식품의약품안전청 고시 제2009-7호

「식품의 기준 및 규격」일부개정고시

2009. 3. 2

식품의약품안전청

식품의약품안전청 고시 제2009-7호

「식품의 기준 및 규격」 일부개정고시

1. 개정 이유

식품 중 멜라민 기준 및 시험법을 신설하고 곡류, 두류 등에 대한 아플라톡신 기준을 총 아플라톡신 기준으로 강화하여 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함

2. 주요 내용

가. 곰팡이독소 기준 및 시험법 개정 [안 제2, 5, 8), (1)], [안 제5, 1, 20, 29] 및 [안 제10, 13, 1) 및 2)]

(1) 아열대지역으로부터의 식품 수입량 증가, 기후 온난화 등으로 곰팡이독소 관리 강화가 요구됨

(2) 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 과자류, 장류, 기타 식품류 등에 대한 곰팡이독소 기준을 아플라톡신 B1 10 ㎍/kg 이하에서 총 아플라톡신(B1, B2, G1, G2의 합) 15 ㎍/kg 이하로 기준을 강화하고, 이 중 아플라톡신 B1은 현행과 같이 10 ㎍/kg 이하로 함.

(3) 식품의 곰팡이독소에 대한 안전성을 확보함

나. 식품 중 멜라민 기준 및 시험법 신설 [안 제2, 5, 12), (6)] 및 [안 제10, 22, 5)]

(1) 식품에 사용할 수 없는 유해물질인 멜라민에 대한 기준 및 규격 설정이 요구됨

(2) 농약(싸이로마진)의 분해산물이나 멜라민 용기․포장 등에 의해 식품 중에 비의도적 오염물질로 존재할 수 있는 멜라민을 고려하여 유통 혼란 등을 방지하기 위해 식품일반에 대한 공통기준 및 규격으로 2.5 mg/kg 이하로 하되, 영․유아나 환자에게 절대적인 영양소 공급원이 되는 특수용도식품의 기준은 불검출로 하고, 식품 중 멜라민 시험법을 신설함

(3) 식품의 멜라민에 대한 안전성을 확보함

3. 기타참고사항

가. 관계법령 : 식품위생법 제7조 및 제12조

나. 규제실시 : 해당사항 없음

다. 예산 : 별도조치 필요없음

라. 합의 : 해당사항 없음

마. 기타사항

식품의약품안전청 고시 제2009-7호

식품위생법 제7조제1항에 따른 식품의 기준 및 규격(식품의약품안전청 고시 제2008-80호, 2008. 12. 23)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2009년 3월 2일

식품의약품안전청장

「식품의 기준 및 규격」일부개정고시

식품의 기준 및 규격 중 일부를 다음과 같이 개정한다.

제2, 5, 8), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
곡류가공품 및 두류가공품(규격외 일반가공식품)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
장류(메주 제외) 및 고춧가루	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제 2, 5, 12)에 (6)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 멜라민(Melamine) 기준

대 상 식 품	기 준
○ 특수용도식품 중 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식, 특수의료용도등식품 ○ 「축산물의 가공기준 및 성분규격」에 따른 조제분유, 조제우유, 성장기용 조제분유, 성장기용 조제우유, 기타조제분유, 기타조제우유	불검출
○ 상기 이외의 모든 식품 및 식품첨가물	2.5 ㎎/㎏ 이하

제5, 1, 5), (10)을 다음과 같이 한다.

(10) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 땅콩 및 견과류 함유제품에 한함)

제5, 20, 5), (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 메주에 한함)

제5, 29, 29-1, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제5, 29, 29-11, 5), (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제5, 29, 29-14, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

제10, 13, 1) 중 “박층크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법”을 “박층크로마토그래피에 의한 총 아플라톡신 시험법”으로 한다.

제10, 13, 1), (2) 중 ③을 삭제한다.

제 10, 13, 2)를 다음과 같이 한다.

2) 액체크로마토그래피에 의한 총 아플라톡신 시험법

(1) 시험법의 적용범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류, 고춧가루 등

(2) 분석원리

시료 중의 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)을 70% 메탄올로 추출한 후 면역친화성칼럼으로 정제하여 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid)으로 유도체화 시킨 것을 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

(3) 장치

① 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

② 정제용 칼럼 : 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) Afla TestTM (VICAM) 또는 이와 동등한 것

③ 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

④ 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(4) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 아플라톡신 혼합 표준원액 : 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2를 아세토니트릴에 녹여 각각 200 μg/mL가 되도록 한다.

③ 아플라톡신 혼합 표준용액 : 아플라톡신 혼합 표준원액을 아세토니트릴로 1, 2, 5, 10, 25, 50 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

④ 추출용액 : 1% 염화나트륨이 함유되도록 조제한 메탄올․물(70:30, v/v) 혼합용액을 추출용액으로 한다.

⑤ 기타시약 : 특급

(5) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 25 g을 달아 추출용액 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 물 30 mL를 가하여 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

② 정제

추출액 20 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 10 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다.

③ 유도체화

용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴․물(20:80, v/v) 혼합용액 0.8 mL를 가하여 혼합하고 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

(6) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 아세토니트릴․물 (25:75, v/v)

㉰ 검출파장 : 여기파장 360 nm, 형광파장 450 nm

㉱ 유속 : 1 mL/분

㉲ 주입량 : 10 μL

② 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액 1 mL를 각각 취하여 50℃에서 질소로 건고시킨 후 (5) 시험용액의 조제 ③ 유도체화에 따라 조작한 것을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

③ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

④ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 각 아플라톡신의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

(7) 계산

총 아플라톡신의 함량(μg/kg)

= (CAFB1 + CAFB2 + CAFG1 + CAFG2)× V/S × D

CAFB1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B1의 농도(ng/mL)

CAFB2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B2의 농도(ng/mL)

CAFG1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G1의 농도(ng/mL)

CAFG2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G2의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

제 10, 22, 5) 식품 중 멜라민 시험법을 다음과 같이 신설한다.

5) 식품 중 멜라민 시험법

(1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 식품

(나) 분석원리

시료 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS)

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 녹여 정확히 100 mL로 한다.

④ 표준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).

⑤ 0.1% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 4% 개미산용액 : 개미산 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1% 개미산 용액 5mL에 아세토니트릴 95 mL를 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑨ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑩ 20 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄(Ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다.

⑪ 기타시약 : 특급

(마) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL를 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 mL를 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.

이동상 A : 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v)

시간(분)	이동상 A	이동상 B
0.0	100	0
5.0	100	0
10.0	25	75
11.0	25	75
13.0	100	0
15.0	100	0

이동상 B : 20 mM 개미산암모늄․아세토니트릴(50:50, v/v)

㉰ 유속 : 0.25 mL/분

㉱ 주입량 : 10 μL

㉲ 칼럼온도 : 35℃

② 질량분석기/질량분석기의 조건

㉮ Ionization : ESI (Positive)

㉯ Source voltage : 4.8 kV

㉰ Capillary Temp. : 350℃

㉱ Auxiliary gas : 질소

㉲ Collision gas : 아르곤 또는 질소

㉳ Source collision energy : 15 ～ 30 V

③ 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

④ 정성시험

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.

물 질	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
멜 라 민	127	85 68

⑤ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피 (mL)

S : 시료 채취량 (g)

D : 시험용액의 희석배수

(아) 정량한계 : 0.5 mg/kg

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품

(나) 분석원리

시료 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector)를 사용한다.

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.

④ 표준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 물에 녹여  희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

⑤ 4% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 기타시약 : 특급

(마) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

※ 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다*. 용출액 2 mL를 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 완충용액․아세토니트릴 (85:15, v/v)

완충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다.

㉰ 검출파장 : 240 nm

㉱ 유속 : 1.0 mL/분

㉲ 주입량 : 10 μL

② 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

③ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

④ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

⑤ 확인시험

(1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법 (바) 시험조작 ④ 정성시험 또는 (3) 기체크로마토그래피/질량분석기 (라) 시험조작 ② 정성시험에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

(3) 기체크로마토그래피/질량분석기를 이용한 멜라민 확인시험법

(가) 장치

① 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)

(나) 시약 및 시액

① 표준용액

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (라) 시약 및 시액 ④ 표준용액을 사용한다.

② 피리딘 : 특급을 사용한다.

③ 유도체시약(BSTFA)

N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1% trimethyl-chlorosilane 함유)를 사용한다.

(다) 시험용액의 조제

① 추출 및 정제

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (마) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하여 용출액으로 사용한다.

② 유도체화

표준용액 및 위의 용출액 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소로 건고한다. 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약(BSTFA) 200 μL를 넣고 마개를 닫은 후 70℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다.

(라) 시험조작

① 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS(0.25 mm × 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 250℃

㉱ 오븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분)

㉳ 주입방법 : splitless

㉴ 주입량 : 1.0 μL

㉵ 이온화 방법 : EI mode

㉶ 이온화 전압 : 70 V

② 정성시험

위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 327 이온에 대한 각 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.

물 질	이 온
멜 라 민	342 343 344 327	(M) (M+1) (M+2) (M-15)

부 칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제2. 5. 8) (1), 제5. 1. 5) (10), 제5. 20. 5) (3), 제5. 29. 29-1 5) (1), 제5. 29. 29-11 5) (2), 제5. 29. 29-14 5) (1), 제10. 13. 1) 및 2)는 2009년 9월 1일부터 시행한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행 당시 접수되어 검사가 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용한다.

현  행

개  정 (안)

제 1. (생  략)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 4. (생  략)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 7) (생  략)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 아플라톡신 B1

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	10 μg/kg 이하
<신 설>	<신 설>
된장, 고추장 및 고춧가루	10 μg/kg 이하

(2) ～ (3) (생  략)

9) ～ 11) (생  략)

12) 기타 유해물질 기준

(1) ～ (5) (생  략)

<신  설>

13) ～ 15) (생  략)

6. (생  략)

제 3. ～ 제 4. (생  략)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (9) (생  략)

(10) 아플라톡신 B1(μg/kg) : 10 이하(땅콩 또는 견과류 함유식품에 한함)

6) (생  략)

2. ～ 19. (생  략)

20. 장류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 아플라톡신(μg/kg) : 10 이하(B1으로서, 메주에 한한다)

(4) ～ (5) (생  략)

6) (생  략)

21. ～ 28. (생  략)

29. 기타 식품류

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) 아플라톡신(μg/kg) : 10 이하(B1으로서)

6) (생  략)

29-2 ～ 29-10 (생  략)

29-11 팝콘용옥수수가공품

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) (생 략)

(2) 아플라톡신(μg/kg) : 10.0 이하(B1으로서)

6) (생  략)

29-12 ～ 29-13 (생  략)

29-14 찐쌀

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) 아플라톡신(μg/kg) : 10.0 이하(B1으로서)

(2) ～ (4) (생  략)

6) (생  략)

29-15 ～ 29-18 (생  략)

제 6. ～ 제 9. (생  략)

제 10. 일반시험법

1.～ 12. (생  략)

13. 식품 중 곰팡이독소시험법

1) 박층크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법

(1) (생  략)

(2) 아플라톡신 표준용액(각 표준원액 및 표준용액은 알루미늄박으로 싸서 냉장고에 보존한다)

① ～ ② (생  략)

③ 아플라톡신 B1 표준용액：아플라톡신 B1 원액 1 mL를 취하여 앞의 혼액으로 정확히 200 mL로 한다.

아플라톡신B1 표준용액 1 mL＝0.5 μg

(3) ～ (4) (생  략)

2) 액체크로마토그래피에 의한 아플라톡신 B1 시험법

(1) 시약

① 이동상：물‧아세토니트릴(3：1)

② 아플라톡신혼합표준용액

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량중의 아플라톡신혼합표준용액 5 mL를 취하여 벤젠‧아세토니트릴혼액(98：2)으로 정확히 100 mL로 한다.

아플라톡신혼합표준용액 1 mL ＝ B1, B2, G1, G2 각 50 ng

③ 아플라톡신B1 표준용액

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량중의 아플라톡신B1 표준용액 10 mL를 취하여 앞의 혼액으로 정확히 100 mL로 한다.

아플라톡신B1 표준용액 1 mL＝ 50 ng

(2) 장치

① 칼럼：μꠅBondapackꠅC18 또는 이와 동등한 것

② 검출기：형광검출기

③ 여과지：Whatman No.2(7.0 cm) 또는 이와 동등한 것

(3) 시험용액의 조제

앞의 1) 박층크로마토그래피에 의한 정성 및 정량 (3) 시험용액의 조제

① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하고 이후부터는 아래의 조작에 따른다.

<트리플루오로아세틸화>

잔류물에 Trifluoroacetic acid(TFA) 0.1 mL를 가하여 Vortex로 1분간 섞고 다시 아세토니트릴‧물(1：1) 4 mL를 넣어 Vortex로 1분간 섞는다. 이 혼액에 아세토니트릴‧물(1：1)용액을 가하여 일정량(5～10 mL)으로 한 후 여과하여 시험용액으로 한다.

(4) 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액 및 아플라톡신B1 표준용액 일정량(5～10 mL)을 취하여 질소가스로 용매를 완전히 제거시킨 후 (3) 시험용액의 조제중의 트리플루오로아세틸화에 따라 조작하여 검량선을 작성한다.

(5) 시험조작

(액체크로마토그래피의 측정조건의 예)

○ 여기파장：365 mm

○ 속정파장：418nm

○ 유속：1 mL/분

시험용액, 아플라톡신혼합표준용액 및 아플라톡신B1 표준용액 5～20 μL를 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 표준용액 및 시험용액의 피크와 머무름시간(Retention time)을 비교해서 정성을 하고, 얻어진 피크의 면적 또는 높이를 측정하여 작성한 검량선으로부터 아플라톡신의 함량을 정량한다.

3) ～ 4) (생  략)

14. ～ 21. (생  략)

22. 식품 중 유해물질시험법

1) ～ 4) (생  략)

<신 설>

23. ～ 30. (생  략)

제11. ～ 제12. (생  략)

[별표1] ~ [별표 7] (생  략)

제 1. (현행과 같음)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 4. (현행과 같음)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 7) (현행과 같음)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순가공품(분쇄, 절단 등)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
곡류가공품 및 두류가공품(규격외 일반가공식품)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
장류(메주 제외) 및 고춧가루	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

(2) ～ (3) (현행과 같음)

9) ～ 11) (현행과 같음)

12) 기타 유해물질 기준

(1) ～ (5) (현행과 같음)

대 상 식 품	기 준
○ 특수용도식품 중 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식, 기타 영·유아식, 특수의료용도등식품 ○ 「축산물의 가공기준 및 성분규격」에 따른 조제분유, 조제우유, 성장기용 조제분유, 성장기용 조제우유, 기타조제분유, 기타조제우유	불검출
○ 상기 이외의 모든 식품 및 식품첨가물	2.5 ㎎/㎏ 이하

(6) 멜라민(Melamine) 기준

13) ～ 15) (현행과 같음)

6. (현행과 같음)

제 3. ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (9) (현행과 같음)

(10) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 땅콩 및 견과류 함유제품에 한함)

6) (현행과 같음)

2. ～ 19. (현행과 같음)

20. 장류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 메주에 한함)

(4) ～ (5) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

21. ～ 28. (현행과 같음)

29. 기타 식품류

29-1 땅콩 또는 견과류 가공품

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

6) (현행과 같음)

29-2 ～ 29-10 (현행과 같음)

29-11 팝콘용옥수수가공품

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) (현행과 같음)

(2) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

6) (현행과 같음)

29-12 ～ 29-13 (현행과 같음)

29-14 찐쌀

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)

(2) ～ (4) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

29-15 ～ 29-18 (현행과 같음)

제 6. ～ 제 9. (현행과 같음)

제 10. 일반시험법

1.～ 12. (현행과 같음)

13. 식품 중 곰팡이독소시험법

1) --------------------- 총 아플라톡신 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) ------------------------

-------------------------

-------------------

① ～ ② (현행과 같음)

<삭 제>

(3) ～ (4) (현행과 같음)

2) --------------------- 총 아플라톡신 시험법

(1) 시험법의 적용범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류, 고춧가루 등

(2) 분석원리

시료 중의 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)을 70% 메탄올로 추출한 후 면역친화성칼럼으로 정제하여 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid)으로 유도체화 시킨 것을 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

(3) 장치

① 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

② 정제용 칼럼 : 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) Afla TestTM (VICAM) 또는 이와 동등한 것

③ 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

④ 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A (pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(4) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 아플라톡신 혼합 표준원액 : 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2를 아세토니트릴에 녹여 각각 200 μg/mL가 되도록 한다.

③ 아플라톡신 혼합 표준용액 : 아플라톡신 혼합 표준원액을 아세토니트릴로 1, 2, 5, 10, 25, 50 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

④ 추출용액 : 1% 염화나트륨이 함유되도록 조제한 메탄올․물(70:30, v/v) 혼합용액을 추출용액으로 한다.

⑤ 기타시약 : 특급

(5) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 25 g을 달아 추출용액 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 물 30 mL를 가하여 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

② 정제

추출액 20 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 10 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다.

③ 유도체화

용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴․물(20:80, v/v) 혼합용액 0.8 mL를 가하여 혼합하고 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

(6) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 아세토니트릴․물 (25:75, v/v)

㉰ 검출파장 : 여기파장 360 nm, 형광파장 450 nm

㉱ 유속 : 1 mL/분

㉲ 주입량 : 10 μL

② 검량선 작성

아플라톡신 혼합표준용액 1 mL를 각각 취하여 50℃에서 질소로 건고시킨 후 (5) 시험용액의 조제 ③ 유도체화에 따라 조작한 것을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

③ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

④ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 각 아플라톡신의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

(7) 계산

총 아플라톡신의 함량(μg/kg)

= (CAFB1 + CAFB2 + CAFG1 + CAFG2)× V/S × D

CAFB1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B1의 농도(ng/mL)

CAFB2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 B2의 농도(ng/mL)

CAFG1  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G1의 농도(ng/mL)

CAFG2  : 검량선에서 구한 아플라톡신 G2의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

3) ～ 4) (현행과 같음)

14. ～ 21. (현행과 같음)

22. 식품 중 유해물질시험법

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 식품 중 멜라민 시험법

(1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 식품

(나) 분석원리

시료 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS)

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 녹여 정확히 100 mL로 한다.

④ 표준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).

⑤ 0.1% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 4% 개미산용액 : 개미산 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1% 개미산 용액 5mL에 아세토니트릴 95 mL를 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑨ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑩ 20 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄(Ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다.

⑪ 기타시약 : 특급

(마) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL를 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 mL를 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.

이동상 A : 0.1% 개미산․아세토니트릴(5:95, v/v)

이동상 B : 20 mM 개미산암모늄․아세토니트릴(50:50, v/v)

시간(분)	이동상 A	이동상 B
0.0	100	0
5.0	100	0
10.0	25	75
11.0	25	75
13.0	100	0
15.0	100	0

㉰ 유속 : 0.25 mL/분

㉱ 주입량 : 10 μL

㉲ 칼럼온도 : 35℃

② 질량분석기/질량분석기의 조건

㉮ Ionization : ESI (Positive)

㉯ Source voltage : 4.8 kV

㉰ Capillary Temp. : 350℃

㉱ Auxiliary gas : 질소

㉲ Collision gas : 아르곤 또는 질소

㉳ Source collision energy : 15 ～ 30 V

③ 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

④ 정성시험

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.

물 질	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
멜 라 민	127	85 68

⑤ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피 (mL)

S : 시료 채취량 (g)

D : 시험용액의 희석배수

(아) 정량한계 : 0.5 mg/kg

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법

(가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품

(나) 분석원리

시료 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.

(다) 장치

① 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector)를 사용한다.

② 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

(라) 시약 및 시액

① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.

④ 표준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 물에 녹여  희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

⑤ 4% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

⑥ 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑦ 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

⑧ 기타시약 : 특급

(마) 시험용액의 조제

① 추출

시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

※ 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.

② 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다*. 용출액 2 mL를 4 mL 바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

(바) 시험조작

① 액체크로마토그래프의 측정조건

㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 이동상 : 완충용액․아세토니트릴 (85:15, v/v)

완충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다.

㉰ 검출파장 : 240 nm

㉱ 유속 : 1.0 mL/분

㉲ 주입량 : 10 μL

② 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

③ 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

④ 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

⑤ 확인시험

(1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법 (바) 시험조작 ④ 정성시험 또는 (3) 기체크로마토그래피/질량분석기 (라) 시험조작 ② 정성시험에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 한다.

(사) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

(3) 기체크로마토그래피/질량분석기를 이용한 멜라민 확인시험법

(가) 기구 및 장비

① 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)

(나) 시약 및 시액

① 표준용액

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (라) 시약 및 시액 ④ 표준용액을 사용한다.

② 피리딘 : 특급을 사용한다.

③ 유도체시약(BSTFA)

N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1% trimethyl-chlorosilane 함유)를 사용한다.

(다) 시험용액의 조제

① 추출 및 정제

(2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (마) 시험용액의 조제 ① 추출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하여 용출액으로 사용한다.

② 유도체화

표준용액 및 위의 용출액 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소로 건고한다. 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약(BSTFA) 200 μL를 넣고 마개를 닫은 후 70℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다.

(라) 시험조작

① 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

㉮ 칼럼 : DB-5MS(0.25 mm × 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

㉯ 주입부 온도 : 250℃

㉰ 검출기 온도 : 250℃

㉱ 오븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분)

㉳ 주입방법 : splitless

㉴ 주입량 : 1.0 μL

㉵ 이온화 방법 : EI mode

㉶ 이온화 전압 : 70 V

② 정성시험

위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 327 이온에 대한 각 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.

물 질	이온
멜 라 민	342 343 344 327	(M) (M+1) (M+2) (M-15)

23. ～ 30. (현행과 같음)

제11. ～ 제12. (현행과 같음)

[별표1] ~ [별표 7] (현행과 같음)

신․구조문 대비표