여과액을 합하여 수욕상에서 건고시키고 그 건고물에 각각 농황산, Erdmann시약 및 Froede 시약 1～2적을 가하여 10분후에 반응을 검사한다. 두유가 존재하면 황산에 의하여 적자색, Erdmann시약에 의하여 혈홍색, Froede시약에 의하여 적갈색을 나타낸다.

다. 세균학적 시험법

(1) 시료채취 및 방법

멸균 교반용기로서 거품이 생기지 않게 주의하면서 충분히 시료를 교반하고 멸균시료채취관(50㎖)을 삽입하여 밑바닥까지 도달하게 하여 표면까지 끌어올린다. 이 조작을 2～3회 반복하여 시료(25㎖ 이상)를 멸균 시료병에 옮겨 4.4℃이하로 유지하면서 실험실로 운반한다.

(2) 시험용액의 준비

채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 하며, 멸균생리식염수등의 희석액을 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1000배… 등 희석액을 만들어 사용한다.

(3) 세균수

(가) 일반세균수

원유중의 일반세균수는 30±1℃에서 72시간(또는 35±1℃에서 48시간)배양한 후 계수한다. 시험방법은 III.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수 시험법에 따라 시험한다. 다만, 이 방법과 95%이상의 상관관계를 나타내는 기기이용법을 적용할 수도 있다.

(나) 총균수

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (2)총균수 시험법에 따라 시험한다.

(4) 대장균군수

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수 시험법에 따라 시험한다.

(5) 대장균수

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 바.대장균수 시험법에 따라 시험한다.

(6) 병원균 시험법

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 자.탄저균, 차.결핵균, 카.부루세라균, 타.병원성 대장균, 파.살모넬라균, 하.리스테리아균(Listeria monocytogenes), 거.캠필로박터균(Campylobacter jejuni/coli), 너.황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 더.크로스트리디움균(Clostridium perfringens) 시험법에 따라 시험한다.

라. 체세포수 검사법

III.일반시험법 10.체세포수 검사법에 따라 시험한다.

2. 식육(이하 “육”이라 한다) 시험법

가. 관능검사

식육의 품질의 변화는 먼저 외관에 나타나며 이어서 맛에 나타나므로 관능검사시 이점을 충분히 유의하여 실시하여야 한다.

(1) 실시요령

포장된 것은 개봉전에 포장재의 파손이나 오염유무, 포장밑의 결로(結露)나 침출액 혹은 빙결정의 존재유무와 그의 상태를 조사하고 표시, 기타 사항을 기록한다. 조심스럽게 포장을 풀고 개봉과 동시에 냄새를 맡는다.

<각종 식육의 특징>

종류	육 질	지 방
소	선적갈색, 오래된 것은 표면이 암갈색으로 됨	엷은 황백색, 육간에 상강상(霜降狀)으로 되어 있음
말	암적색, 공기에 접촉하면 남색으로 됨, 섬유분리 용이	소에 비해서 황색이며 피하에 직접 손으로 잡으면 용해함
돼지	연분홍백 또는 엷은 회백색 다른 육류에 비해서 유연	백색, 단면은 반짝반짝 지방광택이 있음
면양	선홍색 또는 벽돌모양의 적색, 섬유는 미세하고 아름다움	백색, 경고한 육중에 협잡되지 않음
염소	면양육에 비해서 넓은 색임 특유한 냄새가 있음	면양과 같음
토끼	도색(桃色), 평활하며 광택이 있음. 결착력이 강함	백색으로 소량임
닭	백색근과 적색근이 명확히 구분되어 있음	황색으로 소량임

내용물은 청결한 용기에 옮겨 이물의 유무, 빛깔, 육질, 냄새, 맛 등을 검사한다. 이때 큰 시료일 경우에는 먼저 표면에 대해서 오염의 유무, 육질의 상태, 이물의 부착유무, 육즙의 침출등의 유무를 조사한 다음 내부에 칼을 넣어 이물의 존재유무, 육질의 상태, 빛깔, 냄새 등을 검사하고 다시 일부를 절취하여 맛을 검사한다.

수 개의 육편이나 균질되게 간 고기를 넓게 펴서 육질, 빛깔, 냄새 등을 검사한 다음 일부를 취하여 맛을 검사한다.

빛깔, 육질, 냄새, 맛은 품종, 성별, 연령, 사료 등의 영향으로 각각 약간 차이가 있으나 신선하고 양질의 것은 가축의 종류에 따라 대개 일정한 상태로 있게 되는바, 위의 표에 나타낸 가축의 특징을 참고로 하여 이상한 것은 각각 그의 상태로 기록한다.

(2) 이상(異常)판정

각종의 식육을 통해서, 일반적으로 색에서의 이상(異常)은 적육부에 대한 갈색변화 또는 녹색변화이다.

색이 진할때는 암갈색을, 연한 때는 회백색을 띤다. 녹변은 미생물의 발육에 의하여 생긴다. 특히 때에 따라서는 특히 돼지고기에서 많이 볼 수 있으며 인광(燐光)을 지닌 것도 있다. 또한 이따금 일부의 소부분에 자색이 인정될 때가 있는데 이는 도축장에서의 검인에 의한 것이다.

지방에서의 이상색은 황변, 갈변 등이다. 일반적으로 소나 면양과 같은 초식동물의 육지방의 색은 그다지 특수한 색을 나타내지 않으나 돼지와 같은 잡식성의 단위동물의 육에서는 지방의 색이 여러 가지로 변화하는 것에 주의할 필요가 있다.

황색변화에는 지방의 산화에 의한 것과 먹이에 의한 것이 있다. 지방의 산화에 의한 것은 같은 황변이라도 약간 적색을 띤 감이 있다. 먹이의 영향에 의한 것에는 단순한 색소의 이행에 의한 것과 섭취지방의 중합(重合)산화에 의한 것 등이 있다. 전자는 비교적 맑고 엷은 황색으로서 이상인 것이라고 할 수 없다. 후자는 어두운 황색으로서 대체로 황갈색에 가까운 것이 보통이며 심하면 갈색을 나타낸다. 기타 동결시킨 육류에서 볼수 있는 것으로 지방의 적색에 가까운 부분이 도색(桃色)을 띤 것은 있다(이것은 용혈현상에 의한 것으로서 육중의 색소가 분산된 것이 아닌가 생각된다). 이것은 장기간 경과하면 엷은 갈색으로 변화한다.

육질에서의 이상은 넷트의 발생, 연화, 건조, 육즙의 유출과다, 기포의 존재 등이 있다. 이 가운데 연화는 두가지 원인으로 일어난다. 그 하나는 특히 육표면에서 인정되는 것으로 미생물의 발육에 의해서 조직이 분해됨으로서 일어난 것이다. 또 하나는 도살 전후의 취급 기타의 원인에 의해서 육의 탄력이 상실되어 연약하게 된 것이다. 이러한 연화는 대체로 육색의 회백색화 및 육즙의 과잉 유출을 수반하는 것이 통례이다.

육은 예컨데 말고기와 같이 표면이 매우 습윤성이 풍부한 것이 있다.

그러므로 육의 표면에 육즙이 존재한다고 해서 이상이 있는 것으로 말할 수 없다. 그러나 육즙이 고여서 유출하는 경우는 통상 있을 수 없으므로 명확히 이상한 것이라 할수 있다(특히 그의 육즙의 색이 진한 경우는 방혈 불량으로 고려된다). 이와 같이 정상적이 아닌 것에 대해서 명확히 기록할 필요가 있다.

다만 동결육을 해빙한 것에서 특히 일어나기 쉬우므로 검사 전후에 해빙할 때 이점 유의하여야 한다.

육에는, 때에 따라서, 침으로 찌른 것과 같은 구멍이 무수히 존재하는 경우가 있다. 이러한 현상은 가스발생능을 지닌 미생물의 발육에 의한 것이다.

건조에 있어서도 2가지의 상태가 존재한다. 하나는 통상의 온도에서 건조로써, 섬유가 밀착하여, 부분적으로 교질화된 상태로 나타낸다. 암적색의 약간의 투명화된 색을 동반한 특징이 있다. 또 하나는 동결탈수에 뒤따른 것으로서 이때에는 섬유가 조방(粗放)하게 되고 회백색의 불투명한 색깔을 나타냄이 통례이다. 또한 세절육이나 만육(挽肉) 등에서는 이의 육질항에 지방이나 근육 등의 혼입비율을 검사하며 기록하여 둔다. 이는 수분 기타의 이화학적 결과의 판정에 도움이 된다.

냄새에서의 이상(異常)은 각종 육류의 공급적인 이상취 이외에 각각의 종축에 따라서 특징적으로 나타내는 냄새가 있는데 이런 종류의 냄새는 극단적인 것을 제외하고 통상 이상취(異常臭)라 하지 않는다.

공통적인 이취로서는 부패취, 산란취, 기타 등이 있다. 이중 부패취에는 암모니아취와 유화수소취가 있다.

지방의 산화에 의한 산화취는 경미한 경우에는 입에 넣어보지 않으면 알지 못할 때가 있다. 그러므로 냄새에 있어서는 단지 생육에 대한 냄새 맡는 것뿐 아니라 맛의 검사와 함께 입에 넣어 판단할 필요가 있다. 이밖에 육의 지방은 비교적 냄새의 흡착이 쉬우므로 취급상의 부주의로부터 일어나는 오줌냄새나 약품냄새에 기인되는 때도 있으므로 충분한 주의를 요한다.

나. 이화학적 시험법

(1) 시료의 채취 및 조제법

시료를 골고루 5개 부위에서 총 200g이상을 채취하며 멸균샤레 혹은 대형 광구병에 넣어 4℃이하에서 동결되지 않도록 보존하여 실험실로 운반한다. 그리고 고기의 종류, 채취장소, 채취일자, 업소명 또는 축주명 등 필요한 사항을 상세히 기재한다. 이렇게 채취한 시료는 균질하게 한 다음 필요한 양을 약절구 등에 취하고 일정량을 평량하여 검사 시료로 한다.

(2) 시험방법

(가) 일반시험법

1) 수분측정법

시료 2～5g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 준하여 시험한다.

2) 회분 정량법

시료 2～5g을 도가니에 취하고 대부분의 수분을 제거한 다음 알코올 소량을 가하여 점화하여 탄화시키고 전기곤로상에서 더욱 탄화시킨 다음 이하 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 나.회분에 준하여 시험한다.

3) 지방정량법

시료 5g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 3)속스렛(Soxhlet)법에 준하여 시험한다.

4) 단백질 정량법

시료 1～2g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 다. 질소화합물 (1)총질소 및 조단백 (가)세미마이크로킬달법에 따라 시험한다.

(나) 특수검사법

1) 식육중의 기생충(선모충)검사법

가) 표준기법

① 인공소화를 위하여, 가능하다면, 혀, 늑간 또는 횡격막 근육을 선택한다.

② 마쇄기로 검사시료를 마쇄한다.

③ 37℃에서 수돗물로 조제된 1% 펩신 또는 0.5% 염산용액에 넣고 교반한다. 마쇄재료 10g에 대하여 용액을 최소한 100㎖를 사용토록 한다. 진단을 위하여는 500㎖을 사용한다.

④ 자석식 교반기로 계속 교반하든지 또는 빈번한 간격으로 초자봉으로 교반하면서 37℃에서 4 내지 6시간 동안 항온시킨다.

⑤ 0.25㎜짜리와 0.075㎜ 망체를 통하여 걸러서 수돗물 줄기를 이용하여 잘 세척한다.

⑥ 600㎖평량병에 침전법으로 3회 세척해 넣는다. 진단검사를 위한 완전한 침전 재료를 얻기 위하여는 20분간 정치한다.

⑦ 따뜻한 물을 넣고 해부 현미경하에서 조심스럽게 검사한다.

⑧ 선모충 유충의 감염이 확인된 돼지는 도체 전체를 폐기한다.

나) 공기응용기법

① 검사시료뭉치(25개의 횡격막)내에서 각각의 횡격막에서 10g씩의 근육을 잘라낸다(총량 250g).

② 마쇄기에 걸어 25조각을 넣어 마쇄물로 만든다.

③ 마쇄물 250g을 정확히 계량하여 3.2kg짜리 설탕그릇에 넣는다. 4℃에 저장한다.

④ 검사당일에 마쇄물 250g을 4리터의 가온 인공소화액(펩신 40g, 농염산 20㎖ 가온상수 37℃ 4리터)에 넣는다.

⑤ 공기석과 혼합 교반펌프를 이용하면서 37℃에 항온 처리한다. 펌프는 항온기 상부에 설치한다. 그러나 펌프의 공기주입구는 항온기 내부에 연결하여 37℃의 가온공기가 소화액으로 들어가도록 하여야 한다. 30분후 기류를 체크하고 필요한 경우 펌프를 조정한다.

⑥ 소화가 다되면(4～5시간), 설탕그릇의 내용물을 0.25㎜짜리 망체와 0.075㎜짜리 망체를 통과하도록 붓는다. 차가운 수돗물로 망체를 세척해낸다. 0.25㎜짜리 망체와 내용물을 제거한다. 0.075㎜짜리 망체의 내용물을 다시 세척한 다음 망체의 한쪽편에 침사를 모으고 400㎖ 짜리 비커에 세척해 넣는다.

⑦ 이 침사와 세척액을 20분간 정치시킨 다음, 잔사와 상층 혼합액 10내지, 20㎖를 남기고 상층액을 따라 버린다. 잘 섞은 후 페트리디쉬에 담는다.

⑧ 10x의 접안렌즈와 1.25x의 대물렌즈를 이용하여 의심스런 유충을 검사한다. 검사될 용액은 소량이므로 페트리디쉬의 전체가 다 검사되도록 주의깊게 검사한다.

2) 식육감별법

가) Glycogen검사법

시료 50g을 잘게 썰어 잘 분쇄한 다음 200㎖의 증류수를 가하여 1시간 동안 끓인 다음 냉각하고 여과한다. 이 여과액 5～10㎖를 시험관에 넣고 요오드틴크액을 첨가할 때 접촉면에 암적색 내지 적갈색의 테가 생기면 Glycogen 양성이다.

그러나 단순한 암색이나 혼탁을 나타내면 다시 아래의 방법에 따라 시험한다. 시료 50g에 KOH(1.5 : 30)용액 200㎖를 가하고 가열하여 근육조직을 충분히 파괴시킨후 여과하고 이 여과액을 증발농축시켜 약 50㎖가 되게 한 다음 냉각시키고 석출된 단백질을 다시 여과한다. 만약 이 여과액이 착색되어 있을 때는 10% HNO3액을 소량씩 적하하여 탈색시키고 이 액에 대하여 상기의 요오드반응 시험을 실시한다.

<각종 육류중의 Glycogen 함량>

육종 성분	마육	우육	송아지육	돈육
수 분(%) Glycogen(%) Glucose (%)	73.9 0.675 0.225	75.3 0～0.164 0.036～0.196	78.8 0 0.21～0.25	73.8 0 0.100～0.208

(참고자료)

나) 지방검사법

시료를 잘게 썰어 잘 분쇄한 다음 증류수를 가하여 약 30분간 끓인 후 상층에 유리된 지방을 취한다. 이 지방을 분액 깔대기에 옮기고 에텔을 가하여 잘 진탕하고 정치시켜 수분을 분리한 다음 에텔을 증발시켜 순수한 지방을 얻는다. 이 지방을 한쪽 끝이 막힌 유리모세관에 넣고 지방이 굳어지기를 기다렸다가 다시 수은 1적을 그 위에 놓고 온도계가 부착된 수조 중에서 약하게 가열하여 지방의 용융점을 구한다.

<각 가축의 지방용융점>

가축의 종류	지방용융점	가축의 종류	지방용융점
소말	45～50℃ 45～54℃	양 돼지	43～55℃ 43～48℃

위의 수치는 실험자, 기타 실험설비 등에 따라 차이가 있으므로 각기 지방 용융점을 구한 다음 그 성적에 준하여 판별하여야 한다.

다) 자비법

깨끗한 냄비에 시료 한조각을 넣고 증류수를 가하여 뚜껑을 덮은 채 끓이고 끓기 시작하면 뚜껑을 열어 검사시료 중에서 발산되는 수증기의 냄새를 순간적으로 맡아 각 식육의 특유한 냄새를 관능적으로 판별한다.

라) 혈청학적 검사법

① 면역혈청의 조제

㉮ 면역용 항원

칼륨명반으로 처리한 자비혈청, 또는 농축생육 침출액의 생리적 식염수 부유액이 농후하여 주사하기 어려울 때에는 근육내 주사하는 것을 고려하여 적당량의 생리적 식염수를 추가한다.

㉯ 면역혈청의 조제

혈청을 입수가능한 동물종(소, 말, 돼지, 면양, 산양, 개, 고양이등)에 자비혈청(30분), 혈청의 입수가 곤란한 동물종(고래, 캉가루등)에는, 생육으로 부터의 침출액으로 토끼를 사용하여 면역혈청을 조제한다.

혈청을 사용하는 경우: 적어도 2～3마리의 혈청을 채취한다. 혈청을 물 (1:3)로 희석하여 30분간 끓인다. 냉각시킨 후 100㎖에 대해서 10% 명반용액(여과 멸균한 것, 가열해서는 아니됨) 5～10㎖를 가한다. 생성된 백탁을 원심분리하여 잔사를 약절구로 마쇄하여 생리적 식염수로 부유시킨다. 이때 액량은 혈청을 희석하기전의 양으로 되돌린다. 여기에서 얻은 항원과 체중 3kg정도의 토끼에 7일 간격으로 4회, 1회 2㎖를 후지근육 내에 주사한다. 최종 주사후 7～10일째에 시험채혈을 한다. 항원희석법으로 3,200배 이상 양성인 것을 전채혈한다. 만약 항체의 상승이 인정되지 않을 경우에는 다시 일주일 후에 채혈하여 검사한다든가 또는 추가면역을 실시한다.

전채혈에서 얻은 면역혈청은 50℃에서 30분간 처리하여 비동화시킨 후 마죠닌을 1:5000의 비율로 가하여 빙실 또는 냉장고에 보존한다.

면역혈청을 소분하여 두면 사용시 편리하다.

얻은 면역혈청의 종특이성(種特異性)에 대해서는 침강반응의 술식항에 따라 유속(類屬)반응을 나타내는 가를 확인한다.

생육침출액의 경우 : 적어도 2～3마리의 고기를 만육케 한다.

만육 1에 생리적 식염수 2의 비율로 가하여 잘 진탕 혼화시킨후 하룻밤 냉장한다. 침출액은(필요에 따라 짜서) 채취하여 pH 7.0으로 조정한다. 10,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 채취한다. 이때 표면에 지방이 떠오르므로 여지로 여과하여 지방을 제거한다. 셀로판막을 사용하여 고형 폴리에칠렌 글리코올을 써서 침출액을 약 1/10로 농축시킨다.

농축액을 혈청의 경우와 같이 10% 명반액으로 처리하여 원심분리하여 모으고 잔사를 약절구로 마쇄하여 생리적 식염수로 부유시킨다. 이때의 액량은 농축침출액의 양과 일치시킨다. 3kg 전후의 토끼의 후지근육에 7일 간격으로 4회, 1회 1㎖를 주사한다. 최종 주사후 7～10 일째에 시험채혈을 하여 3,200배 이상 양성의 것을 전채혈한다. 이하 혈청으로 면역하는 경우에 준하여 실시한다.

㉰ 면역혈청의 보존

얻어진 면역혈청은 비동화후 질화나트륨(1:1,000～10,000)을 가하여 소분하여 동결(-20℃)보존한다.

㉱ 면역혈청의 흡수

얻어진 면역혈청이 이종동물의 생육침출항원과 교차 반응을 나타날 때는 해당 동물의 비동화 혈청을 가하여 4℃에서 24시간 방치후 석출된 침전을 3000rpm에서 15분간 원심하여 제거하고 그의 상청을 흡수혈청으로 한다. 흡수할 때에는, 한번에 다량의 혈청을 가하여 흡수조작을 피하여 소량씩 수회로 나누어 실시한다. 이종동물의 생육침출액에 대해서 반응이 없어질 때까지 반복하여, 1회의 흡수조작에 가하는 혈청의 양은, 면역혈청 10㎖당 0.1～0.2 ㎖로 한다.

② 시료(생육)로부터의 침강반응용 항원의 조제 : 면역용 생육침출액의 조제에 따르든가(이 경우에는 반드시 농축치 않아도 된다) 또는 아래의 방법으로 실시한다.

시료 10g에 생리적 식염수 40㎖를 가하여, 호모게나이자로 2분간 균질화한다. 37℃에서 60분간, 가열침출한 후 여지로 여과한다. 중층법에 따라 실시할 경우에는 여액의 pH를 7.0으로 조정한 후 원심상층(10,000rpm에서 15분간)을 항원으로 한다. 이때 투명한 액이어야 한다. 겔 확산법의 경우는 여액을 그대로 항원으로 한다.

③ 면역반응의 술식

㉮ 면역혈청침강반응(중층법)

침강반응용 시험관(내경 2～3㎜, 높이 75㎜) 및 미량 피펫을 준비한다. 이것은 미리 멸균하여 둘 필요가 있다. 농축시킨 육의 엑기스를 50에서 12,000배까지 희석한다. 필요에 따라서는 고농도 혹은 저농도에 대해서 실시한다. 먼저 미량피펫으로 소량의 면역혈청을 침강반응용 시험관에 분주한다.

그위에 다른 미량피펫으로 소량의 항원을 조용히 중층하여 접촉면을 만든다.

37℃의 부란기에 넣어 30분인 1시간 후에 검사한다.

결과의 판정: 다음을 표준으로 하여 성적을 기록한다.

+++ : 침강물의 양이 상당히 많으며 두터운 원판을 만들고 또한 그의 일부가 관저에 침전되어 있는 것

++ : 비교적 두터운 원판을 보이는 것

+ : 엷은 원판을 나타낸 것

± : 침강물의 형성이 매우 적어서 다소 상층의 액에 혼탁하게 보이며 대조와는 뚜렷한 차이가 있는 것

: 침강물이 없어, 대조와 차이가 없는 것

침강반응양성(+, ++, +++)인 것에 대해서는 육종(肉種)을 밝힐 수 있게 된다.

㉯ 미량겔 확산법(신속법)

Ⓐ 검사재료

육엑기스 표준항온 : 생육의 경우에는 육종기지의 만육(挽肉)을 4배량의 생리적식염수중에 현탁시켜 37℃에서 1시간 유지시킨 다음 여과한다. 여액을 동결건조하여 사용할 때까지 -20℃에 보존한다. 가열육의 경우에는 육종기지의 식육을 100℃에서 30분간 끓인 후, 2배량의 0.2N 수산화나트륨을 첨가하여 37℃에서 1시간 유지한다. 0.2N 염산을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정한 다음, 생리적 식염수를 첨가하여 최종농도를 20(w/v)%로 조정한다. 4℃에서 18시간 유지한 후 여과하여 여액을 -20℃에서 사용할 때까지 보관한다.

면역항혈청의 조제 : 면역혈청 침강반응항의 조제법에 따른다.

Ⓑ 조작술식 : 현미경용 스라이드글라스(28×76㎜) 위에 1% 한천 3.3㎖를 흘리고 냉각시킨 후 직경 2.0㎜의 중심공(中心孔)과 같은 직경의 주변공(周邊孔)을 3.0㎜의 거리로 첨공하여 약 0.05㎖의 항혈청 및 각종 육엑기스 표준항온을 각각의 중심공 및 주변공에 유입한다. 실온에서 습한 상태로 4～6시간 방치시킨 후에 침강곡선을 관찰하여 육종을 판정한다.

이상의 미량겔확산법에 의한 경우, 아래사항에 유의하여 실시하여야 한다. 한천은 pH 8.0의 바비튤 완충액에 분말한천(혈청반응용)을 1%의 비율로 가하여 가열 용해한 것을 사용한다. 판정은 실온(20℃)에서 18～24시간 방치한 다음 실시한다. 이 기간동안 한천이 건조되지 않게 적당한 습기를 유지하는 용기에 보관하여야 한다.

㉰ 한천겔 확산법

한천겔 평판의 작성은 아래와 같이 실시한다.

생리적식염수 95㎖에, 분말한천(혈청반응용) 1.0～1.5g, 붕산완충액(pH8.5) 5㎖ 및 질화나트륨 10㎎을 가하여 가열, 용해한다.

한천액을 샤레에 옮기고 두께 3㎜의 한천평판으로 한다. 다음 그림과 같은 겔 천공기를 사용하여 직경 6㎜의 구멍을 원의 중심 및 원주위에 뚠다.

각각의 구멍의 중심에서 중심까지의 간격은 9㎜로 한다.

천공기로 사용치 않을 경우에는 미리 구멍의 배치도를 그린 종이를 샤레 밑에 놓고 적당한 기구로 한천의 구멍을 뚠다.

중심의 구멍에 면역혈청, 주위의 구멍에 검사육 침출액을 각각 약 50㎕씩 모세관 피펫으로 주입한다.

판정은 수분의 증발을 방지하면서 실온(25℃전후)에서 24～36시간 방치한 다음 면역혈청공과 항온공간에 생기는 침강대의 유무에 의한다.

어떠한 술식에 의할 경우라도, 반드시 기지동물종의 생육침출액을 양성대조로, 생리적식염수 혹은 사용한 완충액을 음성대조로 두어야 한다. 또한 겔확산법에 의할 경우에는 동일한 스라이드글라스 혹은 평판상에 2종 이상의 면역혈청을 취급하여서는 안된다.

마) 히스티딘 디펩타이드(Histidine dipeptide)함량 측정법

① 시약 및 시액

㉮ 이동상 A : 물 약 700㎖에 lithium citrate 9g과 lithium chloride 20g을 넣어 녹인 후 pH를 7.5로 맞춘 다음 1ℓ로 한다.

㉯ 이동상 B : 물 약 700㎖에 lithium hydroxide 6g과 lithium chloride 6g을 넣어 녹인 후 pH를 14로 맞춘 다음 1ℓ로 한다.

㉰ 유도체화용액  : o-프탈알데히드 100㎎을 메탄올 10㎖에 녹여 OPA diluent(Pickering Lab.) 950㎖에 넣은 후 Thiofluor 2g 및 Brij 35용액 3㎖를 순차적으로 가한다.

㉱ 표준용액 : L-anserine 및 L-carnosine을 각각 증류수에 녹여 50μM이 되게한다.

㉲ 0.9% 염화나트륨 용액 : 물 약 10㎖에 염화나트륨 0.9g을 넣어 녹인 후 물로 100㎖로 한다.

㉳ 8% sulphosalicylic acid 용액 : 물 약 30㎖에 sulphosalicylic acid 8g을 넣어 녹인 후 물로 100㎖로 한다.

② 시험용액의 조제

시료 약 1g에 0.9% 나트륨염용액 1㎖를 가하여 마쇄기로 혼합한 후, 다시 8% sulphosalicylic acid 용액 4㎖를 첨가하여 충분히 균질화한 다음 20℃에서 30분간 초음파처리한다. 균질화된 혼액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리한 다음 상층액을 0.45㎛의 여지로 여과하여 시험용액으로 한다.

③ 시험방법

㉮ 고속액체크로마토그래피의 조건

- 칼럼 : Lithium cation exchange column(안지름 3㎜, 길이 150㎜)

- 칼럼온도 : 42℃

- 검출기 : 형광검출기(여기파장 330㎚, 형광파장 466㎚)

- 이동상

시간(분)	이동상 A	이동상 B
0 5 130	100 100 94	0 0 6

- 유속 : 0.3㎖/분

- 반응조 온도 : 130℃

- 형광반응조 : 이동상에 대해 유도체화용액(형광액)을 넣고 일정하게 유지한다.

㉯ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20㎕씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액중의 히스티딘 디펩타이드 함량을 구하고 그 비를 산출한다. 이 시험법은 소, 돼지, 말, 닭, 오리 및 칠면조의 식육을 감별할 수 있을뿐만 아니라 열처리육에서도 감별이 가능하다.

(예)

축 종	Carnosine/ Anserine ratio	축 종	Carnosine/ Anserine ratio
소 돼지 말	8.33±1.87※ 30.07±12.66 134.58±39.77	닭 오리 칠면조	0.39±0.20 1.61±0.58 0.07±0.02

※ 평균±표준편차

바) 유전자혼성화(DNA-hybridization)법

① 시약 및 시액

㉮ 추출용액 A : 100㎜ NaCl/5㎜ EDTA/100㎜ Tris-HCl/1% lauryl  sulfate(SDS)/10㎜ dithiotreitol(DTT)

㉯ 페놀용액 :  페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25 : 24 : 1)

㉰ 추출용액 B : 100㎜ NaCl/5㎜ EDTA/100㎜ Tris-HCl/1% lauryl sulfate(SDS)

㉱ dNTP labeling mixture(pH 7.5) : 1 ㎜ dCTP/1 ㎜ dGTP/1 ㎜ dATP/0.65 ㎜ dTTP/0.35 ㎜ DIG-dUTP

㉲ 혼성화반응용액(hybridization buffer) : 0.1% N-laurylsarcosine/ 0.02% SDS/5×SSC buffer(saline-sodium citrate buffer)/1% blocking solution

㉳ 세척액Ⅰ: 2×SSC/0.1% SDS

㉴ 세척액Ⅱ(소, 염소, 면양) : 0.1×SSC/0.1% SDS

㉵ 세척액Ⅱ(돼지, 말, 개) : 0.4×SSC/0.1% SDS

㉶ 세척액Ⅱ(닭, 칠면조, 오리) : 2×SSC/0.1% SDS

② 시험방법

㉮ 식육에서의 DNA 분리

식육을 잘게 마쇄하여 일정량을 취한 다음 검사시료량의 20배 용량에 해당하는 추출용액 A를 가하고 혼화하여 60℃에서 1시간 정치한다. 여기에 추출용액A와 동량의 페놀용액을 첨가하고 원심분리(12000rpm, 10분)하여 상층액을 분리한다. 분리된 상층액에 상층액의 2배 용량에 해당하는 에탄올을 가하고, 3M sodium acetate를 넣은 후 -70℃에서 10분간 정치한다. 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전된 DNA를 회수하여 Tris-EDTA buffer(TE-buffer)에 용해한다.

㉯ Probe 작성

분쇄한 간 조직 일정량을 취하고 취한량의 20배 용량의 추출용액B를 첨가하여 1시간 정치시킨 다음 페놀용액으로 3회 추출한다. 이를 원심분리하여 추출액의 상층액을 분리한 후 위의 ㉮식육중 DNA분리의 ‘분리된 상층액의 2배 용량에 해당하는～ ’ 이하의 과정과 동일한 방법으로 DNA를 회수한다. 여기에 ribonuclease-IA(1000㎍/㎖)를 가하고 37℃에서 1시간 반응시켜 RNA를 제거한다. 다시 페놀용액 추출과 에탄올 침전을 반복하여 DNA를 정제하고 정제된 DNA는 초음파처리기로 단편화한 후 probe용 DNA로 사용한다. Probe의 표지는 단편화된 probe용 DNA를 끓는 물에 10분간 침지하고 즉시 얼음에 담구어 완전히 냉각시킨 다음 DNA 3㎍에 hexa- nucleotide mixture 2㎕, dNTP labeling mixture 2㎕ 및 Klenow enzyme(2 unit/㎕) 1㎕를 가하여 37℃에서 24시간 반응시킨다. 표지가 완료된 후 0.2M EDTA(pH 8.0) 2㎕를 가하여 반응을 중지시킨 후 다시 에탄올로 침전시켜 DNA를 회수하여 probe로 사용한다.

㉰ 혼성화반응(Hybridization)

식육에서 분리한 DNA를 nylon membrane에 옮겨 UV- illuminater상에서 5분간 crosslinking한 다음 이 membrane에 혼성화반응용액을 가하여 68℃에서 약 1시간 평형화한다. 다시 membrane을 probe가 첨가된 혼성화반응용액에 침지시켜 68℃에서 12시간 혼성화 한다. 혼성화가 완료되면 membrane을 실온에서 세척액Ⅰ로 5분간 2회 세척한 다음 축종에 따라서 세척액Ⅱ를 차등 적용하여 세척한다.  세척후 membrane은 anti-digoxigenin-alkaline phosphotase conjugate와 실온에서 30분간 반응시키고 NBT(Nitroblue tetrazolium)와 X- phosphate용액을 기질로 암실에서 발색하여(아래의 축종별 혼성화반응조건 참조) 관찰한다.

<축종별 혼성화반응조건 >

구 분	소, 염소, 면양	돼지, 말, 개	닭, 오리, 칠면조
probe농도(ng/㎖)	200	200	200
혼성화반응	12시간, 68℃	12시간, 68℃	12시간, 68℃
세척액Ⅱ (세척조건)	0.1×SSC/0.1%SDS (65℃, 15분, 2회)	0.4×SSC/0.1% SDS (65℃, 15분, 2회)	2×SSC/0.1% SDS (65℃, 10분, 2회)
발색시간(분)	30	20	40

③ 결과판독

㉮ 알고있는 축종의 식육을 대조군으로 하여 상기의 시험과 같은 조건으로 실시하여 검사시료의 발색환(청보라색)과 색의 강도를 비교하여 감별한다.

(예)  축종별 식육중 닭고기의 감별

<주 해>

□ 축종별 식육에서 추출한 DNA 즉 쇠고기(B), 돼지고기(P), 말고기(H), 오리고기(D), 칠면조고기(T), 면양고기(S), 개고기(N) 및 염소고기(G)의 DNA는 membrane의 아랫줄에 dotting(각 1000ng), 닭고기의 DNA는 윗줄에 농도별로 dotting(C1 : 1000ng, C2 : 500ng, C3 : 250ng, C4 : 125ng)한 다음 닭 probe로 혼성화한 그림이다.

□ 닭고기의 경우(식육추출DNA와 probe가 동일 축종인 경우) 명확한 발색환을 형성하며 그 강도는 DNA농도에 비례한다.

□ 닭과 근연관계인 오리고기(D), 칠면조고기(T)에서도 발색환이 관찰되나 그 강도는 동일 농도조건에서 닭고기(C1)의 발색환에 비하여 미약함. 따라서 발색강도 차이에 따라 근연관계 축종의 식육도 감별 가능하다.

□ 이 시험법은 소, 돼지, 닭, 말, 오리, 칠면조, 면양, 개 및 염소 등 근연축종을 포함한 9종의 식육을 감별할 수 있을 뿐만 아니라 열처리육에서도 적용이 가능하다.

3) 부패육 검사법(신선도 검사법)

가) 부패육(신선도) 판정기준

시 험 항 목	기 준
o pH o 암모니아 시험 o 유화수소 검출시험 o Walkiewicz반응 o Trimethylamine o 휘발성염기질소	6.2～6.3이면 부패초기로 의심 음성 미검출 음성 시료 100g중 4㎎이하 시료 100g중 20㎎이하

나) 암모니아 시험법

25% 염산, 에텔, 알코올 혼합액(1:1:3)을 직경 2㎝ 높이 10㎝의 관저로부터 1㎝ 높이되게 넣어 마개를 하고 밀봉한 후 잘 진탕하여 끓는 물 속에서 가열한다. 다음 검사시료의 소편을 백금선에 붙여서 신속히 마개를 열고 관벽에 육편이 닿지않게 그리고 시약면에서 약 1㎝ 높이되게 육편을 달고 관찰할 때 흰 안개가 관내에 발생하면 양성으로 판정한다.

이때 신선한 동일종의 육을 대조로 하여 시험하면 보다 정확한 판정을 할 수 있다.

다) 유화수소 검출법

시료 10～25g을 잘게 썰어 시험관에 넣고 시료가 완전히 젖을 정도의 묽은 황산액을 가하고 10% 질산연(Lead nitrate) 또는 초산연(Lead acetate) 용액을 시료가 완전히 잠길 정도로 추가한다.

다음 여과지를 액면이나 시험관의 벽에 접촉되지 않게 매달은 후 밀봉하고 관찰할 때 지편이 담황색 내지 갈색을 나타내면 소량의 유화수소가 존재함을 의미하며 담홍색으로 변하면 다량 존재하는 것으로 판정한다.

라) 휘발성염기질소의 측정법(콘웨이법)

Ⅴ. 가공품시험법 3.식육가공품 가.공통사항 (4)휘발성염기질소에 따라 시험한다.

마) pH측정법

시료 5g을 잘 마쇄하여 물 20㎖를 가하고 침출시킨 다음 원심분리하여 상층액을 pH메타로 측정한다.

이때 신선한 동일종의 육에 대해서 대조로 시험하여 비교함이 바람직하다.

이상의 여러 시험을 하여 동시에 실시하여 판정함이 타당하다.

바) Walkiewicz반응

① 시료 : 5g을 비이커에 취하고 물 50㎖를 가하여 침출(30분) 후  여과

② 별도로 시험관A에 A액(1% HgCl2) 2㎖, 시험관B에 B액(1% HgCl2를  0.05%되게  초산으로 희석한 것) 2㎖를 취하여

③ 여액 0.1㎖씩을 적가

④ 다음 표에 따라 판정

<Walkiewicz반응 결과 판정>

부패의 정도(선도)	A 액	B 액
초기부패의 직전	+	+
초 기 부 패	+	±
부 패	++	+～++

-  : 전혀 혼탁되지 않은것

± : 원액 0.1㎖를 가할때 약간 혼탁하나 시험관을 흔들면 다시 투명하게 되는 것.

+ : 혼탁되며 시험관을 흔들어도 전체가 혼탁한 것

++ : 혼탁이 침전되어 가라 앉는 것

사) Trimethylamine 시험

① 시료 10～20g을 비이커(100㎖용)에 취하고 물 50㎖를 추가한 다음 30분간 교반침출

② 제단백(20% TBA 10～20㎖)

③ 물을 가하여 100㎖로 하여 여과(1㎖까지)

④ 여액 5㎖(Trimethylamine으로 2～20㎍)를 25㎖용 분액깔대기에 취함.

⑤ 중성포르말린(1 : 3) 1㎖, 톨루엔 10㎖, 포화탄산칼슘액 3㎖를 가하고 1분간 진탕, 5분간방치

⑥ 상층(톨루엔)을 무수황산나트륨(약 0.5g)이 함유된 공전시험관에 옮겨서 탈수(탈수 톨루엔 용액)

⑦ 0.02% 피크린산의 건조톨루엔 용액 5㎖를 가한 다른 공전시험관에 ⑥의 탈수 톨루엔액 5㎖를 주입.

⑧ 생성된 황색도를 표준액과 비교(파장 420㎚)

☆ 표준액 : Trimethylamine을 위와 같이 처리하여 발색시킨다.

☆☆시료 100g중 4～6㎎이면 부패초기로 인정.

다. 세균학적 시험법

(1) 시료 채취 및 방법

시료채취는 무작위로 채취하되 나름대로 기준이 있어야 하며, 작업 라인이 여러개 있을 경우 어느 한 라인을 택해서 채취하나 다음 번에는 다른 라인을 검사한다.

(가) 도체

도체는 표면( 10cm × 10cm)의 3개부위에서 채취하여 검사하는 것을 원칙으로 하고 부득이한 경우에 1개 부위(흉부표면)에서 채취하여 검사할 수도 있다. 다만 닭의 도체는 1마리 전체를 대상으로 한다.

1) 소

소 및 돼지도체는 도축완료후 냉장실에서 12시간이상 경과된 도체표면을 대상으로 하며, 부득이한 경우에 예냉직전의 도체 표면을 대상으로 할 수 있다. 이분도체육에서 시료를 채취하며, 특히 도체가 이동한 전면과 후면에서 각각 골고루 시료가 채취되도록 해야한다.

멸균용기에 담긴 멸균 가아제나 스폰지, 10㎖ Buffered peptone water(BPW), Butterfield's phosphate diluent(BPD)등 희석액, stomacher bag, 100 cm2용 재료채취틀, 멸균장갑, 사다리, 소독수, 손수레등을 준비한다.

멸균한 스폰지 혹은 2겹의 가아제 패드(10cm × 10cm)을 미리 준비한 BPD 또는 BPW를 약 10㎖로 적신 후 사용한다.

특히 시료를 채취하는 부분은 일반적으로 미생물이 가장 많이 오염된 부분이므로 도체의 다른 부위로 오염되지 않도록 해야한다.  어떤 도체에서 채취할 지를 미리 결정한 후 아래의 방법에 따라 시료채취를 시작한다.

가) 시료용 멸균시험관 또는 봉지에 미리 표기를 하고 보조원과 함께 채취를 시작한다.

나) 도체 옆에 사다리를 갖다놓고 채취를 용이하게 한다.

다) 만약 시료채취용 틀을 재사용하려면 보조원은 이를 소독수에 최소한 2분 이상 담근 후 사용해야 한다. 첫 작업을 실시하기 전에 보조원은 장갑의 외부가 손에 닿지 않도록 조심스레 착용한 후 소독수에서 틀을 끄집어낸다. 틀에서 소독수를 털어내고 멸균 탈지면으로 깨끗이 닦아내어 건조시킨 후 도체와 접촉하는 면은 다른 곳과 닿지 않도록 특히 주의한다.

라) 채취부위는 옆구리, 둔부, 가슴부위 등 3부위를 채취함이 원칙이다. 다만 시료채취가 곤란하다고 인정될 경우에는 가슴부위만을 채취할 수도 있다.

마) 가아제 또는 스폰지를 적시기 위하여 시험관 또는 비닐봉지를 열고 멸균 BPW(살모넬라 검사) 또는 BPD 약 10㎖을 가아제나 스폰지가 담긴 멸균 시험관 또는 봉지에 붓는다.

바) 재료 채취용기를 봉한 후 가아제나 스폰지를 완전히 적신다.

사) 가아제 또는 스폰지를 윗부분으로 밀어 올리고 용기를 개봉한다. 절대 손가락이 용기내부와 접촉하지 않도록 하고, 한쪽에 조심스레 보관한다.

아) 멸균장갑을 착용한다.

자) 시료채취할 손으로 적셔진 가아제 혹은 스폰지를 잘 꺼낸다. 이때 절대로 도체에 닿을 가아제(스폰지)면은 만지지 않는다.

차) 다른편 손으로 틀을 잡는데 반드시 틀의 바깥쪽 가장자리를 잡는다.

카) 도체의 옆구리부위(Flank)에 위치를 잡고 틀을 갖다 댄다.

타) 한쪽 손으로 틀을 잡되 시료를 채취할 부분은 절대로 손이 닿지 않도록 한다.

파) 다른 쪽 손을 이용하여 가아제(스폰지)의 전표면(10cm × 10cm)으로 닦되 가로로 10번, 세로로 10번 잘 문질러준다. 도체에 묻어 있는 혈액응고 덩어리가 완전히 떨어지도록 문지르되, 너무 세게 문질러 스폰지가 찢어지는 일은 없도록 한다.

하) 옆구리에 문지른 동일한 가아제(스폰지)의 동일한 면을 가슴(Brisket)에 대고 파.항을 반복 실시한다.

거) 가슴부위를 문지른 후 둔부를 채취하기 위하여 사다리를 올라가는데 한쪽 손만을 이용한다. 시료를 채취할 손은 오염되지 않도록 하라.

너) 옆구리나 가슴부위를 닦아낸 면의 반대쪽면의 엉덩이부위(Rump)에 채취틀을 대고 파.항을 반복실시한다.

더) 가아제(스폰지)를 조심스레 멸균시험관 또는 봉지에 담되 가아제(스폰지)가 봉지외부와 접촉하는 일은 없도록 한다.

러) 멸균봉지 내부의 과다한 기포는 제거하고 완전히 밀폐하고, 실험실로 운반한 다음 최종용량이 40㎖되게 가하여 시험한다.

2) 돼지

시료를 채취하는 방법은 소의 경우와 동일하나, 채취부위가 다르다.

가) 먼저 복부(Belly)를 채취한다.

나) 사다리를 타고 올라가서 복부채취한 면과 동일한 면을 둔부(Ham)에 대고 채취한다.

다) 내려와서 가아제(스폰지)의 반대쪽면을 턱부위(Jowls)에 대고 시료를 채취한다.

3) 닭

도계육인 경우 냉장과정을 거친 것에서 택하되, tri㎜ing되지 않은 완전한 도계육에서 포장하기 직전의 것을 택하여 채취한다. 멸균된 3,500㎖ 용기의 비닐봉지, 400㎖ 멸균 BPW 및 BPD, 멸균장갑, 비닐끈 등을 준비한다.

가) 모든 장비를 준비한 다음 보조원은 계육이 담긴 시료채취용 비닐봉지에 BPW 또는 BPD를 붓는 것을 도와준다.

나) 멸균장갑을 끼고 샘플채취 비닐봉지의 내부를 손으로 만지지 않도록 하면서 비닐봉지를 연다.

다) 무균적으로 계육을 비닐봉지에 넣고 멸균 BPW 또는 BPD를 400㎖ 부은 다음 비닐봉지를 밀봉한 후 30회(약 1분간) 반원을 그리면서 흔들어준다.

라) 테이블 위에서 비닐봉지를 열고 멸균장갑을 낀 손으로 주의하면서 계육을 제거한다.

마) 채취된 액중 40㎖만 다른 멸균용기에 담아서 분석실로 보내고 나머지는 버린다.

(나) 식육

식육은 원칙적으로 3개부위 이상에서 약 300g을 무균적으로 채취하여 냉장 운반 후 25g을 대상으로 미생물검사를 실시함을 원칙으로 하고 시료량이 적을 경우나 부득이한 경우에는 10g을 대상으로 검사할 수 있다. 기타 포장된 원료육의 경우 무작위로 3개이상을 채취한다.  멸균 비닐봉지, 멸균 비닐장갑, 끈 등의 모든 채취도구는 작업하기에 편리한 곳에 두며 미리 어떤 시료를 채취할 것인가를 먼저 결정한 후에 시작한다. 멸균장갑을 반드시 착용한 후에 무균적으로 시료를 채취하며, 채취 후 시료봉지를 완전히 묶고, 봉지를 다시 다른 봉지 안에 넣는다. 시료는 무균적으로 갈은 직후, 양념을 넣기 전, 최종 포장직전의 고기를 채취하여 멸균 비닐봉지에 담는다. 특히 장갑낀 손이 비닐봉지 내부와 닿지 않도록 주의해야 한다.

(2) 시험용액의 준비

일반적인 주의사항으로서는 시료를 무균적으로 취급하는 것이다. 미생물의 수가 적은 것으로 예상되는 시료에 대해서는 특히 신중히 취급하여야 한다. 검사시료를 포장한대로 채취한 때에는 그 외부가 시료에 오염되지 않게 주의하면서 멸균한 기구로 제거한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다. 채취한 시료에 대해서는 멸균생리식염수등의 희석액을 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1000배… 등 희석액을 만들어 사용한다.

(가) 도체표면시료

검사시료표면의 일정면적(보통 100㎝²)을 일정량(5㎖～10㎖)의 멸균생리식염수등의 희석액으로 습한 멸균가제와 면봉 등으로 씻거나 문질러 일정량(45～90㎖)의 희석액을 넣고 세게 진탕하여 부착균의 현탁액을 조제하여 시험용액으로 한다.

(나) 식육

채취된 시료의 일정량(10～25g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른 후 멸균생리식염수등의 희석액을 9배량을 가해 균질기나 스토마커 등을 이용해서 가능한 균질화하여 시험용액으로 한다.

(다) 냉동식육

냉동식육은 냉동상태의 검사시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 무균적으로 제거하고 시험용액을 조제한다.

(3) 일반세균수

III.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수 시험법에 따라 시험 한다.

(4) 대장균군수

III. 일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수 시험법에 따라 시험한다.

(5) 대장균수

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 바.대장균수 시험법에 따라 시험한다.

(6) 진균수(효모 및 사상균수)

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 아.진균수 시험법에 따라 시험한다.

(7) 병원균 시험법

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 자.탄저균, 차.결핵균, 카.부루세라균, 타.병원성 대장균, 파.살모넬라균(Salmonella spp.), 하.리스테리아균(Listeria monocytogenes), 거.캠필로박터균(Campylobacter jejuni/coli), 너.황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 더.클로스트리디움 시험법에 따라 시험한다.

3. 원료알의 시험법

가. 이화학적 시험법

(1) 시료의 채취 및 조제

(가) 시료의 채취

1개의 수집상자중에서 상중하에서 임의로 필요량을 채취한다. 검사할 때까지 시일을 요할 경우는 5～10℃에서 보존하고 채취시 채취번호, 채취일자, 온도, 용기, 난각의 위생상태, 가공업소 및 채취장소 등 필요사항을 기입한다.

(나) 시료의 조제법

비누와 솔로써 난각의 표면을 깨끗이 씻고 물기를 제거한 다음 70% 알코올에 10분간 담갔다가 기공이 있는 쪽을 잡고 멸균된 송곳으로 난황이 나올 수 있을 정도의 구멍을 반대쪽 난각에 만들고 기공이 위로 가게 삼발이 위에 놓고 광구병에 난백을 받는다. 다음 기공부위를 화염으로 가볍게 데우면 난황도 떨어진다. 이 조작을 무균적으로 실시하고 난각이 검게 타지 않도록 주의한다. 내용물이 멸균광구병의 2/3이상 들어가지 않게 하고 흔들거나 멸균 숟갈로써 교반하여 균일하게 한다.

(2) 시험법

(가) 수분측정법

시료 2～5g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분 (1)건조감량법 (나) 감압가열건조법에 의하여 측정한다.

(나) 회분정량법

시료 3～5g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 나.회분에 준하여 시험한다.

(다) 지방정량법

시료 3g, 난황은 2g, 난백은 5g을 정확히 지방추출관(마죠니아관)에 취하여 아래와 같이 산 가수분해 한다.

농염산 10㎖를 소량씩 가하여 시료의 밑부분을 닦아 혼화한다. 공전의 구멍만 열어 70℃의 온탕중에서 때때로 혼화하면서 30분간 가온하고 이어서 조용히 30분간 끓인 후 물을 가하여 전 용량을 22～23㎖로 한다.

가수분해한 시료는 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)Röse-Gottlieb법에 따라 「에칠에텔 25㎖를 가하여……」이하와 같이 실시한다.

<Mojonnier관>

(라) 단백질정량법

시료 1g에 대하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 다.질소화합물 (1)총질소 및 조단백에 준하여 시험한다.

(마) pH측정법

활란하여 난백과 난황으로 나누어 pH메타로 측정한다.

(바) 휘발성 염기질소 정량법

시료 10g에 대하여 Ⅴ.가공품시험법 3.식육제품 가.식육가공품 (4)휘발성염기질소(콘웨이법)에 따라 시험한다.

(사) 유해성금속 시험법

Ⅲ.일반시험법 7.유해성금속시험법에 따라 시험한다.

나. 관능검사법

(1) 외부검사법

(가) 외관

시료에 대해서 먼저 오염도 및 파손의 유무를 검사한다. 신선알 껍질은 광택이 없고 거칠며 오래된 계란은 표면에 광택이 있고 거칠다.

(나) 진음

계란을 흔들어 볼 때 신선알은 아주 소리가 없으나 묵은 계란은 진음이 있다.

(다) 투시

검란기나 검란상자에 넣고 투시하면 신선알은 내용이 균일하며 홍색을 보이고 기실이 깨끗하게 보이나 묵은 계란은 기실이 보다 넓고 내용이 어둡게 보이며 난황의 자리가 동요되고 특히 부패란은 암흑색을 보인다.

(라) 자외선 조사법

계란에 자외선을 조사하면 신선란은 붉은 형광색을 나타내나 수주일 지난 계란은 푸른색의 형광을 나타낸다.

(2) 내용검사법

깨끗한 유리판에 계란의 내용물을 옮기고 그 색깔, 난황의 위치, 배반의 배자발육유무 및 혈관형성 여부를 관찰한다. 그 위에 풍미, 냄새, 먼지의 혼입, 기타 이물의 혼입 및 용해상태를 검사한다. 그리고 난황의 높이 및 용해상태를 검사한다. 그리고 난황의 높이 및 직경을 측정하여 난황계수를 계산한다.

[eqn: 난황계수= { 난황의~ 높이(h)} over {난황의~ 직경(d) }]

(3) 비중에 의한 검사법

정상적인 신선알의 비중은 1.0784～1.0914이다. 아래와 같은 방법에 의하여 비중을 측정할 수 있다.

(가) 11% 식염수에 즉시 가라 앉으면 비중은 1.080이상이다.

(나) 11% 식염수에는 떠오르나 10% 식염수에 가라 앉으면 비중은 1.073정도이다.

(다) 10% 식염수에는 떠오르나 8% 식염수에 가라 앉으면 비중은 1.060정도이다.

(라) 8% 식염수에 떠오르는 경우에는 비중은 1.058미만이다.

(4) 관능검사 결과 식용부적합알 분류

관능검사 결과 부패된 알, 산패취가 있는 알, 곰팡이가 생긴 알, 이물이 혼입된 알, 혈액이 함유된 알, 내용물이 누출된 알, 난황이 파괴된 알(물리적 원인에 의한 것은 제외한다), 부화를 중지한 알 등을 식용부적합알로 분류한다.

다. 세균학적 시험법

(1) 시료채취 및 조제

이화학적 시험법에서와 동일하게 수행한다.

(2) 세균수

III.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 시험법에 따라 시험한다.

(3) 대장균군수

III.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수 시험법에 따라 시험한다.

(4) 대장균수

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 바.대장균수 시험법에 따라 시험한다.

(5) 진균수(효모 및 사상균수)

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 사.진균수 시험법에 따라 시험한다.

(6) 병원균 시험법

이 시험은 필요하다고 인정될 때 III.일반시험법 9.미생물시험법 자.탄저균, 차.결핵균, 카.부루세라균, 타.병원성 대장균, 파.살모넬라균(Salmonella spp.), 하.리스테리아균(Listeria monocytogenes), 거.캠필로박터균(Campylobacter jejuni/coli), 너.황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 더.클로스트리디움 시험법에 따라 시험한다.

Ⅴ. 가공품 시험법

1. 유가공품

가. 우유류

(1) 비중

검사시료를 잘 섞어 실린더에 넣고 잠시 정치하여 기포가 없어졌을 때, 부평비중계로 측정한다. 15℃이외의 온도(10～20℃)에서 측정했을 때에는 Ⅸ.부표 4.우유비중보정표에 따라 보정한다. 다만, 저지방우유류는 Ⅸ. 부표 5. 탈지우유비중보정표에 따라 보정한다.

(2) 산도

검사시료 10㎖에 탄산가스를 함유하지 않은 물 10㎖를 가하고 페놀프탈레인시액 0.5㎖를 가하여 0.1N 수산화나트륨액으로 30초간 홍색이 지속할 때까지 적정한다.

0.1N 수산화나트륨액 1㎖ = 0.009g 젖산

a × f × 0.009

산도(젖산%) = ___________________________________ ×  100

10 × 검사시료의 비중

a : 0.1N 수산화나트륨액의 소비량(㎖)

f : 0.1N 수산화나트륨액의 역가

(3) 무지유고형분

밑지름 5㎝이상의 칭량관에 정제해사 15g과 작은 유리봉을 넣고 98～100℃의 건조기에서 항량이 될때까지 건조한 다음 검사시료 약 5g을 정밀히 달아 앞의 칭량관에 넣고 수욕상에서 내용물을 때때로 저어 섞으면서 가열한다.  대부분의 수분을 증발시킨 후 앞의 건조기에 옮겨 항량이 될 때까지 건조하여 건조물질량을 구하고 이 건조물질의 %에서 조지방의 %를 감한 것을 무지유고형분의 %로 한다.

(4) 유지방(Gerber법)

(가) 시약

1) 황산

15℃에서 비중 1.820～1.825의 것

2) 아밀알코올

비중이 15℃에서 약 0.81이고 비점이 128～132℃의 것으로서 그 2㎖에 대하여 물 11㎖를 써서 우유의 경우와 같이 공시험을 하고 하룻밤 정치하여 지방과 같은 물질의 분리가 없는 것.

(나) 시험방법

황산 10㎖를 황산용 피펫으로 겔벨유지계에 주입하고 검사시료 11㎖를 우유용 피펫으로 천천히 황산 위에 충적한 다음 아밀알코올 1㎖를 가하고 고무마개를 손가락으로 누르고 흔들어 검사시료를 녹인 다음 약 65℃의 온탕에 15분간 담그고 3～5분간 원심분리기(700rpm이상)에서 원심분리한 후 다시 약 65℃의 온탕 중에 담구어 석출한 지방층의 도수를 유지방량의 %로 한다.

(5) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(6) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(7) 포스파타제

(가) 시약

1) 중성 n-부탄올(비점 116～118℃)

색이 없는 것이라야 한다.

2) 붕산염완충액

붕산(Na2B4O7․10H2O)28.427g을 물 900㎖에 녹이고 수산화나트륨 3.27g을 가하여 녹인 다음 물을 가하여 1ℓ로 한다.

3) 기질완충액

결정페닐인산2나트륨(C6H5PO4Na2) 0.5g을 작은 시험관에 넣고 물 5㎖로 녹인다. 다음 붕산염완충액 0.5㎖를 가하여 잘 섞고 BQC시액 0.04㎖를 가하여 충분히 진탕 혼합한 후 5분간 정치한다. 이때 만일 청색을 나타내면 n-부탄올 2㎖를 가하여 잘 흔들어 섞고 생성한 인도페놀 색소를 추출한다. 정치한 다음 위의 부탄올층을 버리고 아래 층의 남은 액에 붕산염완충액 100㎖ 및 물을 가하여 1ℓ로 한다.  이 액은 분해되기 쉬우므로 필요한 양만을 만들어 냉장 보존한다. pH 9.6이다.

4) BQC시액

2-6-Dibromoquinone Chlorimide(BQC) 40㎎을 아세톤이 함유하지 않은 메탄올 10㎖에 녹여 착색병에 넣어 밀전하여 냉장한다.

5) 표준액

적색액 : 염화코발트(CoCl2․6H2O) 59.59g을 1% 염산에 녹여 1ℓ로 한다.

청색액 : 황산동(CuSO4․5H2O) 62.425g을 1% 염산에 녹여 1ℓ로 한다.

황색액 : 염화제2철(FeCl3․6H2O) 45.05g을 1% 염산에 녹여 1ℓ로 한다.

위의 액에서 적색액 0.4㎖, 청색액 1.5㎖ 및 황색액 0.5㎖를 취하여 이에 물 2.6㎖를 가하고 혼합하여 표준액으로 한다.

(나) 시험방법

경질시험관에 균일하게 한 검액 0.5㎖ 및 기질완충액 5㎖를 가하여 진탕 혼합하고 40～42℃의 수욕 중에서 10분간 보온한다. 다음 BQC시액 6방울(0.12㎖)을 가하여 잘 흔들어 5분간 방치하고 이에 n-부탄올 5㎖를 가하여 시험관을 10회 거꾸로 하여 섞고 원심분리한 후 정치하면 상층에 투명한 알코올층이 분리된다. 이 알코올층의 색을 표준액의 색과 비교할 때 알코올층의 색이 더 진하여서는 아니된다.

(8) 유산균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 사.유산균수에 따라 시험한다.

나. 저지방우유류

위의 가.우유류의 시험방법에 따라 시험한다.

다. 유당분해우유

(1) 산도

위의 가.우유류의 (2)산도에 따라 시험한다.

(2) 유당

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 마.탄수화물 (1)당질에 따라 시험한다.

(3) 유지방

위의 가.우유류의 (4)유지방에 따라 시험한다.

(4) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(5) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

라. 가공유류

위의 가.우유류의 시험방법에 따라 시험한다. 다만, 무지유고형분은 아.농축유류의 (5)당분에 따라 시험하여 얻은 양을 감하여 무지유고형분으로 한다.

마. 산양유

위의 가.우유류의 시험방법에 따라 시험한다.

바. 발효유류

(1) 무지유고형분

밑지름 5㎝이상의 칭량관에 정제해사 15g과 작은 유리봉을 넣고 98～100℃의 건조기에서 항량이 될 때까지 건조한 다음 검사시료 약 5g을 정밀히 달아 앞의 칭량관에 넣고 수욕상에서 내용물을 때때로 저어 섞으면서 가열한다. 대부분의 수분을 증발시킨 후 앞의 건조기에 옮겨 항량이 될 때까지 건조하여 건조물량을 구하고 이 건조물의 %에서 조지방의 % 및 당분의 %를 감한 것을 무지유고형분의 %로 한다(당분의 %는 아.농축유류중의 (5)당분에 따라 구한다).

(2) 유지방

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(3) 유산균수 또는 효모수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 사.유산균수 또는 아.진균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(5) 수분

다음 (6)의 유고형분에 따라 건조물질량을 구하고 건조감량을 수분으로 한다.

(6) 유고형분

98～100℃의 건조기 중에서 미리 건조하여 항량으로 한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2～5g을 정밀히 달아 넣고 앞의 건조기 중에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조물질량을 구하고 이 건조물의 %에서 당분의 %를 감한 것을 유고형분의 %로 한다(당분의 %는 아. 농축유류중의 (5)당분에 따라 구한다.)

사. 버터유류

(1) 수분

다음 (2)의 유고형분에 따라 건조물질량을 구하고 건조감량을 수분으로 한다.

(2) 유고형분

98～100℃의 건조기 중에서 미리 건조하여 항량으로 한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2～5g을 정밀히 달아 넣고 앞의 건조기 중에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조물질량을 구해서 이를 유고형분으로 한다.

(3) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

아. 농축유류

(1) 수분

검사시료 1～2g을 정밀히 취하여 위의 가.우유류의 (3)무지유고형분에 따라 시험하여 건조감량을 수분으로 한다.

(2) 유고형분

검사시료 20g을 정밀히 달아 온수로 희석하여 100㎖로 하고 그 5㎖를 취하여 위의 가.우유류 (3)무지유고형분에 따라 시험하여 건조물량을 구하고 아래 (5)당분(설탕, 포도당, 과당)량을 감하여 유고형분으로 한다.

(3) 유지방

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(4) 산도

위의 가.우유류의 (2)산도에 따라 시험한다.

(5) 당분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 마.탄수화물 (1)당질 (다)기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 시험한다.

(6) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(7) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

자. 유크림류

(1) 수분

98～100℃의 건조기 중에서 건조하여 항량으로한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2g을 정밀히 달아 넣고 건조기 중에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조감량을 수분으로 한다.

(2) 산도

비이커에 검사시료 9g을 채취한 후 탄산가스를 함유하지 않은 물 18g(시료량의 2배)을 가하고 페놀프탈레인시액 0.5㎖를 가하여 0.1N 수산화나트륨액으로 30초간 홍색이 지속할 때까지 적정한다.

0.1N 수산화나트륨액 1㎖ = 0.009g 젖산

a × f ×0.009

산도(젖산%) =  --------------------- × 100

검사시료 채취량

a : 0.1N 수산화나트륨액의 소비량(㎖)

f : 0.1N 수산화나트륨액의 역가

(3) 유지방

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(4) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(5) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

차. 버터류

(1) 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

(2) 유지방

검사시료 1～1.5g을 정밀히 달아 50㎖의 비이커에 취하고 에테르로 분액깔대기에 씻어 넣고 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 250㎖의 삼각플라스크에 여과하고 에테르를 날려 보낸 후 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여(20분이상) 얻은 것으로부터 유지방의 양을 산출한다.

(3) 산가

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (3)화학적시험 (가)산가에 따라 시험한다.

(4) 지방의 낙산가

검사시료 10g을 분액 깔때기에 취하고 수욕중에서 가온하여 녹인 후 강암모니아수 2㎖, 에탄올 10㎖를 가해 잘 섞은 다음 에틸에테르 50㎖를 가하고 진탕한 후 석유에테르 50㎖를 가해 진탕한다. 정치하여 상층이 투명해지면 하층을 버리고 상층을 건조 여과지를 이용하여 여과하고, 수욕상에서 용매를 제거한 후 100℃에서 30분간 건조한 시료, 0.500～0.550g을 50㎖의 삼각플라스크에 취하고 알코올성수산화칼륨시액 5㎖를 가하고 비등석을 넣어 환류냉각기를 연결하고 약하게 가열하여 검사시료를 녹인 후 계속하여 5분간 가열한다. 다음 냉각기를 떼고 글리세린(비중 1.23) 1㎖를 가한 다음 끓여서 대부분의 에탄올을 증발시킨다.

증발의 종말점은 액의 거품이 일어나기 시작하는 때로 한다. 이어 삼각플라스크를 수증기 건조기 안에 약 한두시간 두어 에탄올을 완전히 날려 보낸 다음 건조기에서 꺼내어 즉시 포화황산칼륨용액 15㎖를 가하고 20℃로 식혀 계속 흔들어 섞으면서 희석한 황산(1→3) 0.5㎖, 야자유비누액 1㎖ 및 정제규조토 약 0.1g을 가한 다음 소형의 신속여과지(7㎝)를 사용하여 눈금이 표시된 시험관에 여과하여 여액 12.5㎖를 정확히 취한다.

이를 100㎖의 증류플라스크에 옮기고 물 5㎖로 시험관을 씻고 씻은 액을 플라스크의 액과 합쳐 비등석을 넣고 증류하고 11㎖의 눈금이 붙은 유리원통에 정확하게 11㎖를 받고 페놀프탈레인시액을 지시약으로 하여 0.01N 수산화나트륨용액으로 적정한다. 여기에서 얻은 적정치에서 별도의 정제 카카오지 0.500g에 대하여 시행한 공시험치를 감한 값에 검사시료의 채취량에 의하여 달라지는 다음표의 계수를 곱하여 낙산가를 구한다.

※ 반미량법 낙산가 측정에 쓰이는 계수

검 체(g)	계 수
0.500～0.501 0.502～0.505 0.506～0.509 0.510～0.513 0.514～0.517 0.518～0.521 0.522～0.525 0.526～0.529 0.530～0.533 0.534～0.537 0.538～0.541 0.542～0.545 0.546～0.550	1.40 1.39 1.38 1.37 1.36 1.35 1.34 1.33 1.32 1.31 1.30 1.29 1.28

(5) 타르색소

Ⅲ.일반시험법 6.착색료시험법에 따라 시험한다.

(6) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(7) 산화방지제

Ⅲ.일반시험법 5.산화방지제 시험법에 따라 시험한다.

(8) 보존료

Ⅲ.일반시험법 4.발색제 및 보존료시험법 나.보존료에 따라 시험한다.

카. 자연치즈

(1) 대장균

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 바.대장균수에 따라 시험한다.

(2) 크로스트리디움

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 더.크로스트리디움균 시험법에 따라 시험한다.

(3) 유고형분 및 유지방

(가) 유지방

검사시료 1g을 비이커에 취하여 증류수 9㎖ 및 암모니아수 1㎖를 가하여 유리봉으로 저어 균일한 유탁액으로 하고 약간 가온하여 부드럽게 한다.

염산으로 중화하고 다시 염산 10㎖를 가한다. 정제해사를 소량 가하여 시계접시로 덮고 약 5분간 조용히 끓인다. 식힌 다음 내용물을 뢰리히관 또는 마조니어관에 옮기고 비이커는 알코올 10㎖ 및 에테르 25㎖로 씻는다. 씻은 액을 뢰리히관 또는 마조니어관에 넣고, 잘 흔들어 준 후 이하 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(나) 유고형분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가. 수분에 따라 시험한 후 다음 방법에 따라 구한 것을 유고형분으로 한다.

유고형분(%) = 100 － 수분(%)

(4) 보존료

Ⅲ.일반시험법 4. 발색제 및 보존료 시험법 나.보존료에 따라 시험한다.

타. 가공치즈

(1) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(2) 유고형분 및 유지방

다음 방법에 따라 구한 유지방량과 유단백질량, 유회분량을 합한 것을 유고형분으로 한다.

(가) 유지방

Ⅲ.일반시험법 카. 자연치즈 (3)유고형분 및 유지방 (가)유지방에 따라 시험한다.

(나) 유단백질

Ⅲ. 일반시험법 1.일반성분시험법 다.질소 화합물에 따라 시험한다.

(다) 유회분

검사시료 5-10g을 정밀히 달아 Ⅲ. 일반시험법 1. 일반성분시험법 나. 회분에 따라 시험한다.

(3) 보존료

Ⅲ.일반시험법 4. 발색제 및 보존료 시험법 나.보존료에 따라 시험한다.

파. 분유류

(1) 수분

다음 (2)의 유고형분에 따라 건조물질량을 구하고 건조감량을 수분으로 한다.

(2) 유고형분

98～100℃의 건조기 중에서 건조하여 항량으로 한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2g을 정밀히 달아 넣고 앞의 건조기 중에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조물질량을 구해서 이를 유고형분으로 한다. 다만, 당을 첨가한 제품에 대하여는 아래 (4)당분(설탕, 포도당, 과당)량을 감하여 유고형분으로 한다.

(3) 유지방

검사시료 약 1g을 정밀히 달아 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (1)조지방 (가)뢰제․곳트리브법에 따라 시험한다.

(4) 당분

검사시료 약 1.6g을 정밀히 달아 물을 가하여 200㎖로 한다. 이를 검액으로 하여 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 마.탄수화물 (1)당질 (다)기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 시험한다.

(5) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(6) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

하. 유청류

(1) 수분

다음 (2)의 유고형분에 따라 건조물질량을 구하고 건조감량을 수분으로 한다.

(2) 유고형분

98～100℃의 건조기 중에서 건조하여 항량으로 한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2g을 정밀히 달아 넣고 건조기중에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조물질량을 구해서 이를 유고형분으로 한다. 유단백질은 Ⅲ. 일반시험법 1. 일반성분시험법 다. 질소화합물 (1) 총질소 및 조단백에 따라 시험한다.

(3) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

거. 유당

(1) 수분

파.분유류의 (1)수분에 따라 시험한다.

(2) 유당

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 마.탄수화물 (1)당질 (가)환원당 또는 (다)기기분석에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 시험한다.

(3) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

너. 유단백가수분해식품

(1) 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 다.질소화합물 (1)총질소 및 조단백질에 따라 시험한다. 다만, 유단백가수분해물과 유단백가수분해물가공식품 중 단백질원이 유단백질로만 조성되어 있을 경우 질소계수 6.38을 적용한다.

(3) 아미노산질소

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 다.질소화합물 (2)아미노산질소 (가)홀몰적정법에 따라 시험한다.

(4) 카제인포스포펩타이드

검사시료 5g을 달아 물 90㎖에 분산시키고 1N 염산용액으로 pH 4.5로 조정한다. 이를 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 이에 동량의 50mM 염화바륨에탄올용액을 가하여 혼합한 후 5℃에서 12시간 정치하고 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고 50% 에탄올 10㎖를 가하여 침전물을 분산시키고 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고 이어 에탄올 10㎖씩으로 2회 반복조작하여 침전물을 세척한다. 침전물은 소량의 증류수로 분산시켜 미리 무게를 구한 칭량병에 옮겨 수욕에서 수분을 날려보낸 후 105℃에서 항량이 될 때가지 건조하여 카제인포스포펩타이드의 함량을 구한다.

W1 - W2

카제인포스포펩타이드의 함량(%) = ----_______________________× 100

Ws

W1 : 건조후의 무게(g)

W2 : 칭량병의 무게(g)

Ws : 검사시료채취량(g)

(5) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(6) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

더. 조제유류

(1) 수분

위의 파.분유류 (1)수분에 따라 시험한다.

(2) 유성분

(가) 조제우유

밑지름 5㎝이상의 칭량관에 정제해사 15g과 작은 유리봉을 넣고 98 ～ 100℃의 건조기에서 항량이 될때까지 건조한 후 검사시료 약 5g을 정밀히 달아 다음 (나)조제분유에 따라 시험한다.

(나) 조제분유

98 ～ 100℃의 건조기 중에서 건조하여 항량으로 한 밑지름 5㎝이상의 칭량병에 검사시료 약 2g을 정밀히 달아넣고 앞의 건조기 중에서 항량으로 될 때까지 건조하여 건조물량을 구하고, 이에 위의 파.분유류 (4)당분에 따라 시험하여 얻은 당분(설탕, 포도당, 과당)의 %를 감한 것을 유성분으로 한다.

(3) 비타민류(스크리닝법)

조제유류의 비타민 검사는 III. 일반시험법 3. 비타민류에 따라 시험한다. 다만, 조제 분유의 경우 비타민C, 비타민B1, 비타민B2, 비타민B6 및 니코틴산의 검사는 다음의 간이검사법에 따라 시험할 수 있다.

(가) 비타민C, 비타민B1, 비타민B2, 비타민B6 및 니코틴산의 동시 정량법

1) 시약

가) 추출용매

1-heptansulfonic acid를 500mM이 되도록 물에 녹이고, 메타인산 5% 용액을 만든 후, 메스 플라스크에 5% 메타인산 500㎖와 500mM 1-heptansulfonic acid를 10㎖ 넣은 후, 물로 1000㎖가 되도록 채워 추출용매로 한다.

나) 표준용액

비타민C 400㎎, 비타민B1 2㎎, 비타민B2 3㎎, 비타민B6 2㎎, 니코틴산 12.5㎎, 니코틴산아미드 12.5㎎을 각각 정확히 칭량하여 100㎖ 메스플라스크에 넣고 추출용매로 녹인다. 각 비타민의 표준용액을 각 0.5, 1.0, 2.0, 4.0㎖씩 100㎖ 메스플라스크에 넣고 추출용매로 희석하여 검량선 작성에 사용한다.

다) 이동상

이동상 A는 500mM 1-heptansulfonic acid 10㎖와 초산 10㎖를 1000㎖ 메스플라스크에 넣고 물로 채우고 여과 한 후 사용하고, 이동상 B는 500mM 1-heptansulfonic acid 10㎖와 초산 10㎖를 넣고 물로 400㎖ 까지 채운 후, 여기에 메탄올 600㎖를 합친 후 여과하여 사용한다.

2) 시험용액의 조제

가) 시료 전처리는 최대한 신속하게 차광한 상태에서 진행한다.

나) 시료 5～10g을 정확히 취해 100㎖ 메스플라스크에 넣고, 위에서 제조한 추출용매를 채워 녹인 후, 여과지와 0.45 ㎛ 필터로 차례로 여과한다.

3) 시험조작

가) 고속액체크로마토그래피 조건

① 컬럼은 Capcell pak C18, 250 X 4.6㎜, 5㎛ 또는 동등의 분석용 컬럼을 사용한다.

② 유속은 분당 1㎖ 로 유지시키되 시료주입 후 3분간은 이동상 A로만 흘리다가, 시료주입 후 25분까지 점차로 이동상 B가 흐르도록 용매구배조건을 만들고,  주입 후 30분까지 이동상 B로만 유지되도록 한다.

③ 위의 시험 용액을 10～25㎕ 액체크로마토그래프에 주입한다.

④ 검출기는 자외선 검출기를 사용하고 비타민C, 비타민B1, 니코틴산, 니코틴산아미드는 270㎚, 비타민B2와 비타민B6는 290㎚에서 검출한다.

나) 정량시험

① 시험용액 및 표준용액  10～25㎕를 앞의 조건에 따라 고속 액체 크로마토그래피 칼럼에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 다음 식에 따라 검사시료중의 비타민C, 비타민B1, 비타민B2, 비타민B6, 니코틴산의 함량을 산출한다. (단, 이때 니코틴산의 함량은 니코틴산과 니코틴산아미드의 합으로 한다.)

비타민C, B1, 및 B2의 함량(㎎/100g)

a × b         100

= S × ----_______________________  × _______

검사시료채취량     1000

비타민B6, 및 니코틴산의 함량(㎍/100g)

a × b

= S × ----__________________________ × 100

검사시료채취량

S : 시험 용액중의 각 비타민의 농도(㎍/㎖)

a : 시험용액의 전량(㎖)

b : 시험용액의 희석배수

② 부적합 시는 III. 일반시험법 3. 비타민류에 따라 반드시 확인검사해야 한다.

(4) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(5) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

러. 아이스크림류

(1) 유지방(저지방아이스크림의 경우 조지방)

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질에 따라 시험한다(단, 아이스크림류에 다른 식품 또는 식품첨가물을 입히거나 첨가한 것은 아이스크림류 부분만을 취하여 검사시료로 한다)

(2) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(3) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(4) 유산균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 사.유산균수에 따라 시험한다.

머. 아이스크림분말류

(1) 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

(2) 유지방

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질에 따라 시험한다.

(3) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(5) 유산균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 사.유산균수에 따라 시험한다.

버. 아이스크림믹스류

(1) 유지방(저지방아이스크림믹스의 경우 조지방)

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질에 따라 시험한다.

(2) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다. 세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(3) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마. 대장균군수에 따라 시험한다.

(4) 유산균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 사. 유산균수에 따라 시험한다.

2. 식육가공품 및 포장육

가. 공통사항(햄류‧소시지류‧베이컨류‧건조저장육류‧양념육류‧분쇄가공육제품‧갈비가공품‧포장육)

(1) 아질산이온

(가) 디아조화법

1) 시약

가) 초산암모늄완충액

초산암모늄 100g을 물 약 900㎖에 녹이고, 10% 암모니아수로 pH 9.1로 맞춘 다음 물을 넣어 1,000㎖로 한다.

나) 설파닐아미드용액

설파닐아미드 0.5g을 염산(1+1) 100㎖에 가온하여 녹인다.

다) 나프틸에틸렌디아민용액

N-(1-나프틸) 에틸렌디아민염산염 0.12g을 물 100㎖에 녹이고, 불순물이 있으면 여과한다.

라) 아질산표준용액

아질산나트륨(NaNO2최순품)을 황산데시케이터에서 24시간 건조한 후 그 0.150g을 정밀히 달아 멸균수에 녹여 1,000㎖로 하여 표준원액으로 한다. 표준원액 10㎖에 물을 넣어 100㎖로 하고, 그 액 2㎖에 물을 넣어 100㎖로 하여 표준용액으로 한다(사용직전에 제조한다).

아질산표준용액 1㎖ = 0.2㎍ NO2

2) 시험용액의 조제

세절한 검사시료 10g을 정밀히 달아 약 80℃의 물을 적당량 넣고 고르게 섞는다. 이를 200㎖의 메스플라스크에 정량적으로 옮기고, 용기는 더운물로 여러번 씻어 플라스크에 넣는다. 이 때 플라스크 중의 액량은 약 150㎖로 한다.

★ 여기에 0.5N 수산화나트륨용액 10㎖를 넣어 잘 흔들어 섞고 다시 12% 황산아연용액 10㎖를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 80℃의 수욕중에서 가끔 흔들어 섞으면서 20분간 가열한다. 다음 찬물에 담구어 실온이 될 때까지 식힌 후 초산암모늄완충액 20㎖와 물을 넣어 200㎖로 한다. 내용물을 잘 혼화하여 10분간 방치한 후 여과(건조 여지 사용)하여 최초의 여액 약 20㎖는 버리고 맑은 여액을 공전삼각플라스크에 받아 시험용액으로 한다. 따로 검사시료 대신에 물 10㎖를 사용하여 ★이하와 동일하게 조작한 액을 공시험용액으로 한다.

3) 시험방법

시험용액 및 공시험용액 20㎖에 설파닐아미드용액 1㎖를 넣어 섞는다. 다시 나프칠에틸렌디아민용액 1㎖와 물을 넣어 25㎖로 하고 잘 섞어 발색시켜 20분간 방치한 후, 물 20㎖로 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여 파장 540nm에서 흡광도 Aa, Ab를 측정한다. 시험용액이 착색되어 있을 때에는 시험용액 20㎖에 HCl(1+1) 1㎖와 물을 넣어 25㎖로 한 것을, 물을 대조액으로 하여 흡광도 Ac를 측정한다. 흡광도의 차 Aa-Ab 또는 Aa-(Ab-Ac)를 구하여 미리 작성한 검량선에서 시험용액 20㎖ 중의 아질산이온량 A(㎍)을 구하고 다음 식에 따라 검사시료 중의 아질산이온의 농도를 산출한다.

A         1

아질산이온(g/kg) = _______  ×  ________

S        100

S = 검사시료의 채취량(g)

검량선의 작성 : 아질산이온표준용액 2, 5, 10, 15 및 20㎖를 25㎖의 메스플라스크에 취하고 각각의 물을 넣어 약 20㎖로 한다. 여기에 설파닐아미드용액 1㎖씩을 넣어 섞고, 다시 나프칠에틸렌디아민용액 1㎖씩을 넣고 물을 넣어 25㎖로 하여 잘 섞는다. 물 20㎖로 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여 20분 후에 파장 540㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한다.

(나) 이온크로마토그래피를 이용한 기기분석법

1) 시약

가) 아질산 표준용액

아질산나트륨(NaNO2) 1.50g에 증류수를 가하여 1,000㎖로 한다. 이 액 10㎖를 취해 다시 증류수를 가하여 100㎖로 한다. 이 액 1㎖는 100㎍의 아질산이온(NO2-)을 함유한다.

2) 시험용액의 조제

검사시료를 잘게 세절한 후 이중 10g을 취해 200㎖의 메스플라스크에 넣는다. 80℃의 증류수 100㎖를 넣어 잘 혼합하고 항온수조(80℃)에서 20분간 반응시킨다. 이것을 실온이 될 때까지 식힌 후 최종 용량을 200㎖로 하고 10분간 방치한 후 여지로 여과하되 최초의 여액 20㎖는 버린다. 이를 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 사용한다.

3) 시험조작

가) 이온크로마토그래피 조건

- 칼럼 : IonPac AG 9-HC(4×50mm), AS 9-HC(4×250mm) 또는 동등의 것

- 이동상 : 9mM 탄산나트륨(분석 후 필요할 경우 90mM 탄산나트륨으로 칼럼을 세척한다)

- 유속 : 1.0㎖/분

- 검출기 : 전도도검출기(음이온 suppressor, 전도도 100μS)

나) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 50㎕씩 주입하여 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중의 아질산이온의 함량을 구한다.

(2) 타르색소

Ⅲ.일반시험법 6.착색료시험법에 따라 시험한다.

(3) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(4) 휘발성 염기질소

(가) 미량확산(Conway)법

1) 기구

가) 확산기 : 아래 그림과 같이 패트리접시와 닮은 두꺼운 경질유리로서 갈아 맞춘 뚜껑이 있다. 내부는 내실A(지름 35㎜)와 외실B(지름 61㎜)로 동심원형으로 구분되어 있으며, 내실A의 벽의 높이는 외실B의 높이의 약 1/2이다. 뚜껑을 덮고 클립(C)으로 고정하여 기밀성이 유지될 수 있어야 한다.

<그  림>

2) 시약

가) 기밀제 : 글리세린(백색바셀린과 유동파라핀을 적당량 가온 혼합한 것도 가능함)

나) K2CO3포화용액 : K2CO3(최순품) 약 60g을 증류수 약 50㎖에 가열하여 녹이고 NH3 가스를 피하여 식히고 위의 맑은액을 쓴다.

다) 브런스위크(Brünswik)시액 : 메틸레드 0.2g 및 메틸렌블루 0.1g을 에탄올 300㎖에 녹이고 여과하여 갈색병에 넣어 사용한다.

3) 시험용액 조제

식육은 부분적으로 품질이나 조성이 다르기 때문에 전체를 대표할 수 있는 검사시료를 얻기 어렵다. 따라서 검사시료는 부위를 달리하는 여러 곳에서 취하여야 하며, 가능한 한 육질부분을 취하여야 한다. 검사시료의 크기 또는 수량에 따라 임의로 3 ～ 5개소로부터 각각 20 ～ 50g씩을 취하여 이를 잘게 썰어 잘 섞는다. 이중에서 10g(W)씩을 정밀히 달아 2개의 비이커에 따로 넣는다(2회 시험하여 평균치를 내기 때문임). 이에 증류수 50㎖를 넣고 잘 저어 섞어 30분간 침출하고 여과한다. 여과액을 5% 황산용액을 사용하여 약산성으로 중화시킨 후 증류수를 넣어 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.

4) 시험

이 시험은 중화법에 의한 미량 분석이므로 실험실내에 산성 또는 알카리성 가스가 발생하지 않도록 주의하여야 한다.

가) 확산

확산기를 약간 기울여 놓고 외실의 아래쪽에 시험용액 1.00㎖를 피펫(Vol)을 써서 정밀하게 넣은 다음 내실A에 0.01N-H2SO4 1.00㎖를 같은 방법으로 정밀하게 넣는다.

덮개의 갈아 맞추는 부분에 기밀제 소량을 고루 바른 다음 K2CO3 포화용액 약 1㎖를 외실 B의 윗쪽에 재빨리 넣고 즉시 덮개를 덮어 클립으로 고정하고 확산기를 전후좌우로 기울이면서 조용히 회전하여 외실 B내의 시험용액과 K2CO3 포화용액을 잘섞어(이때 외실의 용액과 내실의 용액이 섞이지 않도록 주의) 25℃에서 1시간(20℃에서는 120 분, 16℃에서는 140분, 10℃에서는 160분이상)정치한다.

나) 정량

덮개를 열고 내실의 H2SO4용액에 Brünswik시액 한방울을 넣고 마이크로뷰렛을 사용하여 0.01N-NaOH용액으로 적정하여 그 2회 평균치(a ㎖)를 구한다. 따로 시험용액 대신 증류수를 써서 같은 방법으로 공시험을 하여 그 2회 평균치(b ㎖)를 구하여 다음 식에 따라 계산한다.

(b-a)×f

휘발성염기질소(㎎%) = 0.14 × _____________ × 100 × d

W

W : 검사시료채취량(g)

f : 0.01N-NaOH의 역가

d : 희석배수

(5) 보존료

Ⅲ.일반시험법 4. 발색제 및 보존료시험법 나.보존료에 따라 시험한다.

(6) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

나. 식육추출가공품

(1) 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

(2) 타르색소

Ⅲ.일반시험법 6.착색료시험법에 따라 시험한다.

(3) 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

(5) 대장균

제7. 일반시험법 9.미생물시험법 바.대장균수에 따라 시험한다.

다. 식용우지

(1) 비중, 굴절률, 비비누화물, 비누화가 및 요오드가는 Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (2)물리적시험법 및 (3)화학적시험법에 따라 시험하고, 산화방지제는 Ⅲ.일반시험법 5.산화방지제 시험법에 따라 시험한다.

(2) 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분 (1)건조감량법 (가)상압가열건조법에 따라 시험한다. 단, 건조시간은 105℃에서 1시간으로 한다.

(3) 산가

검사시료 10 ～ 20g을 정밀히 달아 50 ～ 60℃로 가온하여 녹인 다음, Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 라.지질 (3)화학적시험 (가)산가에 따라 시험한다.

라. 식용돈지

위의 (1)식용우지의 시험방법에 따라 시험한다.

3. 알가공품

가. 수분

Ⅲ.일반시험법 1.일반성분시험법 가.수분에 따라 시험한다.

나. 세균수

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 다.세균수 (1)일반세균수에 따라 시험한다.

다. 대장균군

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 마.대장균군수에 따라 시험한다.

라. 살모넬라균

Ⅲ.일반시험법 9.미생물시험법 파.살모넬라균 시험법에 따라 시험한다.

Ⅵ. 기구 및 용기의 시험법

1. 원유통의 시험법

원유통은 금속제 기구 용기의 용출시험이외에 다음의 시험을 한다.

가. 낙하시험

원유통에 물을 가득 채우고 높이 30㎝의 콘크릿 기초 또는 이하 동등의 견고한 수평위에 놓고 통을 30도 경사지게 하여 3회 낙하시켜 변형 및 파괴 여부를 조사한다. 이 때 변형되거나 파괴되어서는 안된다.

나. 누수시험

낙하시험이 끝나면 그 통에 물로 채우고 외부를 깨끗이 닦은 다음 2일간 누수여부를 관찰할 때 누수가 인정되어서는 안된다.

2. 기타의 기구 및 용기․포장의 시험방법은 식품위생법 제7조의 규정에 의한 식품공전에 따른다.

Ⅶ. 시약․시액․표준용액 및 용량 분석용 규정용액

따로 규정이 없는 한 시험에 쓰는 시약․시액․표준용액 및 용량분석용 표준용액은 다음의 규격에 맞는 것을 쓴다.

시약․시액․표준용액 및 용량분석용 표준용액을 보존하는 유리용기는 용해도 및 알칼리도가 매우 낮고 납 및 비소를 될 수 있는대로 함유하지 아니하는 것을 쓴다.

1. 시약

시약은 따로 표시하지 아니한 것은 모두 최순품을 쓴다.

과망간산칼륨  KMnO4

과산화수소  H2O2

구연산  C6H8O7․H2O

구연산암모늄  (NH4)2HC6H5O7

규조토

글리세린  C3H8O3

α-나프틸아민  C10H7․NH2

N-1-나프틸에틸렌디아민염산염  C10H7NH(CH2)2NH2․HCl

뉴트랄레드  C15H17N4Cl

데히드로초산나트륨  C8H7O4Na․H20

둘신  C9H12N2O2

n-디메틸아미노벤즈알데히드  (CH3)2N․C2H4CHO

디아스타아제

디에틸디티오카바민산나트륨  (C2H5)2NCS2Na․3H2O

디에틸포름아미드  (C2H5)2NCOH

디티존  C6H5NHNHCSN․NC6H5

레소르신  C6H6C2

로다민B  C28H31CIN2O3

메틸렌블루  C16H18N3CIS

메틸레드  C15H15O2N3

메틸바이오렛  C25H30CIN3

메타인산  HPO3 35%이상

메탄올  CH3OH 95v/v%이상

무수삼산화비소  삼산화비소․무수와 같다.

무비소아연  아연․무비소와 같다.

무비소염산  염산․무비소와 같다.

무수아황산나트륨  아황산나트륨․무수와 같다.

무수에탄올  에탄올․무수와 같다.

무수초산나트륨  초산나트륨․무수와 같다.

무수탄산나트륨  탄산나트륨․무수와 같다.

무수탄산칼륨  탄산칼륨․무수와 같다.

무수황산나트륨  황산나트륨․무수와 같다.

무수황산동  황산동․무수와 같다.

바닐린  C6H3CHO(OCH3)OH

벤젠  C6H6 95 v/v% 이상

n-부탄올  CH3(CH2)2CHOH

붕산  H3BO3 99.5%

브롬티몰블루  C27H28O5Br2S

브롬크레졸그린  C21H14O5Br4S

브롬크레졸퍼플  C21H16O5Br2S

브롬페놀블루  C19H10O4Br4S

브롬화제이수은  HgBr2

브루신  C23H21N2O4

빙초산  CH3COOH 99～100%

사상아연  아연․사상과 같다.

사염화탄소  CCl4

사카린나트륨  C7H4NNaO3S․2H20

산화마그네슘  MgO

살리실산  HOC6H4COOH

삼산화비소․무수  As2O3

삼염화요오드  ICl3

석유벤젠

석유에테르

설파닌산  C6H7NO3S

설파민  C6H8O2N2S

솔빈산나트륨  C6H7O2Na

수산  H2C2O4․2H2O 99.8% 이상

수산나트륨 Na2C2O4(표준시약)110℃에서 3시간 보존한 후 데시케이타(황산)에서 식힌다.

수산암모늄  (NH4)2C2O4․H2O

수산화나트륨  NaOH

수산화칼륨  KOH

승화요오드  요오드․승화와 같다.

승화황 황․승화와 같다.

시안화칼륨  KCN

식용색소녹색제2호  C37H34O9N2S3Na2

식용색소녹색제3호  C37H34O10N2S3Na2

식용색소자색제1호  C39H40O6N3S2Na

식용색소적색제2호  C20H11O10N2S3Na3

식용색소적색제3호  C20H6O5I4Na2․H2O

식용색소청색제1호  C37H34O2N2S3Na2

식용색소청색제2호  C16H18O2S2Na2

식용색소황색제4호  C16H9O9N4S2Na3

식용색소황색제5호  C16H10O7N2S2Na2

실리카겔G  박층크로마토그래피용

실리콘수지

싸이클라민산나트륨  C6H11NHSO3Na

아밀알코올 C6H11OH

아밀알코올․이소  아밀알코올과 같다.

아세톤 CH3COCH3

아연․분말 Zn

아연․사상 Zn

아연․입상 Zn

아연․무비소 Zn

아질산나트륨 NaNO2

아황산나트륨․무수 Na2SO3

아황산수소나트륨 NaHSO3

안식향산나트륨 C7H5O2Na

알룸  황산알루미늄칼륨과 같다.

암바라이트 IR-120(H)

야자유

에틸렌디아민테트라초산나트륨  C10H14N2Na2O8․2H2O

에틸에테르  C2H5OC2H5

에탄올  C2H5OH 95%이상

에탄올․무수  C2H5OH 99.5% 이상

에스테르  에틸에테르와 같다.

염기성푹신

염산 HCl

염산․희  염산 23.6㎖에 물을 넣어 100㎖로 한다. HCl 9.5 ～ 10.5 w/v %

염화나트륨  NaCl

염화나트륨(표준시약) NaCl 500～650℃에서 40～50분간 가열한 다음 데시케이타(황산)에서 식힌다.

염화바륨  BaCl2

염화암모늄  NH4Cl

염화제이수은  HgCl2

염화제이철  FeCl3․6H2O

염화제일주석  SnCl2․2H2O

요오드  I2

요오드․승화  I2

요오드산칼륨  KIO3

요오드화나트륨  NaI

요오드화아연  ZnI2

요오드화칼륨  KI

유동파라핀  파라핀․유동과 같다.

이소아밀알코올  아밀알코올과 같다.

이소프로판올  (CH3)2CHOH

이황화탄소  CS2

인산  H3PO4

입상아연  아연․입상과 같다.

전분(약전품)

주석산  C4H6O6

주석산나트륨  Na2C4H4O6․2H2O

주석산칼륨나트륨  KNaC4H4O6․4H2O

질산  HNO3

질산․희  질산 10.5㎖에 물을 넣어 100㎖로 한다.

질산납  Pb(NO3)2

질산수은  Hg(NO3)2․H2O

질산알루미늄  Al(NO3)3

질산암모늄  NH4NO3

질산은  AgNO3

질산칼륨  KNO3

철․환원  Fe

초산  CH3COOH 35%

초산․빙  빙초산과 같다.

초산․희  CH3COOH 6%

초산나트륨  CH3COONa․3H2O

초산나트륨․무수  CH3COONa

초산납  Pb(CH3COCO)2․3H2O

초산아연  Zn(CH3COO)2․2H2O

초산암모늄  CH3COONH4

초산에틸  CH3COOC2H5

초산제이동  Cu(CH3C00)2․H2O

티몰블루  C27H30O5S

티오황산나트륨  Na2S2O3․5H2O

카카오지

크로모트로프산  크로모트로산디나트륨과 같다.

크로모트로프산디나트륨  (HO)2C10H4(SO2Na)2

크롬산칼륨  K2CrO4

크리스탈바이오  메틸바이오와 같다.

클로로포름  CHCl3

키실렌  C6H4(CH3)2

탄산나트륨  Na2CO3․10H2O

탄산나트륨  Na2CO3(표준시약) 500～650℃에서 40～50분간 가열한 다음 데시케이타(황산)에서 식힌다.

탄산나트륨․무수  Na2CO3

탄산수소나트륨  NaHCO3

탄산칼슘  CaCO3

탈지면(약전품)

톨루엔  C6H5CH3

1․1․2-트리클로로에탄  CH2ClCHCl2

파라옥시안식향산부틸  C11H14O3

파라핀․유동

판크레아틴

페놀레드  C19H14O5S

페놀프탈레인  C20H14O4

페로시안화칼륨  K4Fe(CN)6

포르말린  HCHO 35.0～37.0을 함유한다.

푹신․염기성  염기성푹신과 같다.

피리딘  C5H5N

피크린산  HOC6H2(NO2)3

헥사민  C6H12N4

활성탄

황․승화  S

황산  H2SO4

황산․희  H2SO4․10%

황산나트륨  Na2SO4․10H2O

황산나트륨․무수  Na2SO4

황산동  CuSO4․5H2O

황산동․무수  CuSO4

황산마그네슘  MgSO4․7H2O

황산알루미늄칼륨  KAl(SO4)2․12H2O

황화제이철  Fe2(SO4)3․3H2O

황산칼륨  K2SO4

황화나트륨  Na2S․9H2O

황화수소  H2S

휘발류  무색투명하고 납이 함유되지 아니한 것

묽은염산  염산․희와 같다.

묽은질산  질산․희와 같다.

묽은초산  초산․희와 같다.

묽은황산  황산․희와 같다.

2. 시액

강암모니아시액  암모니아시액․강과 같다.

뉴트랄레드시액  뉴트랄레드 0.1g을 빙초산에 녹여 100㎖로 한다.

뉴트랄레드․브롬티몰블루혼합시액  뉴트랄레드시액 및 브롬티몰블루혼합시액의 같은 양을 섞는다.

레소르신시액  레소르신 1g을 염산에 녹여 100㎖로 한다.

메틸렌블루시액  메틸렌블루 0.1g을 에탄올 100㎖로 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸레드시액  메틸레드 0.1g을 에탄올 100㎖로 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸바이오렛시액  메틸바이오렛 0.1g을 물 100㎖로 녹이고 필요하면 여과한다.

메틸렌오렌지시액  메틸오렌지 0.1g을 물 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

바닐린황산시액  바닐린 0.5g을 황산에 녹여 100㎖로 한다.

벨트란시액A  황산동의 순수한 결정 40g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액B  주석산칼륨나트륨 200g 및 수산화나트륨 150g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액C 황산제일철(과망간산칼륨액을 환원하여서는 아니된다) 50g을 적당량의 물에 녹여 황산 200㎖를 가하고 식힌 후 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

벨트란시액D  과망간산칼륨 5g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

표정

수산화암모늄 0.2500g을 물 100㎖에 녹이고 황산 2㎖를 가하여 60～70℃로 가열한 후 과망간산칼륨액으로 적정하고 그 적정량을 a ㎖라고 하면 이 액 1㎖는  Cu 0.2238/ag에 대응한다.

브롬티몰블루시액 브롬티몰블루 0.1g을 희에탄올(1+1) 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

브롬크레졸그린시액 브롬크레졸그린 50㎎을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

브롬크레졸그린․메틸레드혼합시액  브롬크레졸그린시액 및 메틸레드시액의 같은 양을 섞는다.

브롬페놀블루시액  브롬페놀블루 0.1g을 희에탄올(1+1) 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

알루미나(Alumina)크림  냉포화명반(Alum)수용액에 리트머스지로 알카리성이 될 때까지 암모니아수를 가하여 침전을 얻고 이 침전을 염화바륨시액으로 황산이온 반응이 나타나지 않을 때까지 경사법으로 씻고 과량의 물을 버리고 잔류크림을 밀전하여 보존한다.

알코올성수산화칼륨시액  7.5w/v% 수산화칼륨용액 40㎖를 물 40㎖로 희석하고 에탄올을 가하여 1,000㎖로 한다.

암모니아시액  암모니아시액․강 10㎖에 물을 가하여 30㎖로 한다.

암모니아시액․강 암모니아수(28%이상)

야자유비누액

정제야자유 50g, 에탄올 50㎖ 및 75w/v% 수산화칼륨용액 20㎖를 200㎖의 삼각플라스크에 넣고 환류냉각기를 달아 조용히 가열하여 투명한 비누액으로 한 후 10분간 끓인다. 다음 에탄올을 날려 보내고 잔류한 비누액을 110℃의 건조기에서 에탄올 냄새가 없어질 때까지 건조한 후 물에 녹여 500㎖로 한다.

염기성초산납용액  중성초산납 330g을 물 500㎖에 녹이고 산화납 110g을 혼합하여 저어 섞으면서 30분간 끓인 후 식히고 상징액을 기울여 분리하여 사용한다.

염화바륨시액  염화바륨 12g을 물에 녹여 100㎖로 한다.

염화제이철시액  염화제이철 5g에 염산 5㎖ 및 물을 넣어 용해하여 100㎖로 한다.

요오드화칼륨시액 요오드화칼륨 16.5g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 이 액은 차광하여 보존한다.

황화나트륨시액 황화나트륨 5g을 물 10㎖ 및 글리세린 30㎖의 혼액에 녹인다. 또는 수산화나트륨 5g을 물 30㎖ 및 글리세린 90㎖의 혼액에 녹여, 그 반용량에 찰 때 황화수소를 포화시키고 여기에 나머지 반용량을 혼합시킨다.

차광한 병에 거의 가득 채워서 보존하고 만든 다음 3개월 이내에 사용한다.

위스시액

가. 요오드 13g을 빙초산 1ℓ에 녹이고 그 10㎖를 취하여 0.1N 티오황산나트륨용액으로 적정하여 요오드의 농도를 결정하여 둔 다음 요오드용액에 정제 건조염소가스를 통하여 암갈색에서 담등황색으로 변할 때 이를 중지하고 이 액 10㎖를 취하여 요오드화칼륨 10㎖ 및 물10㎖를 가하여 잘 섞고 0.1N 티오황산나트륨액으로 적정하여 이 측정치가 정확히 먼저의 측정치의 2배가 되도록 한다.

측정치가 2배가 되지 않으면 염소가스를 더 통하고 2배가 넘으면 소량 남겨둔 요오드용액을 가하여 조절한다.

나. 삼염화요오드 7.9g와 요오드 8.7g을 따로 따뜻한 빙초산에 녹인 후 혼합하여 이에 빙초산을 가하여 1000㎖로 한다.

가. 또는 나.의 어느 방법에 의하여 만들어 사용하여도 좋으나 갈색병에 밀전하여 어두운 곳에 보존한다.

전분시액

전분 1g를 찬물과 잘 섞고 이를 열탕 200㎖에 저어 섞으면서 천천히 가하고 액이 반투명하게 될 때까지 끓이고 방냉정치한 다음 상징액을 사용한다.

정제에텔

적당량의 에테르를 분액깔때기에 취하여 새로 만든 2%황산제일철용액을 에테르의 약 1/5용량 가하고 잘 흔들어 섞은 후 물층을 버린다. 이 조작을 2%황산제일철용액의 물층이 황갈색을 나타내지 않을 때까지 되풀이 하고 에테르의 약 1/5 용량의 물로 2 ～ 3회 씻은 후 에틸층을 분취하여 무수황산나트륨을 넣고 탈수한다. 다음 에테르를 증류플라스크에 옮기고, 분류관을 붙여 증류한다. 초유액 약 10%를 버리고 플라스크내의 에테르가 약 10%정도 남게 유액을 받아 밀전차광용기에 넣고 황산제일철(결정) 및 수산화나트륨(입상)을 각각 소량씩 넣어 냉암소에 보관한다. 이액은 사용할 때 만든다.

중성초산납포화용액  중성초산납 250g을 물 500㎖에 녹여 여과한다. 산 또는 알카리를 함유할 때는 수산화나트륨용액 또는 초산으로 중화한다.

질산수은시액

염화제이수은 또는 질산제이수은을 물에 녹이고 이에 수산화나트륨용액을 소량씩 저어 섞으면서 가하여 산화제이수은을 완전히 침전시키고 감압여과하여 침전물을 물로 여러번 씻은 후 그 1 ～ 2g을 비이커에 취하고 질산은을 가하여 녹인 다음 30% 수산화나트륨용액을 소량씩 적가하여 과잉의 질산을 중화한다. 이때 새로 생긴 산화제이수은의 침전이 완전히 녹지 않게 될 때까지 물을 가하여 15 ～ 25㎖로 한다. 침전을 가라 앉힌 다음 상징액을 사용한다. 이 액은 산성이면 아니된다.

초산시액(1N)  빙초산 5.8㎖에 물을 가하여 100㎖로 한다.

티몰블루시액  티몰블루 0.1g을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

카레스(Carrez)침전제  제1액 15%페로시안화칼륨용액, 제2액 30%황산아연용액

크롬산칼륨시액  크롬산칼륨 10g에 물을 가하여 100㎖로 한다.

페놀레드시액  페놀레드 0.1g을 에탄올 100㎖에 녹이고 필요하면 여과한다.

페놀프탈레인시액  페놀프탈레인 1g을 에탄올 100㎖에 녹인다.

페링시액A액

황산동(CuSO4․5H2O)34.64g을 물에 녹여 500㎖로 한 다음, 다음과 같이 표정하여 둔다. A액 10㎖를 350㎖의 삼각플라스크에 취하고 물 40㎖, 30%초산용액 4㎖ 및 50% 요오드화 칼륨용액 6㎖를 가하고 유리한 요오드를 전분시액을 지시액으로 하여 0.1N 티오황산나트륨으로 적정한다.

6.354×A×f

F=  □□□□□□□□□□□□□

174.8

F : A액의 역가

A : 0.1N 티오황산나트륨액의 소비량(㎖)

f : 0.1N 티오황산나트륨액의 역가, 이 역가는 1±0.005로 조정한다.

페링시액B액 주석산칼륨나트륨 173g과 수산화나트륨 50g에 물을 가하여 500㎖로 한다.

3. 표준용액

데히드로초산표준용액

데히드로초산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 6㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고, 그 20㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

데히드로초산표준용액 1㎖= 20㎍ 데히드로초산

둘씬표준용액  둘씬 20㎎을 에탄올 15㎖에 녹인다.

싸이클라민산표준용액  싸이클라민산나트륨 50㎎을 물 5㎖에 녹인다.

사카린표준용액  사카린나트륨 50㎎을 물 5㎖에 녹인다.

살리실산표준용액

살리실산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 8㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고, 그 25㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

살리실산표준용액 1㎖= 25㎍ 살리실산

소르빈산표준용액

소르빈산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 9㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 5㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

소르빈산표준용액 1㎖= 5㎍ 소르빈산

색소표준용액

수용성 산성착색료는 0.05～0.1% 수용액을 사용하고 염기성색소는 0.05～0.5%수용액을 사용하고, 유용성색소는 0.05～0.5%의 에탄올용액이나 사염화탄소용액을 사용한다.

안식향산표준용액

안식향산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨용액 8.5㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 10㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

안식향산표준용액 1㎖= 10㎍ 안식향산

파라옥시안식향산표준용액

파라옥시안식향산 100㎎을 정확히 취하여 0.1N 수산화나트륨액 9㎖에 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 하고 그 10㎖를 정확히 취하여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

파라옥시안식향산표준용액1㎖= 10㎍ 파라옥시안식향산

휴젤유표준용액

휴젤유 또는 이소아밀알코올 1g을 무수에탄올에 녹인 후 물을 가하여 1,000㎖로 한다.

휴젤유표준용액 1㎖= 1㎎ 휴젤유

4. 용량분석용 규정용액

0.1N 과망간산칼륨액

1000㎖중 KMnO4 3.1608g을 함유한다.

과망간산칼륨 약 3.3g을 물에 녹여 1,000㎖로 하고 15분간 끓인 다음 밀전한 플라스크에 넣어 적어도 2일간 방치하고 석면으로 여과한다.

표정

수산화나트륨(표준시약)을 300℃에서 1시간 건조하고 데시케이타(황산)에서 식히고 그 약 0.3g을 정밀히 달아 500㎖의 비이커에 넣고 물 30㎖를 넣어 10 ～ 15분간 끓인 다음 27±3℃로 식히고 황산(1→20) 250㎖를 넣어 녹인다. 과망간산칼륨액을 유리콕크가 있는 뷰렛에 넣고 천천히 저으면서 40㎖를 1분간에 25 ～ 30㎖의 속도로 넣어 액의 홍색이 없어질 때까지 방치하고  55 ～ 60℃로 가열하여 탈색한 다음 적정을 계속한다. 30초동안 지속하는 엷은 홍색을 나타낼 때까지 적정을 계속한다. 단, 종말점 전의 0.5 ～ 1㎖는 과망간산칼륨액의 색이 없어진 다음에 계속 한방울씩 적가하도록 주의하여야 한다.

0.1N 과망간산칼륨액 1㎖= 6.700㎎ Na2C2O4

이 액은 차광하여 보존하고 오래되면 다시 표정한다.

0.01N 과망간산칼륨액

사용할 때 0.1N 과망간산칼륨액을 물로 정확히 10배 용량으로 희석한다.

0.1N 수산액

1,000㎖중 C2H2O4 4.502g을 함유한다.

수산 6.45g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다.

차광한 공전병에 보존한다.

새로 표정한 0.1N 과망간산칼륨액으로 0.1N 과망간산칼륨에 따라 표정한다.

0.01N 수산액

0.1N 수산액을 정확히 10배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액

1,000㎖중 NaOH 39.999g을 함유한다.

수산화나트륨 45g을 물 약 950㎖에 녹이고 이에 새로 만든 수산화바륨포화용액을 침전이 그 이상 생기지 않을 때까지 가한다. 액을 잘 섞은 다음 밀전하고 하루 밤 방치한다. 상징액을 기울이거나 여과하여 다음 방법으로 표정한다. 이 액은 고무마개로 밀전하거나 또는 소다석회관을 단 병에 보존한다. 가끔 다시 표정하여 사용하지 않으면 아니된다. 1N 염산 또는 1N 황산25㎖를 취하여 새로 끓여 식힌 물 50㎖로 희석하여 수산화나트륨액으로 적정한다(지시액: 페놀프탈레인시액 두방울).

0.1N 수산화나트륨액

1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하거나 수산화나트륨 약 4.5g을 취하여 1N 수산화나트륨액에 따라 만들고 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

0.02N 수산화나트륨액

0.1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 5배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액에 따라 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

0.01N 수산화나트륨액

0.1N 수산화나트륨액을 취하여 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석한다.

1N 수산화나트륨액에 따라 표정하여 보존한다.

이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

1N 수산화칼륨액

1,000㎖중 KOH 56.108g을 함유한다.

수산화칼륨 약 70g을 취하여 1N 수산화나트륨액에 따라 만들고 표정한다.

0.1N 수산화칼륨액

1N 수산화칼륨액을 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하거나 수산화칼륨 약 7g을 취하여 1N 수산화칼륨액에 따라 만들고 표정한다.

0.02N 아황산수소나트륨액

아황산수소나트륨 0.5g을 물에 녹여 500㎖로 하고 갈색병에 보존한다.

이 용액은 약 1주일간 사용할 수 있다.

0.5N 알코올성수산화칼륨액

1,000㎖중 KOH 28.054g을 함유한다.

수산화칼륨 약 35g을 물 20㎖에 녹이고 에탄올(알데히드 없는 것)을 가하여 1,000㎖로 하고 밀전한 용기에 넣어 24시간 이상 방치한 다음 상징액을 다른 병에 옮기고 밀전․차광하여 보존한다.

표정

0.5N 염산 25㎖를 취하여 물 50㎖를 가하고 이 알코올성수산화칼륨액으로 적정한다(지시액:페놀프탈레인시액 두방울).

1N 염산

1,000㎖중 HCl 36.465g을 함유한다.

염산 95㎖를 물로 희석하여 1,000㎖로 하고 다음 방법으로 표정한다.

미리 약 270℃에서 1시간 건조한 탄산나트륨(표준시약) 약 1.5g을 정밀히 달아 물 100㎖에 녹이고 이 염산으로 적정한다(지시액:브롬페놀블루시액 두방울). 다만, 종말점 부근에서 한번 끓여 이산화탄소를 날려 보낸 다음 곧 적정을 계속한다.

1N 염산 1㎖= 52.99㎎ Na2CO3

0.5N 염산

염산 47.5㎖를 취하여 1N염산에 따라 만들고 표정한다.

0.5N염산 1㎖= 26.50㎎ Na2CO3

0.1N 염산

1N 염산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 염산 9.5㎖를 취하여 1N염산에 따라 만들고 표정 한다.

0.1N염산 1㎖= 5.229㎎ Na2CO3

0.1N 요오드액

1,000㎖중 I2 12.691g을 함유한다.

요오드 약 14g에 요오드화칼륨 36g을 물 100㎖에 녹인 액에 녹이고 염산 3방울 및 물을 가하여 1,000㎖로 하고 다음 방법으로 표정한다.

이 액은 공전병에 보존하고 가끔 다시 표정하여야 한다.

표정

삼산화비소(표준시약)를 분말로 하여 100℃에서 항량이 될 때까지 건조한 다음 그 약 0.15g을 정밀히 달아 이를 1N 수산화나트륨액 20㎖에 필요하면 가열하여 녹인다. 다음 이에 물 약 40㎖ 및 메틸오렌지시액 두방울을 가하고 다시 액의 황색이 담홍색으로 될 때까지 희염산을 가한다.

이에 탄산수소나트륨 2g, 물 약 50㎖ 및 전분시액 3㎖를 가하고 요오드액으로 이 액이 청색이 지속될 때까지 적정한다.

0.1N 요오드액 1㎖= 4.946g As2O3

이 액은 차광하여 보존하고 오래된 것은 다시 표정하여 사용한다.

0.02N 요오드액

0.1N 요오드액을 물로 5배 용량으로 희석하여 0.1N 요오드액에 따라 표정하여 보존한다.

0.01N 요오드액

0.1N 요오드액을 물로 10배 용량으로 희석하여 0.1N 요오드액에 따라 표정하여 보존한다.

0.1N 질산은액

1,000㎖중 AgNO3 16.988g을 함유한다.

질산은 약 17.5g을 물 1,000㎖에 녹이고 다음과 같이 표정한다. 염화나트륨(표준시약)을 500～650℃에서 1시간 건조하고 황산데시케이타에서 식힌 다음 약 150㎎을 정밀히 달아 물 50㎖에 녹여 크롬산칼륨시액 1㎖를 넣고 질산은액으로 엷은 적갈색을 나타낼 때까지 적정한다.

0.1N 질산은액 1㎖= 5.844㎎ NaCl, 이 액은 차광하여 보존하여야 한다.

0.02N 질산은액

사용할 때 0.1N 질산은액에 물을 가하여 정확히 5배 용량으로 희석한다.

0.01N 질산은액

사용할 때 0.1N 질산은액에 물을 가하여 정확히 10배 용량으로 희석한다.

0.1N 티오황산나트륨액

1,000㎖중 Na2S2O3 15.812g을 함유한다.

티오황산나트륨 약 26g 및 무수탄산나트륨 0.2g을 새로 끓여 식힌 물에 녹여 1,000㎖로 한다. 이 액은 가끔 다시 표정하여야 한다.

표정

이 액으로 0.1N 요오드액을 적정하거나 다음 방법으로 표정한다.

요오드산칼륨(표준시약)을 120～140℃로 2시간 건조하고 데시케이타(황산)에서 식히고 그 약 100㎎을 정밀히 달아 밀전한 병에 넣고 물 25㎖에 녹인 다음 요오드화칼륨 2g 및 희황산 10㎖를 넣고 마개를 꼭 막고 10분간 방치한 다음 물 100㎖를 넣고 유리된 요오드를 티오황산나트륨액으로 적정한다.

이때 종말점 부근에서 액이 담황색으로 되었을 때 전분시액 3㎖를 넣고 생성된 청색이 탈색될 때까지 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1N 티오황산나트륨액 1㎖= 3.567㎎ KIO3

0.01N 티오황산나트륨액

0.1N 티오황산나트륨액을 새로 끓여 식힌 물로 10배 용량으로 희석하고 0.1N 티오황산나트륨액에 따라 사용할 때 표정한다.

1N 황산

1,000㎖중 H2SO4 49.04g을 함유한다.

물 약 1,000㎖를 저으면서 이에 황산 30㎖를 천천히 가하여 20℃가 될 때까지 식히고 1N염산의 표정에 따라 탄산나트륨(표준시약)으로 표정한다.

1N 황산 1㎖= 52.996㎎ Na2CO3

0.1N 황산

1N 황산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 황산 3㎖로 1N 황산에 따라 만들고 표정한다.

0.1N 황산 1㎖= 5.299㎎ Na2CO3

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지

1. 시액

가. Antibiotics stock solution(항생제류)

(1) Amphotericin B

Amphotericin B 50㎎을 증류수 100㎖로 완전히 용해한 후 여과멸균한다. -20℃에서 1년간 보관 가능하다(최종 사용농도는 2㎎/ℓ).

(2) Cefoperazone

Sodium cefoperazone 0.4g을 증류수 100㎖로 완전히 용해한 후 여과 멸균하여 사용하며, 보관용액은 4℃에서 5일, -20℃에서 14일, -70℃에서 1개월 보관 가능하다(최종 사용농도는 32㎎/ℓ).

(3) Novobiocin

Novobiocin(sodium salt) 200㎎을 증류수 10㎖에 녹여 여과멸균하여 사용하며, 4℃에서 1개월간 보관가능하다(최종 사용농도는 20㎎/ℓ).

(4) Rifampicin

Rifampicin은 Vancomycin 대용으로 사용할 수 있다. Rifampicin 0.125g을 30㎖의 알코올로 완전히 녹을 때까지 잘 저은후, 증류수 100㎖를 첨가한다. -20℃에서 1년간 보관 가능하다(최종 사용농도는 10㎎/ℓ).

(5) Trimethoprim lactate

Trimethoprim lactate 0.375g을 증류수 100㎖로 완전히 용해한 후 여과멸균한다. 침전물이 생기며, 4℃에서 1년간 보관 가능하다(최종 사용농도는 15㎎/ℓ)

(6) Vancomycin

Vancomycin 0.25g을 증류수 100㎖로 완전히 용해한 후 여과멸균한다. 4℃에서 2개월 보관가능하다(최종 사용농도는 10㎎/ℓ).

나. BPD(Butterfield's Phosphate Buffered Dilution Water:인산염 완충희석액)

인산제2수소칼륨(KH2PO4) 34g을 증류수 500㎖에 용해하고 1N 수산화나트륨(NaOH) 175㎖를 가하여 pH 7.2로 조정하고 여기에 증류수를 가하여 1,000㎖로 하여 인산완충액(보관용)으로 한다. 이것을 121℃에서 20분간 멸균한 다음 냉장고에 보존하면서 사용할 때에는 이 원액 1㎖을 취하여 멸균증류수 800㎖에 가하여 희석하고 이것을 인산염완충희석액으로 한다.

다. BPW(Buffered peptone water)

Peptone	10g

NaCl	5g

Na2HPO4	3.5g

KH2PO4	1.5g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 용해한 후 pH 7.5가 되도록 한 다음 고압증기멸균하여 사용한다.

라. Campylobacter supplement(A)

Cefoperazone, Trimethoprim lactate, Vancomycin, Amphotericin B의 stock solution를 각각 4㎖씩 첨가하여 조제한다.

마. Campylobacter supplement(B)

Cefoperazone, Trimethoprim lactate, Vancomycin, Rifampicin의 stock solution 각 4㎖씩 첨가하여 조제 한다.

바. FBP

Ferrous sulfate	6.25g

Sodium metabisulfite	6.25g

Sodium pyruvate	6.25g

Distilled water	100㎖

여과멸균하여 15-25㎖씩 분주한 후, 밀봉하여 -20℃의 암소에서 보관한다. 약 1개월동안 사용가능하다.

사. Listeria Supplement

Cefrazidime	20㎎

Polymxyin B	10㎎

Acriflavine․HCl	5㎎

여과멸균 후 밀봉하여 -20℃의 암소에서 보관하며, 배지 1,000㎖에 첨가하여 사용한다.

아. Lysed horse blood

신선한 말혈액을 구매한 상태 그대로 용혈시켜 사용한다. 즉시 사용하지 않을 때는 1-2일 이내에 동결 보관한다. 동결보관 시에는 멸균된 polypropylene bottle에 약 100㎖씩 분주하여 -20℃에서 보관하면서 6개월 이내 사용한다. 용혈은 사용직전에 8℃에서 녹인 다음 다시 -20℃에 동결하였다가 다시 녹이는 방법으로 용혈하여 사용한다.

자. NewMan Stain(뉴만 염색액)

테트라클로로에탄(Tetrachloroethane) 40㎖와 에탄올(Ethanol)을 삼각플라스크에 취하고 70℃까지 가온한 후 여기에 메틸렌블루(Methylen blue) 1.0 ～ 2.0g을 가하여 진탕혼합하여 색소를 용해시킨 다음 냉각시킨다. 여기에 빙초산 6㎖를 천천히 가한 후 여과시켜 냉암소에 밀봉 저장한다. 염색액을 조제하여 시일이 경과한 것이나 또는 침전물이 생성된 것은 사용해서는 안된다.

차. Ninhydrin 용액

Ninhydrin 3.5g을 acetone과 butanol을 1:1로 혼합한 용액 100㎖로 용해하여 사용하며, 냉장보관한다.

카. Peptone Water(0.1%)

Peptone 1g을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 7.0으로 조정하고 고압증기멸균한다.

타. Sodium chloride (0.85%) solution (Saline : 멸균생리식염수)

Sodium chloride 8.5g에 증류수를 가하여 1,000㎖되게 하여 용해 한 다음  15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

파. Ziehl-Neelsen 염색액

(1) Saturated Alcoholic Basic Fuchsin(Stock Solution)

95% Ethyl alcohol	100㎖

Basic fuchsin	3g

(2) Basic Fuchsin(Working Solution)

Saturated Alcoholic Basic Fuchsin	10㎖

5% Phenol	90㎖

(3) Acid Alcohol

Hydrochloric acid	3.2㎖

95% Ethyl alcohol	97㎖

(4) Brilliant Green Counter stain

Brilliant green	1g

0.01 % NaOH	100㎖

하. 젤라틴-인산완충액

Gelatin	2g

Disodium Phosphate	4g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.2로 조정하고 121℃에서 15분간 가열한다.

거. Nitrite 지시약

․ A시약 : Sulfanilic acid 1g에 5N acetic acid 125ml을 가하여 제조한다.

․ B시약 : N-(1-naphthyl)ethylene dihydrochloride 0.25g에 5N acetic acid 200ml을 가하여 제조한다.

5N acetic acid는 28.75ml의 빙초산(glacial acetic acid)에 증류수 71.25ml를 가하여 제조한다.

사용시 0.5ml A시약과 0.2ml B시약을 각각 반응액에 첨가하여 적색-보라색을 띄면 양성으로 판정하며, 만일 반응이 없으면 Zn을 소량 첨가하여 색의 변화가 없으면 이를 양성으로 판정한다.

너. Bacillus cereus Supplement

Polymyxin B 50,000IU에 2ml의 멸균증류수를 첨가하여 사용한다.

2. 배지

가. Baird-Parker Medium

Tryptone	10g

Beef extract	5g

Yeast extract	1g

Sodium pyruvate	10g

Glycine	12g

Lithium chloride. 6H2O	5g

Agar	20g

위의 성분에 증류수 950㎖를 가하여 녹이고 pH를 7.8로 조정한다음 121℃, 15분간 고압증기멸균하여 48 ～ 50℃로 유지한다. Bacto EY tellurite enrichment 50㎖를 무균적으로 배지에 첨가한다. 거품이 나지 않도록 잘 섞은 뒤 샤레에 15 ～ 18㎖씩 분주한다. 이 배지는 불투명해야 한다.

나. Bismuth Sulfite(BS) Agar

Beef Extract	5.0g

Peptone	10.0g

Dextrose	5.0g

Bismuth sulfite	8.0g

Na2HPO4	4.0g

FeSO4	0.3g

Brilliant green	0.025g

Agar	20.0g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 1분간 끓여 녹인 후 pH 7.6으로 조정하여 사용한다.

다. BL 한천배지(BL Agar)

Beef extract	3g

Liver extract	5g

Yeast extract	5g

Proteose peptone	10g

Tryptone	5g

Soypeptone	3g

Soluble starch	0.5g

Glucose	10g

Dipotassium phosphate	1g

Monopotassium phosphate	1g

Magnesium sulfate	0.2g

Sodium chloride	0.01g

Manganese sulfate	0.0067g

L-Cysteine․HCl․H2O	0.5g

Ferrous sulfate	0.01g

Polysorbate 80(Tween 80)	1g

Agar	15g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 후 pH 7.2이 되도록 조정한 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 고압멸균시킨 BL한천 배지를 약 50℃로 냉각시킨 후 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5%되도록 첨가시켜 멸균샤레에 약 20㎖씩 분주하여 응고시켜 사용한다.

라. BS배지

Sodium propionate	15g

Paromomycin sulfate	50㎎

Neomycin	100㎎

Lithium chloride	3g

BL배지 1,000㎖에 위의 성분을 첨가하여 조제한 후 15파운드(121℃)에서 15분간 고압증기멸균한다.

마. Blood Agar (혈액한천배지)

Tryptone	15.0g

Agar	15.0g

NaCl	5.0g

Soytone	5.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 950㎖로 만들고 가열 용해한 후 pH 7.3이 되도록 맞춘 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 고압멸균시킨 배지를 약 50℃로 냉각시킨 후 양의 탈섬유소 혈액을 5%(50㎖)가 되도록 첨가한 다음 멸균샤레에 약 20㎖씩 분주하여 응고시켜 사용한다.

바. Blaser's Campylobacter Agar(BCA)

Yeast extract	5.0g

Peptone	15.0g

NaCl	5.0g

Agar	12.0g

Liver digest	2.5g

위의 성분에 증류수를 가하여 950㎖되게 용해하여 pH 7.0로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 용혈된 말혈구 50㎖과  Campylobacter Supplement (A) (유제품의 경우 사용가능)를 권장량이 되게 첨가한다.

사. Brilliant Green Lactose Bile Broth(BGLB배지)

Peptone	10.0g

Lactose	10.0g

Oxgall	20.0g

Brilliant green	0.0133g

위의 성분에 증류수를 가하여 1000㎖가 되도록 하고 pH 7.2로 조정한 다음 여과멸균하여 발효관을 넣은 시험관에 분주하여 고압증기멸균한다. 필요에 따라 MUG 50㎎을 첨가하여 사용한다(BGLB-MUG)

아. Campylobacter Enrichment Broth(CEB)

(1) Campylobacter enrichment broth base

Beef extract	10g

Peptone	10g

NaCl	5g

Yeast extract	6g

위의 성분에 증류수를 가하여 950㎖되게 용해하여 pH 7.5로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 보관한다.

(2) CEB(Campylobacter enrichment broth )

950㎖의 CEB base를 멸균하여 식히고 Lysed horse blood 50㎖, Antibiotic Campylobacter Supplement (A) 또는 Campylobacter Supplement (B)(유제품의 경우 사용가능) 16㎖, FBP 4㎖를 혼합하여 제조한다.

자. Campylobacter Blood Free Selective Agar(CBFA)

Agar	12.0g

Peptone	10.0g

Beef extract	10.0g

Charcoal	4.0g

Casein hydrolysate	3.0g

Sodium deoxycholate	1.0g

Fe2SO4 H2O	0.25g

Sodium pyruvate	0.25g

위의 성분을 증류수로 990㎖되게 용해하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 Cefoperazone 10㎖을 첨가한다.

차. Campy Cefex Agar(CCA)

Brucella Agar(Difco)	44.0g

Ferrous sulfate	0.5g

Sodium pyruvate	0.5g

Sodium bisulfite	0.25g

위의 성분을 증류수로 990㎖되게 용해하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 Cefoperazone 10㎖ 및 Cycloheximide(200㎎/ℓ)을 첨가한다.

카. Clostridium perfringens Agar

Pancreatic digest of casein	15.0g

Liver extract	7.0g

Yeast extract	5.0g

Papaic digest of soybean meal	5.0g

Tris aminomethane buffer	1.5g

Ferric ammonium citrate	1.0g

Na2S2O5	1.0g

Agar	10g

위의 성분에 증류수를 가하여 990㎖로 만들고 pH 7.3으로 조정한 후 15파운드 (121℃)에서 15분간 고압증기멸균한다. 멸균 후 배지를 50℃정도로 식혀 제조된 항생제 10㎖(sodium sulfadixine 0.1g, oleandomycin phosphate 0.5㎎, polymyxin B 10,000IU)를 무균적으로 가해 잘 혼합한 후 평판배지를 제조한다.

타. Cooked Meat Medium

Beef heart	500g

Peptone	10g

Glucose	2g

Sodium chloride	5g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균하고 pH 7.2로 조정한다.

파. Christensen's Urea Agar

Peptone	1g

NaCl	5g

Dextrose	1g

KH2PO4	2g

Phenol red (6㎖ of 1:500 solution)	0.012g

Agar	15g

위의 성분을 900㎖의 멸균증류수에 녹이고 pH 6.8로 조정한 다음 121℃, 15분 고압증기멸균을 실시하고 배지를 50±2℃되게 항온수조에 보관한다. Urea 20g을 증류수로 100㎖되게 용해하여 여과멸균한 다음 배지에 첨가하여 잘 섞은 후 16×125㎜의 멸균된 시험관에 분주하고 사면으로 굳힌다.

하. Christensen‘s Citrate Agar

Sodium citrate	3g

Glucose	0.2g

Yeast extract	0.5g

Cysteine monohydrochloride	0.1g

Ferric ammonium citrate	0.4g

KH2PO4	1g

NaCl	5g

Sodium thiosulfate	0.08g

Phenol red	0.012g

Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖를 가하여 약 1분동안 가열 용해한 다음 16×150㎜ 시험관의 ⅓정도 채운 뒤 뚜껑 또는 마개로 호기상태를 유지하여 121℃, 15분 고압증기멸균을 실시한다. 멸균후 4 ～ 5㎝의 사면과 2 ～ 3㎝의 깊이를 얻기 위해 시험관을 사면으로 유지한채 굳힌다.

거. Desoxycholate Lactose Agar (DCLA:데스옥시콜레이트 유당한천배지)

Peptone	10.0g

Lactose	10.0g

Sodium chloride	5.0g

Sodium citrate	2.0g

Sodium desoxycholate	0.5g

Agar	15.0g

Neutral Red	0.03g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 pH 7.3 ～ 7.5가 되도록 맞춘 다음 1분간 끓여서 용해시켜 멸균하지 않고 즉시 사용할 수 있다.

(고압증기멸균하면 배지의 pH가 떨어져 데스옥시콜산나트륨이 침전할 수 있으므로 피하는 것이 좋다.)

너. Desoxycholate Citrate Agar(DCA)

Beef extract	5.0g

Peptone	5.0g

Lactose	10.0g

Sodium citrate	8.5g

Sodium thiosulfate	5.4g

Ferric ammonium citrate	1.0g

Sodium desoxycholate	5.0g

Neutral red	0.02g

Agar	12.0g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 pH 7.5가 되도록 한다.

더. EC broth (EC 배지)

Peptone	20.0g

Lactose	5.0g

Bile salt No. 3	1.5g

Dipotassium phosphate(K2HPO4)	4.0g

Monopotassium phosphate(KH2PO4)	1.5g

Sodium chloride	5.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH가 6.9 ～ 7.1이 되도록 맞추고 발효관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

러. EC - MUG 배지

EC 배지 l,000㎖에 MUG(4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide) 50㎎을 첨가하여 시험관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

머. Endo Agar (Endo배지)

Dipotassium Phosphate(K2HPO4)	3.5g

Peptone	10.0g

Lactose	10.0g

Sodium sulfate	2.5g

Basic fuchsin	0.5g

Agar	15.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖되게 만들고 멸균한 후 pH 7.4가 되도록 조정한 다음 15 파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

버. EMB Agar(EMB 배지)

Peptone	10.0g

Lactose	5.0g

Sucrose	5.0g

Dipotassium phosphate	2.0g

Eosin Y	0.4g

Methylene blue	0.0065g

Agar	13.5g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH 7.2되도록 조정한 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

서. Fluorocult E.coli O157:H7 Agar

Peptone	20.0g

Meat extract	2.0g

Yeast extract	1.0g

Sorbitol	10.0g

Ammonium iron(III) citrate	0.5g

MUG((4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide)	0.1g

Sodium chloride	5.0g

Bromothymol blue	0.025g

Sodium thiosulfate	2.0g

Sodium deoxycholate	1.12g

Agar	13.0g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 후 15파운드(121℃)로 20분간 고압증기멸균하여 pH 7.0 ～ 7.2가 되도록 한다. 대장균 O157:H7을 선택배양하기 위한 항생제로서 Cefixime(0.05㎍/㎖) 및 Potassium tellurite (2.5㎍/㎖)를 첨가할 수 있다.

어. Fluid Thioglycollate Medium(치오글리콜린산염배지)

Yeast extract	5.0g

Casitone	15.0g

Dextrose	5.0g

Sodium chloride	2.5g

L-cystine	0.75g

Thioglycollic acid	0.5g

Agar	0.75g

Resazurin	0.001g

위의 성분을 1,000㎖중류수에 용해시켜 시험관에 분주하고 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한 후 급냉하여 레자즈린층이 나타나게 한다.

저. Fraser Broth

Tryptose	10g

Beef extract	5g

Yeast extract	5g

Sodium chloride	20g

Sodium phsphate, dibasic	9.6g

Potassium phosphate, monobasic	1.35g

Esculin	1g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 후 Nalidixic acid 0.02g, Acreflavin HCl 0.021g, Lithium chloride 3g을 여과멸균하여 가한다.

처. Hektoen Enteric (HE) Agar

Peptone	12g

Yeast extract	3g

Bile salts No. 3	9g

Lactose	12g

Sucrose	12g

Salicin	2g

NaCl	5g

Sodium thiosulfate	5g

Ferric ammonium citrate	1.5g

Bromthymol blue	0.065g

Acid fuchsin	0.1g

Agar	14.0g

Distilled water	1 liter

가끔 교반시키면서 약 1분동안 가열한 뒤 항온수조에서 냉각시킨다. 멸균된 15×100㎜ 페트리디쉬에 20㎖씩 분주하고 뚜껑을 열고 2시간가량 굳힌다. 최종 pH는 7.6±0.2로 하고, 1일이상 보관해서는 안된다.

커. Lactose Broth(유당부이온배지)

Peptone	5.0g

Beef extract	3.0g

Lactose	5.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 제조하고 멸균한 후 pH 6.9가 되도록 조정하여 발효관을 넣은 시험관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

퍼. Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth

Tryptose or trypticase	20g

Lactose	5g

K2HPO4	2.75g

NaCl	5g

Sodium lauryl sulfate	0.1g

위의 성분을 증류수로 1,000㎖ 되게 제조하여 pH 6.8로 조정한 다음 발효관(Duram tube)을 넣은 시험관에 10㎖씩 분주하고, 고압증기멸균한다. 필요에 따라 MUG 50㎎을 첨가하여 사용한다.(LST-MUG)

허. Liver Agar

Beef liver	500g

Proteose peptone	10g

Sodium chloride	5g

Agar	20g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 15파운드(121℃)에서 15분간 고압증기멸균한다. 일반세균의 증식을 억제하기 위하여 배지에 Bactracin (25units/㎖), Vancomycin (20㎍/㎖), Polymyxin B(5units/㎖), Nalidixic acid(5㎍/㎖)과 Cloheximide(100㎍/㎖)을 첨가한다.

고. Lithium Chloride-Phenylethanol-Moxalactam(LPM) Agar

Thyptose	10g

Beef extract	3g

Sodium chloride	5g

Lithium chloride	5g

Glycine anhydride	10g

Phenylethanol	2.5g

Agar	15g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식힌 후 Moxalactam 20㎎을 여과멸균하여 가한다.

노. LIM 배지

Peptone	10g

Yeast extract	3g

Dextrose	3g

Bromcresol purple	0.02g

L-lysin hydrochloride	10g

L-tryptophan	0.5g

Agar	3g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 pH 6.7로 조정한 다음 시험관에 분주하여 15파운드 (121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

도. Listeria Enrichment Broth (LEB)

Tryptone	17g

Soytone	3g

Glucose	2.5g

Sodium chloride	5g

Potassium phosphate, dibasic	2.5g

Yeast extract	6g

Cycloheximide	0.05g

Acriflavin HCl	0.015g

Nalidixic acid	0.04g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들어 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)에서 15분간 고압증기멸균하고 pH 7.3으로 조정한다.

로. MacConkey Agar

Peptone	17.0g

Polypeptone	3.0g

Lactose	10.0g

Bile salts No.3	1.5g

Sodium chloride	5.0g

Neutral red	0.03g

Crystal violet	0.001g

Agar	13.5g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 후 15파운드(121℃)로 20분간 고압증기멸균하여 pH 7.0 ～ 7.2가 되도록 한다.

모. mEC Broth (mEC 배지)

Peptone	20.0g

Lactose	5.0g

Bile salts No. 3	1.5g

Dipotassium phosphate(K2HPO4)	4.0g

Monopotassium phosphate(KH2PO4)	1.5g

Sodium chloride	5.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH가 6.9 ～ 7.1이 되도록 맞추고 발효관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 배지를 약 50℃로 식힌 후 여과멸균한 Novobiocin(20㎍/㎖)을 첨가한다.

보. mTSB

Tryptose	17g

Soytone	3g

Glucose	2.5g

Sodium chloride	5g

Bile salts No. 3	1.5g

Dipotassium phosphate	5g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드에서 15분간 멸균하고 pH 7.3으로 조정한다. 배지를 약 50℃로 식힌 후 여과멸균한 Novobiocin(20㎍/㎖)을 첨가한다.

소. MacConkey Sorbitol Agar(SMAC)

Peptone	15.5g

Polypeptone	3.0g

Sorbitol	10.0g

Bile salts No.3	1.5g

Sodium chloride	5.0g

Neutral red	0.03g

Crystal violet	0.001g

Agar	15.0g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 후 15파운드(121℃)로 20분간 고압증기멸균하여 pH 7.0 ～ 7.2가 되도록 한다. 대장균 O157:H7을 선택배양하기 위한 항생제로서 Cefixime(0.05㎍/㎖) 및 Potassium tellurite(2.5㎍/㎖)을 첨가할 수 있다.

오. Mannitol Salt-Egg Yolk Agar(난황첨가 만니톨 식염한천배지)

Beef extract	2.5g

Peptone	10g

Mannitol	10g

Sodium chloride	75g

Phenol red	25㎎

Agar	15g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 후 pH 7.2 ～ 7.6으로 맞추고 15파운드 (121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 멸균시킨 배지를 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것)을 10% 비율로 무균적으로 가해 잘 혼합한 후 멸균샤레에 약 15㎖씩 분주하여 굳혀서 평판을 조제한다.

조. Nutrient Broth(보통부이온 배지)

Peptone	5.0g

Beef extract	3.0g

증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH 6.9 ～ 7.4가 되도록 조정한 다음 시험관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 용도에 따라 Sodium chloride를 0.5% 되게 첨가하여 제조한다.

초. Nutrient Agar (보통한천배지)

Nutrient Broth 1,000㎖에 Agar 15g을 가하여 가열 용해하고, pH 7.0 ～ 7.4가 되도록 조정한 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 용도에 따라 Sodium chloride를 0.5% 되게 첨가하여 제조한다.

코. 3% Okawa 배지(3% KH2PO₄배지)

Monopotassium phosphate                          3g

Sodium glutamate                                  1g

위의 성분에 증류수를 가하여 100㎖로 만들고 100℃에서 30분간 끓인다. 이 기초액에 전란액 20㎖, Glycerol 6㎖, 2% Malachite green 수용액 6㎖씩 취하여 충분히 혼합한 후 5 ～ 6㎖씩 멸균시험관 또는 시험병에 분주한 다음 85 ～ 90℃에서 60분간 가열 멸균한다.

토. Oxford Agar

Columbia blood agar base	39g

Esculin	1g

Ferric ammonium citrate	0.5g

Lithium chloride	15g

Agar	2g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 후 Cycloheximide 400㎖, Colistin Sulfate 20㎎, Acriflavin 5㎎, Cefotettan 2㎎, Fosfomycin 10㎎을 여과멸균하여 가한다.

포. PALCAM(Polymyxin Acriflavine LiCI Ceftazidime Esculin Mannitol) Agar

Peptone	23g

LiCl	15g

Agar	10g

Mannitol	10g

NaCl	5g

Yeast extract	3g

Starch	1g

Esculin	0.8g

Ferric ammonium citrate	0.5g

Glucose	0.5g

Phenol Red	0.08g

PALCAM selective supplement	10㎖

Distilled water	1 liter

위의성분을 증류수로 용해시켜 25℃에서 pH 7.2±0.2 로 조정하여 고압증기멸균한다.

호. Plate Count Agar with Brom Cresol Purple( BCP첨가 평판측정용배지)

Yeast extract	2.5g

Peptone	5.0g

Dextrose	1.0g

Tween 80	1.0g

L-cysteine	0.1g

Agar	15.0g

위의 성분(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 가열 용해한 다음 pH 6.8 ～ 7.0으로 맞춘다. 여기에 BCP(Bromcresol purple)은 0.004～0.006%가 되도록 가하고 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

구. Potato Dextrose Agar(PDA)

Potato infusion	200.0g(㎖)

Dextrose	20.0g

Agar	20.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 멸균한 후 pH 5.6±2가 되도록 맞추고 15파운드(121℃)로 15분간 멸균시킨 다음 사용 직전에 멸균된 10% Tartaric acid(주석산)를 무균적으로 가하여 pH 3.5±0.1로 맞추고 멸균 샤레에 약 15㎖씩을 분주하여 굳혀서 평판을 조제한다.

누. Rapparport-Vassiliadine Medium

(1) Broth base

Tryptone	5g

NaCl	8g

KH2PO4	1.6g

Distilled water	1 liter

(2) Magnesium chloride solution

MgCl2․6H2O	400g

Distilled water	1 liter

(3) Malachite green oxalate solution

Malachite green oxalate	0.4g

Distilled water	100㎖

완전한 배지를 준비하기 위해서 1,000㎖의 Broth base와 100㎖의 Magnesium chloride 용액과 10㎖의 Malachite green oxalate용액을 혼합한다(완전한 배지의 총량은 1110㎖이다). Broth base는 완전한 배지에 첨가되는 성분과 동일한 날에 준비하고 Magnesium chloride용액은 1년동안 실온에서 갈색병에 보관이 가능하다.

두. Sabouraud's Dextrose Agar(SDA)

Polypeptone	10.0g

Dextrose	40.0g

Agar	20.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 제조하여 pH 5.6가 되도록 맞추고 15파운드(121℃)로 15분간 멸균시킨다. 세균의 증식을 방지하기 위하여 적절한 항생제(Chlortetracycline-HCl 및 Chloramphenicol)를 40ppm(4㎎/㎖)되게 배지에 첨가한다.

루. Selenite Cystine Broth

Tryptone or polypeptone	5g

Lactose	4g

Sodium acid selenite (NaHSeO3)	4g

Na2HPO4	10g

L-cystine	0.01g

Distilled water	1 liter

완전히 녹이기 위해 가열한 뒤 16×150㎜의 멸균된 시험관에 10㎖씩 분주하고, 고압증기멸균은 금할것이며 흐르는 증기에서 10분동안 가열한다. 최종 pH는 7.0±0.2가 되도록하며 사용직전에 제조한다.

무. Serum Dextrose Agar

Peptone	10.0g

Meat extract	5.0g

Sodium chloride	5.0g

Agar	20.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 950㎖로 만들고 pH 7.4가 되도록 조정한 다음 시험관에 분주하여 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한후 약 50℃의 항온수조에 보관한다. Fetal bovine serum 100㎖내에 Dextrose 20g을 녹이고 여과하여 제조한 것 50㎖를 배지에 첨가한다.

일반세균의 증식을 억제하기 위하여 배지에 Bacitracin(25units/㎖), Vancomycin (20㎍/㎖), Polymyxin B(5units/㎖), Nalidixic acid(5㎍/㎖)과 Cycloheximide (100㎍/㎖)을 첨가한다.

부. Standard Plate Count Agar(표준한천평판배지)

Tryptone	5.0g

Yeast extract	2.5g

Dextrose	1.0g

Agar	15.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖되게 제조하고 멸균한 후 pH 7.0이 되도록 조정한 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균 한다.

수. Tetrathionate Broth

(1) Tetrathionate broth base

Polypeptone	5g

Bile salts	1g

Calcium carbonate	10g

Sodium thiosulfate․5H2O	30g

Distilled water	1 liter

1,000㎖ 멸균증류수에 배지성분을 부유시켜서 섞은후 끓인다(배지성분이 침전되어 있으면 녹지 않는다). 최종 pH가 8.4±0.2가 되도록 한 뒤 45℃이하로 식혀서 5 ～ 8℃에 보관한다.

(2) Iodine-potassium iodide (I-KI) solution

Potassium iodide	5g

Iodine, resublimed	6g

Distilled water, sterile	20㎖

5㎖의 멸균증류수에 Potassium iodide를 용해시킨 뒤 iodine을 첨가하고 완전히 녹인 후 증류수를 가하여 20㎖로 한다.

(3) Brilliant green solution

Brilliant green dye, sterile	0.1g

Distilled water, sterile	100㎖

사용하려고 하는날, 20 ㎖의 I-KI 용액과 10㎖의 Brilliant green 용액을 Tetrathionate broth base에 첨가하고 서서히 교반하면서 배지침전물들을 재부유시킨 뒤 20×150㎜ 또는 16×150 ㎜의 멸균된 시험관에 무균적으로 10㎖씩 분주한다. 배지에 I-KI와 dye 용액을 첨가한 뒤에는 가열해서는 안된다.

우. TSA(Tryptic Soy Agar)

Tryptose	17g

Soytone	3g

Glucose	2.5g

Sodium chloride	5g

Dipotassium phosphate	2.5g

Agar	15g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)에서 15분간 멸균하고 pH7.3으로 조정한다.

주. TSB 배지(Tryptic Soy Broth)

Tryptone	17g

Soytone	3g

Dextrose	2.5g

Sodium chloride	5g

Dipotassium phosphate	2.5g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 pH를 7.3±0.2로 맞춘 다음 15파운드 (121℃)로 15분간 고압증기멸균한다.

추. TSI(Triple Sugar Iron) Agar

Beef extract	3.0g

Yeast extract	3.0g

Peptone	20.0g

Lactose	10.0g

Sucrose	10.0g

Dextrose	1.0g

Ferrous sulfate	0.2g

Sodium chloride	5.0g

Sodium thiosulfate	0.3g

Phenol red	0.24g

Agar	13.0g

위 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 끓여 녹인 후 15파운드(121℃)로 15분간 멸균한다.

쿠. Violet Red Bile Agar(VRBA)

Yeast extract	3.0g

Peptone	7.0g

Lactose	10.0g

Bile salts No.3	1.5g

Sodium chloride	5.0g

Neutral red	0.03g

Crystal violet	0.002g

Agar	15.0g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들고 pH 7.3 ～ 7.5가 되도록 맞춘 다음 2분간 끓여서 용해시켜 사용한다. 멸균은 하지 않는다.

투. Xylose Lysin Desoxycholate (XLD) Agar

Yeast extract	3g

L-lysine	5g

Xylose	3.75g

Lactose	7.5g

Sucrose	7.5g

Sodium desoxycholate	2.5g

Ferric ammonium citrate	0.8g

Sodium thiosulfate	6.8g

NaCl	5g

Agar	15g

Phenol red	0.08g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH7.4로 조정하고 고압증기멸균한 후 사용한다.

푸. TPGY 배지

Trypticase	50g

Peptone	5g

Yeast Extract	20g

Dextrose	4g

Sodium Thioglycollate	1g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.0으로 조정하고, 15㎖씩 시험관에 분주하여 121℃에서 10분간 멸균한다.

후. Liver-Veal 난황한천배지

Liver-Veal Agar	48.5g

Liver-Veal Agar를 증류수 500㎖에 녹여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것) 40㎖을 무균적으로 가하고 평판을 만든다.

기. 혐기성 난황한천배지

Yeast Extract	5g

Tryptone	5g

Proteose Peptone	20g

Sodium Chloride	5g

Agar	20g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.0으로 조정하고, 121℃에서 15분간 멸균한 후 50℃정도로 식혀 난황액(난황에 동량의 멸균생리식염수를 가한 것) 40㎖를 무균적으로 가하고 평판을 만든다.

니. GAM 당분해용 반유동 배지

Peptone	10g

Soytone	3g

Proteose Peptone	10g

Bovine Serum Albumin	13.5g

Yeast Extract	5g

Beef	2.2g

Potassium Phosphate, Monobasic	2.5g

Liver	1.2g

Sodium Chloride	3g

L-Cystein	0.3g

Sodium Thioglychollate	0.3g

Agar	1.5g

Sugar	10g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 가온용해 후 당을 가해서 작은 시험관에 분주하여 110～115℃에서 15분간 멸균 후 급냉시킨다.

디. 세균수 건조필름배지

Pancreatic Digest of Casein	3.4g

Yeast Extract	2.4g

Sodium Pyruvate	6.8g

Dextrose	0.6g

Potassium Phosphate(dibasic)	1.3g

Potassium Phosphate(monobasic)	0.4g

Guar Gum(Cold water soluble gellingagent)	91.4g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.0205g

(Tetrazolium indicator dye for red color reaction)

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

리. 대장균군 건조필름배지

Yeast Extract	9.6g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9g

Bile Salt #3	1.6g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6g

Lactose	21.4g

Sodium Chloride	5.3g

Crystal Violet	2㎎

Neutral Red	0.1g

Guar Gum(Cold water soluble gelling agent)	65.7g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

미. 대장균 건조필름배지

Yeast Extract	9.6g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9g

Bile Salt #3	1.6g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6g

Lactose	21.4g

Sodium Chloride	5.3g

Crystal Violet	2㎎

Neutral Red	0.1g

Guar gum	65.4g

5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronic Acid,

Cyclohexylammonium Salt	0.2g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

비. TCBS(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose)

Agar Yeast Extract	5g

Peptone	10g

Sodium Citrate	10g

Sodium Thiosulfate	10g

Oxgall	5g

Sodium Cholate	3g

Sucrose	20g

Sodium Chloride	10g

Ferrous Citrate	1g

Brom Thymol Blue	0.04g

Thymol Blue	0.04g

Agar	15g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 가열한 후 50℃정도로 식혀 멸균 페트리접시에 붓는다. 최적 pH는 8.6이며 고압증기멸균을 해서는 안된다.

시. VP반유동배지

Yeast Extract	1g

Casein Peptone	7g

Soypeptone	5g

Dextrose	10g

NaCl	5g

Agar	3g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹인 후 pH 7.0 ∼7.2로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

이. Purple Broth Base

Proteose Peptone	10g

Beef Extract	1g

Sodium Chloride	5g

Brom Cresol Purple	0.015g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

지. Moeller Basal Broth

Beef Extract	5g

Dextrose	0.5g

Brom Cresol Purple	0.01g

Cresol Red	0.005g

Pyridoxal Hydrochloride	0.005g

위의 성분을 증류수 1,000㎖에 녹여 pH 6.0으로조정한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간멸균한다. 균을 접종 후 멸균유동 파라핀을 중층한다.

치. ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) broth

0.5% NaCl을 가한 Peptone Water 75㎖에 ONPG 용액25㎖를 첨가한다. 시험관에 ONPG Broth 2.5㎖씩 분주한다.

* ONPG용액：ONPG 6g을 0.01M 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 1,000㎖에 용해하여 pH를 7.5로 조정한다.

키. Enterobacteriaceae enrichment broth(EE broth)

Peptone	10.0g

Glucose	5.0g

Sodium monohydrogen phosphate dihydrate	8.0g

Potassium dihydrogen phosphate	2.0g

Ox-gall	20.0g

Brilliant Green	0.015g

위의 성분을 1,000㎖의 증류수에 가한 후 100℃에서 30분간 끓여 녹인 후 90㎖씩 분주한다.

티. Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(CESA)

Tryptone	15.0g

Soya peptone	5.0g

Sodium chloride(NaCl)	5.0g

Ferric ammonium citrate	1.0g

Sodium desoxycholate	1.0g

Sodium thiosulphate	1.0g

Chromogen	0.1g

Agar	15.0g

위의 성분을 1,000㎖의 증류수에 가열 용해한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

피. E. sakazakii medium

Tryptone	20.0g

Bile Salts #3	1.5g

Sodium thiosulphate	1.0g

Ferric ammonium citrate	1.0g

MUG α-D-glucopyranoside	0.05g

Agar	15.0g

위의 성분을 1,000㎖의 증류수에 가열 용해한 후 25℃에서 pH 7.0 ± 0.2 로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한다.

히. MYP agar

Meat extract	1.0g

Peptone	10.0g

Mannitol                                         10.0g

Sodium chloride                                  10.0g

Phenol Red                                      0.025g

Agar	12.0g

pH 7.2±0.2

위의 성분 21.5g을 450㎖의 증류수에 가한 후 121℃에서 15분간 autoclave 해서 살균한 후 49℃정도로 식히고 50ml의 Egg Yolk Emulsion을 지시에 따라 녹인 후 Bacillus cereus Supplement를 무균적으로 첨가한 후 페트리디쉬에 분주한다.

Ⅸ. 부        표

1. 벨트란당류정량표

당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)					당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)
	전화당	포도당	갈락 토오스	맥아당	유당		전화당	포도당	갈락 토오스	맥아당	유당
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33	20.6 22.6 24.6 26.5 28.5 30.5 32.5 34.5 36.4 38.4 40.4 42.3 44.2 46.1 48.0 49.8 51.7 53.6 55.5 57.4 59.3 61.1 63.0 64.8	20.4 22.4 24.3 26.3 28.3 30.2 32.2 34.2 36.2 38.1 40.1 42.0 43.9 45.8 47.7 49.6 51.5 53.4 55.3 57.2 59.1 60.9 62.8 64.6	19.3 21.2 23.0 24.9 26.7 28.6 30.5 32.3 34.2 36.0 37.9 39.7 41.6 43.4 45.2 47.0 48.9 50.7 52.5 54.4 56.2 58.0 59.7 61.5	11.2 12.3 13.4 14.5 15.6 16.7 17.8 18.9 20.0 21.1 22.2 23.3 24.4 25.5 26.6 27.7 28.9 30.0 31.1 32.2 33.3 34.4 35.5 36.5	14.4 15.8 17.2 18.6 20.0 21.4 22.8 24.2 25.6 27.0 28.4 29.8 31.1 32.5 33.9 35.2 36.6 38.0 39.4 40.7 42.1 43.4 44.8 46.1	34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57	66.7 68.5 70.3 72.2 74.0 75.9 77.7 79.5 81.2 83.0 84.8 86.5 88.3 90.1 91.9 93.6 95.4 97.1 98.8 100.6 102.2 104.0 105.7 107.4	66.5 68.3 70.1 72.0 73.8 75.7 77.5 79.3 81.1 82.9 84.7 86.4 88.2 90.0 91.8 93.6 95.4 97.1 98.9 100.6 102.3 104.0 105.8 107.6	63.3 65.0 66.8 68.6 70.4 72.1 73.9 75.6 77.4 79.1 80.8 82.5 84.3 86.0 87.7 89.5 91.2 92.9 94.6 96.3 98.0 99.7 101.5 103.2	37.6 38.7 39.8 40.9 41.9 43.0 44.1 45.2 46.3 47.4 48.5 49.5 50.6 51.7 52.8 53.9 55.0 56.1 57.1 58.2 59.3 60.3 61.4 62.5	47.4 48.7 50.1 51.4 52.7 54.1 55.4 56.7 58.0 59.3 60.6 61.9 63.3 64.6 65.9 67.2 68.5 69.8 71.1 72.4 73.7 74.9 76.2 77.5

당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)					당류 (㎎)	각 당류에 상당하는 동 중량(㎎)
	전화당	포도당	갈락 토오스	맥아당	유당		전화당	포도당	갈락 토오스	맥아당	유당
58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79	109.2 110.9 112.6 114.3 115.9 117.6 119.2 120.9 122.6 124.2 125.9 127.5 129.2 130.8 132.4 134.0 135.6 137.2 138.9 140.5 142.1 143.7	109.3 111.1 112.8 114.5 116.2 117.9 119.6 121.3 123.0 124.7 126.4 128.1 129.8 131.4 133.1 134.7 136.3 137.9 139.6 141.2 142.8 144.5	104.9 106.6 108.3 110.0 111.6 113.3 115.0 116.6 118.3 120.0 121.7 123.3 125.0 126.6 128.3 130.0 131.5 133.1 134.8 136.4 138.0 139.7	63.5 64.6 65.7 66.8 67.9 68.9 70.0 71.1 72.2 73.3 74.3 75.4 76.5 77.6 78.6 79.7 80.8 81.8 82.9 84.0 85.1 86.2	78.8 80.1 81.4 82.7 83.9 85.2 86.5 87.7 89.0 90.3 91.6 92.8 94.1 95.4 96.7 98.0 99.1 100.4 101.7 102.9 104.2 105.4	80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100	145.3 146.9 148.5 150.0 151.6 153.2 154.8 156.4 157.9 159.5 161.1 162.6 164.2 165.7 167.3 168.8 170.3 171.9 173.4 175.0 176.5	146.1 147.7 149.3 150.9 152.5 154.0 155.6 157.2 158.8 160.4 162.0 163.6 165.2 166.7 168.3 169.9 171.5 173.1 174.6 176.2 177.8	141.3 142.9 144.6 146.2 147.8 149.4 151.1 152.7 154.3 156.0 157.6 159.2 160.8 162.4 164.0 165.6 167.2 168.8 170.4 172.0 173.6	87.2 88.3 89.4 90.4 91.5 92.6 93.7 94.8 95.8 96.9 98.0 99.0 100.1 101.1 102.2 103.2 104.2 105.3 106.3 107.4 108.4	106.7 107.9 109.2 110.4 111.7 112.9 114.1 115.4 116.6 117.9 119.1 120.3 121.6 122.8 124.0 125.2 126.5 127.7 128.9 130.2 131.4

2. 레인․에이논 전화당 정량표

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 전화당량 (㎖)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 전화당량 (㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액100㎖ 중의 전화당량 (㎎)
16.0 16.1 16.2 16.3 16.4 16.5 16.6 16.7 16.8 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 17.6 17.7 17.8 17.9 18.0 18.1 18.2 18.3 18.4 18.5 18.6 18.7 18.8 18.9 19.0 19.1 19.2 19.3	316.6 314.7 312.7 310.8 308.9 307.0 305.2 303.4 301.5 299.8 298.0 296.4 294.8 293.2 291.6 290.0 288.4 286.8 285.2 283.6 282.0 280.5 279.0 277.5 276.0 274.5 273.0 271.5 270.0 268.5 267.0 265.7 264.5 263.2	19.4 19.5 19.6 19.7 19.8 19.9 20.0 20.1 20.2 20.3 20.4 20.5 20.6 20.7 20.8 20.9 21.0 21.1 21.2 21.3 21.4 21.5 21.6 21.7 21.8 21.9 22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7	262.0 260.7 259.5 258.2 257.0 255.7 254.5 253.3 252.2 251.0 249.9 248.7 247.5 246.5 245.2 244.1 242.9 241.8 240.7 239.6 238.5 237.4 236.2 235.1 234.0 232.9 231.8 230.8 229.9 228.9 228.0 227.0 226.0 225.1	22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9 24.0 24.1 24.2 24.3 24.4 24.5 24.6 24.7 24.8 24.9 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0 35.0	224.1 223.2 222.2 221.3 220.4 219.5 218.6 217.8 216.9 216.0 215.1 214.2 213.3 212.4 211.6 210.7 209.9 209.0 208.2 207.3 206.4 205.6 204.8 197.4 190.4 183.7 177.6 171.7 166.3 161.2 156.6 152.2 147.9

3. 레인․에이논 유당 정량표

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화당으로서 나타내는양(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화당으로서 나타내는양(㎎)
25.0 25.1 25.2 25.3 25.4 25.5 25.6 25.7 25.8 25.9 26.0 26.1 26.2 26.3 26.4 26.5 26.6 26.7 26.8 26.9 27.0 27.1 27.2 27.3 27.4 27.5	258.0 257.0 256.0 255.0 254.0 253.0 252.0 251.0 250.0 249.0 248.0 247.1 246.1 245.2 244.2 243.3 242.3 241.4 240.4 239.5 238.5 237.7 236.8 235.0 235.1 234.3	207.3 206.5 205.7 205.0 204.2 203.3 202.5 201.7 201.0 200.1 199.3 198.6 197.9 197.2 196.4 195.7 194.9 194.2 193.5 192.7 192.0 191.4 190.7 190.1 189.3 188.8	27.6 27.7 27.8 27.9 28.0 28.1 28.2 28.3 28.4 28.5 28.6 28.7 28.8 28.9 29.0 29.1 29.2 29.3 29.4 29.5 29.6 29.7 29.8 29.9 30.0 30.1	233.4 232.6 231.7 230.9 230.0 229.2 228.4 227.7 226.9 226.1 225.3 224.5 223.8 223.0 222.2 221.5 220.7 220.0 219.2 218.4 217.7 216.9 216.2 215.4 214.7 214.0	188.0 187.4 186.7 186.1 185.3 184.7 184.1 183.5 182.9 182.3 181.5 180.9 180.3 179.7 179.1 178.4 177.8 177.3 176.7 176.1 175.5 174.8 174.3 173.7 173.1 172.6

검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유 당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화당으로서 나타내는양(㎎)	검액의 소요량 (㎖)	검액 100㎖ 중의 무수유당량 (㎎)	좌의 유당량이 전화 후 전화당으로서 나타내는양(㎎)
30.2 30.3 30.4 30.5 30.6 30.7 30.8 30.9 31.0 31.1 31.2 31.3 31.4 31.5 31.6 31.7 31.8 31.9 31.0 32.1 32.2 32.3 32.4 32.5 32.6	213.3 212.6 211.9 211.2 210.5 209.8 209.2 208.4 207.8 207.2 206.5 205.9 205.2 204.6 203.9 203.3 202.6 202.0 201.3 200.7 200.1 199.5 198.9 198.3 197.7	172.1 171.5 170.9 170.4 169.9 169.4 168.8 168.3 167.7 167.2 166.7 166.2 165.7 165.2 164.7 164.1 163.6 163.1 162.6 162.1 161.6 161.2 160.7 160.1 159.6	32.7 32.8 32.9 33.0 33.1 33.2 33.3 33.4 33.5 33.6 33.7 33.8 33.9 34.0 34.1 34.2 34.3 34.4 34.5 34.6 34.7 34.8 34.9 35.0	197.1 196.5 195.9 195.3 194.7 194.2 193.6 193.1 192.5 191.9 191.4 190.8 190.3 189.7 189.2 188.6 188.1 187.5 187.0 186.5 185.9 185.4 184.8 184.3	159.1 158.7 158.2 157.7 157.3 156.8 156.3 155.8 155.3 154.9 154.4 154.0 153.5 153.0 152.6 152.2 151.8 151.4 151.0 150.6 150.3 149.9 149.4 149.0

4. 우유비중 보정표

우유온도		0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
우유용비중계도수	14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35	12.9 13.9 14.9 15.9 16.9 17.8 18.7 19.6 20.6 21.5 22.4 23.3 24.3 25.2 26.1 27.0 27.9 28.8 29.7 30.6 31.5 32.4	12.9 13.9 14.9 15.9 16.9 17.8 18.7 19.6 20.6 21.5 22.4 23.3 24.3 25.3 26.2 27.1 28.0 28.9 29.8 30.7 31.6 32.5	12.9 13.9 14.9 15.9 16.9 17.8 18.7 19.7 20.7 21.6 22.5 23.4 24.4 25.4 26.3 27.2 28.1 29.0 29.9 30.8 31.7 32.6	13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 17.9 18.8 19.7 20.7 21.7 22.6 23.5 24.5 25.5 26.4 27.3 28.2 29.1 30.0 30.9 31.8 32.7	13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 17.9 18.8 19.7 20.7 21.7 22.7 23.6 24.6 25.6 26.5 27.4 28.3 29.2 30.1 31.0 31.9 32.8	13.1 14.1 15.1 16.1 17.1 18.0 18.8 19.8 20.8 21.8 22.8 23.7 24.7 25.7 26.6 27.5 28.4 29.3 30.3 31.2 32.1 33.0	13.1 14.1 15.1 16.1 17.1 18.1 19.0 19.9 20.9 21.9 22.9 23.8 24.8 25.8 26.7 27.6 28.5 29.5 30.4 31.3 32.2 33.1	13.1 14.1 15.1 16.1 17.1 18.1 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 23.9 24.9 25.9 26.8 27.7 28.6 29.6 30.5 31.4 32.3 33.2	13.2 14.2 15.2 16.2 17.2 18.2 19.1 20.1 21.1 22.1 23.1 24.0 25.0 26.0 26.9 27.8 28.7 29.7 30.6 31.6 32.5 33.4	13.3 14.3 15.3 16.3 17.3 18.3 19.2 20.2 21.2 22.2 23.2 24.1 25.1 26.1 27.0 27.9 28.8 29.8 30.8 31.8 32.7 33.6	13.4 14.4 15.4 16.4 17.4 18.4 19.3 20.3 21.3 22.3 23.3 24.2 25.2 26.2 27.1 28.1 29.0 30.0 31.0 32.0 32.9 33.8	13.5 14.5 15.5 16.5 17.5 18.5 19.4 20.4 21.4 22.4 23.4 24.3 25.3 26.3 27.2 28.2 29.2 30.2 31.2 32.2 33.1 34.0	13.6 14.6 15.6 16.6 17.6 18.6 19.5 20.5 21.5 22.5 23.5 24.5 25.5 26.5 27.4 28.4 29.4 30.4 31.4 32.4 33.3 34.2	13.7 14.7 15.7 16.7 17.7 18.7 19.6 20.6 21.6 22.6 23.6 24.6 25.6 26.6 27.6 28.6 29.6 30.6 31.6 32.6 33.5 34.4	13.8 14.8 15.8 16.8 17.8 18.8 19.8 20.8 21.8 22.8 23.8 24.8 25.8 26.8 27.8 28.8 29.8 30.8 31.8 32.8 33.8 34.7

15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0 35.0	14.1 15.1 16.1 17.1 18.1 19.1 20.1 21.2 22.2 23.2 24.2 25.2 26.2 27.2 28.2 29.2 30.2 31.2 32.2 33.2 34.2 35.2	14.2 15.2 16.3 17.3 18.3 19.3 20.3 21.4 22.4 23.4 24.4 25.4. 26.4 27.4 28.4 29.4 30.4 31.4 32.4 33.4 34.4 35.4	14.4 15.4 16.5 17.5 18.5 19.5 20.5 21.6 22.6 23.6 24.6 25.6 26.6 27.6 28.6 29.6 30.6 31.7 32.7 33.7 34.7 35.7	14.6 15.6 16.7 17.7 18.7 19.7 20.7 21.8 22.8 23.8 24.8 25.8 26.9 27.9 28.9 29.9 30.9 32.0 33.0 34.0 35.0 36.0	14.8 15.8 16.9 17.9 18.9 19.9 20.9 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.1 28.2 29.2 30.2 31.2 32.3 33.3 34.3 35.3 36.3	15.0 16.0 17.1 18.1 19.1 20.1 21.1 22.2 23.2 24.2 25.2 26.2 27.3 28.4 29.4 30.4 31.4 32.5 33.6 34.6 35.6 36.6	15.2 16.2 17.3 18.3 19.3 20.3 21.3 22.4 23.4 24.4 25.4 26.4 27.5 28.6 29.6 30.6 31.6 32.7 33.8 34.9 35.9 36.9	15.4 16.4 17.5 18.5 19.5 20.5 21.5 22.6 23.6 24.6 25.6 26.6 27.7 28.8 29.9 30.9 31.9 33.0 34.1 35.2 36.2 37.2	15.6 16.6 17.7 18.7 19.7 20.7 21.7 22.8 23.8 24.8 25.8 26.8 27.9 29.0 30.1 31.2 32.2 33.3 34.4 35.5 36.5 37.5	15.8 16.8 17.9 18.9 19.9 20.9 21.9 23.1 24.1 25.1 26.1 27.1 28.2 29.3 30.4 31.5 32.5 33.6 34.7 35.8 36.8 37.8	16.0 17.0 18.1 19.1 20.1 21.1 22.1 23.2 24.3 25.3 26.3 27.3 28.4 29.5 30.6 31.7 32.7 33.8 34.9 36.0 37.1 38.1	16.2 17.2 18.3 19.3 20.3 21.3 22.3 23.4 24.5 25.5 26.5 27.5 28.6 29.7 30.8 31.9 33.0 34.1 35.2 36.3 37.4 38.4	16.4 17.4 18.5 19.5 20.5 21.5 22.5 23.6 24.7 25.7 26.7 27.7 28.9 30.0 31.1 32.2 33.3 34.4 35.5 36.6 37.7 38.7	16.6 17.6 18.7 19.7 20.7 21.7 22.7 23.8 24.9 26.0 27.0 28.0 29.2 30.3 31.4 32.5 33.6 34.7 35.8 36.9 38.0 39.1	16.8 17.8 18.9 20.0 21.0 22.0 23.0 24.1 25.2 26.2 27.3 28.3 29.5 30.6 31.7 32.8 33.9 35.1 36.2 37.3 38.4 39.5

5. 탈지우유비중 보정표

탈지유 온도		0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
우유용비중계도수	18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40	17.2 18.2 19.2 20.2 21.1 22.0 22.9 23.8 24.8 25.8 26.8 27.8 28.7 29.7 30.7 31.7 32.6 33.5 34.4 35.3 36.2 37.1 38.0	17.2 18.2 19.2 20.2 21.1 22.0 22.9 23.8 24.8 25.8 26.8 27.8 28.7 29.7 30.7 31.7 32.6 33.5 34.5 35.4 36.3 37.2 38.1	17.2 18.2 19.2 20.2 21.1 22.0 22.9 23.8 24.8 25.8 26.8 27.8 28.7 29.7 30.7 31.7 32.6 33.5 34.5 35.5 36.4 37.3 38.2	17.2 18.2 19.2 20.2 21.2 22.0 22.9 23.8 24.8 25.8 26.8 27.8 28.7 29.7 30.7 31.7 32.7 33.6 34.6 35.6 36.5 37.4 38.3	17.2 18.2 19.2 20.2 21.2 22.1 23.0 23.9 24.9 25.9 26.9 27.9 28.8 29.8 30.8 31.8 32.8 33.7 34.7 35.7 36.6 37.5 38.4	17.3 18.3 19.3 20.3 21.3 22.2 23.1 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 28.9 29.9 30.9 31.9 32.9 33.8 34.8 35.8 36.7 37.6 38.5	17.3 18.3 19.3 20.3 21.3 22.3 23.2 24.1 25.1 26.1 27.1 28.1 29.0 30.0 31.0 32.0 32.9 33.8 34.8 35.8 36.8 37.7 38.6	17.3 18.3 19.3 20.3 21.3 22.3 23.2 24.1 25.1 26.1 27.1 28.1 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 33.9 34.9 35.9 36.9 37.8 38.7	17.3 18.3 19.3 20.3 21.3 22.3 23.2 24.1 25.1 26.1 27.1 28.1 29.1 30.1 31.1 32.1 33.1 34.0 35.0 36.0 36.9 37.9 38.8	17.4 18.4 19.4 20.4 21.4 22.4 23.3 24.2 25.2 26.2 27.2 28.2 29.2 30.2 31.2 32.2 33.2 34.1 35.1 36.1 37.1 38.0 38.9	17.5 18.5 19.5 20.5 21.5 22.5 23.4 24.3 25.3 26.3 27.3 28.3 29.3 30.3 31.3 32.3 33.3 34.2 35.2 36.2 37.2 38.2 39.1	17.6 18.6 19.6 20.6 21.6 22.6 23.5 24.4 25.4 26.4 27.4 28.4 29.4 30.4 31.4 32.4 33.4 34.3 35.3 36.3 37.3 38.3 39.2	17.7 18.7 19.7 20.7 21.7 22.7 23.6 24.5 25.5 26.5 27.5 28.5 29.5 30.5 31.5 32.5 33.5 34.4 35.4 36.4 37.4 38.4 39.4	17.8 18.8 19.8 20.8 21.8 22.8 23.7 24.6 25.6 26.6 27.6 28.6 29.6 30.6 31.6 32.6 33.6 34.6 35.6 36.6 37.6 38.6 39.6	17.9 18.9 19.9 20.9 21.9 22.9 23.9 24.8 25.8 26.8 27.8 28.8 29.8 30.8 31.8 32.8 33.8 34.8 35.8 36.8 37.8 38.8 39.8

15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0 35.0 36.0 37.0 38.0 39.0 40.0	18.1 19.1 20.1 21.1 22.1 23.1 24.1 25.1 26.1 27.1 28.1 29.1 30.1 31.2 32.2 33.2 34.2 35.2 36.2 37.2 38.2 39.2 40.2	18.2 19.2 20.2 21.2 22.2 23.2 24.2 25.2 26.3 27.3 28.3 29.3 30.3 31.4 32.4 33.4 34.4 35.4 36.4 37.4 38.4 39.4 40.4	18.4 19.4 20.4 21.4 22.4 23.4 24.4 25.4 26.5 27.5 28.5 29.5 30.5 31.6 32.6 33.6 34.6 35.6 36.6 37.6 38.6 39.6 40.6	18.6 19.6 20.6 21.6 22.6 23.6 24.6 25.6 26.7 27.7 28.7 29.7 30.7 31.8 32.8 33.8 34.8 35.8 36.9 37.9 38.9 39.9 40.9	18.8 19.8 20.8 21.8 22.8 23.8 24.8 25.8 26.9 27.9 28.9 29.9 30.9 32.0 33.0 34.0 35.0 36.0 37.1 38.2 39.2 40.2 41.2	18.9 19.9 20.9 21.9 22.9 23.9 24.9 25.9 27.0 28.1 29.1 30.1 31.1 32.2 33.2 34.2 35.2 36.2 37.3 38.4 39.4 40.4 41.4	19.1 20.1 21.1 22.1 23.1 24.1 25.1 26.1 27.2 28.3 29.3 30.3 31.3 32.4 33.4 34.4 35.4 36.4 37.5 38.6 39.7 40.7 41.7	19.3 20.3 21.3 22.3 23.3 24.3 25.3 26.3 27.4 28.5 29.5 30.5 31.5 32.6 33.6 34.6 35.6 36.6 37.7 38.8 39.9 41.0 42.0	19.5 20.5 21.5 22.5 23.5 24.5 25.5 26.5 27.6 28.7 29.7 30.7 31.7 32.8 33.9 34.9 35.9 36.9 38.0 39.1 40.2 41.3 42.3	19.7 20.7 21.7 22.7 23.7 24.7 25.7 26.7 27.8 28.9 29.9 30.9 31.9 33.0 34.1 35.2 36.2 37.2 38.3 39.4 40.5 41.6 42.6	19.9 20.9 21.9 22.9 23.9 24.9 25.9 26.9 28.0 29.1 30.1 31.1 32.1 33.2 34.3 35.4 36.4 37.4 38.5 39.6 40.7 41.8 42.9	20.1 21.1 22.1 23.1 24.1 25.1 26.1 27.1 28.2 29.3 30.3 31.3 32.3 33.4 34.5 35.6 36.7 37.7 38.8 39.8 41.0 42.1 43.2	20.3 21.3 22.3 23.3 24.3 25.3 26.3 27.3 28.4 29.5 30.5 31.5 32.5 33.6 34.7 35.8 36.9 38.0 39.1 40.2 41.3 42.4 43.5	20.5 21.5 22.5 23.5 24.5 25.5 26.5 27.5 28.6 29.7 30.7 31.7 32.7 33.8 35.0 36.1 37.2 38.3 39.4 40.5 41.6 42.7 43.8	20.7 21.7 22.7 23.7 24.7 25.7 26.7 27.7 28.8 29.9 31.0 32.0 33.0 34.1 35.2 36.3 37.4 38.5 39.7 40.8 41.9 43.0 44.1

6. 산 도 환 산 표

우유100㎖에 대한 N/10 HCl의 소비량㎖	산 도	우유100㎖에 대한 N/10 HCl의 소비량㎖	산 도	우유100㎖에 대한 N/10 HCl의 소비량㎖	산 도	우유100㎖에 대한 N/10 HCl의 소비량㎖	산 도
5.0 5.25 5.5 5.75 6.0 6.25 6.5 6.75 7.0 7.25 7.5 7.75 8.0 8.25 8.5 8.75 9.0 9.25 9.5 9.75 10.0 10.25 10.5 10.75 11.0 11.25	6.0 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.95 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.35 8.4	11.5 11.75 12.0 12.25 12.5 12.75 13.0 13.25 13.5 13.75 14.0 14.25 14.5 14.75 15.0 15.25 15.5 15.75 16.0 16.25 16.5 16.75 17.0 17.25 17.5	8.5 8.6 8.7 8.75 8.8 8.9 9.0 9.1 9.15 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.65 9.7 9.8 9.9 10.0 10.1 10.2 10.3 10.4 10.55 10.7	17.75 18.0 18.25 18.5 18.75 19.0 19.25 19.5 19.75 20.0 20.25 20.5 20.75 21.0 21.25 21.5 21.75 22.0 22.25 22.5 22.75 23.0 23.25 23.5 23.75	10.8 10.9 11.0 11.15 11.25 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 12.0 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.9 13.0 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5	24.0 24.25 24.5 24.75 25.0 25.25 25.5 25.75 26.0 26.25 26.5 26.75 27.0 27.25 27.5 27.75 28.0 28.25 28.5 28.75 29.0 29.25 29.5 29.75 30.0	13.7 13.8 13.9 14.0 14.1 14.3 14.5 14.6 14.8 14.9 15.1 15.3 15.4 15.6 15.8 16.0 16.1 16.3 16.5 16.6 16.8 16.9 17.0 17.2 17.4

7. 3단계희석 시험관 3개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수	MPN/g(㎖)	양성시험관수	MPN/g(㎖)
0.1 0.01 0.001		0.1 0.01 0.001
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3	<3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3	9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1,100

8. 3단계희석 시험관 5개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/g(㎖)
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5	1.8 3.6 5.4 7.2 9 1.8 3.6 5.5 7.3 9.1 11 3.7 5.5 7.4 9.2 11 13 5.6 7.4 9.3 11 13 15 7.5 9.4 11 13 15 17 9.5 11 13 15 17 19	1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5	2 4 6 8 10 12 4 6.1 8.1 10 12 14 6.1 8.2 10 12 15 17 8.3 10 13 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 5 0 2 5 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 5	4.6 6.8 9.1 12 14 16 6.8 9.2 12 14 17 19 9.3 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32	3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 0 4 3 0 5 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 1 5 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 0 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 5 3 5 0 3 5 1 3 5 2 3 5 3 3 5 4 3 5 5	7.8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24 28 31 35 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45	4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 0 4 4 0 5 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 2 0 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 3 3 4 3 4 4 3 5 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 5 0 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 4 5 5	13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45 52 59 34 40 47 54 62 69 41 48 56 64 72 81	5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 1 5 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5	23 31 43 58 76 95 33 46 64 84 110 130 49 70 95 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 200 350 540 920 1,600 >2,400

9. 난 수 표

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25	95767 81934 64959 88488 22306 01436 35962 80319 32141 99197 04030 99835 26400 64363 82878 19485 72762 53747 84760 42365 44336 52930 50436 24980 94186	26878 99378 10235 81729 61346 13553 90832 01462 01977 78637 88194 54210 63946 11259 87304 82792 47963 17433 29591 42338 05322 61970 54490 54548 95540	94971 73901 55441 60733 09026 53487 21604 60338 57874 67636 08580 80413 83204 59066 33618 88195 14380 51614 96142 66105 04540 05808 50650 49428 75071	75204 46997 87439 84690 66275 19706 29620 69763 25052 35765 86080 82015 36388 92948 19490 31877 96130 97763 02207 03782 75989 22807 59386 91704 10076	64775 11173 04966 94315 78204 30740 01151 32812 11567 36871 76119 07459 30497 72291 88779 74902 74633 90426 79847 83727 51385 85460 25572 86913 10263	52647 80744 96170 10841 11563 83272 81945 84076 35505 22555 62260 63910 24021 31804 38883 13212 21388 47833 89559 14200 52279 22723 23267 92940 27664	35672 51957 22582 99296 67457 69602 61894 10555 04797 94013 81248 93694 93962 82029 14481 02514 22096 58245 66803 57263 16661 61318 44039 86923 98534	97456 50801 13512 47844 69438 99251 91583 88707 21900 15118 51732 41184 25555 15789 77089 47152 24987 14890 15461 85617 91446 23281 08759 22428 81171	89815 25785 60227 87998 98753 81599 41133 92309 81703 81620 89078 65698 00357 04683 58544 17292 50056 77303 39639 95577 48811 63426 33702 47877 61507	16767 40475 81391 01066 23478 79264 83955 34505 11848 76730 21940 31977 93441 34455 22761 62081 26487 35338 23187 88654 25346 69030 34580 20510 74976	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50	12359 57132 71239 03935 72801 80252 69388 40225 59925 31172 45587 37819 51402 93873 97645 13123 72110 13751 83809 46264 97426 74715 92481 40176 90176	46569 49387 49511 83975 73777 11587 92356 60304 62338 89780 42590 60911 74213 99143 51836 15323 70217 40714 98109 57933 78630 09140 55828 70724 19360	11050 74792 07466 28893 79101 10862 81282 13526 78784 95384 08443 94740 01105 82254 11835 24885 23475 99330 48292 37607 06115 90315 20144 99476 74015	90529 50937 15364 66615 26592 11627 33832 47601 63228 51947 20404 05536 15098 53647 99276 74046 48152 05232 06947 58926 44047 03927 77853 34567 89080	49289 62339 86050 14015 45424 89857 56676 11751 82603 13841 15100 94042 61470 11010 86466 49145 83357 97056 15924 60772 42350 82118 18100 10214 36337	94545 43401 31093 22410 00899 07788 35132 19233 31755 74371 74747 17969 23047 68668 67647 99982 01585 40788 08787 62523 88455 00800 13196 97743 40242	02258 82825 16730 90938 78462 46817 07119 02057 72733 81016 50642 36747 28521 25888 60834 48231 90915 70005 03919 66260 61426 14314 12279 15770 39621	20678 03692 73587 35961 74336 55863 27613 28447 80303 39798 34480 92151 58559 36209 30704 26711 69308 36274 72577 95270 08812 06984 20903 78474 71369	18898 37836 79875 36373 60478 35713 01304 46676 91066 26690 68080 07501 59305 65412 06711 87670 89090 78649 12906 46469 04255 88951 01252 75691 72350	50931 68752 43576 84810 13852 44712 70032 29541 52537 00978 23169 67660 08761 00066 11128 22062 77158 50897 80694 45110 87718 10983 00731 59930 73430	26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

# 난수표 사용법

아래의 그림과 같이 축산물이 든 상자가 가로, 세로, 높이 각 10개씩 1,000상자가 쌓여 있다고 할 때 난수표를 사용하여 검사시료를 채취할 상자를 선정하는 것을 설명하면 다음과 같다.

가. 임의로 한상자를 선택한다.

예 : 임의로 왼쪽 끝의 위에서 두번째 상자를 선택하였다면 위 그림의 “가”에 해당된다.

나. 난수표의 한 지점을 임의로 선택한다.

예 : 임의로 난수표의 한 지점을 선택한 결과 3번칸, 25번줄 위치에 있는 다섯 숫자(7 5 0 7 1)중에서 네 번째 숫자인 7을 선택한다.

다. 난수표에서 선택한 숫자로부터 임의로 가로, 세로 또는 위, 아래 방향으로 세개 숫자를 읽는다.

예 : 선택된 숫자인 7로부터 가로 방향으로 읽기로 했다면 7, 1, 1로 읽혀진다.

라. 읽혀진 숫자에 따라 세 방향으로 상자를 세어 검사시료채취할 상자를 선정한다.

예 : 오른쪽, 위의, 안쪽으로 숫자를 세기로 하였다면 위 그림에서 오른쪽으로 7번째, 윗쪽으로 1번째, 안쪽으로 1번째에 있는 상자 즉, 위 그림의 “나”가 검사시료를 채취할 상자가 된다.

10. 한국인 1일 영양권장량(2000년 제7차 개정)※

체중  신장 에너지 단백질 비타민 비타민 비타민 비타민 비타민 비타민 나이아신 비타민  엽산   칼슘    인    철분**  아연

연령                                   A     D      E      C     B1     B2              B6

㎏    ㎝    ㎉     g    ㎍RE   ㎍   ㎎α-TE  ㎎     ㎎     ㎎    ㎎NE     ㎎     ㎍     ㎎     ㎎     ㎎     ㎎

영아 0～4(개월)  5.6   58   500    15    350     5      3      35    0.2    0.3      2      0.1     60    200    100     2      2

(20)           (10)          (50)   (0.3)  (0.4)     (3)    (0.2)   (100)  (300)  (200)    (6)    (4)

5～11       9.3    73   750    20   350    10     4       35    0.4   0.5       5      0.4     70    300    300     8     4

소아 1～3(세)    14    92  1200    25    350    10     5       40    0.6   0.7       8      0.5     80    500    500     8     6

4～6       19    111  1600    30    400    10     6       50    0.8  1.0      11     0.6    100    600    600     9     8

7～9       27    127  1800    40    500    10     7       60    0.9  1.1      12     0.8    150    700    700    10     9

남자 10～12(세)  38    144  2200    55    600    10     8       70    1.1  1.3       15     1.1    200    800    800    12    12

13～15     54    162  2500    70    700    10    10       70    1.3  1.5       17     1.4    250    900    900    16    12

16～19     64    172  2700    75    700    10    10       70    1.4  1.6       18     1.5    250    900    900    16    12

20～29     67    174  2500    70    700     5    10       70    1.3  1.5       17     1.4    250    700    700    12    12

30～49     68    170  2500    70    700     5    10       70    1.3  1.5       17     1.4    250    700    700    12    12

50～64     68    168  2300    70    700    10    10       70    1.2  1.4       15     1.4    250    700    700    12    12

65～74     64    167  2000    65    700    10    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    12    12

75이상     60    166  1800    60    700    10    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    12    12

여자 10～12(세)  38    144  2000    55    600    10     8       70    1.0  1.2       13     1.1    200    800    800    16    10

13～15     51    158  2100    60    700    10    10       70    1.1  1.3       14     1.4    250    800    800    16    10

16～19     54    160  2100    60    700    10    10       70    1.1  1.3       14     1.4    250    800    800    16    10

20～29     54    161  2000    55    700     5    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    16    10

30～49     55    158  2000    55    700     5    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    16    10

50～64     57    157  1900    55    700    10    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    12    10

65～74     54    154  1700    55    700    10    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    12    10

75이상     52    152  1600    55    700    10    10       70    1.0  1.2       13     1.4    250    700    700    12    10

임신 전 반              +150    +15    +0     +5    +0    +15    +0.3  +0.3      +1      +0.5   +250   +300   +300   +4**  +3

후 반              +350    +15  +100     +5    +2    +15    +0.4  +0.4      +2      +0.5   +250   +300   +300   +8**   +3

수유                    +400   +20   +350    +5     +3    +35   +0.4   +0.5      +4      +0.6   +100   +400   +400   +2    +7

※ 사단법인 한국영양학회 : 한국인영양권장량(2000, 제7차 개정)

※※ 식품으로 충당할 수 없을 때는 철 보충제로 보충할 수 있음.