식품의약품안전청 공고 제2008-281호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시안

2008. 12. 24

식품의약품안전청

식품의약품안전청 공고 제2008-281호

식품의 기준 및 규격을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 행정절차법 제46조의 규정에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2008년 12월 24일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시안 입안예고

1. 개정이유

식품 중 멜라민 기준 및 시험법 신설, 두부 중 납 기준 강화, 곡류, 두류 등에 대한 아플라톡신 기준을 총아플라톡신 기준으로 강화하고, 기준 미설정 유해물질에 대해 외국의 기준 중 엄격한 기준 적용원칙을 개정하고자 함. 또한, 잔류농약, 동물용의약품의약품 시험법 및 유전자재조합식품의 시험법을 개정하고, 식품의 제한적 사용원료의 사용 확대·개편을 통하여 다양한 식품 개발 및 산업발전에 기여 하고자 함

2. 주요내용

가. 식품 중 멜라민 기준 및 시험법 신설 [안 제2. 5. 12) (6)] 및 [제10. 22. 6)]

(1) 식품에서 사용은 허용될 수 없으나, 사용이 허가된 농약(싸이로마진)의 분해산물이나 멜라민 용기․포장 등에 의해 식품 중에 비의도적 오염물질로 존재할 수 있는 멜라민의 기준을 정함으로써 유통 혼란 등을 방지할 필요가 있음

(2) 식품일반에 대한 공통기준 및 규격으로 오염물질인 멜라민에 대한 기준 2.5 ppm을 신설하며, 다만 영․유아나 환자에게 절대적인 영양소 공급원이 되는 식품은 불검출로 하고, 식품 중 멜라민 시험법을 신설함

(3) 식품의 멜라민에 대한 안전성을 확보함

나. 두부류 및 묵류 중 중금속 기준 개정 [제5. 13. 5) ]

(1) 두부류 및 묵류의 총중금속 기준을 실제 관리가 필요한 납 기준으로 구체화하고, 다른 개별식품의 중금속 관리와 일관성을 유지함

(1) 두부류 및 묵류의 총중금속 기준(3.0 ppm 이하)을 납(0.3 ppm 이하) 기준으로 개정

(2) 안전관리의 대상을 명확하게 함

다. 곰팡이독소 기준 및 시험법 개정 [제2. 5. 8) (1) ] 및 [제5. 1. 20. 29.]

(1) 아열대지역으로부터의 식품 수입량 증가, 기후 온난화 등으로 곰팡이독소 관리 강화가 요구됨

(2) 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 과자류, 장류, 기타 식품류 등에 대한 곰팡이독소 기준을 아플라톡신 B1에서 총아플라톡신(B1, B2, G1, G2의 합) 15㎍/Kg 기준으로 강화하고, 이 중 아플라톡신 B1은 현행과 같이 10㎍/Kg이하로 함.

(3) 식품의 곰팡이독소에 대한 안전성을 확보함

라. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격 중 식품원료기준의 원료 등의 구비요건 개정 [제2. 2. 1)]

(1) 식품원료가 될 수 있는 식품과 관련된 각종 법규(주세법, 건강기능식품에 관한 법률, 축산물가공처리법 등)의 적용대상이 불명확하여 개선이 요구됨

(2) 각종 법규의 식품원료 적용대상을 명확히 하고, 식품원료가 될 수 없는 기구, 용기, 포장 등 관련 사항 삭제 또는 항목 이동 개정함

(3) 원료 등의 구비여건을 명확히 함

마. 제한적 사용원료의 사용 확대·개편 등 원료 등의 구비요건 개정

[제2. 2. 2) (7), 제2. 3. 18), [별표 1] 및 [별표 2] ]

(1) 안전을 근거로 하여 제한적 사용원료를 식품원료로 확대하여 다양한 식품 개발 저해요인을 정비하고 소비자의 선택권을 넓힘

(2) 감나무, 산수유, 연 등 10종의 제한적 사용원료와 기타 원료 1종을 일반 식품 원료로 전환 개정

(3) 다양한 식품개발 및 산업발전에 기여하여 소비자 선택권 확대

바. 유전자재조합식품 등의 시험법 신설 및 개정 [제10. 23. ]

(1) 유전자재조합식품 표시제도의 과학적 사후관리를 위해 국내 유통이 승인된 유전자재조합식품의 시험법 확대 필요

(2) 유전자재조합 알팔파 1건, 유전자재조합 면화 6건, 유전자재조합 카놀라 3건, 유전자재조합 사탕무 1건 등 총 11건의 시험법 추가 신설

(3) 과학적인 분석업무 적용범위 확대

3. 의견제출

「식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는  단체 또는 개인은 2009년 1월 15일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(주소 : 서울특별시 은평구 통일로 194, 참조 : 위해기준과, 전화 02-380-1690, 1699, 팩스 02-383-2870)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 전화번호 및 주소

다. 기타사항

식품의약품안전청 공고 제2008-281호

「식품위생법」 제7조제1항에 따른 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2008-80호, 2008. 12. 23)을 다음과 같이 개정합니다.

2008년 12월 24일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제2, 2, 1), (4)를 다음과 같이 하고, (5)를 제2, 3, 18)로 하며, (6)부터 (20)까지를 (5)부터 (19)까지로 한다.

(4) 기준 및 규격이 정하여져 있는 식품, 식품첨가물은 그 기준 및 규격에, 주정은 「주세법」에 의한 품질기준에, 인삼·홍삼은 「인삼산업법」에, 축산물 및 그 가공품은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 한다.

제2, 5, 8), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
곡류가공품 및 두류가공품(규격외 일반가공식품)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
장류(메주 제외) 및 고춧가루	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제 2, 5, 12)에 (6)을 다음과 같이 신설한다.

대 상 식 품	기 준
○ 식품의 기준 및 규격 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식, 특수의료용도등식품 ○ 축산물의 가공기준 및 성분규격 조제분유, 조제우유, 성장기용 조제분유, 성장기용 조제우유, 기타조제분유, 기타조제우유	불검출
○ 상기 이외의 모든 식품	2.5 ㎎/㎏ 이하

(6) 멜라민(Melamine) 기준

제5, 1, 5), (10)을 다음과 같이 한다.

(10) 총아플라톡신 (μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 땅콩 및 견과류 함유제품에 한함)

제5, 13, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 납(mg/kg) : 0.3 이하

제5, 13, 6), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 납

제 10. 일반시험법 6. 유해성금속시험법에 따라 시험한다.

제5, 20, 5), (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 총아플라톡신 (μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 메주에 한함)

제5, 29, 29-1, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제5, 29, 29-11, 5), (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 총아플라톡신(μg/kg) : 15.0 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제5, 29, 29-14, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총아플라톡신(μg/kg) : 15.0 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제 10, 9, 83), (5), ① 중 “ GC 분석 대상(150종)”을 “GC 분석 대상(154종)”으로 하고, “151 Bromobutide(NPD), 152 Metrafenone(ECD), 153 Piperophos(FPD),  154 Dichlorvos(NPD)”를 신설한다.

제 10, 9, 83), (5), ② 중 “ HPLC 분석 대상(60종)”을 “HPLC 분석 대상(68종)”으로 하고, 45 Trifloxystrobin (HPLC-UVD) 다음에 “46 Amisulbrom(HPLC-UVD), 47 Flubendiamide(HPLC-UVD), 48 Pyribenzoxim(HPLC-UVD), 49 Chlorantraniliprole(HPLC-UVD), 50 Metamifop(HPLC-UVD), 51 Quinoclamine(HPLC-UVD), 52 Chromafenozide(HPLC-UVD)”를 신설하며, 15 3,4,5-Trimethacarb(HPLC-FLD) 다음에 “16 Carbofuran (HPLC-FLD)”를 신설한다.

제 10, 9, 중 163)부터 180)까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

163) 디메타메트린(Dimethametryn) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 후 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 염산으로 pH를 조절한 후 헥산으로 세정하고 수산화나트륨 용액으로 pH를 조절하여 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 표준원액 : 디메타메트린을 헥산에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

다) 표준용액 : 표준원액을 각각 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

라) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달고 증류수 20 mL를 가하여 습윤화 하고 아세톤 100 mL를 첨가하여 1시간 진탕추출한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액에 2% 인산이수소칼륨(KH2PO4) 40 mL를 가한 후 6 N 및 1 N 염산을 이용하여 pH를 1.8～2.0으로 조절한 후 250 mL 분액깔때기로 옮긴다. 분액깔때기에 헥산 50 mL를 가하여 1분간 격렬하게 진탕하고 정치한 다음 헥산층은 버리고 수용액층을 100 mL 비이커에 받아 5 N 및 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 6.8～7.0으로 조절한다. 조절된 용액을 250 mL용량의 분액깔때기로 옮기고 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 탈수하고 다시 수용액 층에 디클로로메탄 50 mL를 가하여 위와 같이 되풀이한 다음 앞서의 용액과 합한다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축 하여 날려버리고 건고물은 아세톤 5 mL에 녹여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 260℃

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

디메타메트린 (6.0분) 2 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 300

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
21.1	255	212, 255

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

164) 피리벤족심(Pyribenzoxim) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인 여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v)으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 잔류농약분석용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 피리벤족심을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 25 g을 단다)를 균질기에 정밀히 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 2 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물을 아세톤 40 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.5 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 10 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충진한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 7 mL을 가하여 잘 녹이고 증류수를 3 mL을 가하여 혼합한 후 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 247 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

피리벤족심 (10.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 700

(8) Capillary temperature : 300℃

(9) Cone voltage : 142 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.8	609	610, 413

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

165) 디비이디시(DBEDC) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 메탄올 및 수산화나트륨 용액으로 추출한 후 흡인여과하고 황산으로 pH를 조절한 다음 감압농축한다. 클로로포름으로 분배한 후 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 메탄올/아세톤 혼합액 (50/50, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/형광검출기

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 디비이디시를 메탄올에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (60/40, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 25 g을 단다.)를 균질기 용기에 달아넣고 메탄올 100 mL와 10% 수산화나트륨 용액 5 mL를 첨가하고 3 분간 균질화한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 메탄올로 씻어 위의 여액과 합한다. 여과액은 1 N 황산을 이용하여 pH를 7.0으로 조절하고 40℃이하 수욕 중에서 감압농축한 후 분액깔때기에 옮기고 메틸렌블루 40 mL를 첨가한 다음 클로로포름 50 mL을 넣고 흔들어 정치한다. 클로로포름층을 취한 후 다시 수용액층에 클로로포름 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 건고물은 클로로포름 5 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 클로로포름 50 mL를 가하여 상단에 소량의 클로로포름이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 클로로포름에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/클로로포름 혼합액 (50/50, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 메탄올/아세톤 혼합액 (50/50, v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 메탄올 3 mL에 녹인 다음 0.1% 개미산(Formic acid) 2 mL을 첨가하여 잘 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (60/40, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : Ex 225 nm, Em 295 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

디비이디시 (8.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (60/40, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : -100 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	833	325

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

166) 메타미포프(Metamifop) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴로 추출한 후 흡인여과하고 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 에틸아세테이트로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 C18 카트리지(용출용매 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v))로 정제한 후 후로리실 카트리지(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) C18 카트리지 : C18(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지 (용량 3 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

마) 표준원액 : 메타미포프를 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 40 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 증류수 40 mL를 가하여 습윤화 한다. 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 50 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 에틸아세테이트 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 에틸아세테이트층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 에틸아세테이트 100 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 C18 카트리지에 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세토니트릴/물 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v) 20 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL로 녹인다.

미리 후로리실 카트리지에 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 유출시켜 버린다. 여기에 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴 7 mL에 녹이고 증류수 3 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 240 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

메타미포프 (7.9분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : 85 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
8.0	440	441, 443

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

167) 메타플루미존(Metaflumizone) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 메탄올으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 카트리지(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 메타플루미존을 메탄올에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 메탄올 80 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 소량의 메탄올로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 100 mL과 포화식염수 20 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 후로리실 카트리지에 헥산 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액에 녹인 10 mL 중 5 mL을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 유출시켜 버리고. 이어서 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 아세토니트릴 2.5 mL로 녹이고 5 mM 초산암모늄 2.5 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40 ℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 280 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

메타플루미존 (8.2분) 20 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 300 ～ 700

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : -109 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
4.5	506	505

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

168) 메트라페논(Metrafenone)시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/전자포획검출기(ECD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용   카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 메트라페논을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합,   희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한다. Celite 545를 깔은 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤으로 씻어 위의 여액에 합한다. 여과액을 1 L 분액깔때기에 옮기고 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세톤 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 230℃

(4) 주입부 : 260℃

(5) 검출기 온도 : 300℃

(6) 주입량 : 2 μL(직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

메트라페논 (5.4분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
5.408	408	395, 379

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

169) 브로모뷰타이드(Bromobutide) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 다음 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/5/45, v/v/v))로 정제한 후 알루미나 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/1.5/48.5, v/v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 알루미나 (Alumina) : 칼럼크로마토그래피용 (70～230 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

마) 표준원액 : 브로모뷰타이드을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합,   희석한다.

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL 및 Celite 545 한 스푼을 첨가하고 2 분간 균질화한 한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 40 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 40 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/0.35/49.65, v/v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/5/45, v/v/v) 70 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 헥산 10 mL로 녹인다.

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 알루미나 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/1.5/48.5, v/v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세톤 4 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 220℃

(5) 검출기 온도 : 310℃

(6) 주입량 : 2 μL(직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

브로모뷰타이드  (4.0 분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 350

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
19.4	311	119, 232

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

170) 스피네토람 (Spinetoram) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 다음 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 수산화나트륨 용액으로 pH를 조절한 후 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 아세톤)로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용   카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 스피네토람을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 30 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL 및 Celite 545 한 스푼을 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 5.5～6.6로 맞추고 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 25 mL를 가하여 유출시켜 버리고 아세톤 40 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 246 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

스피네토람-J형(8.0 분), 스피네토람-L형(8.9 분) 20 ng

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 500 ～ 900

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 137 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.6	748	749
6.5	760	761

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

171) 아미설브롬(Amisulbrom) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴/물 혼합액 (80/20, v/v) 으로 추출한 후 흡인여과하고 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가한 다음 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용   카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 아미설브롬을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세토니트릴/물 혼합용액 (80/20, v/v) 80 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 100 mL과 포화식염수 20 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 에틸아세테이트/헥산 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 헥산 5 mL 및 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 20 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴/물 (70/30, v/v) 혼합용액 2 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 255 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

아미설브롬 (8.6 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 600

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 83 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	465	466

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

172) 옥솔린산(Oxolinic acid) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류, 채소류

2) 분석원리

시료를 1 N 염산 및 메탄올로 추출한 후 흡인 여과하고 감압농축한다. 농축액에 수산화나트륨 용액을 이용해 pH를 조절한 다음 헥산으로 세정하고 다시 염산으로 pH를 조절해 디클로로메탄으로 분배하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/형광검출기

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 옥솔린산을 0.25 M 수산화나트륨/메탄올 혼합액 (10/90, v/v)에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

마) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류는 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 10 g을 달고 채소류는 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 1 N 염산/메탄올 혼합액 (10/90, v/v) 100 mL를 첨가한 후 2 분간 균질화한다. 여액을 감압농축한 후 2% 인산일수소칼륨(K2HPO4) 40 mL를 가한 후 5 N 및 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.5～8.0으로 조절한 다음 250 mL 분액깔때기로 옮긴다. 분액깔때기에 헥산 50 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 헥산층은 버리고 수용액층을 여분의 분액깔때기로 옮긴 다음 6 N 및 1 N 염산을 이용하여 pH 2.5로 조절하고 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 취한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : Ex 330 nm, Em 365 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

옥솔린산 (8.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 400

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 80 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	261	262

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

173) 올소설파뮤론(Orthosulfamuron) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴으로 추출한 후 흡인여과, 감압농축한 다음 분액깔때기에 옮겨 포화식염수를 가하고 염산으로 pH를 조절하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 알루미나 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 메탄올/디클로로메탄/초산 혼합액 (5/94/1, v/v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 알루미나 (Alumina) : 칼럼크로마토그래피용 (70～230 mesh)을 130 ℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 올소설파뮤론을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/인산완충용액 혼합액, pH 2.5 (20/80, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 40 mL를 넣고 2 시간 방치하여 습윤화 한다. 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 30 분간 진탕 추출한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액에 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 3 N 염산 5 mL를 가해 pH 2이하로 조절한다. 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 100 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 메탄올/디클로로메탄 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 알루미나 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 디클로로메탄 25 mL를 가하여 상단에 소량의 디클로로메탄이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 디클로로메탄에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 충진제 표면이 노출되기 직전 메탄올/디클로로메탄 혼합액 (5/95, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버린 후, 메탄올/디클로로메탄/초산 혼합액 (5/94/1, v/v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴/인산완충용액 혼합액, pH 2.5 (20/80, v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/인산완충용액 (pH 2.5) 혼합액 (20/80, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 235 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

올소설파뮤론 (9.7 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/0.2% 개미산(Formic acid) 혼합액 (10/90, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 600

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 89 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	424	425

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

174) 엠씨피에이(MCPA) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 염산과 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 감압농축하여 용매를 제거한 후 수용액을 분액깔때기에 옮겨 헥산으로 세정한 후 벤젠으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 유도체화한 다음 후로리실 카트리지(용출용매 : 에틸에테르/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/전자포획검출기(ECD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : MCPA을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한 후 감압농축하고 유도체화시약을 이용하여 유도체화한다. 헥산으로 분배한 후 용매를 감압농축하고 건고물을 헥산으로 용해한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20g을 단다)를 용기에 정밀히 달아 1 N 염산 100 mL와 아세톤 100 mL를 가해 30 분간 진탕추출 후 Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고, 아세톤 50 mL로 용기 및 잔사를 씻어 앞의 여과액과 합한 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기로 옮기고 헥산 50 mL를 가하여 약하게 흔들어 정치한 후 수용액 층은 다른 분액깔때기로 옮기고 헥산층은 버린다. 분액깔때기에 벤젠 50 mL를 가하고 흔들어 정치한 후 유기용매층은 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고, 수용액층에는 다시 벤젠 50 mL를 가하여 흔들어 정치하고 재차 무수황산나트륨에 통과시켜 앞서의 여액과 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버린다.

나) 유도체화

건고물에 클로로에칠화 유도체시약 (10% BF3/2-chloroethanol 용액)을 2 mL 가하여 70℃에서 20분간 유도체화한 뒤 냉각 후 5% 염화나트륨 용액 50 mL를 가하고 분액깔때기로 옮겨 헥산 50 mL로 2 회 추출하여 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 5 mL로 녹인다.

다) 정제

미리 후로리실 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 에틸에테르/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL를 가하여 유출시켜 버리고 에틸에테르/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 헥산 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-17 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 190℃

(4) 주입부 : 250℃

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

엠씨피에이 에스테르 유도체 (7.7 분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 2 분간 유지한 후 10℃/분의 비율로 280℃로 상승시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량*	Fragment monitored (m/z)
13.9	262	141, 143

* MCPA ester 유도체

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

175) 퀴노클라민(Quinoclamine) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과, 감압농축하고 분액깔때기에 옮겨 포화식염수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 퀴노클라민을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (30/70, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 1 시간 진탕 추출한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 100 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세톤/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.5 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 10 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버린 후, 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 70 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 3 mL에 녹이고 증류수 7 mL을 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (30/70, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 290 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

퀴노클라민 (11.0 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (30/70, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 400

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : 87 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
11.4	207	208, 210

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

176) 퀸머락(Quinmerac) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류

2) 분석원리

시료에 수산화나트륨 용액을 첨가한 후 아세톤으로 추출하고 흡인여과, 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 세정한 후 염산으로 pH를 조절하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 유도체시약(요오드화메틸)을 이용하여 유도체화 반응(에스터화 반응)한 후 기체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 퀸머락을 아세톤에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석하고 요오드화메틸을 이용하여 에스터화 반응을 시킨 후 아세톤으로 추출하여 사용한다.

마) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(과실류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 0.1 N 수산화나트륨 용액 50 mL를 넣고 10 분 동안 정치시킨다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 농축액은 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 버리고 수용액층에 2 N 염산용액 20 mL를 넣어 pH 1로 조절한 다음 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 건고물을 벤젠 1 mL로 녹인다.

나) 유도체화

벤젠에 녹인 용액에 디메칠설폭사이드 1 mL를 넣고 요오드화메칠 1 mL를 첨가한 후 수소화나트륨(NaH) 40 mg을 넣고 단단히 밀봉한 다음 40℃ 수욕 중에서 60 분 동안 에스터화 반응을 시킨다. 반응이 종료된 용액에 증류수 10 mL를 넣고 분액깔때기로 옮긴 후 헥산 10 mL를 가하여 심하게 흔들어 정치한다. 헥산층을 받아 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하고 건고물을 아세톤 10 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛)  또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 180℃

(4) 주입부 : 230℃

(5) 검출기 온도 : 260℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

퀸머락 메칠에스테르 유도체 (5.4분) 10 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량*	Fragment monitored (m/z)
20.3	235	177, 204

* Quinmerac methyl ester 유도체

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

177) 크로마페노자이드(Chromafenozide) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v))로 정제한 후 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 (Silica) : 칼럼크로마토그래피용 (63～200 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

마) 표준원액 : 크로마페노자이드를 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 25 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 증류수 30 mL를 가하여 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 250 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 실리카 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 에틸아세테이트/헥산 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 35 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 40 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL로 녹인다.

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 25 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 40 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 5 mL로 녹이고 증류수 5 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 220 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

크로마페노자이드 (10.2 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : -61 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
8.3	394	393

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

178) 클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류, 채소류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴으로 추출한 후 흡인여과하고 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용   카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 클로란트라닐리프롤을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴 : 물 혼합액 (45/55, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(과실류 및 채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 50 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산/에틸아세테이트 혼합액 10 mL 중 5 mL을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 15 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴 2.5 mL에 녹이고 물 2.5 mL를 가하여 혼합한 후 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴 : 물 혼합액 (45/55, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 254 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

클로란트라닐리프롤 (9.6 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 600

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : -59 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
6.0	481	480, 482, 484

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

179) 플루벤디아마이드(Flubendiamide) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류, 채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v)으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 플루벤디아마이드을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(과실류 및 채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 25 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL를 첨가하고 2 분간 균질화한 한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 디클로로메탄 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 디클로로메탄 25 mL를 가하여 상단에 소량의 디클로로메탄이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 디클로로메탄에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 여분의 디클로로메탄 5 mL로 칼럼 벽면을 씻어버린다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (7/93, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (40/60, v/v) 50 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 5 mL를 가하여 잘 녹이고 물 5 mL와 잘 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 40 μL

(6) 검출기파장 : UV 240 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

플루벤디아마이드 (9.1분)  40 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 800

(8) Capillary temperature : 330℃

(9) Cone voltage : -113 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
9.0	682	681

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

180) 피페로포스(Piperophos) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/불꽃광도검출기(FPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 피페로포스을 헥산에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 아세톤/물 혼합액 (80/20, v/v) 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한 한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 6 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산/에틸아세테이트 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 50 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 헥산 10 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 240℃

(5) 검출기 온도 : 240℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

피페로포스 (5.7 분) 2 ng.

라) 정량한계

0.01 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
19.2	353	320, 140

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

제10, 13, 1) 중 “박층크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법”을 “박층크로마토그래피에 의한 총 아플라톡신 시험법”으로 한다.

제10, 13, 1), (2) 중 ③을 삭제한다.

제 10, 13, 2)를 다음과 같이 한다.

2) 액체크로마토그래피에 의한 총아플라톡신 시험법

(1) 시험법의 적용 범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류, 고춧가루 등

(2) 원리

검체 중의 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)를 70% 메탄올로  추출, 여과한 후 면역친화성컬럼을 이용하여 정제시킨 것을 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 유도체화하여 형광검출기가 부착된 역상액체크로마토그래프로 분석한다.

(3) 기구 및 장비

① 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

② 정제용 컬럼 : 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) Afla TestTM 또는 이와 동등한 것

③ 여과지：Whatman No.4(12.0 cm) 및 Whatman GF/A(9 cm)

(4) 시약 및 시액

① 아플라톡신 혼합 표준원액

아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2를 아세토니트릴에 녹여 각각 200 μg/mL이 되도록 한다.

② 아플라톡신 혼합 표준용액

아플라톡신 혼합 표준원액을 아세토니트릴로 1.0 ～ 50 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

③ 추출용액

1% 염화나트륨이 함유되도록 조제한 메탄올․물(7:3, v/v) 혼액

(5) 시험용액의 조제

① 추출

분쇄한 시료 25 g을 달아 균질기에 넣고 추출용액 100 mL를 넣어 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과(Whatman No.4)한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 물 30 mL를 가하여 희석시킨다. 희석액을 흔들어 섞은 후 여과(Whatman GF/A)한 것을 추출액으로 한다.

② 정제

추출액 20 mL를 정제용 컬럼에 주입하여 초당 1 방울의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 10 mL를 같은 유속으로 완전히 유출하여 버리고 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다.

③ 유도체화

용출액의 용매를 50℃에서 질소로 완전히 제거하고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴․물 혼합액(2:8 , v/v) 0.8 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

④ 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액을 이용하여 검량선을 작성한다.

(6) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 아세토니트릴․물 (25:75, v/v)

㉰ 검출파장

- 여기파장 : 360 nm

- 형광파장 : 450 nm

㉱ 유속 : 1 mL/분

㉲ 주입량 : 5～20 μL

② 정성 및 정량시험

시험용액 및 아플라톡신 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 표준용액 및 시험용액의 피크와 머무름 시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고, 얻어진 피크의 면적 또는 높이를 측정하여 아플라톡신의 함량을 구한다.

(7) 계산

총 아플라톡신의 함량(μg/kg)

= (CAFB1 + CAFB2 + CAFG1 + CAFG2)× V/S × D

CAFB1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B1의 농도(ng/mL)

CAFB2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B2의 농도(ng/mL)

CAFG1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G1의 농도(ng/mL)

CAFG2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G2의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 검체 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

제 10, 15, 3), (2), “⑥ 올라퀸독스(Olaquindox)”를 삭제하고, “⑥ 올라퀸독스(Olaquindox), 카바독스(Carbadox)”를 아래와 같이 신설한다.

⑥ 올라퀸독스(Olaquindox), 카바독스(Carbadox)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중의 올라퀸독스와 카바독스는 각각의 대사물질인 3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산(3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)과 퀴녹살린-2-카르복실산(quinoxaline-2-carboxylic acid, QCA)으로 존재한다. 시료에 단백질 분해효소를 첨가하고 산성화 시킨 후, 에틸아세테이트로 각각의 대사물질을 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/질량분석기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산(MQCA, 3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid) 및 퀴녹살린-2-카르복실산(QCA, quinoxaline-2-carboxylic acid) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 5% 메탄올로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 내부 표준물질 표준원액 : 퀴녹살린-2-카르복실산 D4(QCA-D4, quinoxaline-2-carboxylic acid D4) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다.

Ⓕ 내부 표준물질 용액 : 내부 표준물질 표준원액을 5% 메탄올로 희석하여 1 μg/mL가 되도록 한다.

Ⓖ 0.2 M 트리스완충용액(pH 2.5) : 1 L 메스플라스크에 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethane 200 mL와 2 M 염화칼슘용액 50 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다. 10 M 염산으로 pH를 2.5로 한다.

Ⓗ 프로테아제 용액 : 프로테아제(type ⅩⅣ) 50 mg을 물 1 mL에 녹여 사용한다. 시험 당일 제조하도록 한다.

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 내부 표준물질 용액 20 μL를 넣고 0.2 M 트리스완충용액 8 mL와 프로테아제 용액 50 μL를 넣어 균질화한 후 항온수조 60℃에서 16시간 반응시킨다. 실온까지 냉각한 후 10 M 염산 300 μL를 넣고 균질화한다. 이 용액을 4℃, 4,000 G에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 8 mL를 가한다. 이 용액을 균질화한 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하고 잔사에 에틸아세테이트 5 mL를 가한 후 위 과정을 한번 반복한다. 모아진 상층액을 60℃에서 질소농축한 후 잔류물은 5% 메탄올 1 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

－ 칼럼：C18(2.0 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

－ 칼럼온도 : 40℃

－ 이동상

․이동상 A : 아세토니트릴 : 메탄올 : 물 : 빙초산(100:100:796:4)

․이동상 B : 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	100	0
5.0	100	0
10.0	20	80
16.0	20	80
17.0	100	0
20.0	100	0

－ 유속 : 0.15 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

－ Ionization : ESI(positive)

－ Capillary temperature : 350℃

－ Collision gas : 아르곤(Ar)

－ Collision energy : MQCA 13 V, QCA 17 V, QCA-D4 17 V

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, QCA-D4 m/z 133 이온에 대한 MQCA m/z 145 이온, QCA m/z 129 이온에 대한 면적비를 각각 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 올라퀸독스와 카바독스 함량을 각각 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
MQCA	189	145, 102
QCA	175	129, 102
QCA-D4	179	133, 106

Ⓑ 정량한계 : 각각 0.004 mg/kg

제 10, 15, 3), (2), "⑪ 카바독스(Carbadox)"를 삭제하고, ⑫부터 까지를 각각 ⑪부터 까지로 한다.

제 10, 15, 3), (2)에 부터  까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

답손(Dapsone)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중의 답손과 대사물질인 모노아세틸 답손을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 양이온교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 답손, 모노아세틸 답손 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.6) : 아세토니트릴(6 : 4) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.6) : 초산암모늄 0.7708 g을 1 L 메스플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채우고 초산으로 pH 4.6으로 한다.

Ⓕ 양이온교환카트리지 : SCX(Strong Cation Exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣은 후 10분간 균질화한다. 이 균질화한 용액을 20분간 초음파 추출하고 4℃, 3,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 다시 전 원심분리관에 아세토니트릴 10 mL를 넣은 후 위 과정을 한번 더 반복하여 아세토니트릴층을 모은다. 이 용액에 헥산 10 mL를 가한 후 균질화하고 20분간 초음파 추출하고 4℃, 3,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 버린다. 아세토니트릴 층을 여과지로 여과하여 50 mL 원심분리관에 취하고 1 M 염산 10 mL로 잔류물을 세척한 후 다시 여과하여 50 mL 원심분리관에 위의 아세토니트릴 층과 합한 후 물로 50 mL 표시선까지 맞춘다. 이 용액 50 mL를 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 양이온교환카트리지에 흡착시킨다. 0.1 N 염산 5 mL와 메탄올 5 mL로 카트리지를 세척한 후, 암모니아수 : 아세토니트릴(1 : 19) 혼합용액 5 mL로 용출한다. 용출액을 40℃에서 농축한 후 잔류물은 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.5) : 아세토니트릴(6 : 4) 혼합용액 1 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼：C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 40℃

㉢ 이동상

－ 이동상 A : 0.01 M 초산암모늄(pH 4.6)

－ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
16.0	60	40
20.0	60	40
21.0	95	5
24.0	95	5

－ 유속 : 1.0 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉣ 측정파장 : 294 nm

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 답손과 모노아세틸 답손 함량을 각각 구한 후 이를 합쳐 답손 함량으로 한다.

Ⓑ 정량한계 : 0.01 mg/kg

페닐부타존(Phenylbutazone)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중 페닐부타존을 에틸아세테이트로 추출하고 실리카 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/질량분석기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 페닐부타존 표준품을 정밀히 달아 100 mL 메스플라스크에 취하고 메탄올 80 mL와 25% D,L-디치오쓰레이톨 5 mL에 녹인 후 메탄올로 표시선을 맞춰 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.2 N 초산 : 아세토니트릴(1 : 1) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 25% D,L-디치오쓰레이톨(dithiothreitol) : D,L-디치오쓰레이톨 125 mg을 에틸아세테이트 500 mL에 녹인다. 당일 제조하여 사용한다.

Ⓕ 실리카 카트리지 : Silica 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ  기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 메탄올 : 25% D,L-디치오쓰레이톨(1 : 7) 혼합용액 15 mL를 가한 후 10분간 균질화한다. 균질화 한 용액을 3,000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 100 mL 농축플라스크에 취한다. 잔류물에 메탄올 : 25% D,L-디치오쓰레이톨(1 : 7) 혼합용액 15 mL를 가한 후 위의 과정을 한번 더 반복한다. 모아진 상층액은 50℃ 수욕 상에서 감압농축하고 테트라하이드로퓨란 : 헥산(1 : 4) 혼합용액 15 mL를 3번에 나누어 용해시킨다. 이 용액을 미리 테트라하이드로퓨란 : 헥산(1 : 4) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지를 통과시키면서 동시에 용출되는 액을 50 mL 농축플라스크에 수집한다. 이 용출액은 50℃ 수욕 상에서 감압농축하고 잔류물은 0.2 N 초산 : 아세토니트릴(1 : 1) 혼합용액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

－ 칼럼：C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

－ 칼럼온도 : 40℃

－ 이동상 : 5% 초산 함유 10 mM 초산암모늄용액 : 아세토니트릴(1 : 1)

－ 유속 : 0.2 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

－ Ionization : ESI(negative)

－ Capillary temperature : 350℃

－ Collision gas : 아르곤(Ar)

－ Collision energy : 21 V

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특정이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 279 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 페닐부타존의 함량을 구한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
페닐부타존	307	160, 188, 279

Ⓑ 정량한계 : 0.01 mg/kg

제 10, 15, 4) 중 (1) 을 삭제하고, “(2) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)”을 “(1) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES), 제라놀(Zeranol)”로 하며,   ① 중 “시료중의 디에틸스틸베스트롤”을 “시료중의 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀”로 하고, ③, ㉯ 중 “디에틸스틸베스트롤 표준품”을 “디에틸스틸베스트롤 및 제라놀 표준품”로 하며, ⑤, Ⓑ, ㉣ 중 “420(디에틸스틸베스트롤 D8)”을 “m/z 433(제라놀), m/z 420(디에틸스틸베스트롤 D8)”로 하고,   “㉯ 정량”을 “⑥ 정량시험”으로 하며, ⑥ 정량시험(종전의 ㉯ 정량)을 다음과 같이 한다.

⑥ 정량시험

㉮ 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 질량분석기에 주입한 후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하여 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합의 비 및 제라놀의 피크 면적 또는 높이의 비를 구하고 각각의 검량선을 작성하여 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀의 함량을 구한다. 각 물질에 대한 확인이온은 아래의 표와 같다.

※ 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량

=

이온 412의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

※ 시험용액 중 제라놀의 함량

=

이온 433의 피크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

※ 확인이온

물질	확인이온 (m/z)
디에틸스틸베스트롤	412, 397, 383
제라놀	538, 523, 433, 379
디에틸스틸베스트롤 D9	420

㉯ 정량한계

Ⓐ 디에틸스틸베스트롤 : 0.5 μg/kg

Ⓑ 제라놀 : 1 μg/kg

제 10, 15, 4) 중 “(3) 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)”을 “(2) 초산메드록시프로게스테론 (Medroxyprogesterone acetate, MPA)”으로 한다.

제 10, 22, 6) 식품중 멜라민(Melamine) 시험법을 다음과 같이 신설한다.

6) 식품 중 멜라민 시험법

(1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용 범위 : 불검출 기준 적용대상 식품

(나) 원리

검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(1:1) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 (LC/MS/MS)

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)으로 녹인 후 정확히 100 mL로 한다.

② 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)에 녹여 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).

③ 4% 개미산용액

개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

④ 0.1% 개미산용액

개미산 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑤ 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)

아세토니트릴 95 mL에 0.1% 개미산 용액 5mL 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 :

디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액

디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 20 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄 1.26g를 물에 녹여 1,000 mL로 한다

⑨ 개미산 : 순도가 98% 이상인 시약을 사용한다.

⑩ 아세토니트릴 : HPLC 급 또는 그 이상의 것을 사용한다.

⑪ 디에틸아민 : 순도가 99% 이상의 것을 사용한다.

⑫ 초산암모늄 : 순도가 99% 이상의 것을 사용한다.

⑬ 물 : HPLC 급 또는 그 이상의 것을 사용한다.

(마) 시험용액의 조제

① 추출

검체 일정량을 분쇄하고 그 중 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상층액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상층액이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 완전히 유출하여 버린 다음 카트리지 출구에 바이알을 대고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 (카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다). 용출액 1 mL을 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 용매를 완전히 제거한 후 잔류물에 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5) 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm 칼럼) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.

이동상 A : 0.1% 개미산․아세토니트릴 (5:95)

시간	유속 (mL/분)	A 용액	B 용액
0.0	0.25	100.0	0.0
4.2	0.25	100.0	0.0
8.0	0.25	65.0	35.0
8.5	0.25	65.0	35.0
9.0	0.25	25.0	75.0
11.0	0.25	25.0	75.0
11.2	0.25	100.0	0.0
13.0	0.25	100.0	0.0

이동상 B : 20 mM 개미산암모늄․아세토니트릴(50:50)

㉰ 주입량 : 10 μL

㉱ 칼럼온도 : 35 ℃

② 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기의 조건

㉮ Ionization mode : Positive ESI

㉯ Source voltage (kV) : 4.8

㉰ Capillary Temp. (℃) : 350

㉱ Auxillary gas flow (N2) : 20

㉲ Sheath gas flow (N2) : 40

㉳ Scan time (sec) : 0.5

㉴ Source collision energy (eV) : 15 ~ 30

㉵ 멜라민 표준물질의 m/z 127 → 85(정량이온), 127 → 68

③ 검량선 작성

표준용액을 농도별로 취하여 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

④ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

⑤ 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피 (mL)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

(아) 정량한계 : 0.5 mg/kg

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용 범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품

(나) 원리

검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(1:1) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 역상액체크로마토그래프로 분석한다.

(다) 기구 및 장비

① 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector) 또는 PDA을 사용한다.

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 멜라민 표준원액

멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.

② 멜라민 표준용액

멜라민 표준원액을 물에 녹여 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μg/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

③ 4% 개미산용액

개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

④ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액

디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑤ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액

디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

(마) 시험용액의 조제

① 추출

검체 일정량을 분쇄하고 그 중 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상층액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상층액이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

※ 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 완전히 유출하여 버린 다음 카트리지 출구에 바이알을 대고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 (카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다). 용출액* 2 mL을 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 용매를 완전히 제거한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

③ 검량선 작성

멜라민 표준용액을 농도별로 취하여 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 완충용액․아세토니트릴 (85:15, v/v)

완충용액 : 무수구연산 1.92 g와 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다.

㉰ 검출파장 : 240 nm

㉱ 유속 : 1.0 mL/분

㉲ 주입량 : 10～20 μL

② 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

③ 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

④ 확인시험

기체크로마토그래프/질량분석기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 사용하여 표준용액 및 시험용액의 피크를 비교할 때 머무름 시간과 이온/질량(m/z) 값이 일치하여야 한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 검체 채취량(g)

D : 희석배수

(3) 기체크로마토그래프/질량분석기를 이용한 멜라민 확인시험법

(가) 기구 및 장비

① 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)

(나) 시약 및 시액

① 멜라민 표준용액

2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (4) 시약 및 시액 ② 멜라민 표준용액을 사용한다.

② 피리딘 : 특급을 사용한다.

③ 유도체시약(BSTFA)

N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1% trimethyl- chlorosilane 함유)를 사용한다.

(다) 시험용액의 조제

① 추출 및 정제

2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (5) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하고 이후부터는 아래의 조작에 따른다.

② 유도체화

멜라민 표준용액 및  2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (5) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따른 용출액(*) 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소를 이용하여 농축․건고한다. 건고된 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약(BSTFA) 200 μL를 넣고 마개를 닫은 후 70℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다.

(라) 시험조작

① 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS(30 m × 0.25 mm 0.25 μm)또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 250℃

㉱ 오븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉲ 이동상 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분)

㉳ 주입방법 : splitless

㉴ 주입량 : 1.0 μL

㉵ 이온화 방법 : EI mode

㉶ 이온화 전압 : 70eV

㉷ 분석방법 : Scan mode(40 ~ 450 amu)

㉸ 확인 이온 : m/z = 342, 343, 327, 171

제 10, 23 중 “정량분석은 실시간 PCR장치를 이용한다”를 “또는 실시간 PCR (Real-Time PCR)를 이용하며, 정량분석은 실시간 PCR장치를 이용한다”로 한다.

제 10. 23. 3) (3)을 다음과 같이 신설한다.

(3) 알팔파 추출법

분쇄한 시료 0.5 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, 55℃로 CTAB 완충액(미리 55℃로 가온한 것) 6 mL, 2-Mercaptoethanol 0.12 mL, proteinase K용액(20 ㎎/mL) 30 μL를 가하여 혼합기로 잘 섞은 후 추가로 10%(w/v) SDS 800 μL를 가하여 잘 혼합한 다음 65℃ 항온수조에서 20분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 반응 후 혼합기로 충분히 혼합하고 페놀-클로로포름 혼합액 4 mL를 가하여 혼합한 후 37℃에서 40분간 225 rpm으로 진탕반응시킨다. 충분히 혼합한 후 5,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액 4 mL를 가하여 진탕배양기로 37℃에서 40분간 225rpm 섞어주면서 진탕반응시킨 후 5,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 다시 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 5 M 포타슘아세테이트(KOAc) 2 mL를 가하여 DNA를 침전시킨 후 상하로 10회 정도 뒤집어 주고 얼음 속에서 30분간 정치한다. 혼합액에 이소프로필알코올 4 mL를 가한 후 상하로 10회 뒤집어 주고 5,000 G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거 한 후 70%(v/v) 에탄올 2 mL를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어 내고 5,000 G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 마이크로피펫으로 제거하고 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0) 500 μL를 가하고 50℃에서 2시간 동안 때때로 섞어주면서 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다.

제 10. 23. 11)부터 13)까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

11) 유전자재조합 면화 분석법

면화씨(cottonseed) 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 해충 저항성 또는 제초제 내성 유전자재조합 면화인 531, 1445, 15985, MON88913, LLCotton25, 281/3006을 검출하기 위한 정성분석법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 면화 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 9와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 9의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 조성은 표 10, 11, 12, 13과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에는 음성대조군으로서 주형 DNA 대신 멸균증류수를 사용한 것(NTC, no template control)을, 양성대조군으로 비유전자재조합(non-GMO) DNA를 함유한 것(동일 작물로서 0%(w/w) 표준시료에서 추출한 DNA 등)과 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는 표준시료에서 추출한 DNA 등)을 시료와 함께 PCR 시험을 한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액에 대하여 3 반복 시험(3웰 분량의 PCR 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을 실시하여 측정한다.

표 9. 유전자재조합 면화의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	면화 (76 bp)	acp1 primer1-5' acp1 primer2-3' acp1 probe-Taq	5'-ATT GTG ATG GGA CTT GAG GAA GA-3' 5'-CTT GAA CAG TTG TGA TGG ATT GTG-3' 5'-FAM-ATT GTC CTC TTC CAC CGT GAT TCC GAA -TAMRA-3'
구조 유전자	531* (72 bp)	531 primer1-5' 531 primer2-3' 531 probe-Taq	5'-TCC CAT TCG AGT TTC TCA CGT-3' 5'-AAC CAA TGC CAC CCC ACT GA-3' 5'-FAM-TTG TCC CTC CAC TTC TTC TC-TAMRA-3'
	1445 (87 bp)	1445 primer1-5' 1445 primer2-3' 1445 probe-Taq	5'-GGA GTA AGA CGA TTC AGA TCA AAC AC-3' 5'-ATC GAC CTG CAG CCC AAG CT-3' 5'-FAM-ATC AGA TTG TCG TTT CCC GCC TTC AGT TT -TAMRA-3'
	15985 (82 bp)	15985 primer1-5' 15985 primer2-3' 15985 probe-Taq	5'-GTT ACT AGA TCG GGG ATA TCC-3' 5'-AAG GTT GCT AAA TGG ATG GGA-3' 5'-FAM-CCG CTC TAG AAC TAG TGG ATC TGC ACT GAA-TAMRA-3'
	Mon88913 (94 bp)	Mon88913 primer1-5' Mon88913 primer2-3' Mon88913 probe-Taq	5'-GGC TTT GGC TAC CTT AAG AGA GTC-3' 5'-CAA ATT ACC CAT TAA GTA GCC AAA TTA C-3' 5'-FAM-AAC TAT CAG TGT TTG ACT ACA T- MGBNFQ**-3'
	LLCotton25 (79 bp)	KVM156 1-5' KVM155 2-3' TM018 probe-Taq	5'-CAA GGA ACT ATT CAA CTG AG-3' 5'-CAG ATT TTT GTG GGA TTG GAA TTC-3' 5'-FAM-CTT AAC AGT ACT CGG CCG TCG ACC GC -TAMRA-3'
	281/3006 (111 bp)	281 f1-5' 281 r2-3' 281s2 probe-Taq	5'-CTC ATT GCT GAT CCA TGT AGA TTT C-3' 5'-GGA CAA TGC TGG GCT TTG TG-3' 5'-FAM-TTG GGT TAA TAA AGT CAG ATT AGA GGG AGA CAA -TAMRA-3'

* 면화 531 검출용 PCR 검사 결과 양성인 경우 별도로 15985 PCR 검사 결과를 확인하여 15985 양성인 경우 “15985 검출”로 판정하고 15985 음성인 경우 “531 검출”로 판정한다.

** MGBNFQ : Minor groove binding non-fluorescent quencher

표 10. 면화의 내재성 유전자와 면화 531, 1445, 15985 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (5 μM)	50 nM	0.25
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

표 11. 면화 MON88913 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 500 nM	각 1.25
Probe (5 μM)	100 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.5
전체량		25

표 12. 면화 LLCotton25 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8
전체량		25

표 13. 면화 281/3006 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2X)	1 X	12.5
F-primer (10 μM)	350 nM	0.875
R-primer (10 μM)	450 nM	1.125
Probe (10 μM)	175 nM	0.438
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8.062
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

Real-Time PCR은 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96웰 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 표 14, 15와 같으며, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 Real-Time PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

표 14. 유전자재조합 면화 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건(531 제외)

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

표 15. 유전자재조합 면화 531 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	55℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

PCR 결과를 해석하기 위하여 다음과 같은 절차를 수행한다. ㉮ PCR이 완료되면 PCR 반응 횟수(PCR cycle)에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 유전자 증폭곡선에서 3 cycles부터 15 cycles까지를 baseline의 범위로 지정하며, ㉯ 분석하고자 하는 유전자의 양성대조군의 증폭곡선이 지수함수적으로 증가하는 부분의 가운데에 threshold line (Th. line)이 위치하도록 하고(이때 선택된 Th. line은 NTC에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 함), ㉰ 분석하고자 하는 시료의 Ct 값(설정된 Th. line과 시료의 증폭 곡선과의 교차점에서 구해진 PCR cycle)을 구한다. ㉱ 다른 유전자의 양성대조군 증폭곡선들에 대해서도 각각 ㉯ - ㉰항의 작업을 반복하여 Ct 값을 구한다. 이때 NTC의 경우 모든 웰에서 Ct 값이 45여야 한다. 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰에서 Ct 값이 45 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.

하나의 시료에 대한 2 반복 추출 DNA의 PCR 결과, 하나 이상의 추출 DNA에서 내재성 유전자와 재조합유전자가 양성인 경우 ‘유전자재조합 면화 검출’로 판정한다. 2 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자는 양성이지만 모든 재조합유전자가 음성인 경우 ‘불검출’로 판정한다. 다만, 2 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자가 음성인 경우에는 DNA 추출 과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험에서도 동일한 결과인 경우 ‘검사불능’으로 판정한다(표 16).

표 16. 결과 판정의 흐름도(예시)

사례	추출 DNA	결과 분석		GMO 여부 판정
		내재성유전자	재조합유전자
사례 1	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	+
사례 2	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	-
사례 3	추출 1	+	+	검출
	추출 2	-	/
사례 4	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	+	-
사례 5	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	-	/
사례 6	추출 1	-	/	검사 불능*
	추출 2	-	/

+ : 목적 유전자의 증폭이 확인됨

- : 목적 유전자의 증폭이 확인되지 않음

/ : 실험이 불필요함

* 사례 6의 경우 DNA 추출 1회를 추가로 실시하여 PCR을 한다.

12) 유전자재조합 카놀라 분석법

카놀라 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 제초제 내성 유전자재조합 카놀라인 T45, GT73, Ms8/Rf3를 검출하기 위한 정성분석법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 카놀라 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 17과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 17의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 18, 19, 20과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (2) 시약 및 시액 ② 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

표 17. 유전자재조합 카놀라 실시간 PCR에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	카놀라 (101 bp)	BncruA 1-5' BncruA 2-3' BncruA-Taq	5'-GGC CAG GGT TTC CGT GAT-3' 5'-CCG TCG TTG TAG AAC CAT TGG-3' 5'-FAM-AGT CCT TAT GTG CTC CAC TTT CTG GTG CA -TAMRA-3'
구조 유전자	T45 (123 bp)	KVM172 -5' MDB599 -3' TM026 probe-Taq	5'-CAA TGG ACA CAT GAA TTA TGC-3' 5'-GAC TCT GTA TGA ACT GTT CGC-3' 5'-FAM-TAG AGG ACC TAA CAG AAC TCG CCG T-TAMRA-3'
	GT73 (108 bp)	GT73 primer1-5' GT73 primer2-3' GT73 pribe-Taq	5'-CCA TAT TGA CCA TCA TAC TCA TTG CT-3' 5'-GCT TAT ACG AAG GCA AGA AAA GGA-3' 5'-FAM-TTC CCG GAC ATG AAG ATC ATC CTC CTT -TAMRA-3'
	Ms8 (130 bp)	KVM085 -5' HCA048 -3' TM011probe-Taq	5'-GTT AGA AAA AGT AAA CAA TTA ATA TAG CCG G-3' 5'-GGA GGG TGT TTT TGG TTA TC-3' 5'-FAM-AAT ATA ATC GAC GGA TCC CCG GGA ATT C-TAMRA-3'
	Rf3 (139 bp)	DPA165 -5' KVM084 -3' TM010 probe-Taq	5'-CAT AAA GGA AGA TGG AGA CTT GAG-3' 5'-AGC ATT TAG CAT GTA CCA TCA GAC A-3' 5'-FAM-CGC ACG CTT ATC GAC CAT AAG CCC A- TAMRA-3'

표 18. 카놀라 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 200 nM	각 0.5
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9
전체량		25

표 19. 카놀라 T45, Ms8, Rf3 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8
전체량		25

표 20. 카놀라 GT73 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (5 μM)	50 nM	0.25
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

카놀라 PCR 반응 조건은 표 21과 같으며, 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)에 따른다.

표 21. 유전자재조합 카놀라 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

11) 유전자재조합 면화 분석법 (4) 분석결과의 판정에 따른다.

13) 유전자재조합 사탕무, 알팔파 분석법

사탕무, 알팔파 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 제초제 내성 유전자재조합 사탕무와 알팔파를 검출하기 위한 정성분석방법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따르며, 알팔파의 경우 3) (3) 알파파 추출법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 사탕무와 알팔파 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 22와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 22의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 23, 24, 25, 26, 27과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (2) 시약 및 시액 ② 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

표 22. 유전자재조합 사탕무, 알팔파의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	사탕무 (121 bp)	GruA3 F-5' GruA3 R-3' GruD1 probe-Taq	5'-GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG-3' 5'-GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA-3' 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC -TAMRA-3'
	알팔파 (127 bp)	pef1-85F-5' pef1-211R-3' pef1-110P-Taq	5'-TAC GTC CAA TCC CAA CGC C-3' 5'-GGC CTT TTG CTG GTA ATC TAC AAA C-3' 5'-FAM-ACC GTG ACT GCA GCA TCT CTG GCA -TAMRA-3'
구조 유전자	사탕무 H7-1 (110 bp)	H7PLT1 -5' ZRH7-R2-3' ZRH7-probe-Taq	5'-TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T-3' 5'-AAT GCT GCT AAA TCC TGA G-3' 5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT -TAMRA-3'
	알팔파 J101 (121bp)	J101-F12-5' J101-R11-3' J101-P11-Taq	5'-CTG ATC TTG TGT CAT AGT TTC AAA CAC TG-3' 5'-GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT TCC A-3' 5'-FAM-AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA ATC TG -TAMRA-3'
	알팔파 J163 (105bp)	J163-F1-5' J163-R3-3' J163-P1-Taq	5'-GAG GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT T-3' 5'-CAA GGT CAT CCA AAC TGA AGT GTT C-3' 5'-FAM-CAC TCG AGC AGG ACC TGC AGA AGC TT-TAMRA-3'

표 23. 사탕무 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (10 μM)	100 nM	0.25
주형 DNA(25 ng/μL)	50 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

표 24. 사탕무 H7-1 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.25
주형 DNA(25 ng/μL)	50 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8.25
전체량		25

표 25. 알팔파 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 450 nM	각 1.125
Probe (10 μM)	210 nM	0.525
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.725
전체량		25

표 26. 알팔파 J101 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
F-primer (10 μM)	450 nM	1.125
R-primer (10 μM)	600 nM	1.5
J101-P11-probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA (50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.375
전체량		25

표 27. 알팔파 J163 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 450 nM	각 1.125
Probe (10 μM)	180 nM	0.45
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.8
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

사탕무의 PCR 반응조건은 표 28과 같고 알팔파의 PCR 반응조건은 표 29와 같으며, 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)에 따른다.

표 28. 유전자재조합 사탕무 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	50 cycles
	60℃	1분	Yes

표 29. 유전자재조합 알팔파 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

11) 유전자재조합 면화 분석법 (4) 분석결과의 판정에 따른다. 다만, 사탕무의 경우 PCR cycle 수가 50이므로 모든 NTC의 Ct 값이 50이어야 하며, 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰에서 Ct 값이 50 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.

별표 1, 1 중 7을 다음과 같이 한다.

7	갈매보리수나무	Sea buckthorn, 비타민나무	Hippophae rhamnoides L.	열매, 잎

별표 1, 1 중 10을 다음과 같이 신설하고, 10부터 126까지를 각각 11부터 127까지로 한다.

10	감나무	-	Diospyros kaki Thunb.	열매, 잎

별표 1, 1 중 128을 다음과 같이 신설하고, 127부터 137까지를 각각 129부터 139까지로 한다.

128	비술나무	-	Ulmus pumila L.	나무껍질, 잎

별표 1, 1 중 140 및 141을 각각 다음과 같이 신설하고, 138부터 185까지를 각각 142부터 189까지로 한다.

140	산사나무	산사	Crataegus pinnatifida Bunge. 과 그 변종	열매
141	산수유	-	Cornus officinalis Siebold & Zucc.	열매

190	연	-	Nelumbo nucifera Gaertner	뿌리(연근), 꽃(연꽃), 잎(하엽)

별표 1, 1 중 190을 다음과 같이 신설하고, 187부터 191까지를 각각 191부터 195까지로 한다.

별표 1, 1 중 196을 다음과 같이 신설하고, 192부터 200까지를 각각 197부터 205까지로 한다.

196	왕느릅나무	유백피	Ulmus macrocarpa Hance	나무껍질

별표 1, 1 중 206을 다음과 같이 신설하고, 201부터 222까지를 각각 207부터 228까지로 한다.

206	일본호손	Japanese Hawthorn	Crataegus cuneata Siebold & Zucc.	열매

별표 1, 1 중 229를 다음과 같이 신설하고, 223부터 263까지를 각각 230부터 270까지로 한다.

229	참느릅나무	-	Ulmus parvifolia Jacq.	나무껍질, 잎

별표 1, 1 중 271을 다음과 같이 신설하고, 264부터 272까지를 각각  272부터 280까지로 한다.

271	호손	Hawthorn	Crataegus monogyna Thunb.	열매, 순, 잎, 씨앗, 꽃

3	트레할로스	Trehalose	-	-

별표 1, 3 중 3을 다음과 같이 한다.

별표 2, 1 중 1, 23, 24, 34 및 39를 삭제하고, 2부터 22까지를 각각 1부터 21까지로 하며,  25부터 33까지를 각각 22부터 30까지로 하며, 35부터 38까지를 각각 32부터 35까지로 하며, 40부터 60까지를 각각 36부터 56까지로 한다.

부 칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날로부터 시행한 날로부터 시행한다. 다만, 제10. 15 중 동물용의약품 잔류시험법은 고시한 날로 부터 2개월 경과한 날부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행 당시 접수되어 검사가 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용한다.

현   행

개   정 (안)

제 1. (생  략)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (생  략)

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ～ (3) (생 략)

(4) 기준 및 규격이 정하여져 있는 식품, 식품첨가물, 기구 및 용기·포장은 그 기준 및 규격에, 건강기능식품은 건강기능식품에관한법률에 의한 기준 및 규격에, 주정은 주세법에 의한 품질기준에, 인삼·홍삼은 인삼산업법에, 축산물 및 그 가공품은 축산물가공처리법에, 수처리제는 먹는물관리법에 적합한 것이어야 한다.

(5) 식품의 용기·포장은 용기·포장류 제조업 신고를 필한 업소에서 제조한 것이어야 한다. 다만, 그 자신의 제품을 포장하기 위하여 용기·포장류를 직접 제조하는 경우는 제외한다.

(6) ～ (20) (생 략)

2) (생 략)

3. 제조·가공기준

1) ～ 17) (생 략)

<신  설>

4. (생 략)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1)～7) (생  략)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 아플라톡신 B1

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	10 μg/kg 이하
<신 설>	<신 설>
된장, 고추장 및 고춧가루	10 μg/kg 이하

(2) ～ (3) (생  략)

9) ～ 11) (생  략)

12) 기타 유해물질 기준

(1) ～ (5) (생  략)

<신  설>

13) ～ 15) (생  략)

제 3 ～ 제 4. (생 략)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) ～ (9) (생 략)

(10) 아플라톡신 B1(μg/kg) : 10 이하(땅콩 또는 견과류 함유식품에 한함)

6) (생 략)

2. ～ 12. (생 략)

13. 두부류 및 묵류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) 중금속(mg/kg) : 3.0 이하

(2) ～ (3) (생  략)

6) 시험방법

(1) 중금속

제 10. 일반시험법 6.유해성금속시험법 4) 중금속에 따라 시험한다.

(2) ～ (3) (생략)

14. ～ 19. (생 략)

20. 장류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생 략)

(3) 아플라톡신(μg/kg) : 10 이하(B1으로서, 메주에 한한다)

(4) ～ (5) (생 략)

6) (생 략)

21. ～ 28. (생 략)

29. 기타 식품류

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) 아플라톡신(μg/kg) : 10 이하(B1으로서)

6) (생 략)

29-2 ～ 29-10 (생 략)

29-11 팝콘용옥수수가공품

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) (생 략)

(2) 아플라톡신(μg/kg) : 10.0 이하(B1으로서)

6) (생 략)

29-12 ～ 29-13 (생 략)

29-14 찐쌀

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) 아플라톡신(μg/kg) : 10.0 이하(B1으로서)

(2) ～ (4) (생 략)

6) (생 략)

29-15 ～ 29-18 (생 략)

제 6. ～ 제 9. (생 략)

제 10. 일반시험법

1.～8. (생 략)

9. 식품중 농약잔류시험법

1)～82) (생  략)

83) 다종농약다성분 시험법(Multi class pesticide multiresidue methods)

(1)～(4) (생  략)

(5) 이 시험법의 분석 대상농약 및 검출기

① GC 분석 대상(150종)

1 ～ 150  (생  략)

<신  설>

② HPLC 분석 대상(60종)

1 ～ 45  (생  략)

<신  설>

1 ～ 15  (생  략)

84)～162) (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

10. ～ 12. (생 략)

13. 식품 중 곰팡이독소시험법

1) 박층크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법

(1) (생 략)

(2) 아플라톡신 표준용액(각 표준원액 및 표준용액은 알루미늄박으로 싸서 냉장고에 보존한다)

① ～ ② (생 략)

③ 아플라톡신 B1 표준용액：아플라톡신 B1 원액 1 mL를 취하여 앞의 혼액으로 정확히 200 mL로 한다.

아플라톡신B1 표준용액 1 mL＝0.5 μg

(3) ～ (4) (생 략)

2) 액체크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법

(1) 시약

① 이동상：물‧아세토니트릴(3：1)

② 아플라톡신혼합표준용액

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량중의 아플라톡신혼합표준용액 5 mL를 취하여 벤젠‧아세토니트릴혼액(98：2)으로 정확히 100 mL로 한다.

아플라톡신혼합표준용액 1 mL ＝ B1, B2, G1, G2 각 50 ng

③ 아플라톡신B1 표준용액

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량중의 아플라톡신B1 표준용액 10 mL를 취하여 앞의 혼액으로 정확히 100 mL로 한다.

아플라톡신B1 표준용액 1 mL＝ 50 ng

(2) 장치

① 칼럼：μꠅBondapackꠅC18 또는 이와 동등한 것

② 검출기：형광검출기

③ 여과지：Whatman No.2(7.0 cm) 또는 이와 동등한 것

(3) 시험용액의 조제

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량 (3) 시험용액의 조제

① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하고 이후부터는 아래의 조작에 따른다.

<트리플루오로아세틸화>

잔류물에 Trifluoroacetic acid(TFA) 0.1 mL를 가하여 Vortex로 1분간 섞고 다시 아세토니트릴‧물(1：1) 4 mL를 넣어 Vortex로 1분간 섞는다. 이 혼액에 아세토니트릴‧물(1：1)용액을 가하여 일정량(5～10 mL)으로 한 후 여과하여 시험용액으로 한다.

(4) 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액 및 아플라톡신B1 표준용액 일정량(5～10 mL)을 취하여 질소가스로 용매를 완전히 제거시킨 후 (3) 시험용액의 조제중의 트리플루오로아세틸화에 따라 조작하여 검량선을 작성한다.

(5) 시험조작

(액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

○ 여기파장：365 mm

○ 속정파장：418nm

○ 유속：1 mL/분

시험용액, 아플라톡신혼합표준용액 및 아플라톡신B1 표준용액 5～20 μL를 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 표준용액 및 시험용액의 피크와 머무름시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고, 얻어진 피크의 면적 또는 높이를 측정하여 작성한 검량선으로부터 아플라톡신의 함량을 정량한다.

3) ～ 4) (생 략)

14. (생 략)

15. 식품중의 잔류물질시험법

1)～2) (생  략)

3) 합성항균제

(1) (생  략)

(2) 정량시험법

①～⑤ (생  략)

⑥ 올라퀸독스(Olaquindox)

㉮ 정량법의 원리

검체 중 올라퀸독스에 대한 잔류검사방법으로 올라퀸독스를 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 탈지한 후 알루미나 칼럼에서 정제하여 HPLC의 자외선 검출기로 분석하는 방법이다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그라프/자외부검출기

㉰ 시약 및 시액

㉠ 표준용액：올라퀸독스 표준품 10 mg을 정밀히 달아 100 mL 용량플라스크에 취하고 아세토니트릴 10 mL에 잘 녹인 다음 아세토니트릴로 표시선까지 채워 잘 혼합한다(100 ppm). 이액 1 mL을 정확히 취하여 100 mL 용량플라스크에 옮기고 이동상으로 표시선까지 채운 다음 잘 혼합하여 표준용액으로 사용한다(1 ppm).

㉡ 기타시약：특급

㉱ 시험용액의 조제

검체 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심관에 넣고 아세토니트릴 20 mL 과 황산나트륨 10 g을 넣고 균질화하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 여과한 후 분액여두에 취하고 다시 아세토니트릴 20 mL을 가하고 추출하여 여과한 후 상층액에 합한다. 헥산 20 mL을 가하여 3분간 흔든 후 아래층을 취하여 농축시킨다. 잔류물에 5 mL의 아세토니트릴을 가하여 용해시킨 후 미리 준비된 알루미나 칼럼으로 옮긴다. 100% 아세토니트릴로 세척한 후 95% 아세토니트릴로 분당 0.2 mL의 속도로 용출하여, 그 용출액을 60℃에서 감압 건조시키고 잔류물에 이동상 1 mL을 가한 후 초음파 세척기에서 5분간 방치하여 완전히 용해시킨 후 상층액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

－ 칼 럼：μ- Bondapak C18(4.0×300 mm, 10 μm) 또는 이와 동등한 것

－ 이동상：7.5% 아세토니트릴 용액

－ 유 속：1 mL/min

－ 검출파장：UV 356㎚

Ⓑ 정량시험

1 ppm 표준용액을 각각의 10 mL 용량플라스크에 1, 2.5, 5 mL씩 취하고 이동상으로 표시선까지 채워 0.1, 0.25, 0.5 ppm으로 희석한다. 3개 농도의 희석된 표준용액을 50[eqn: mu]L씩 3회 반복 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 올라퀸독스 농도별 평균면적을 구하여 표준회귀곡선을 곡선을 작성한다.

y = mx + b

y：올라퀸독스 피크의 면적, m：기울기, b：y축 값

x：올라퀸독스의 농도(ppm)

각 검체의 피크의 면적을 측정하고 위 공식을 이용하거나 다음 계산식에 의해서 올라퀸독스의 농도를 계산한다.

검체 중 농도 :

표준용액 x (검체의 올라퀸독스 면적/표준용액의 올라퀸독스 면적) X (검체용액용량(ml)/ 검체무게(g) ) = 검체농도

⑦～⑩ (생  략)

⑪ 카바독스(Carbadox)

⑫～

<신  설>

<신  설>

4) 성장호르몬제

(1) 제라놀

(2) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)

① 정량법의 원리

시료중의 디에틸스틸베스트롤을 분해효소제를 사용하여 ----- 가스크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

② (생  략)

③ 시약 및 시액

㉮ (생  략)

㉯ 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉰～㉶ (생  략)

④ (생  략)

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ (생  략)

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠～㉢ (생  략)

㉣ SIM ion : m/z 412(디에틸스틸베스트롤), m/z 420(디에틸스틸베스트롤 D8)

㉯ 정량

Ⓐ 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 --- 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합의 비를 구하여 검량선을 작성하여 검체 중 디에틸스틸베스트롤의 함량을 구한다.

※ 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량

=

이온 412의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

Ⓑ 정량한계 : 0.5 μg/kg

(3) 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA

1) ～ 5) (생 략)

16. ～ 21. (생 략)

22. 식품 중 유해물질시험법

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

23. 유전자재조합식품의 시험법

유전자재조합식품의 시험법은  ----- 같은 간이신속검사키트를 이용할 수 있다.

재조합 유전자 분석방법으로 정성분석은 일반 PCR장치 정량분석은 실시간 PCR장치를 이용한다. 다만, ------- 가공식품은 정량분석방법이 확립될 때 까지는 정성분석만 적용한다.

1)～2) (생 략)

3) DNA 추출․정제법

(1) ～ (2) (생 략)

<신  설>

4) ～ 10) (생 략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

24. ～ 30. (생 략)

제11. ～ 제12. (생 략)

[별표1] 원료의 목록

1. 식물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용부위
1~6	(생략)
7	갈매보리수 나무	Sea buckthorn, 비타민나무	Hippophae rhamnoides L.	열매
8~9	(생략)
<신설>
10~126	(생략)
<신설>
127~137	(생략)
<신설>
<신설>
138~185	(생략)
186	연	연근	Nelumbo nucifera Gaertner	뿌리
187~191	(생략)
<신설>
192~200	(생략)
<신설>
201~222	(생략)
<신설>
223~263	(생략)
<신설>
264~272	(생략)

2 (생략)

3 기타원료

	품목명	이명 또는 영명	학명 또는 특성	사용부위
1～2	(생략)
3	트레할로스	Trehalulose	-	-
4	(생략)

[별표2]  “제한적 사용 원료” 목록

1. 식물성 제한적 사용 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용 부위	사용 조건
1	감나무	-	Diospyros kaki Thunb.	잎	-
2~22	(생략)
23	산사자	-	Crataegus pinnatifida Bunge.	열매	-
24	산수유	-	Cornus officinalis S. & Z.	열매	-
25~33	(생략)
34	연	연꽃, 연잎, 연자육	Nelumbo nucifera Gaertner	꽃(화뢰), 잎, 씨	-
35~38	(생략)
39	유근피, 유백피	느릅나무껍질	왕느릅나무(Ulmus macrocarpa)/ 참느릅나무(Ulmus parvifolia)/ 비슬나무(Ulmus pumila)	나무껍질	-
40~60	(생략)

[별표3] ～ [별표7] (생 략)

제 1. (현행과 같음)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (현행과 같음)

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ～ (3) (현행과 같음)

(4) 기준 및 규격이 정하여져 있는 식품, 식품첨가물은 그 기준 및 규격에, 주정은 「주세법」에 의한 품질기준에, 인삼·홍삼은 「인삼산업법」에, 축산물 및 그 가공품은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 한다.

<삭제>

(5) ～ (19)  (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3. 제조·가공기준

1) ～ 17) (현행과 같음)

18) 식품의 용기·포장은 용기·포장류 제조업 신고를 필한 업소에서 제조한 것이어야 한다. 다만, 그 자신의 제품을 포장하기 위하여 용기·포장류를 직접 제조하는 경우는 제외한다.

4. (현행과 같음)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 7) (현행과 같음)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
곡류가공품 및 두류가공품(규격외 일반가공식품)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
장류(메주 제외) 및 고춧가루	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

(2) ～ (3) (현행과 같음)

9) ～ 11) (현행과 같음)

12) 기타 유해물질 기준

(1) ～ (5) (현행과 같음)

대 상 식 품	기 준
○ 식품의 기준 및 규격 영아용조제식, 성장기용조제식, 영․유아용곡류조제식, 기타 영․유아식, 특수의료용도등식품 ○ 축산물의 가공기준 및 성분규격 조제분유, 조제우유, 성장기용 조제분유, 성장기용 조제우유, 기타조제분유, 기타조제우유	불검출
-상기 이외의 모든 식품	2.5 ㎎/㎏ 이하

(6) 멜라민(Melamine) 기준

13) ～ 15) (현행과 같음)

제 3 ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (9) (현행과 같음)

(10) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 땅콩 및 견과류 함유제품에 한함)

6) (현행과 같음)

2. ～ 12. (현행과 같음)

13. 두부류 및 묵류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) 납(mg/kg) : 0.3 이하

(2) ～ (3) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1) 납

제 10. 일반시험법 6.유해성금속시험법 에 따라 시험한다.

(2) ～ (3) (현행과 같음)

14. ～ 19. (현행과 같음)

20. 장류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 메주에 한함)

(4) ～ (5) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

21. ～ 28. (현행과 같음)

29. 기타 식품류

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

6) (현행과 같음)

29-2 ～ 29-10 (현행과 같음)

29-11 팝콘용옥수수가공품

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) (현행과 같음)

(2) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

6) (현행과 같음)

29-12 ～ 29-13 (현행과 같음)

29-14 찐쌀

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) 총아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

(2) ～ (4) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

29-15 ～ 29-18 (현행과 같음)

제 6. ～ 제 9. (현행과 같음)

제 10. 일반시험법

1.～8. (현행과 같음)

9. 식품중 농약잔류시험법

1)～82) (현행과 같음)

83) 다종농약다성분 시험법(Multi class pesticide multiresidue methods)

(1)～(4) (현행과 같음)

(5) 이 시험법의 분석 대상농약 및 검출기

① GC 분석 대상(154종)

1 ～ 150  (현행과 같음)

151 Bromobutide(NPD)

152 Metrafenone(ECD)

153 Piperophos(FPD)

154 Dichlorvos(NPD)

② HPLC 분석 대상(68종)

1 ～ 45  (현행과 같음)

46 Amisulbrom(HPLC-UVD)

47 Flubendiamide(HPLC-UVD)

58 Pyribenzoxim(HPLC-UVD)

49 Chlorantraniliprole(HPLC-UVD)

50 Metamifop(HPLC-UVD)

51 Quinoclamine(HPLC-UVD)

52 Chromafenozide(HPLC-UVD)

1 ～ 15  (현행과 같음)

16 Carbofuran(HPLC-FLD)

84)～162) (현행과 같음)

163) 디메타메트린(Dimethametryn) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 후 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 염산으로 pH를 조절한 후 헥산으로 세정하고 수산화나트륨 용액으로 pH를 조절하여 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 표준원액 : 디메타메트린을 헥산에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

다) 표준용액 : 표준원액을 각각 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

라) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달고 증류수 20 mL를 가하여 습윤화 하고 아세톤 100 mL를 첨가하여 1시간 진탕추출한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액에 2% 인산이수소칼륨(KH2PO4) 40 mL를 가한 후 6 N 및 1 N 염산을 이용하여 pH를 1.8～2.0으로 조절한 후 250 mL 분액깔때기로 옮긴다. 분액깔때기에 헥산 50 mL를 가하여 1분간 격렬하게 진탕하고 정치한 다음 헥산층은 버리고 수용액층을 100 mL 비이커에 받아 5 N 및 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 6.8～7.0으로 조절한다. 조절된 용액을 250 mL용량의 분액깔때기로 옮기고 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 탈수하고 다시 수용액 층에 디클로로메탄 50 mL를 가하여 위와 같이 되풀이한 다음 앞서의 용액과 합한다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축 하여 날려버리고 건고물은 아세톤 5 mL에 녹여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 260℃

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 디메타메트린 (6.0분) 2 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 300

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
21.1	255	212, 255

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

164) 피리벤족심(Pyribenzoxim) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인 여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v)으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 잔류농약분석용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 피리벤족심을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 25 g을 단다)를 균질기에 정밀히 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 2 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물을 아세톤 40 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.5 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 10 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충진한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 7 mL을 가하여 잘 녹이고 증류수를 3 mL을 가하여 혼합한 후 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 247 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 피리벤족심 (10.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 700

(8) Capillary temperature : 300℃

(9) Cone voltage : 142 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.8	609	610, 413

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

165) 디비이디시(DBEDC) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 메탄올 및 수산화나트륨 용액으로 추출한 후 흡인여과하고 황산으로 pH를 조절한 다음 감압농축한다. 클로로포름으로 분배한 후 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 메탄올/아세톤 혼합액 (50/50, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/형광검출기

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 디비이디시를 메탄올에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (60/40, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 25 g을 단다.)를 균질기 용기에 달아넣고 메탄올 100 mL와 10% 수산화나트륨 용액 5 mL를 첨가하고 3 분간 균질화한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 메탄올로 씻어 위의 여액과 합한다. 여과액은 1 N 황산을 이용하여 pH를 7.0으로 조절하고 40℃이하 수욕 중에서 감압농축한 후 분액깔때기에 옮기고 메틸렌블루 40 mL를 첨가한 다음 클로로포름 50 mL을 넣고 흔들어 정치한다. 클로로포름층을 취한 후 다시 수용액층에 클로로포름 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 건고물은 클로로포름 5 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 클로로포름 50 mL를 가하여 상단에 소량의 클로로포름이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 클로로포름에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/클로로포름 혼합액 (50/50, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 메탄올/아세톤 혼합액 (50/50, v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 메탄올 3 mL에 녹인 다음 0.1% 개미산(Formic acid) 2 mL을 첨가하여 잘 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid)  혼합액 (60/40, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : Ex 225 nm, Em 295 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 디비이디시 (8.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid)  혼합액 (60/40, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : -100 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	833	325

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

166) 메타미포프(Metamifop) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴로 추출한 후 흡인여과하고 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 에틸아세테이트로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 C18 카트리지(용출용매 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v))로 정제한 후 후로리실 카트리지(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) C18 카트리지 : C18(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지 (용량 3 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이  충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

마) 표준원액 : 메타미포프를 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 40 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 증류수 40 mL를 가하여 습윤화 한다. 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 50 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 에틸아세테이트 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 에틸아세테이트층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 에틸아세테이트 100 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 C18 카트리지에 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세토니트릴/물 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v) 20 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL로 녹인다.

미리 후로리실 카트리지에 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 유출시켜 버린다. 여기에 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴 7 mL에 녹이고 증류수 3 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 240 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 메타미포프 (7.9분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : 85 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
8.0	440	441, 443

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

167) 메타플루미존(Metaflumizone) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 메탄올으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 카트리지(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이  충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 메타플루미존을 메탄올에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 메탄올 80 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 소량의 메탄올로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 100 mL과 포화식염수 20 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 후로리실 카트리지에 헥산 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액에 녹인 10 mL 중 5 mL을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 유출시켜 버리고. 이어서 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 아세토니트릴 2.5 mL로 녹이고 5 mM 초산암모늄 2.5 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40 ℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 280 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 메타플루미존 (8.2분) 20 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/5 mM 초산암모늄 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 300 ～ 700

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : -109 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
4.5	506	505

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

168) 메트라페논(Metrafenone)시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/전자포획검출기(ECD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 메트라페논을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여   적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한다. Celite 545를 깔은 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤으로 씻어 위의 여액에 합한다. 여과액을 1 L 분액깔때기에 옮기고 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (15/85, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세톤 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 230℃

(4) 주입부 : 260℃

(5) 검출기 온도 : 300℃

(6) 주입량 : 2 μL(직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 메트라페논 (5.4분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
5.408	408	395, 379

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

169) 브로모뷰타이드(Bromobutide) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 다음 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/5/45, v/v/v))로 정제한 후 알루미나 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/1.5/48.5, v/v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 알루미나 (Alumina) : 칼럼크로마토그래피용 (70～230 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터  에서 식힌다.

마) 표준원액 : 브로모뷰타이드을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여   적당한 농도로 혼합, 희석한다.

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL 및 Celite 545 한 스푼을 첨가하고 2 분간 균질화한 한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 40 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 40 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/0.35/49.65, v/v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/5/45, v/v/v) 70 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 헥산 10 mL로 녹인다.

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 알루미나 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 디클로로메탄/아세토니트릴/헥산 혼합액 (50/1.5/48.5, v/v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세톤 4 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 220℃

(5) 검출기 온도 : 310℃

(6) 주입량 : 2 μL(직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 브로모뷰타이드 (4.0 분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 350

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
19.4	311	119, 232

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

170) 스피네토람 (Spinetoram) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한 다음 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 수산화나트륨 용액으로 pH를 조절한 후 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 아세톤)로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 스피네토람을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 30 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL 및 Celite 545 한 스푼을 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 5.5～6.6로 맞추고 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 25 mL를 가하여 유출시켜 버리고 아세톤 40 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 246 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 스피네토람-J형(8.0 분), 스피네토람-L형(8.9 분) 20 ng

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/메탄올/1% 초산암모늄 혼합액 (45/45/10, v/v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 500 ～ 900

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 137 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.6	748	749
6.5	760	761

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

171) 아미설브롬(Amisulbrom) 시험법

1) 시험법 적용범위

채소류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴/물 혼합액 (80/20, v/v) 으로 추출한 후 흡인여과하고 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가한 다음 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 아미설브롬을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (70/30, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세토니트릴/물 혼합용액 (80/20, v/v) 80 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 100 mL과 포화식염수 20 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 5 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 에틸아세테이트/헥산 혼합액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 헥산 5 mL 및 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 20 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴/물 (70/30, v/v) 혼합용액 2 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 255 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 아미설브롬 (8.6 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (70/30, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 600

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 83 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	465	466

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

172) 옥솔린산(Oxolinic acid) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류, 채소류

2) 분석원리

시료를 1 N 염산 및 메탄올로 추출한 후 흡인 여과하고 감압농축한다. 농축액에 수산화나트륨 용액을 이용해 pH를 조절한 다음 헥산으로 세정하고 다시 염산으로 pH를 조절해 디클로로메탄으로 분배하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/형광검출기

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 옥솔린산을 0.25 M 수산화나트륨/ 메탄올 혼합액 (10/90, v/v)에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

마) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류는 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 10 g을 달고 채소류는 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 1 N 염산/메탄올 혼합액 (10/90, v/v) 100 mL를 첨가한 후 2 분간 균질화한다. 여액을 감압농축한 후 2% 인산일수소칼륨(K2HPO4) 40 mL를 가한 후 5 N 및 1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 7.5～8.0으로 조절한 다음 250 mL 분액깔때기로 옮긴다. 분액깔때기에 헥산 50 mL를 가하여 2분간 심하게 흔들어 정치한다. 헥산층은 버리고 수용액층을 여분의 분액깔때기로 옮긴 다음 6 N 및 1 N 염산을 이용하여 pH 2.5로 조절하고 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 취한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid) 혼합액 (40/60, v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid)  혼합액 (40/60, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : Ex 330 nm, Em 365 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 옥솔린산 (8.3 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 메탄올/0.1% 개미산(Formic acid)  혼합액 (40/60, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 400

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 80 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	261	262

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

173) 올소설파뮤론(Orthosulfamuron) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴으로 추출한 후 흡인여과, 감압농축한 다음 분액깔때기에 옮겨 포화식염수를 가하고 염산으로 pH를 조절하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 알루미나 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 메탄올/디클로로메탄/초산 혼합액 (5/94/1, v/v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 알루미나 (Alumina) : 칼럼크로마토그래피용 (70～230 mesh)을 130 ℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 올소설파뮤론을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/인산완충용액 혼합액, pH 2.5 (20/80, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 40 mL를 넣고 2 시간 방치하여 습윤화 한다. 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 30 분간 진탕 추출한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액에 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 3 N 염산 5 mL를 가해 pH 2이하로 조절한다. 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 100 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 메탄올/디클로로메탄 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 알루미나 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 디클로로메탄 25 mL를 가하여 상단에 소량의 디클로로메탄이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 디클로로메탄에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 충진제 표면이 노출되기 직전 메탄올/디클로로메탄 혼합액 (5/95, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버린 후, 메탄올/디클로로메탄/초산 혼합액 (5/94/1, v/v/v) 100 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴/인산완충용액 혼합액, pH 2.5 (20/80, v/v) 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/인산완충용액 (pH 2.5) 혼합액 (20/80, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 235 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 올소설파뮤론 (9.7 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/0.2% 개미산(Formic acid) 혼합액 (10/90, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 600

(8) Capillary temperature : 350℃

(9) Cone voltage : 89 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
5.4	424	425

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

174) 엠씨피에이(MCPA) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 염산과 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 감압농축하여 용매를 제거한 후 수용액을 분액깔때기에 옮겨 헥산으로 세정한 후 벤젠으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 유도체화한 다음 후로리실 카트리지(용출용매 : 에틸에테르/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/전자포획검출기(ECD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 카트리지 : 후로리실(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : MCPA을 아세톤에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한 후 감압농축하고 유도체화시약을 이용하여 유도체화한다. 헥산으로 분배한 후 용매를 감압농축하고 건고물을 헥산으로 용해한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20g을 단다)를 용기에 정밀히 달아 1 N 염산 100 mL와 아세톤 100 mL를 가해 30 분간 진탕추출 후 Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고, 아세톤 50 mL로 용기 및 잔사를 씻어 앞의 여과액과 합한 후 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기로 옮기고 헥산 50 mL를 가하여 약하게 흔들어 정치한 후 수용액 층은 다른 분액깔때기로 옮기고 헥산층은 버린다. 분액깔때기에 벤젠 50 mL를 가하고 흔들어 정치한 후 유기용매층은 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고, 수용액층에는 다시 벤젠 50 mL를 가하여 흔들어 정치하고 재차 무수황산나트륨에 통과시켜 앞서의 여액과 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버린다.

나) 유도체화

건고물에 클로로에칠화 유도체시약 (10% BF3/2-chloroethanol 용액)을 2 mL 가하여 70℃에서 20분간 유도체화한 뒤 냉각 후 5% 염화나트륨 용액 50 mL를 가하고 분액깔때기로 옮겨 헥산 50 mL로 2 회 추출하여 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고 용액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 헥산 5 mL로 녹인다.

다) 정제

미리 후로리실 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산용액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 전개 시킨 후 에틸에테르/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL를 가하여 유출시켜 버리고 에틸에테르/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액을 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물은 헥산 5 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-17 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 190℃

(4) 주입부 : 250℃

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 엠씨피에이 에스테르 유도체 (7.7 분) 2 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 2 분간 유지한 후 10℃/분의 비율로 280℃로 상승시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량*	Fragment monitored (m/z)
13.9	262	141, 143

* MCPA ester 유도체

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

175) 퀴노클라민(Quinoclamine) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과, 감압농축하고 분액깔때기에 옮겨 포화식염수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 퀴노클라민을 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (30/70, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 물 20 mL를 넣고 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 1 시간 진탕 추출한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 100 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 아세톤/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.5 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 10 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/헥산 혼합액 (5/95, v/v) 100 mL를 가하여 유출시켜 버린 후, 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 70 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 3 mL에 녹이고 증류수 7 mL을 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (30/70, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 290 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 퀴노클라민 (11.0 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (30/70, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI positive-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 400

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : 87 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
11.4	207	208, 210

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

176) 퀸머락(Quinmerac) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류

2) 분석원리

시료에 수산화나트륨 용액을 첨가한 후 아세톤으로 추출하고 흡인여과, 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 세정한 후 염산으로 pH를 조절하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 유도체시약(요오드화메틸)을 이용하여 유도체화 반응(에스터화 반응)한 후 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/질소․인 검출기(NPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 퀸머락을 아세톤에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세톤에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석하고 요오드화메틸을 이용하여 에스터화 반응을 시킨 후 아세톤으로 추출하여 사용한다.

마) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(과실류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 0.1 N 수산화나트륨 용액 50 mL를 넣고 10 분 동안 정치시킨다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 농축액은 분액깔때기에 옮겨 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 버리고 수용액층에 2 N 염산용액 20 mL를 넣어 pH 1로 조절한 다음 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 건고물을 벤젠 1 mL로 녹인다.

나) 유도체화

벤젠에 녹인 용액에 디메칠설폭사이드 1 mL를 넣고 요오드화메칠 1 mL를 첨가한 후 수소화나트륨(NaH) 40 mg을 넣고 단단히 밀봉한 다음 40℃ 수욕 중에서 60 분 동안 에스터화 반응을 시킨다. 반응이 종료된 용액에 증류수 10 mL를 넣고 분액깔때기로 옮긴 후 헥산 10 mL를 가하여 심하게 흔들어 정치한다. 헥산층을 받아 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하고 건고물을 아세톤 10 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛)  또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 180℃

(4) 주입부 : 230℃

(5) 검출기 온도 : 260℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 퀸머락 메칠에스테르 유도체 (5.4분) 10 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량*	Fragment monitored (m/z)
20.3	235	177, 204

* Quinmerac methyl ester 유도체

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

177) 크로마페노자이드(Chromafenozide) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v))로 정제한 후 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 (Silica) : 칼럼크로마토그래피용 (63～200 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

마) 표준원액 : 크로마페노자이드를 아세토니트릴에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

바) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (50/50, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 25 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 증류수 30 mL를 가하여 습윤화 한다. 아세톤 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 250 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 5 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 실리카 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 에틸아세테이트/헥산 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 35 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 40 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 5 mL로 녹인다.

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 아세톤/헥산 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 아세톤/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 25 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 아세톤/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 40 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 5 mL로 녹이고 증류수 5 mL와 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 220 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 크로마페노자이드 (10.2 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 500

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : -61 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
8.3	394	393

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

178) 클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류, 채소류

2) 분석원리

시료를 아세토니트릴으로 추출한 후 흡인여과하고 감압농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 실리카 카트리지(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 실리카 카트리지 : 실리카   (1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

라) 표준원액 : 클로란트라닐리프롤을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴 : 물 혼합액 (45/55, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출검체

검체(과실류 및 채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 20 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세토니트릴 100 mL를 첨가하고 5 분간 균질화한 다음 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세토니트릴 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한 다음 40℃ 이하의 수욕중에서 감압하에 농축한다. 농축액을 분액깔때기에 옮겨 증류수 50 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 100 mL을 넣고 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

미리 실리카 카트리지에 헥산 10 mL를 초당 2～3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시킨 다음 여기에 위의 헥산/에틸아세테이트 혼합액 10 mL 중 5 mL을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2 방울 정도의 속도로 용출시켜 버린다. 여기에 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 15 mL로 씻어 버리고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (40/60, v/v) 10 mL로 용출시켜 받는다. 용출액은 40℃이하의 수욕조 중에서 질소를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 건고물을 아세토니트릴 2.5 mL에 녹이고 물 2.5 mL를 가하여 혼합한 후 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴 : 물 혼합액 (45/55, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 20 μL

(6) 검출기파장 : UV 254 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 클로란트라닐리프롤 (9.6 분) 20 ng.

라) 정량한계

0.02 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (55/45, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : APCI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 600

(8) Capillary temperature : 275℃

(9) Cone voltage : -59 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
6.0	481	480, 482, 484

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

179) 플루벤디아마이드(Flubendiamide) 시험법

1) 시험법 적용범위

과실류, 채소류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v)으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (40/60, v/v))로 정제하여 액체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV Detector)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터  에서 식힌다.

라) 표준원액 : 플루벤디아마이드을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 아세토니트릴/물  혼합액 (50/50, v/v)에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(과실류 및 채소류 약 1 kg을 잘 썰거나 갈은 후 그 25 g을 단다)를 균질기 용기에 달아넣고 아세톤 100 mL를 첨가하고 2 분간 균질화한 한다. 여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄/헥산 혼합액 (20/80, v/v) 100 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 수용액층은 버리고 유기용매층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한다. 탈수한 용액을 40℃이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 디클로로메탄 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 5 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 디클로로메탄 25 mL를 가하여 상단에 소량의 디클로로메탄이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 디클로로메탄에 녹인 용액 10 mL를 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보내고 여분의 디클로로메탄 5 mL로 칼럼 벽면을 씻어버린다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (7/93, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액 (40/60, v/v) 50 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 아세토니트릴 5 mL를 가하여 잘 녹이고 물 5 mL와 잘 혼합하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)

(4) 이동상 유량 : 1.0 mL/min

(5) 시료주입량 : 40 μL

(6) 검출기파장 : UV 240 nm

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 플루벤디아마이드 (9.1분)  40 ng.

라) 정량한계

0.05 mg/kg

마) 액체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (2.0 mm I.D. × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 40℃

(3) 이동상 : 아세토니트릴/물 혼합액 (50/50, v/v)

(4) 이동상 유량 : 0.2 mL/min

(5) 시료주입량 : 5 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 분자량 범위 : 200 ～ 800

(8) Capillary temperature : 330℃

(9) Cone voltage : -113 V

표 1. 액체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Ion monitored (m/z)
9.0	682	681

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 액체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

180) 피페로포스(Piperophos) 시험법

1) 시험법 적용범위

곡류

2) 분석원리

시료를 아세톤으로 추출한 후 흡인여과한다. 여과액을 분액깔때기에 옮겨 포화식염수와 증류수를 가하고 디클로로메탄으로 분배한다. 유기용매층을 탈수, 감압농축하고 후로리실 칼럼크로마토그래피(용출용매 : 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v))로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프/불꽃광도검출기(FPD)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 후로리실 (Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 (60～100 mesh)을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

라) 표준원액 : 피페로포스을 헥산에 녹여 1000 mg/L이 되게 한다.

마) 표준용액 : 표준원액을 각각 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

바) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체(곡류 약 1 kg을 잘 혼합하여 표준체 420 ㎛를 통과하도록 분쇄한 후 그 50 g을 단다)를 균질기 용기에 달아 아세톤/물 혼합액 (80/20, v/v) 100 mL를 첨가하고 30 분간 균질화한 한다. Celite 545가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고 잔류물은 아세톤 50 mL로 씻어 위의 여액과 합한다. 여액은 분액깔때기에 옮겨 증류수 450 mL과 포화식염수 50 mL를 첨가한 후 디클로로메탄 50 mL를 가하여 2 분간 심하게 흔들어 정치한다. 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 다시 수용액층에 디클로로메탄 50 mL를 가하고 분배과정을 되풀이 하여 추출된 용액을 합친다. 합친 용액을 40℃이하 수욕 중에서 감압농축하고 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL로 녹인다.

나) 정제

안지름 1.1 cm, 길이 40 cm의 칼럼관에 후로리실 6 g, 다음에 무수황산나트륨 약 2 g을 충전한 후 헥산 50 mL를 가하여 상단에 소량의 헥산이 남을 정도로 유출시킨다. 여기에 위의 헥산/에틸아세테이트 혼합액에 녹인 용액을 가한 후 약 3 mL/min의 유속으로 흘려보낸다. 충진제 표면이 노출되기 직전 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (10/90, v/v) 50 mL를 가하여 유출시켜 버리고, 에틸아세테이트/헥산 혼합액 (30/70, v/v) 50 mL로 용출시켜 받는다. 이 용출액을 40℃이하의 수욕상에서 감압농축하여 건고물을 헥산 10 mL로 정용하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.53 mm I.D. × 30 m, 0.5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 15 mL/분

(3) 오븐온도 : 220℃

(4) 주입부 : 240℃

(5) 검출기 온도 : 240℃

(6) 주입량 : 2 μL (직접주입법)

나) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 : 피페로포스 (5.7 분) 1 ng.

라) 정량한계

0.01 mg/kg

마) 기체크로마토그래프․질량분석의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm ID × 30 m, 0.25 ㎛) 또는 이와 동등한 것

(2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.0 mL/분

(3) 칼럼온도 : 45℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 280℃로 상승 시킨 후 2 분간 유지한다.

(4) 주입부 : Splitless mode

(5) 주입부 온도 : 250℃

(6) Interface 온도 : 280℃

(7) 분자량 범위 : 100 ～ 250

(8) 주입량 : 1 μL

표 1. 기체크로마토그래프․질량분석기 분석을 위한 이온

머무름 시간 (분)	분자량	Fragment monitored (m/z)
19.2	353	320, 140

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 주. 기체크로마토그래프․질량분석기상의 머무름 시간 및 mass spectrum으로 각 농약의 성분을 확인할 수 있다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크 높이법 또는 피이크 면적법에 따라 정량한다.

10. ～ 12. (현행과 같음)

13. 식품 중 곰팡이독소시험법

1) --------------------- 총아플라톡신 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) ------------------------

-------------------------

-------------------

① ～ ② (현행과 같음)

<삭 제>

(3) ～ (4) (현행과 같음)

2) --------------------- 총아플라톡신 시험법

(1) 시험법의 적용 범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류, 고춧가루 등

(2) 원리

검체 중의 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)를 70% 메탄올로  추출, 여과한 후 면역친화성컬럼을 이용하여 정제시킨 것을 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 유도체화하여 형광검출기가 부착된 역상액체크로마토그래프로 분석한다.

(3) 기구 및 장비

① 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

② 정제용 컬럼 : 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) Afla TestTM 또는 이와 동등한 것

③ 여과지：Whatman No.4(12.0 cm) 및 Whatman GF/A(9 cm)

(4) 시약 및 시액

① 아플라톡신 혼합 표준원액

아플라라톡신 B1, B2, G1 및 G2를 아세토니릴에 녹여 각각 200 μg/mL이 되도록 한다.

② 아플라톡신 혼합 표준용액

아플라톡신 혼합 표준원액을 아세토니트릴로 1.0 ～ 50 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

③ 추출용액

1% 염화나트륨이 함유되도록 조제한 메탄올․물(7:3, v/v) 혼액

(5) 시험용액의 조제

① 추출

분쇄한 시료 25 g을 달아 균질기에 넣고 추출용액 100 ml를 넣어 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과(Whatman No.4)한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 물 30 mL를 가하여 희석시킨다. 희석액을 흔들어 섞은 후 여과(Whatman GF/A)한 것을 추출액으로 한다.

② 정제

추출액 20 mL를 정제용 컬럼에 주입하여 초당 1 방울의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 10 mL를 같은 유속으로 완전히 유출하여 버리고 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다.

③ 유도체화

용출액의 용매를 50℃에서 질소로 완전히 제거하고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴․물 혼액(2:8 , v/v) 0.8 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

④ 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액을 이용하여 검량선을 작성한다.

(6) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 아세토니트릴․물 (25:75, v/v)

㉰ 검출파장

- 여기파장 : 360 nm

- 형광파장 : 450 nm

㉱ 유속 : 1 mL/분

㉲ 주입량 : 5～20 μL

② 정성 및 정량시험

시험용액 및 아플라톡신 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 표준용액 및 시험용액의 피크와 머무름 시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고, 얻어진 피크의 면적 또는 높이를 측정하여 아플라톡신의 함량을 구한다.

(7) 계산

총 아플라톡신의 함량(μg/kg)

= (CAFB1 + CAFB2 + CAFG1 + CAFG2) × V/M × D

CAFB1 : 검량선에서 구한 아플라톡신 B1의 농도(ng/mL)

CAFB2 : 검량선에서 구한 아플라톡신 B2의 농도(ng/mL)

CAFG1 : 검량선에서 구한 아플라톡신 G1의 농도(ng/mL)

CAFG2 : 검량선에서 구한 아플라톡신 G2의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

M : 검체 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

3) ～ 4) (현행과 같음)

14. (현행과 같음)

15. 식품중의 잔류물질시험법

1)～2) (현행과 같음)

3) 합성항균제

(1) (현행과 같음)

(2) 정량시험법

①～⑤ (현행과 같음)

⑥ 올라퀸독스(Olaquindox)

카바독스(Carbadox)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중의 올라퀸독스와 카바독스는 각각의 대사물질인 3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산(3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)과 퀴녹살린-2-카르복실산(quinoxaline-2- carboxylic acid, QCA)으로 존재한다. 시료에 단백질 분해효소를 첨가하고 산성화 시킨 후, 에틸아세테이트로 각각의 대사물질을 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/질량분석기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산(MQCA, 3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid) 및 퀴녹살린-2-카르복실산(QCA, quinoxaline-2-carboxylic acid) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 5% 메탄올로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 내부 표준물질 표준원액 : 퀴녹살린-2-카르복실산 D4(QCA-D4, quinoxaline-2-carboxylic acid D4) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다.

Ⓕ 내부 표준물질 용액 : 내부 표준물질 표준원액을 5% 메탄올로 희석하여 1 μg/mL가 되도록 한다.

Ⓖ 0.2 M 트리스완충용액(pH 2.5) : 1 L 메스플라스크에 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethane 200 mL와 2 M 염화칼슘용액 50 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다. 10 M 염산으로 pH를 2.5로 한다.

Ⓗ 프로테아제 용액 : 프로테아제(type ⅩⅣ) 50 mg을 물 1 mL에 녹여 사용한다. 시험 당일 제조하도록 한다.

Ⓘ 기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 내부 표준물질 용액 20 μL를 넣고 0.2 M 트리스완충용액 8 mL와 프로테아제 용액 50 μL를 넣어 균질화한 후 항온수조 60℃에서 16시간 반응시킨다. 실온까지 냉각한 후 10 M 염산 300 μL를 넣고 균질화한다. 이 용액을 4℃, 4,000 G에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 8 mL를 가한다. 이 용액을 균질화한 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하고 잔사에 에틸아세테이트 5 mL를 가한 후 위 과정을 한번 반복한다. 모아진 상층액을 60℃에서 질소농축한 후 잔류물은 5% 메탄올 1 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

－ 칼럼：C18(2.0 × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

－ 칼럼온도 : 40℃

－ 이동상

․이동상 A : 아세토니트릴 : 메탄올 : 물 : 빙초산(100:100:796:4)

․이동상 B : 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	100	0
5.0	100	0
10.0	20	80
16.0	20	80
17.0	100	0
20.0	100	0

－ 유속 : 0.15 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

－ Ionization : ESI(positive)

－ Capillary temperature : 350℃

－ Collision gas : 아르곤(Ar)

－ Collision energy :

MQCA 13 V, QCA 17 V,

QCA-D4 17 V

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, QCA-D4 m/z 133 이온에 대한 MQCA m/z 145 이온, QCA m/z 129 이온에 대한 면적비를 각각 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 올라퀸독스와 카바독스 함량을 각각 구한다.

물질	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
MQCA	189	145, 102
QCA	175	129, 102
QCA-D4	179	133, 106

Ⓑ 정량한계 : 각각 0.004 mg/kg

⑦～⑩ (현행과 같음)

<삭  제>

⑪～ (현행⑫부터 와 같음)

답손(Dapsone)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중의 답손과 대사물질인 모노아세틸 답손을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 양이온교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/자외부흡광검출기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 답손, 모노아세틸 답손 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다. 조제된 표준원액은 냉장보관 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.6) : 아세토니트릴(6 : 4) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.6) : 초산암모늄 0.7708 g을 1 L 메스플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채우고 초산으로 pH 4.6으로 한다.

Ⓕ 양이온교환카트리지 : SCX(Strong Cation Exchange, benzenesulfonic acid) 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣은 후 10분간 균질화한다. 이 균질화한 용액을 20분간 초음파 추출하고 4℃, 3,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 다시 전 원심분리관에 아세토니트릴 10 mL를 넣은 후 위 과정을 한번 더 반복하여 아세토니트릴층을 모은다. 이 용액에 헥산 10 mL를 가한 후 균질화하고 20분간 초음파 추출하고 4℃, 3,000 G에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 버린다. 아세토니트릴 층을 여과지로 여과하여 50 mL 원심분리관에 취하고 1 M 염산 10 mL로 잔류물을 세척한 후 다시 여과하여 50 mL 원심분리관에 위의 아세토니트릴 층과 합한 후 물로 50 mL 표시선까지 맞춘다. 1 M 염산 10 mL로 잔류물을 세척한 후 다시 여과하여 50 mL 원심분리관에 위의 아세토니트릴 층과 합한 후 물로 50 mL 표시선까지 맞춘다. 이 용액 50 mL를 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 양이온교환카트리지에 흡착시킨다. 0.1 N 염산 5 mL와 메탄올 5 mL로 카트리지를 세척한 후, 암모니아수 : 아세토니트릴(1 : 19) 혼합용액 5 mL로 용출한다. 용출액을 40℃에서 농축한 후 잔류물은 0.01 M 초산암모늄완충용액(pH 4.6) : 아세토니트릴(6 : 4) 혼합용액 1 mL에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 칼럼：C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉡ 칼럼온도 : 40℃

㉢ 이동상

－ 이동상 A : 0.01 M 초산암모늄(pH 4.6)

－ 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
16.0	60	40
20.0	60	40
21.0	95	5
24.0	95	5

－ 유속 : 1.0 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉣ 측정파장 : 294 nm

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 답손과 모노아세틸 답손 함량을 각각 구한 후 이를 합쳐 답손 함량으로 한다.

Ⓑ 정량한계 : 0.01 mg/kg

페닐부타존(Phenylbutazone)

㉮ 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

㉯ 분석원리

시료 중 페닐부타존을 에틸아세테이트로 추출하고 실리카 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

㉰ 장치

액체크로마토그래프/질량분석기

㉱ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 페닐부타존 표준품을 정밀히 달아 100 mL 메스플라스크에 취하고 메탄올 80 mL와 25% D,L-디치오쓰레이톨 5 mL에 녹인 후 메탄올로 표시선을 맞춰 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 0.2 N 초산 : 아세토니트릴(1 : 1) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 25% D,L-디치오쓰레이톨(dithiothreitol) : D,L-디치오쓰레이톨 125 mg을 에틸아세테이트 500 mL에 녹인다. 당일 제조하여 사용한다.

Ⓕ 실리카 카트리지 : Silica 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

Ⓖ 기타시약 : 특급

㉲ 시험용액의 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 메탄올 : 25% D,L-디치오쓰레이톨(1 : 7) 혼합용액 15 mL를 가한 후 10분간 균질화한다. 균질화 한 용액을 3,000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 100 mL 농축플라스크에 취한다. 잔류물에 메탄올 : 25% D,L-디치오쓰레이톨(1 : 7) 혼합용액 15 mL를 가한 후 위의 과정을 한번 더 반복한다. 모아진 상층액은 50℃ 수욕 상에서 감압농축하고 테트라하이드로퓨란 : 헥산(1 : 4) 혼합용액 15 mL를 3번에 나누어 용해시킨다. 이 용액을 미리 테트라하이드로퓨란 : 헥산(1 : 4) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지를 통과시키면서 동시에 용출되는 액을 50 mL 농축플라스크에 수집한다. 이 용출액은 50℃ 수욕 상에서 감압농축하고 잔류물은 0.2 N 초산 : 아세토니트릴(1 : 1) 혼합용액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉳ 시험조작

Ⓐ 측정조건

㉠ 액체크로마토그래프 조건

－ 칼럼：C18(1.5 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

－ 칼럼온도 : 40℃

－ 이동상 : 5% 초산 함유 10 mM 초산암모늄용액 : 아세토니트릴(1 : 1)

－ 유속 : 0.2 mL/분

－ 주입량 : 10 μL

㉡ 질량분석기 조건

－ Ionization : ESI(negative)

－ Capillary temperature : 350℃

－ Collision gas : 아르곤(Ar)

－ Collision energy : 21 V

㉴ 정량시험

Ⓐ 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특정이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 비교하고, m/z 279 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 페닐부타존의 함량을 구한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
페닐부타존	307	160, 188, 279

Ⓑ 정량한계 : 0.01 mg/kg

4) 성장호르몬제

<삭  제>

(1) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES), 제라놀(Zeranol)

① 정량법의 원리

시료중의 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀을-----------------------

-----------------------------

② (현행과 같음)

③ 시약 및 시액

㉮ (현행과 같음)

㉯ 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀 표준품을 ---------

-----------------.

㉰～㉶ (현행과 같음)

④ (현행과 같음)

⑤ 시험조작

㉮ 측정조건

Ⓐ (현행과 같음)

Ⓑ 질량분석기 조건

㉠～㉢ (현행과 같음)

㉣ SIM ion : m/z 412(디에틸스틸베스트롤), m/z 433(제라놀),m/z 420(디에틸스틸베스트롤 D8)

⑥ 정량시험

㉮ --------------------------

-------- 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합의 비 및 제라놀의 피크 면적 또는 높이의 비를 구하고 각각의 검량선을 작성하여 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀의 함량을 구한다. 각 물질에 대한 확인이온은 아래의 표와 같다.

※ 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량

=

이온 412의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피이크 면적 또는 높이의 합

※ 시험용액 중 제라놀의 함량

=

이온 433의 피크 면적 또는 높이의 합

이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합

※ 확인이온

물질	확인이온 (m/z)
디에틸스틸베스트롤	412, 397, 383
제라놀	538, 523, 433, 379
디에틸스틸베스트롤 D9	420

㉯ 정량한계

Ⓐ 디에틸스틸베스트롤 : 0.5 μg/kg

Ⓑ 제라놀 : 1 μg/kg

(2) 초산메드록시프로게스테론 (Medroxyprogesterone acetate, MPA)

1) ～ 5) (현행과 같음)

16. ～ 21. (현행과 같음)

22. 식품 중 유해물질시험법

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 식품중 멜라민(Melamine) 시험법

(1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용 범위 : 불검출 기준 적용대상 식품

(나) 원리

검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(1:1) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 (LC/MS/MS)

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)으로 녹인 후 정확히 100 mL로 한다.

② 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)에 녹여 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).

③ 4% 개미산용액

개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

④ 0.1% 개미산용액

개미산 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑤ 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5)

아세토니트릴 95 mL에 0.1% 개미산 용액 5mL 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 :

디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액

디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 20 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄 1.26g를 물에 녹여 1,000 mL로 한다

⑨ 개미산 : 순도가 98% 이상인 시약을 사용한다.

⑩ 아세토니트릴 : HPLC 급 또는 그 이상의 것을 사용한다.

⑪ 디에틸아민 : 순도가 99% 이상의 것을 사용한다.

⑫ 초산암모늄 : 순도가 99% 이상의 것을 사용한다.

⑬ 물 : HPLC 급 또는 그 이상의 것을 사용한다.

(마) 시험용액의 조제

① 추출

검체 일정량을 분쇄하고 그 중 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상층액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상층액이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 완전히 유출하여 버린 다음 카트리지 출구에 바이알을 대고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 (카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다). 용출액 1 mL을 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 용매를 완전히 제거한 후 잔류물에 아세토니트릴․0.1% 개미산 혼합용액(95:5) 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm 칼럼) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.

이동상 A : 0.1% 개미산․아세토니트릴 (5:95)

이동상 B : 20 mM 개미산암모늄․아세토니트릴(50:50)

시간	유속 (mL/분)	A 용액	B 용액
0.0	0.25	100.0	0.0
4.2	0.25	100.0	0.0
8.0	0.25	65.0	35.0
8.5	0.25	65.0	35.0
9.0	0.25	25.0	75.0
11.0	0.25	25.0	75.0
11.2	0.25	100.0	0.0
13.0	0.25	100.0	0.0

㉰ 주입량 : 10 μL

㉱ 칼럼온도 : 35 ℃

② 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기의 조건

㉮ Ionization mode : Positive ESI

㉯ Source voltage (kV) : 4.8

㉰ Capillary Temp. (℃) : 350

㉱ Auxillary gas flow (N2) : 20

㉲ Sheath gas flow (N2) : 40

㉳ Scan time (sec) : 0.5

㉴ Source collision energy (eV) : 15 ～ 30

㉵ 멜라민 표준물질의 m/z 127 → 85(정량이온), 127 → 68

③ 검량선 작성

표준용액을 농도별로 취하여 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

④ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

⑤ 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피 (mL)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

(아) 정량한계 : 0.5 mg/kg

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용 범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품

(나) 원리

검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(1:1) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 역상액체크로마토그래프로 분석한다.

(다) 기구 및 장비

① 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector) 또는 PDA을 사용한다.

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 멜라민 표준원액

멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.

② 멜라민 표준용액

멜라민 표준원액을 물에 녹여 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μg/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

③ 4% 개미산용액

개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

④ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액

디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑤ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액

디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

(마) 시험용액의 조제

① 추출

검체 일정량을 분쇄하고 그 중 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상층액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상층액이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

※ 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 완전히 유출하여 버린 다음 카트리지 출구에 바이알을 대고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 (카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다). 용출액* 2 mL을 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 용매를 완전히 제거한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

③ 검량선 작성

멜라민 표준용액을 농도별로 취하여 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 완충용액․아세토니트릴 (85:15, v/v)

완충용액 : 무수구연산 1.92 g와 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다.

㉰ 검출파장 : 240 nm

㉱ 유속 : 1.0 mL/분

㉲ 주입량 : 10～20 μL

② 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

③ 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

④ 확인시험

기체크로마토그래프/질량분석기 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 사용하여 표준용액 및 시험용액의 피크를 비교할 때 머무름 시간과 이온/질량(m/z) 값이 일치하여야 한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 검체 채취량(g)

D : 희석배수

(3) 기체크로마토그래프/질량분석기를 이용한 멜라민 확인시험법

(가) 기구 및 장비

① 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)

(나) 시약 및 시액

① 멜라민 표준용액

2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (4) 시약 및 시액 ② 멜라민 표준용액을 사용한다.

② 피리딘 : 특급을 사용한다.

③ 유도체시약(BSTFA)

N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1% trimethyl- chlorosilane 함유)를 사용한다.

(다) 시험용액의 조제

① 추출 및 정제

2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (5) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하고 이후부터는 아래의 조작에 따른다.

② 유도체화

멜라민 표준용액 및 멜라민 표준용액 및  2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (5) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따른 용출액(*) 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소를 이용하여 농축․건고한다. 건고된 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약(BSTFA) 200 μL를 넣고 마개를 닫은 후 70℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다.

(라) 시험조작

① 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS(30 m × 0.25 mm 0.25 μm)또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 250℃

㉱ 오븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉲ 이동상 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분)

㉳ 주입방법 : splitless

㉴ 주입량 : 1.0 μL

㉵ 이온화 방법 : EI mode

㉶ 이온화 전압 : 70eV

㉷ 분석방법 : Scan mode(40 ~ 450 amu)

㉸ 확인 이온 : m/z = 342, 343, 327, 171

23. 유전자재조합식품의 시험법

유전자재조합식품의 시험법은 ----- 같은 간이신속검사키트를 이용할 수 있다.

재조합 유전자 분석방법으로 정성분석은 일반 PCR장치 또는 실시간 PCR (Real-Time PCR)를 이용하며, 정량분석은 실시간 PCR장치를 이용한다. 다만, ------- 가공식품은 정량분석방법이 확립될 때 까지는 정성분석만 적용한다.

1)～2) (현행과 같음)

3) DNA 추출․정제법

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 알팔파 추출법

분쇄한 시료 0.5 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, 55℃로 CTAB 완충액(미리 55℃로 가온한 것) 6 mL, 2-Mercaptoethanol 0.12 mL, proteinase K용액(20 ㎎/mL) 30 μL를 가하여 혼합기로 잘 섞은 후 추가로 10%(w/v) SDS 800 μL를 가하여 잘 혼합한 다음 65℃ 항온수조에서 20분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 반응 후 혼합기로 충분히 혼합하고 페놀-클로로포름 혼합액 4 mL를 가하여 혼합한 후 37℃에서 40분간 225 rpm으로 진탕반응시킨다. 충분히 혼합한 후 5,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액 4 mL를 가하여 진탕배양기로 37℃에서 40분간 225rpm 섞어주면서 진탕반응시킨 후 5,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한다. 다시 상층액을 새로운 50 mL 튜브에 옮기고 5 M 포타슘아세테이트(KOAc) 2 mL를 가하여 DNA를 침전시킨 후 상하로 10회 정도 뒤집어 주고 얼음 속에서 30분간 정치한다. 혼합액에 이소프로필알코올 4 mL를 가한 후 상하로 10회 뒤집어 주고 5,000 G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거 한 후 70%(v/v) 에탄올 2 mL를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어 내고 5,000 G로 1분간 원심분리한다. 상층액을 마이크로피펫으로 제거하고 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0) 500 μL를 가하고 50℃에서 2시간 동안 때때로 섞어주면서 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다.

4) ～ 10) (현행과 같음)

11) 유전자재조합 면화 분석법

면화씨(cottonseed) 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 해충 저항성 또는 제초제 내성 유전자재조합 면화인 531, 1445, 15985, MON88913, LLCotton25, 281/3006을 검출하기 위한 정성분석법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 면화 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 9와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 9의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 조성은 표 10, 11, 12, 13과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에는 음성대조군으로서 주형 DNA 대신 멸균증류수를 사용한 것(NTC, no template control)을, 양성대조군으로 비유전자재조합(non-GMO) DNA를 함유한 것(동일 작물로서 0%(w/w) 표준시료에서 추출한 DNA 등)과 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(동일 작물로서 분석 대상 GMO를 포함하는 표준시료에서 추출한 DNA 등)을 시료와 함께 PCR 시험을 한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액에 대하여 3 반복 시험(3웰 분량의 PCR 반응액을 잉여분을 고려하여 한번에 조제하여 동일 플레이트에서 시험)을 실시하여 측정한다.

표 9. 유전자재조합 면화의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재 성 유 전자	면화 (76 bp)	acp1 primer1-5' acp1 primer2-3' acp1 probe-Taq	5'-ATT GTG ATG GGA CTT GAG GAA GA-3' 5'-CTT GAA CAG TTG TGA TGG ATT GTG-3' 5'-FAM-ATT GTC CTC TTC CAC CGT GAT TCC GAA -TAMRA-3'
구조유전자	531* (72 bp)	531 primer1-5' 531 primer2-3' 531 probe-Taq	5'-TCC CAT TCG AGT TTC TCA CGT-3' 5'-AAC CAA TGC CAC CCC ACT GA-3' 5'-FAM-TTG TCC CTC CAC TTC TTC TC-TAMRA-3'
	1445 (87 bp)	1445 primer1-5' 1445 primer2-3' 1445 probe-Taq	5'-GGA GTA AGA CGA TTC AGA TCA AAC AC-3' 5'-ATC GAC CTG CAG CCC AAG CT-3' 5'-FAM-ATC AGA TTG TCG TTT CCC GCC TTC AGT TT -TAMRA-3'
	15985 (82 bp)	15985 primer1-5' 15985 primer2-3' 15985 probe-Taq	5'-GTT ACT AGA TCG GGG ATA TCC-3' 5'-AAG GTT GCT AAA TGG ATG GGA-3' 5'-FAM-CCG CTC TAG AAC TAG TGG ATC TGC ACT GAA-TAMRA-3'
	Mon88913 (94 bp)	Mon88913 primer1-5' Mon88913 primer2-3' Mon88913 probe-Taq	5'-GGC TTT GGC TAC CTT AAG AGA GTC-3' 5'-CAA ATT ACC CAT TAA GTA GCC AAA TTA C-3' 5'-FAM-AAC TAT CAG TGT TTG ACT ACA T- MGBNFQ**-3'
	LLCotton25 (79 bp)	KVM156 1-5' KVM155 2-3' TM018 probe-Taq	5'-CAA GGA ACT ATT CAA CTG AG-3' 5'-CAG ATT TTT GTG GGA TTG GAA TTC-3' 5'-FAM-CTT AAC AGT ACT CGG CCG TCG ACC GC -TAMRA-3'
	281/3006 (111 bp)	281 f1-5' 281 r2-3' 281s2 probe-Taq	5'-CTC ATT GCT GAT CCA TGT AGA TTT C-3' 5'-GGA CAA TGC TGG GCT TTG TG-3' 5'-FAM-TTG GGT TAA TAA AGT CAG ATT AGA GGG AGA CAA -TAMRA-3'

* 면화 531 검출용 PCR 검사 결과 양성인 경우 별도로 15985 PCR 검사 결과를 확인하여 15985 양성인 경우 “15985 검출”로 판정하고 15985 음성인 경우 “531 검출”로 판정한다.

** MGBNFQ : Minor groove binding non-fluorescent quencher

표 10. 면화의 내재성 유전자와 면화 531, 1445, 15985 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (5 μM)	50 nM	0.25
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

표 11. 면화 MON88913 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 500 nM	각 1.25
Probe (5 μM)	100 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.5
전체량		25

표 12. 면화 LLCotton25 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8
전체량		25

표 13. 면화 281/3006 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2X)	1 X	12.5
F-primer (10 μM)	350 nM	0.875
R-primer (10 μM)	450 nM	1.125
Probe (10 μM)	175 nM	0.438
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8.062
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

Real-Time PCR은 기기에 플레이트나 캐필러리를 장착하고 분석 프로그램을 작동시켜 시료의 정보를 입력한 후 장치의 덮개 온도(cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 96웰 플레이트 방식의 PCR 반응 조건은 표 14, 15와 같으며, PCR 반응 종료 후 실험결과를 해석한다. PCR 반응 조건은 사용하는 Real-Time PCR 기기에 따라 최적 조건으로 변형하여 사용할 수 있으며, 기기 제조사에 별도 문의하여 적용한다.

표 14. 유전자재조합 면화 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건(531 제외)

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

표 15. 유전자재조합 면화 531 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	55℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

PCR 결과를 해석하기 위하여 다음과 같은 절차를 수행한다. ㉮ PCR이 완료되면 PCR 반응 횟수(PCR cycle)에 대해 형광 시그널의 증가량(ΔRn)을 표시한 유전자 증폭곡선에서 3 cycles부터 15 cycles까지를 baseline의 범위로 지정하며, ㉯ 분석하고자 하는 유전자의 양성대조군의 증폭곡선이 지수함수적으로 증가하는 부분의 가운데에 threshold line (Th. line)이 위치하도록 하고(이때 선택된 Th. line은 NTC에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않아야 함), ㉰ 분석하고자 하는 시료의 Ct 값(설정된 Th. line과 시료의 증폭 곡선과의 교차점에서 구해진 PCR cycle)을 구한다. ㉱ 다른 유전자의 양성대조군 증폭곡선들에 대해서도 각각 ㉯ - ㉰항의 작업을 반복하여 Ct 값을 구한다. 이때 NTC의 경우 모든 웰에서 Ct 값이 45여야 한다. 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰에서 Ct 값이 45 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.

하나의 시료에 대한 2 반복 추출 DNA의 PCR 결과, 하나 이상의 추출 DNA에서 내재성 유전자와 재조합유전자가 양성인 경우 ‘유전자재조합 면화 검출’로 판정한다. 2 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자는 양성이지만 모든 재조합유전자가 음성인 경우 ‘불검출’로 판정한다. 다만, 2 반복 추출 DNA에서 모두 내재성 유전자가 음성인 경우에는 DNA 추출 과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험에서도 동일한 결과인 경우 ‘검사불능’으로 판정한다(표 16).

표 16. 결과 판정의 흐름도(예시)

사례	추출 DNA	결과 분석		GMO 여부 판정
		내재성유전자	재조합유전자
사례 1	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	+
사례 2	추출 1	+	+	검출
	추출 2	+	-
사례 3	추출 1	+	+	검출
	추출 2	-	/
사례 4	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	+	-
사례 5	추출 1	+	-	불검출
	추출 2	-	/
사례 6	추출 1	-	/	검사 불능*
	추출 2	-	/

+ : 목적 유전자의 증폭이 확인됨

- : 목적 유전자의 증폭이 확인되지 않음

/ : 실험이 불필요함

* 사례 6의 경우 DNA 추출 1회를 추가로 실시하여 PCR을 한다.

12) 유전자재조합 카놀라 분석법

카놀라 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 제초제 내성 유전자재조합 카놀라인 T45, GT73, Ms8/Rf3를 검출하기 위한 정성분석법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 카놀라 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 17과 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 17의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 18, 19, 20과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (2) 시약 및 시액 ② 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

표 17. 유전자재조합 카놀라 실시간 PCR에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물 크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재 성 유전자	카놀라 (101 bp)	BncruA 1-5' BncruA 2-3' BncruA-Taq	5'-GGC CAG GGT TTC CGT GAT-3' 5'-CCG TCG TTG TAG AAC CAT TGG-3' 5'-FAM-AGT CCT TAT GTG CTC CAC TTT CTG GTG CA -TAMRA-3'
구조유전자	T45 (123 bp)	KVM172 -5' MDB599 -3' TM026 probe-Taq	5'-CAA TGG ACA CAT GAA TTA TGC-3' 5'-GAC TCT GTA TGA ACT GTT CGC-3' 5'-FAM-TAG AGG ACC TAA CAG AAC TCG CCG T-TAMRA-3'
	GT73 (108 bp)	GT73 primer1-5' GT73 primer2-3' GT73 pribe-Taq	5'-CCA TAT TGA CCA TCA TAC TCA TTG CT-3' 5'-GCT TAT ACG AAG GCA AGA AAA GGA-3' 5'-FAM-TTC CCG GAC ATG AAG ATC ATC CTC CTT -TAMRA-3'
	Ms8 (130 bp)	KVM085 -5' HCA048 -3' TM011probe-Taq	5'-GTT AGA AAA AGT AAA CAA TTA ATA TAG CCG G-3' 5'-GGA GGG TGT TTT TGG TTA TC-3' 5'-FAM-AAT ATA ATC GAC GGA TCC CCG GGA ATT C-TAMRA-3'
	Rf3 (139 bp)	DPA165 -5' KVM084 -3' TM010 probe-Taq	5'-CAT AAA GGA AGA TGG AGA CTT GAG-3' 5'-AGC ATT TAG CAT GTA CCA TCA GAC A-3' 5'-FAM-CGC ACG CTT ATC GAC CAT AAG CCC A- TAMRA-3'

표 18. 카놀라 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 200 nM	각 0.5
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9
전체량		25

표 19. 카놀라 T45, Ms8, Rf3 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8
전체량		25

표 20. 카놀라 GT73 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (5 μM)	50 nM	0.25
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

카놀라 PCR 반응 조건은 표 21과 같으며, 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)에 따른다.

표 21. 유전자재조합 카놀라 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

11) 유전자재조합 면화 분석법 (4) 분석결과의 판정에 따른다.

13) 유전자재조합 사탕무, 알팔파 분석법

사탕무, 알팔파 또는 그 가공식품에 대하여 Real-Time PCR 장치를 사용하여 제초제 내성 유전자재조합 사탕무와 알팔파를 검출하기 위한 정성분석방법이다.

(1) DNA의 추출

3) DNA의 추출․정제법에 따르며, 알팔파의 경우 3) (3) 알파파 추출법에 따라 2 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

(2) 시약 및 시액

① 프라이머와 프로브

유전자재조합 사탕무와 알팔파 검출에 사용되는 프라이머와 프로브는 표 22와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브를 사용할 수도 있다.

② 실시간 PCR용 반응액의 조제

표 22의 프라이머와 프로브를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25 μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 23, 24, 25, 26, 27과 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브 또는 Real-Time PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다. 각 PCR 반응 시에 사용하여야 하는 음성대조군과 양성대조군 등 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (2) 시약 및 시액 ② 실시간 PCR용 반응액의 조제에 따른다.

표 22. 유전자재조합 사탕무, 알팔파의 PCR 검사에 사용되는 프라이머와 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성유전자	사탕무 (121 bp)	GruA3 F-5' GruA3 R-3' GruD1 probe-Taq	5'-GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG-3' 5'-GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA-3' 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC -TAMRA-3'
	알팔파 (127 bp)	pef1-85F-5' pef1-211R-3' pef1-110P-Taq	5'-TAC GTC CAA TCC CAA CGC C-3' 5'-GGC CTT TTG CTG GTA ATC TAC AAA C-3' 5'-FAM-ACC GTG ACT GCA GCA TCT CTG GCA -TAMRA-3'
구조유전자	사탕무 H7-1 (110 bp)	H7PLT1 -5' ZRH7-R2-3' ZRH7-probe-Taq	5'-TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T-3' 5'-AAT GCT GCT AAA TCC TGA G-3' 5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT -TAMRA-3'
	알팔파 J101 (121bp)	J101-F12-5' J101-R11-3' J101-P11-Taq	5'-CTG ATC TTG TGT CAT AGT TTC AAA CAC TG-3' 5'-GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT TCC A-3' 5'-FAM-AAC TGA AGG CGG GAA ACG ACA ATC TG -TAMRA-3'
	알팔파 J163 (105bp)	J163-F1-5' J163-R3-3' J163-P1-Taq	5'-GAG GCT TTG GAC TGA GAA TTA GCT T-3' 5'-CAA GGT CAT CCA AAC TGA AGT GTT C-3' 5'-FAM-CAC TCG AGC AGG ACC TGC AGA AGC TT-TAMRA-3'

표 23. 사탕무 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 150 nM	각 0.375
Probe (10 μM)	100 nM	0.25
주형 DNA(25 ng/μL)	50 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	9.5
전체량		25

표 24. 사탕무 H7-1 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 400 nM	각 1
Probe (10 μM)	200 nM	0.25
주형 DNA(25 ng/μL)	50 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8.25
전체량		25

표 25. 알팔파 내재유전자 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 450 nM	각 1.125
Probe (10 μM)	210 nM	0.525
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.725
전체량		25

표 26. 알팔파 J101 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
F-primer (10 μM)	450 nM	1.125
R-primer (10 μM)	600 nM	1.5
J101-P11-probe (10 μM)	200 nM	0.5
주형 DNA (50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.375
전체량		25

표 27. 알팔파 J163 검사용 PCR 반응액 조성

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix (2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 10 μM)	각 450 nM	각 1.125
Probe (10 μM)	180 nM	0.45
주형 DNA(50 ng/μL)	100 ng	2
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.8
전체량		25

(3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)

사탕무의 PCR 반응조건은 표 28과 같고 알팔파의 PCR 반응조건은 표 29와 같으며, 그 외 사항은 11) 유전자재조합 면화 분석법 (3) 시험 조작(Real-Time PCR 장치에 의한 정성분석)에 따른다.

표 28. 유전자재조합 사탕무 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	50 cycles
	60℃	1분	Yes

표 29. 유전자재조합 알팔파 검사에 사용되는 RT-PCR 반응 조건

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
최종의 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	60℃	1분	Yes

(4) 분석결과의 판정

11) 유전자재조합 면화 분석법 (4) 분석결과의 판정에 따른다. 다만, 사탕무의 경우 PCR cycle 수가 50이므로 모든 NTC의 Ct 값이 50이어야 하며, 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰에서 Ct 값이 50 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.

24. ～ 30. (현행과 같음)

제11. ～ 제12. (현행과 같음)

[별표1] 원료의 목록

1. 식물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용부위
1~6	(현행과 같음)
7	갈매보리수나무	Sea buckthorn, 비타민나무	Hippophae rhamnoides L.	열매, 잎
8~9	(현행과 같음)
10	감나무	-	Diospyros kaki Thunb.	열매, 잎
11~127	(현행 10~126과 같음)
128	비술나무	-	Ulmus pumila L.	나무껍질, 잎
129~139	(현행 127~137과 같음)
140	산사나무	산사	Crataegus pinnatifida Bunge. 과 그 변종	열매
141	산수유	-	Cornus officinalis Siebold & Zucc.	열매
142~189	(현행 138~185와 같음)
190	연	-	Nelumbo nucifera Gaertner	뿌리(연근), 꽃(연꽃), 잎(하엽)
191~195	(현행 187~191과 같음)
196	왕느릅나무	유백피	Ulmus macrocarpa Hance	나무껍질
197~205	(현행 192~200과 같음)
206	일본호손	Japanese Hawthorn	Crataegus cuneata Siebold & Zucc.	열매
207~228	(현행 201~222와 같음)
229	참느릅나무	-	Ulmus parvifolia Jacq.	나무껍질, 잎
230~270	(현행 223~263과 같음)
271	호손	Hawthorn	Crataegus monogyna Thunb.	열매, 순, 잎, 씨앗, 꽃
272~280	(현행 264~272와 같음)

2 (현행과 같음)

3. 기타원료

	품목명	이명 또는 영명	학명 또는 특성	사용부위
1～2	(현행과 같음)
3	트레할로스	Trehalose	-	-
4	(현행과 같음)

[별표2]  “제한적 사용 원료” 목록

1. 식물성 제한적 사용 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용 부위	사용 조건
<삭제>
1~21	(현행 2~22와 같음)
<삭제>
<삭제>
22~30	(현행 25~33과 같음)
31	연	연자육	Nelumbo nucifera Gaertner	씨	-
32~35	(현행 35~38과 같음)
<삭제>
36~56	(현행 40~60과 같음)

[별표3] ～ [별표7] (현행과 같음)

신․ 구조문 대비표