식품의약품안전청 고시 제2010-2호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

2010. 1. 7

식품의약품안전청

식품의약품안전청 고시 제2010-2호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

1. 개정이유

과자류 제조 시 유산균 첨가제품 뿐만 아니라 발효제품을 함유한 제품 등이 다양하게 출시됨에 따라 합리적 규격 개선을 위한 세균수 규격 단서조항을 개정하고, 「건강기능식품의 기준 및 규격」 전부개정(고시 제2008-12호, 2008. 2. 27) 으로 일부 기능성 원료가 삭제됨에 따라 관련 식품에 대하여 식품유형을 신설하고 그에 따른 규격 및 시험법을 마련하고자 하며, 시험법이 없는 농약의 시험법을 신설하여 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함

2. 주요내용

가. 과자류의 세균수 규격 단서조항 개정[안 제5. 1. 5), (6)]

(1) 발효제품을 함유한 과자류에 대한 현실성 있는 규격 필요

(2) 유산균 뿐만아니라 발효제품을 함유한 과자류에서도 세균수 규격을 제외하도록 단서조항 개정

나. 기타 식품류 중 6종의 식품유형 신설 등[안 제5. 29]

(1) 종전의 기능성원료를 이용한 로얄젤리가공식품, 버섯가공식품, 자라가공식품, 효모식품, 효소식품, 화분가공식품에 대한 새로운 식품유형을 신설하고 규격 및 시험법을 마련함

(2) 일정기간 동안 캡슐․정제의 형태로 제조할 수 있도록 제형 규제 완화를 통해 건강기능식품에서 일반식품으로 원활하게 전환될 수 있도록 제도적 토대 마련

다. 식품 중 잔류농약 시험법(사이에노피라펜, 프로헥사디온칼슘, 테트라메쓰린) 신설 [안 제10. 4. 4.1.4.137, 4.1.4.138, 4.1.4.139]

(1)「농약관리법」에 따라 국내 사용 등록된 사이에노피라펜 등 3종 농약 시험법 신설

3. 기타참고사항

가. 관계법령 : 「식품위생법」 제7조제1항

나. 예산조치 : 별도조치 필요없음

다. 합의 : 해당사항 없음

라. 기타 :  (1) 신․구조문 대비표 별첨

(2) 행정예고 : ’09. 6. 24 ～ 7. 15 (과자류 세균수 관련)

’09. 8. 13 ～ 9. 3 (농약 시험법)

’09. 12. 21 ～ 12. 28(기타 식품류 중 유형신설)

식품의약품안전청 고시 제2010-2호

「식품위생법」 제7조제1항에 따른 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2009-172호, 2009. 12. 9)을 다음과 같이 개정합니다.

2010년 1월 7일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제2. 2. 1) (8)과 (9)를 삭제하고 (10)부터 (20)까지를 (8)부터 (18)까지로 한다.

제2. 3. 12) “캡슐형태로 제조할 수 있으나 이 경우 의약품으로 오인․혼동할 우려가 없도록 하여야 한다.”를 “캡슐형태로, 로얄젤리가공식품, 버섯가공식품, 자라가공식품, 효모식품, 효소식품, 화분가공식품은 정제 또는 캡슐형태로 제조할 수 있으나 이 경우 의약품으로 오인․혼동할 우려가 없도록 하여야 한다.”로 한다.

제 5, 1, 5), (6) 중 “유산균 함유제품은”을 “발효제품 또는 유산균 함유제품은”으로 한다.

제5. 29. 29-7 “벌꿀”을 “벌꿀류”로 한다.

제5. 29. 29-7. 1) “벌꿀이라 함은 꿀벌들이 꽃꿀을 채집하여 벌집에 저장한 것을 채밀한 것으로, 채밀 후 화분, 로얄젤리, 당류, 감미료 등 일절 다른 물질을 첨가하지 아니한 것을 말한다.”를 “벌꿀류란 꿀벌들이 꽃꿀, 수액 등 자연물을 채집하여 벌집에 저장한 것을 채밀한 것 또는 일벌의 인두선에서 분비되는 분비물을 그대로 또는 섭취가 용이하도록 가공한 것 말한다.”로 한다.

제5. 29. 29-7 4)를 다음과 같이 신설한다.

(1) 벌꿀

꿀벌들이 꽃꿀, 수액 등 자연물을 채집하여 벌집에 저장한 것을  채밀한 것으로, 채밀 후 화분, 로얄젤리, 당류, 감미료 등 다른 식품이나 식품첨가물을 첨가하지 아니한 것을 말한다.

(2) 로얄젤리가공식품

① 생로얄젤리

일벌의 인두선에서 분비되는 분비물인 로얄젤리를 식용에 적합하도록 이물을 제거한 것

② 동결건조로얄젤리

생로얄젤리를 동결건조한 것

③ 로얄젤리제품

위 ①, ② 외의 로얄젤리가공식품으로 로얄젤리(생로얄젤리 35.0% 이상, 동결건조로얄젤리 14.0% 이상)를 제조․가공한 것

제5. 29. 29-7 5) “(1) 벌꿀”을 신설하고 (1)부터 (9)까지를 ①부터 ⑨까지로 한다.

제5. 29. 29-7 5) (2)를 다음과 같이 신설한다.

(2) 로얄젤리가공식품

유형 항목	생로얄젤리	동결건조 로얄젤리	로얄젤리제품
① 10-히드록시-2-데센산(%)	1.6 이상	4.0 이상	0.56 이상
② 수분(%)	65.5～68.5	5.0 이하	-
③ 조단백질(%)	11.0～14.5	30.0～41.0	-
④ 산도(1 N NaOH mL/100 g)	32～53	-	-
⑤ 대장균	음성	음성	음성
⑥ 붕해시험	적합하여야 한다(정제 또는 캡슐제품에 한한다. 단 씹어먹는 것은 제외한다.).

제5. 29. 29-7 6) “(1) 벌꿀”을 신설하고 (1)부터 (8)까지를 ①부터 ⑧까지로 한다.

제5. 29. 29-7 6) (2)를 다음과 같이 신설한다.

(2) 로얄젤리가공식품

① 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

㉮ 장치

고속액체크로마토그래프

㉯ 표준용액의 조제

10ꠀHDA 표준품을 황산데시케이타에서 건조시킨 후 약 50 mg을 정밀히 취하여 넣고 메탄올로 녹여 50 mL로 한 것을 표준원액(1,000 ppm)으로 하여 필요시 희석하여 사용한다.

㉰ 시험용액의 조제

10ꠀHDA로서 48 mg에 해당하는 양의 검체(연질캡슐 제품은 내용물과 피막을 함께 취한다)를 취하여 500 mL 용량 플라스크에 넣고, 물 약 50 mL를 넣어 50℃로 가온하고 진탕 혼화하고, 연질캡슐은 피막과 내용물을 균질하게 혼화시킨 후 메탄올 약 350 mL를 넣어 약 30분간 초음파 진탕 추출하고 메탄올을 넣어 500 mL로 한다. 이 액을 여과하여 검액으로 한다.

캡슐 제품의 경우에는 20캡슐 이상을 취하여, 캡슐을 절개하고 개개의 내용물의 무게를 정밀하게 달아 평균무게를 구하여 1캡슐의 평균무게로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 측정조건

ⓐ 칼럼∶μ—Bondapak C18 또는 이와 유사한 칼럼

ⓑ 이동상∶0.02 M (NH4)2HPO4‧메탄올(7∶3) 혼합액(단, 인산을 가하여 pH 7.0으로 조정한다)

ⓒ 검출기∶UV 214 nm

ⓓ 유속∶1.4 mL/min

(유속은 10ꠀHDA 주피크의 유지시간이 7～10분 되도록 적절히 조정한다).

Ⓑ 정량시험

검액 및 표준액 10 μL를 액체크로마토그래프내에 주입하여 10ꠀHDA의 그래프를 얻는다. 이 그래프를 표준 그래프와 비교하여 10ꠀHDA에 해당하는 피크를 확인한다. 10ꠀHDA의 함량은 피크의 면적 또는 높이로 다음 식에 따라 산출한다.

<계 산>

10ꠀHDA 함량(%) ＝	검액 중의 10-HDA의 피크면적	×	표준품 취한 량(mg)	×100
	표준액중의 10-HDA의 피크면적		검체채취량(mg)

② 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분 1.1.1.3 칼피셔법에 따라 시험한다. 또는 칭량병에 정제해사(20～40메쉬의 것)를 약 절반정도 채우고 유리봉을 넣어 항량시킨 후 이에 검체 2～3 g을 정밀히 달아 넣고 유리봉으로 잘 혼합한 후 이를 70±2℃의 감압건조기에 넣고 25±5 mmHg로 감압하여 4시간 건조시킨다.

건조 후 데시케이타에서 약 30분간 항량시킨 후 다음 식에 따라 수분함량을 구한다.

수분(%) =	B-C	× 100
	B-A

A∶칭량병(해사, 유리봉 포함)무게(g)

B∶검체 및 칭량병 무게(g)

C∶건조 후 무게(g)

③ 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

④ 산도

검체 0.5 g에 탄산가스를 함유하지 않은 물 50 mL를 가하고 페놀프탈레인 시액 0.5 mL를 가하여 0.1 N 수산화나트륨용액으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정한다.

산도(1 N NaOH mL/100 g) ＝	a × f × 10
	검체채취량(g)

a∶0.1 N NaOH 용액의 소비 mL수

f∶0.1 N NaOH 용액의 역가

⑤ 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

⑥ 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제5. 29. 29-19을 다음과 같이 신설한다.

29-19 버섯가공식품

1) 정의

버섯가공식품이란 영지, 운지 또는 표고버섯 자실체의 건조물을 분말로 한 것 또는 자실체나 이들의 균사체 배양물의 추출물을 식용에 적합하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

3) 제조·가공기준

(1) 자실체를 직접 식용으로 하는 경우 소화기 내에서 유효성분의 용출이 용이하도록 미세하게 분말로 하여야 한다.

(2) 추출에 사용되는 주정은 농축과정에서 충분히 제거되어야 한다.

(3) 배양에 사용된 배지성분의 잔존량은 건조배양물의 10% 이하이어야 한다.

4) 식품유형

(1) 버섯자실체가공식품

영지, 운지 또는 표고버섯의 자실체의 건조물을 분말화하거나 자실체를 추출하여 가공한 것으로 자실체가 30% 이상(자실체추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)인 것을 말한다.

(2) 버섯균사체가공식품

영지, 운지 또는 표고버섯의 균사체 배양물을 추출하여 가공한 것으로 균사체가 50% 이상(균사체 배양물 추출물의 경우에는 균사체 배양물의 건조물로 환산)인 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	버섯자실체가공식품	버섯균사체가공식품
(1) 수분(%)	7.0 이하(액상제품은 제외한다)
(2) 자실체(%)	30.0 이상(추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)	-
(3) 균사체(%)	-	50.0 이상(추출물의 경우 균사체 배양물의 건조물로 환산)
(4) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(5) 대장균군	음성	음성
(6) 붕해시험	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 자실체 또는 균사체 함량

① 영지버섯제품

㉮ 산성클로로포름 가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후 추출물은 가온하여 녹인다. 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압농축하여 전량을 10 mL이하로 한다.

농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 조제검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건조물 약 10 g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 검체 3～10 mg을 정확히 달아 내부 표준용액 1 mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3～10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10 μL씩을 다음의 조건하에서 고속액체크로마토그래피하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건

ⓐ 자실체 가공제품의 경우

— 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1 mg/mL)

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶40 ℃

— 이동상∶2% 초산수용액‧아세토니트릴(2∶1)

— 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

— 칼럼의 선택∶표준용액 10 μL에 대해 상기 조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 2.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 A(Ganoderic acid A)>과 내부표준물질의 분리도가 2.0 이상의 것을 사용한다.

ⓑ 배양물을 가공한 제품의 경우

— 내부표준용액∶파이렌의 에탄올 용액(10 μg/mL )

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장∶210 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶실온

— 이동상∶(pH 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액)‧에탄올의 혼액(9:20)

— 유량∶파이렌의 머무름시간이 약 30분이 되도록 조정한다.

— 칼럼의 선택∶표준용액 10 μL에 대해 상기조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 1.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 S(Ganoderic acid S)>과 내부표준물질의 분리도가 6.0 이상의 것을 사용한다.

Ⓒ 정량시험

㉠ 자실체 또는 배양물을 가공한 제품의 경우

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거하여 구한다.

영지함유율(건조물환산율 %)＝	검체의 산성클로로포름 가용분(mg)	×100
	검체채취량(g)
	표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)
	표준자실체 또는 표준배양물의 건조물량(g)

㉡ 자실체와 배양물을 혼합하여 가공한 제품의 경우

확인시험에 의해 얻은 검체 및 표준물질의 액체크로마토그램의 내부표준물질이 피크 면적에 대한 지표물질(자실체에 있어서는 가노데린산 A 배양물에 있어서는 가노데린산 S)의 피크 면적비와 QtA, QsA 및 QtS, QsS를 구하여 다음식에 의거 계산한다.

영지의 함유율(건조물 환산율)(%) ＝ <영지자실체 함유율(M)>＋<영지배양물함유율(N)>

M＝	QtA(조제검체)/검체채취량(g)	×100
	QsA(표준물질)/표준자실체건조물량(g)

N＝	QtS(조제검체)/검체채취량(g)	×100(%)
	QsS(표준물질)/표준배양물의 건조물량(g)

② 운지버섯제품

㉮ 산성클로로포름가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고, 물 100 mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL 이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다.  물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 이를 조제검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당 제품의 원료 자실체 건조물의 분말 또는 배양물의 건조물 약 10 g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가하여 냉각판을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하여 이를 조제표준물질로 한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제검체 3～10 mg을 정밀히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료운지버섯의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제표준물질 3～10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10 μL씩을 다음의 조건하에 고속액체크로마토그래프를 할 때 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건

— 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1 mg/mL)

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶40℃

— 이동상∶2% 초산수용액∶아세토니트릴(2∶1)

—유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

Ⓒ 정량시험

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거 함량을 구한다.

운지자실체 또는 균사체(건조물환산율)(%) =	검체의 산성클로로포름 가용분(mg)	×100
	검체의 채취량(g)
	표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)
	표준자실체 또는 표준 배양추출물의 건조물량(g)

③ 표고버섯제품

㉮ 장치

Ⓐ 전개조∶200 mm×200 mm 유리판의 사용이 가능한 유리재질로 기밀한 것

Ⓑ 실리카겔박층판∶박층크로마토그래피용 실리카겔 30 g에 물 50 mL를 가하여 섞은 후 유리판(200 mm×200 mm)에 0.3～0.5 mm의 두께로 도포한다. 풍건 후 105～110℃에서 3시간 건조하고 데시케이타중에서 방냉하여 보존한다.

Ⓒ 자외선등(365 nm)∶탁상형 또는 휴대형

㉯ 시약

Ⓐ 무수에탄올(특급)

Ⓑ 1 N 암모니아용액∶농암모니아수(28%) 67 mL를 취하여 물을 가해 1 L로 한다.

Ⓒ 0.5 N 초산용액∶초산(특급) 29 mL를 취해 물을 가해 1L로 한다.

Ⓓ 전개용매∶nꠀ부탄올(특급), 초산(특급), 증류수를 4∶1∶2(용량비)로 혼합한다.

Ⓔ 이온교환수지∶Amberlite IRꠀ120B(H형), Amberlite IRAꠀ45(OH형)

Ⓕ 닌히드린용액∶물로 포화시킨 nꠀ부탄올에 닌히드린(특급)을 용해하여 0.2%로 한 용액

㉰ 표준용액의 조제

Ⓐ 표준물질의 조제∶원료인 건조표고버섯 및 관리배양한 표고균사 10 g을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액을 모아 감압농축하여 액량을 20 mL로 한다.

Ⓑ 표준용액의 조제∶표준물질에 4배량의 무수에탄올을 가해 80% 에탄올용액으로 하고 생성한 침전을 원심분리하여 제거한다. 상등액을 감압농축하여 에탄올을 제거하고, 분액여두에 옮겨 동량의 에테르로 2회 추출하고 그 에테르층을 제거한다. 에테르를 완전히 제거한 후 물층에 10 g의 Amberlite IRꠀ120B(H형)을 가해 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착된 수지를 물로 세척한 후 1 N NH4OH를 20 mL 가하여 30분간 진탕하여 용출시킨다. 용출 후 10 g의 Amberlite IRAꠀ45(OH형)을 가하고 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착시킨 수지를 물로 씻어낸 후 0.5 N CH3COOH 20 mL로 30분간 흔들어서 용출시킨 후 이것을 2～3회 반복하여 용출액을 모아 감압농축하여 전량을 1 mL로 하여 표준용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 검체의 조제∶원료표고버섯 자실체 또는 인공적으로 관리배양한 균사의 가공분말 또는 이들을 가공한 제품의 경우에는 원료의 10 g에 해당하는 제품을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관이 부착된 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액은 합하여 감압농축하여 액량을 20 mL로 한다. 단, 원료가 표고버섯의 자실체 및 인공적으로 관리배양한 균사의 추출물인 경우에는 원료 10 g 상당의 제품에 20 mL의 물을 가해 용해 또는 현탁한다.

Ⓑ 시험용액의 조제∶③ 표준용액의 조제 Ⓑ 표준용액의 조제와 동일한 방법으로 실험하여 시험용액을 준비한다.

㉲ 시험조작

표준용액 및 시험용액을 실리카겔박층판(200 mm×200 mm)에 각각 20 μL씩 직경 3～5 mm로 점적한 후 전개조에서 전개시킨다. 전개된 실리카겔박층판은 풍건한 후 닌히드린용액을 분무하여 90～100℃에서 수분간 가열하여 발색한 후 발색부에 자외선(365 nm)를 조사하여 형광의 반점(Elidadenin)을 비교 확인한다. 별도로 조작하여 얻은 박층판의 동일 반점부위를 긁어모아 에탄올 일정량을 가하여 추출하고 원심분리하여 액층 1 cm, 파장 253.6 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 구한다.

(3) 타르색소

제10. 일반시험법 2. 식품 중 식품첨가물시험법 2.4 착색료에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.7 대장균군에 따라 시험한다.

(5) 붕해시험

제10. 일반시험법 9.일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제5. 29. 29-20를 다음과 같이 신설한다.

29-20 자라가공식품

1) 정의

자라가공식품이란 식용으로 양식한 자라를 식용에 적합하도록 가공한 것 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 자라는 청결히 양식된 것이어야 하며, 품질이 양호하고 변질되지 아니한 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 자라분말

식용양식자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 것으로 동결건조 또는 열풍건조하여 분말화한 것을 말한다.

(2) 자라분말제품

동결건조자라분말 또는 열풍건조자라분말을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 자라유제품

자라유를 주원료(98.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다(자라유 포함).

5) 규격

유형 항목	자라분말	자라분말제품	자라유제품
(1) 수분(%)	5.0 이하	10.0 이하	-
(2) 회분(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	16.0～40.0 20.0～40.0	4.8 이상 6.0 이상	-
(3) 조단백질(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	48.0～58.0 50.0～70.0	14.0 이상 15.0 이상	-
(4) 히드록시프롤린(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	1.0 이상 2.0 이상	0.3 이상 0.6 이상	-
(5) 조지방(%)	-	-	95.0 이상
(6) 산가	-	-	1.0 이하
(7) 과산화물가	-	-	15.0 이하
(8) 팔밑올레산(%)	-	-	8.0～18.0
(9) 아라키돈산+에이코사펜타엔산(%)	-	-	2.0～8.0
(10) 대장균군	음성	음성	음성
(11) 붕해시험		적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 회분

10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.2 회분에 따라 시험한다.

(3) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(4) 히드록시프롤린

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.3 아미노산에 따라 시험한다.

(5) 조지방

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.1 조지방에 따라 시험한다.

(6) 산가

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.3 화학적 시험 1.1.5.3.1 산가에 따라 시험한다.

(7) 과산화물가

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.3 화학적 시험 1.1.5.3.5 과산화물가에 따라 시험한다.

(8) 팔밑올레산

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.4 지방산에 따라 시험한다. 단, 표준품은 팔밑올레산을 사용한다.

(9) 아라키돈산+에이코사펜타엔산

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.4 지방산에 따라 시험한다. 단, 표준품은 아라키돈산을 추가하여 시험한다.

(10) 대장균군

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.7 대장균군에 따라 시험한다.

(11) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제5. 29. 29-21을 다음과 같이 신설한다.

29-21 효모식품

1) 정의

효모식품이란 식용효모 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 건조효모

식용 효모균주를 분리, 정제하여 건조한 것을 말한다.

(2) 건조효모제품

건조효모를 주원료(60.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 효모추출물제품

식용 효모균주를 분리, 정제한 후 자가소화, 효소분해, 열수추출 등의 방법에 의해 추출한 식용효모추출물을 주원료(고형분함량으로 30.0% 이상. 단, 액상제품은 고형분 함량으로 15.0% 이상)로 하여 제조한 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	건조효모	건조효모제품, 효모추출물제품
(1) 수분(%)	8.0 이하	10.0 이하(액상제품은 제외한다)
(2) 조단백질(%)	40.0 이상	24.0 이상(건조효모제품) 10.0 이상(효모추출물제품 단, 액상제품은 5.0 이상)
(3) 대장균	음성	음성
(4) 붕해시험	-	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(4) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제5. 29. 29-22을 다음과 같이 신설한다.

29-22 효소식품

1) 정의

효소식품이란 식물성 원료에 식용미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 배양에 사용되는 미생물은 안전한 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 곡류효소함유제품

곡류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(2) 배아효소함유제품

곡물의 배아(40.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 과·채류효소함유제품

과·채류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(4) 기타식물효소함유제품

곡류, 곡물배아 또는 과·채류 이외의 식물성 원료(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

5) 규격

(1) 수분(%) : 10.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)

(2) 조단백질(%) : 10.0 이상

(3) α-아밀라아제 : 양성이어야 한다.

(4) 프로테아제 : 양성이어야 한다.

(5) 대장균 : 음성이어야 한다.

(6) 붕해시험 : 적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) α-아밀라아제

① 시약

㉮ 1 % 가용성전분용액∶가용성전분(최순품) 1 g을 물에 녹이고 호화하여 100 mL로 한다.

㉯ 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0)∶0.1 N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1 N 구연산액을 넣어 pH 6.0 및 7.0으로 각각 만든다.

㉰ 0.1% 염화칼슘용액∶염화칼슘(순품) 1 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉱ 요오드시액∶요오드 0.2 g과 요오드칼륨 2 g을 물에 녹여 100 mL로 하고 그 1 mL에 1 N 염산 1 mL를 넣고 물로 100 mL로 한다.

② 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

③ 시험용액의 조제

검체 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20 mL 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성전분용액 5 mL, 맥바인완충액(pH 6.0 또는 7.0으로서) 13 mL와 0.1% 염화칼슘용액 1 mL를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1 mL를 넣은 후 37℃에서 30분간 방치한다. 별도로 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1 mL를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용반응액 0.2 mL에 요오드시액 10 mL를 넣은 것을 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

(4) 프로테아제

① 시약

㉮ 0.6% 카제인용액∶카제인(최순품)을 건조하여 0.6 g을 달아 0.1 N 수산화나트륨액 20 mL에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1 M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20 mL를 넣어 100 mL로 한다.

㉯ 0.4 M 삼염화초산액∶삼염화초산(순품) 65.4 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉰ 0.4 M 탄산나트륨액∶탄산나트륨(순품) 42.5 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉱ 포린시액∶식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.

㉲ 완충액∶0.1 M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1 M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0)

② 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

③ 시험용액의 조제

검체 약 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1 mL를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1 mL를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1 mL를 시험관에 정확히 취하여 0.4 M 탄산나트륨용액 5 mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1 mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인용액 1 mL를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.

④ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm, 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

(5) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(6) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제5. 29. 29-23을 다음과 같이 신설한다.

29-23 화분가공식품

1) 정의

화분가공식품이란 화분을 껍질 파쇄, 추출·농축·정제 등의 공정을 거친 것 또는 이를 주원료로 하여 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 화분은 꿀벌에 의해 채취된 것이나 또는 기타의 방법으로 채취된 것으로 이물이 섞여 있지 않는 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 가공화분

꿀벌 또는 인공적으로 채취한 화분에서 이물을 제거하고 껍질을 파쇄한 것을 말한다.

(2) 화분추출물

화분을 기계적으로 파쇄 또는 효소처리하여 추출한 것을 농축하거나 분말화 한 것을 말한다.

(3) 화분제품

화분을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(4) 화분추출물제품

화분추출물을 주원료(고형분으로서 10.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	가공화분	화분추출물	화분제품, 화분추출물제품
(1) 수분(%)	8.0 이하	8.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)	10.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)
(2) 조단백질(%)	18.0 이상	20.0 이상 (건조물로 환산)	5.0 이상 (화분제품), 2.0 이상 (화분추출물제품)
(3) 타르색소	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.
(4) 대장균	음성	음성	음성
(5) 붕해시험	-	-	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) 타르색소

제10. 일반시험법 2. 식품 중 식품첨가물시험법 2.4 착색료에 따라 시험한다.

(4) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(5) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제 10. 4. 4.1.4 중 4.1.4.137 사이에노피라펜(Cyenopyrafen)을 다음과 같이 신설한다.

4.1.4.137 사이에노피라펜(Cyenopyrafen)

1) 시험법 적용범위

과실류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 사이에노피라펜을 아세톤으로 추출하고 후로리실로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프-자외부흡광검출기 (HPLC-UVD, High Performance Liquid Chromatograph-Ultraviolet Detector)를 사용한다.

나) 액체크로마토그래프-질량분석기(HPLC-MS, High Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 사이에노피라펜 표준품을 아세토니트릴에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 후로리실(Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 후로리실(60∼100 mesh) 10 g을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식혀 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 25 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 아세톤 100 mL를 가하여 3분간 균질화한다. 부흐너깔때기로 흡입여과하고 아세톤 40 mL로 잔사 및 용기를 씻어 상기 여액과 합하여 분액깔때기에 옮기고 증류수 450 mL, 포화식염수 50 mL 및 디클로로메탄/헥산 혼합액(20/80, v/v) 100 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한다. 유기용매층(상층)을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고 감압농축플라스크에 취하여 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 헥산 10 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

안지름 15 mm, 길이 400 mm의 유리칼럼에 후로리실 10 g과 무수황산나트륨 2 g을 차례로 충진한 후 헥산 25 mL를 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘가) 추출’로부터 얻은 헥산 용액 10 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 디클로로메탄 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고 다시 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 100 mL로 유출시켜 감압농축플라스크에 취한다. 이 유출액을 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)을 가하여 최종부피를 5 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)

(3) 이동상 유량 : 1 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 검출파장 : 297 nm

(6) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL를 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

사이에노피라펜

↓

0

2

4

6

8

10

12

14

머무름 시간(분)

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

사이에노피라펜 (9.9분)

라) 정량한계

0.02 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 사이에노피라펜을 확인한다.

가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)

(3) 이동상 유량 : 0.5 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 주입량 : 2 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 콘 볼테이지 : 50 V

(8) 분자량 범위 : 300∼500 m/z

표 1. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름 시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
23.1	393	394

제 10. 4. 4.1.4 중 4.1.4.138 프로헥사디온칼슘(Prohexadione-calcium)을 다음과 같이 신설한다.

4.1.4.138 프로헥사디온칼슘(Prohexadione-calcium)

1) 시험법 적용범위

채소류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 프로헥사디온을 산성화 아세토니트릴로 추출하고 음이온 교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프-자외부흡광검출기(HPLC-UVD, High Performance Liquid Chromatograph-Ultraviolet Detector)를 사용한다.

나) 액체크로마토그래프-질량분석기(HPLC-MS, High Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 및 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 프로헥사디온칼슘 표준품을 메탄올에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)으로 희석하여 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 0.02 M 초산암모늄(ammonium acetate) 용액 : 초산암모늄 0.16 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

바) 5% 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate) 용액 : 인산수소이나트륨 5 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

사) 1% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 1 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

아) 0.2% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 0.2 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

자) 음이온 교환 카트리지 : 음이온 교환 수지 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지(500 mg, 6 cc)를 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 20 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 5 N 황산 용액 1 mL와 아세토니트릴 100 mL를 가하여 3분간 균질화한다. 부흐너깔때기로 흡입여과하고 아세토니트릴 40 mL로 잔사 및 용기를 씻어 상기 여액과 합하여 40℃ 이하 수욕상에서 10 mL 정도 남을 때까지 감압농축한 후 5% 인산수소이나트륨 용액 100 mL를 가하여 용해한다. 이를 분액깔때기에 옮기고 헥산 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한 후 물층을 취하여 10 N 인산 용액을 가하여 pH 3으로 맞춘다. 물층에 포화식염수 30 mL와 디클로로메탄 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치하고 디클로로메탄층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 감압농축플라스크에 취한다. 물층에 다시 디클로로메탄 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한 후 디클로로메탄층을 탈수하여 상기 감압농축플라스크에 합한다. 이를 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

음이온 교환 카트리지에 메탄올 5 mL를 넣고 고정상 상단에 소량의 메탄올이 남을 정도까지 유출시켜 버리고 다시 0.02 M 초산암모늄 용액 5 mL를 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘가) 추출’로부터 얻은 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 물 5 mL와 0.02 M 초산암모늄/메탄올 혼합액(80/20, v/v) 5 mL를 각각 가하여 유출시켜 버리고 다시 1% 포름산 용액 9 mL로 유출시켜 10 mL 메스플라스크에 취한다. 이 플라스크에 아세토니트릴을 가하여 최종부피를 10 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)

(3) 이동상 유량 : 1 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 30℃

(5) 검출파장 : 275 nm

(6) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/mL를 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

프로헥사디온

↓

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

머무름 시간(분)

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

프로헥사디온(10.0분)

라) 정량한계

0.01 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 프로헥사디온을 확인한다.

가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)

(3) 이동상 유량 : 0.5 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 주입량 : 2 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 콘 볼테이지 : 25 V

(8) 분자량 범위 : 100∼300 m/z

표 1. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름 시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
17.7	212	211

제 10. 4. 4.1.4 중 4.1.4.139 테트라메쓰린(Tetramethrin)을 다음과 같이 신설한다.

4.1.4.139 테트라메쓰린(Tetramethrin)

1) 시험법 적용범위

버섯류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 테트라메쓰린을 아세토니트릴로 추출한 후 후로리실로 정제하여 기체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD, Gas Chromatograph - Electron Capture Detector)를 사용한다.

나) 기체크로마토그래프-질량분석기(GC-MS, Gas chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 테트라메쓰린 표준품을 아세톤에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 아세톤으로 희석하여 0.04, 0.08, 0.5, 1.0 2.0, 5.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 후로리실 카트리지 : 후로리실 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(1 g, 6 cc)를 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 10 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 물 30 mL를 가하여 2시간 정치한다. 아세토니트릴 100 mL를 가하여 3분간 균질화한 후 부흐너깔때기로 흡인여과한다. 이 여액을 염화나트륨 15 g이 들어있는 분액깔때기에 옮긴 후 심하게 흔들어 1시간 정치한다. 아세토니트릴층에서 20 mL를 감압농축플라스크에 취하여 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 2 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

후로리실 카트리지에 헥산 50 mL를 넣고 고정상 상단에 소량의 헥산이 남을 정도까지 유출시켜 버리고 ‘가) 추출’로부터 얻은 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 2 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 5 mL로 유출시켜 15 mL 시험관에 받는다. 이 유출액을 40℃ 이하 수욕상에서 질소 농축한 후 잔류물에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v)을 가하여 최종부피를 1 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5(30 m × 0.25 mm, 0.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 가스 및 유량: N2, 1 mL/min

(3) 주입부 온도 : 260℃

(4) 오븐 온도 : 80℃에서 시험용액을 주입한 후 2분간 유지하고 10℃/분의 비율로 280℃까지 상승하여 15분간 유지한다.

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입모드 : split mode(10:1)

(7) 주입량 : 1 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.04, 0.08, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL를 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 테트라메쓰린 피크 1과 2를 합한 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

0

10

5

15

20

25

테트라메쓰린 2

↓

테트라메쓰린 1

머무름 시간(분)

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

테트라메쓰린 1(21.6분), 테트라메쓰린 2(21.8분)

라) 정량한계

0.02 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 테트라메쓰린 피크 1과 2를 합한 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

기체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 테트라메쓰린을 확인한다.

가) 기체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5ms(30 m × 0.25 mm, 0.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 가스 및 유량 : He, 1 mL/min

(3) 주입부 온도 : 260℃

(4) 오븐 온도 : 80℃에서 시험용액을 주입한 후 2분간 유지하고 10℃/분의 비율로 280℃까지 상승하여 15분간 유지한다.

(5) 인터페이스 온도 : 250℃

(6) 이온원 온도 : 200℃

(7) 주입모드 : splitless mode

(8) 주입량 : 1 μL

(9) 분자량 범위 : 50～350

표 1. 기체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
21.1, 21.2	331	164, 123, 81

부  칙(2010.1.7)

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(유효기간) 제 2. 3. 12)와 제 5. 개별 기준 및 규격의 29. 기타 식품류 중 29-7. 4) (2) 로얄젤리가공식품, 29-19 버섯가공식품, 29-20 자라가공식품, 29-21 효모식품, 29-22 효소식품, 29-23 화분가공식품 중 캡슐 또는 정제 형태로 이들 제품을 제조할 수 있다는 규정은 2012년 12월 31일까지 효력을 가진다.

현  행

개  정

제 1. (생 략)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (생 략)

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ～ (7) (생 략)

(8) 화분 함유제품에 사용되는 화분은 꿀벌에 의해 채취된 것이나 또는 기타의 방법으로 채취된 것으로 이물이 섞여 있지 않는 것이어야 한다.

(9) 효소 함유제품의 배양과 식물추출물발효물 함유제품의 제조시 사용하는 미생물은 안전성이 인정되는 것이어야 한다.

(10) ～ (20) (생 략)

3. 제조·가공기준

1) ～ 11) (생 략)

12) 캡슐 또는 정제형태로 제조할 수 없다. 다만, 과자류, 초콜릿류, 식염, 장류, 복합조미식품, 당류가공품은 정제형태로, 식용유지류 및 식용유지가공품은 캡슐형태로 제조할 수 있으나 이 경우 의약품으로 오인․혼동할 우려가 없도록 하여야 한다.

13) ～ 18) (생 략)

4. ～ 6. (생 략)

제 3. ～ 제 4. (생 략)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) ～ (5) (생 략)

(6) 세균수

① 과자, 캔디류 : 1 g 당 10,000 이하

(밀봉제품에 한하며, 유산균함유제품은 제외한다)

2. ～ 28. (생 략)

29. 기타 식품류

29-1 ～ 29-6 (생 략)

29-7 벌꿀

1) 정의

벌꿀이라 함은 꿀벌들이 꽃꿀을 채집하여 벌집에 저장한 것을 채밀한 것으로, 채밀 후 화분, 로얄젤리, 당류, 감미료 등 일절 다른 물질을 첨가하지 아니한 것을 말한다.

2) ～ 3) (생 략)

4) 식품유형

<신 설>

<신 설>

5) 규격

<신 설>

(1) ～ (9) (생 략)

<신 설>

6) 시험방법

<신 설>

(1) ～ (8) (생 략)

29-8 ～ 29-18 (현행과 같음)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

제 6. ～ 제 9. (생 략)

제 10. 일반시험법

1. ～ 3.  (생  략)

4. 식품중 잔류농약 분석법

4.1.4 단성분 분석법

(individual residue methods)

4.1.4.1 ～ 4.1.4.136 (생 략)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

4.2 ～ 4.3 (생  략)

5. ～ 9.  (생  략)

제 11. ～ 제 12.  (생  략)

[별표 1] ～ [별표 7] (생  략)

제 1. (현행과 같음)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (현행과 같음)

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ～ (7) (현행과 같음)

<삭 제>

<삭 제>

(8) ～ (18) (현행 (10)부터 (20)까지와 같음)

3. 제조·가공기준

1) ～ 11) (현행과 같음)

12) --------------------------

-------------------------

-------------------------

-------------------------

-------------------------

캡슐형태로, 로얄젤리가공식품, 버섯가공식품, 자라가공식품, 효모식품, 효소식품, 화분가공식품은 정제 또는 캡슐형태로 제조할 수 있으나 이 경우 의약품으로 오인․혼동할 우려가 없도록 하여야 한다.

13) ～ 18) (현행과 같음)

4. ～ 6. (현행과 같음)

제 3. ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (5) (현행과 같음)

(6) 세균수

① 과자, 캔디류 : 1 g 당 10,000 이하

(--------------- 발효제품 또는 유산균 함유제품은 ------)

2. ～ 28. (현행과 같음)

29. 기타 식품류

29-1 ～ 29-6 (현행과 같음)

29-7 벌꿀류

1) 정의

벌꿀류란 꿀벌들이 꽃꿀, 수액 등 자연물을 채집하여 벌집에 저장한 것을 채밀한 것 또는 일벌의 인두선에서 분비되는 분비물을 그대로 또는 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) ～ 3) (현행과 같음)

4) 식품유형

(1) 벌꿀

꿀벌들이 꽃꿀, 수액 등 자연물을 채집하여 벌집에 저장한 것을 채밀한 것으로, 채밀 후 화분, 로얄젤리, 당류, 감미료 등 다른 식품이나 식품첨가물을 첨가하지 아니한 것을 말한다.

(2) 로얄젤리가공식품

① 생로얄젤리

일벌의 인두선에서 분비되는 분비물인 로얄젤리를 식용에 적합하도록 이물을 제거한 것

② 동결건조로얄젤리

생로얄젤리를 동결건조한 것

③ 로얄젤리제품

위 ①, ② 외의 로얄젤리가공식품으로 로얄젤리(생로얄젤리 35.0% 이상, 동결건조로얄젤리 14.0% 이상)를 제조․가공한것

5) 규격

(1) 벌꿀

① ～ ⑨ (현행 (1)부터 (9)까지와 같음)

(2) 로얄젤리가공식품

유형 항목	생로얄젤리	동결건조 로얄젤리	로얄젤리 제품
① 10-히드록시-2-데센산(%)	1.6 이상	4.0 이상	0.56 이상
② 수분(%)	65.5～68.5	5.0 이하	-
③ 조단백질(%)	11.0～14.5	30.0～41.0	-
④ 산도(1 N NaOH mL/100 g)	32～53	-	-
⑤ 대장균	음성	음성	음성
⑥ 붕해시험	적합하여야 한다(정제 또는 캡슐제품에 한한다. 단 씹어먹는 것은 제외한다.).

6) 시험방법

(1) 벌꿀

① ～ ⑧ (현행 (1)부터 (8)까지와  같음)

(2) 로얄젤리가공식품

① 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)

㉮ 장치

고속액체크로마토그래프

㉯ 표준용액의 조제

10ꠀHDA 표준품을 황산데시케이타에서 건조시킨 후 약 50 mg을 정밀히 취하여 넣고 메탄올로 녹여 50 mL로 한 것을 표준원액(1,000 ppm)으로 하여 필요시 희석하여 사용한다.

㉰ 시험용액의 조제

10ꠀHDA로서 48 mg에 해당하는 양의 검체(연질캡슐 제품은 내용물과 피막을 함께 취한다)를 취하여 500 mL 용량 플라스크에 넣고, 물 약 50 mL를 넣어 50℃로 가온하고 진탕 혼화하고, 연질캡슐은 피막과 내용물을 균질하게 혼화시킨 후 메탄올 약 350 mL를 넣어 약 30분간 초음파 진탕 추출하고 메탄올을 넣어 500 mL로 한다. 이 액을 여과하여 검액으로 한다.

캡슐 제품의 경우에는 20캡슐 이상을 취하여, 캡슐을 절개하고 개개의 내용물의 무게를 정밀하게 달아 평균무게를 구하여 1캡슐의 평균무게로 한다.

㉱ 시험조작

Ⓐ 고속액체크로마토그래피 측정조건

ⓐ 칼럼∶μ—Bondapak C18 또는 이와 유사한 칼럼

ⓑ 이동상∶0.02 M (NH4)2HPO4‧메탄올(7∶3) 혼합액(단, 인산을 가하여 pH 7.0으로 조정한다)

ⓒ 검출기∶UV 214 nm

ⓓ 유속∶1.4 mL/min

(유속은 10ꠀHDA 주피크의 유지시간이 7～10분 되도록 적절히 조정한다).

Ⓑ 정량시험

검액 및 표준액 10 μL 를 액체크로마토그래프내에 주입하여 10ꠀHDA의 그래프를 얻는다. 이 그래프를 표준 그래프와 비교하여 10ꠀHDA에 해당하는 피크를 확인한다. 10ꠀHDA의 함량은 피크의 면적 또는 높이로 다음 식에 따라 산출한다.

<계 산>

10ꠀHDA 함량(%) ＝

검액 중의 10-HDA의 피크면적	×	표준품 취한 량(mg)	×100
표준액중의 10-HDA의 피크면적		검체채취량(mg)

② 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법   1.1.1 수분 1.1.1.3 칼피셔법에 따라 시험한다. 또는 칭량병에 정제해사(20～40메쉬의 것)를 약 절반정도 채우고 유리봉을 넣어 항량시킨 후 이에 검체 2～3 g을 정밀히 달아 넣고 유리봉으로 잘 혼합한 후 이를 70±2℃의 감압건조기에 넣고 25±5 mmHg로 감압하여 4시간 건조시킨다.

건조 후 데시케이타에서 약 30분간 항량시킨 후 다음 식에 따라 수분함량을 구한다.

수분(%) =	B-C	× 100
	B-A

A∶칭량병(해사, 유리봉 포함)무게(g)

B∶검체 및 칭량병 무게(g)

C∶건조 후 무게(g)

③ 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법   1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

④ 산도

검체 0.5 g에 탄산가스를 함유하지 않은 물 50 mL를 가하고 페놀프탈레인 시액 0.5  mL를 가하여 0.1 N 수산화나트륨용액으로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정한다.

산도(1 N NaOH mL/100 g) ＝	a × f × 10
	검체채취량(g)

a∶0.1 N NaOH 용액의 소비  mL수

f∶0.1 N NaOH 용액의 역가

⑤ 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

⑥ 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

29-8 ～ 29-18 (현행과 같음)

29-19 버섯가공식품

1) 정의

버섯가공식품이란 영지, 운지 또는 표고버섯 자실체의 건조물을 분말로 한 것 또는 자실체나 이들의 균사체 배양물의 추출물을 식용에 적합하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

3) 제조·가공기준

(1) 자실체를 직접 식용으로 하는 경우 소화기 내에서 유효성분의 용출이 용이하도록 미세하게 분말로 하여야 한다.

(2) 추출에 사용되는 주정은 농축과정에서 충분히 제거되어야 한다.

(3) 배양에 사용된 배지성분의 잔존량은 건조배양물의 10% 이하이어야 한다.

4) 식품유형

(1) 버섯자실체가공식품

영지, 운지 또는 표고버섯의 자실체의 건조물을 분말화하거나 자실체를 추출하여 가공한 것으로 자실체가 30% 이상(자실체추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)인 것을 말한다.

(2) 버섯균사체가공식품

영지, 운지 또는 표고버섯의 균사체 배양물을 추출하여 가공한 것으로 균사체가 50% 이상(균사체 배양물 추출물의 경우에는 균사체 배양물의 건조물로 환산)인 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	버섯자실체가공식품	버섯균사체가공식품
(1) 수분(%)	7.0 이하(액상제품은 제외한다)
(2) 자실체(%)	30.0 이상(추출물의 경우 자실체의 건조물로 환산)	-
(3) 균사체(%)	-	50.0 이상(추출물의 경우 균사체 배양물의 건조물로 환산)
(4) 타르색소	검출되어서는 아니된다.
(5) 대장균군	음성	음성
(6) 붕해시험	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 자실체 또는 균사체 함량

① 영지버섯제품

㉮ 산성클로로포름 가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후 추출물은 가온하여 녹인다. 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압농축하여 전량을 10 mL이하로 한다.

농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH  3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 조제검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건조물 약 10 g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포름을 감압하에 날려보내고 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 검체 3～10 mg을 정확히 달아 내부 표준용액 1 mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3～10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10 μL씩을 다음의 조건하에서 고속액체크로마토그래피하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건

ⓐ 자실체 가공제품의 경우

— 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1 mg/ mL)

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶40℃

— 이동상∶2% 초산수용액‧아세토니트릴(2∶1)

— 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

— 칼럼의 선택∶표준용액 10 μL에 대해 상기 조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 2.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 A (Ganoderic acid A)>과 내부표준물질의 분리도가 2.0 이상의 것을 사용한다.

ⓑ 배양물을 가공한 제품의 경우

— 내부표준용액∶파이렌의 에탄올 용액(10 μg/mL )

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장∶210 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화 실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶실온

— 이동상∶(pH 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액)‧에탄올의 혼액(9:20)

— 유량∶파이렌의 머무름시간이 약 30분이 되도록 조정한다.

— 칼럼의 선택∶표준용액 10 μL에 대해 상기조건에서 조작할 때 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 1.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 S(Ganoderic acid S)>과 내부표준물질의 분리도가 6.0 이상의 것을 사용한다.

Ⓒ 정량시험

㉠ 자실체 또는 배양물을 가공한 제품의 경우

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거하여 구한다.

영지함유율(건조물환산율 %)＝	검체의 산성클로로포름 가용분(mg)	×100
	검체채취량(g)
	표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)
	표준자실체 또는 표준배양물의 건조물량(g)

㉡ 자실체와 배양물을 혼합하여 가공한 제품의 경우

확인시험에 의해 얻은 검체 및 표준물질의 액체크로마토그램의 내부표준물질이 피크 면적에 대한 지표물질(자실체에 있어서는 가노데린산 A 배양물에 있어서는 가노데린산 S)의 피크 면적비와 QtA, QsA 및 QtS, QsS를 구하여 다음식에 의거 계산한다.

영지의 함유율(건조물 환산율)(%) ＝ <영지자실체 함유율(M)>＋<영지배양물함유율(N)>

M＝	QtA(조제검체)/검체채취량(g)	×100
	QsA(표준물질)/표준자실체건조물량(g)

N＝	QtS(조제검체)/검체채취량(g)	×100(%)
	QsS(표준물질)/표준배양물의 건조물량(g)

② 운지버섯제품

㉮ 산성클로로포름가용분에 의한 확인 및 정량

Ⓐ 검체 및 표준물질의 조제

㉠ 검체의 조제

제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고, 물 100 mL를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물을 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL 이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다.  물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하고 이를 조제검체로 한다.

㉡ 표준물질의 조제

해당 제품의 원료 자실체 건조물의 분말 또는 배양물의 건조물 약 10 g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 mL를 가하여 냉각판을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출한 후(추출물은 가온하여 녹인다) 이에 에탄올 100 mL를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다. 잔류물은 물∶에탄올(1∶1) 200 mL로 30분간 진탕하여 추출한다. 여액을 합하여 감압하에 농축하여 전량을 10 mL이하로 한다. 농축물을 물 200 mL에 분산하여 2 N 염산으로 pH 3으로 한 후 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 mL씩으로 3회 추출한다. 물층을 합하여 2 N 염산으로 pH 3으로 조정하여 클로로포름 50 mL씩으로 3회 추출한다. 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮겨 클로로포름을 감압하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔)중에서 24시간 건조한 후 그 무게를 구하여 이를 조제표준물질로 한다.

Ⓑ 확인시험

제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제검체 3～10 mg을 정밀히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 검액으로 한다. 별도로 원료운지버섯의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 조제표준물질 3～10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 mL를 정확히 가해 표준용액으로 한다.

검액 및 표준용액 10 μL씩을 다음의 조건하에 고속액체크로마토그래프를 할 때 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다.

㉠ 고속액체크로마토그래피 조건

— 내부표준용액∶티몰의 에탄올 용액(1 mg/ mL)

— 검출기∶자외흡광광도계(측정파장 254 nm)

— 칼럼∶내경 4 mm, 길이 25～30 cm의 스테인레스관에 5～10 μm의 옥타데실화실리카겔(μꠀBondapak C18 상당품)을 충전한 것

— 칼럼온도∶40℃

— 이동상∶2% 초산수용액∶아세토니트릴(2∶1)

— 유량∶티몰의 머무름시간이 약 40분이 되도록 조정한다.

Ⓒ 정량시험

검체 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음식에 의거 함량을 구한다.

운지자실체 또는 균사체(건조물환산율)(%) =	검체의 산성클로로포름 가용분(mg)	×100
	검체의 채취량(g)
	표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg)
	표준자실체 또는 표준 배양추출물의 건조물량(g)

③ 표고버섯제품

㉮ 장치

Ⓐ 전개조∶200 mm×200 mm 유리판의 사용이 가능한 유리재질로 기밀한 것

Ⓑ 실리카겔박층판∶박층크로마토그래피용 실리카겔 30 g에 물 50 mL를 가하여 섞은 후 유리판(200 mm×200 mm)에 0.3～0.5 mm의 두께로 도포한다. 풍건 후 105～110℃에서 3시간 건조하고 데시케이타중에서 방냉하여 보존한다.

Ⓒ 자외선등(365 nm)∶탁상형 또는 휴대형

㉯ 시약

Ⓐ 무수에탄올(특급)

Ⓑ 1 N 암모니아용액∶농암모니아수(28%) 67 mL를 취하여 물을 가해 1 L로 한다.

Ⓒ 0.5 N 초산용액∶초산(특급) 29 mL를 취해 물을 가해 1 L로 한다.

Ⓓ 전개용매∶nꠀ부탄올(특급), 초산(특급), 증류수를 4∶1∶2(용량비)로 혼합한다.

Ⓔ 이온교환수지∶Amberlite IRꠀ120B(H형), Amberlite IRAꠀ45(OH형)

Ⓕ 닌히드린용액∶물로 포화시킨 nꠀ부탄올에 닌히드린(특급)을 용해하여 0.2%로 한 용액

㉰ 표준용액의 조제

Ⓐ 표준물질의 조제∶원료인 건조표고버섯 및 관리배양한 표고균사 10 g을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액을 모아 감압농축하여 액량을 20 mL로 한다.

Ⓑ 표준용액의 조제∶표준물질에 4배량의 무수에탄올을 가해 80% 에탄올용액으로 하고 생성한 침전을 원심분리하여 제거한다. 상등액을 감압농축하여 에탄올을 제거하고, 분액여두에 옮겨 동량의 에테르로 2회 추출하고 그 에테르층을 제거한다. 에테르를 완전히 제거한 후 물층에 10 g의 Amberlite IRꠀ120B(H형)을 가해 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착된 수지를 물로 세척한 후 1 N NH4OH를 20 mL 가하여 30분간 진탕하여 용출시킨다. 용출 후 10 g의 Amberlite IRAꠀ45(OH형)을 가하고 30분간 진탕하여 흡착시킨다. 흡착시킨 수지를 물로 씻어낸 후 0.5 N CH3COOH 20 mL로 30분간 흔들어서 용출시킨 후 이것을 2～3회 반복하여 용출액을 모아 감압농축하여 전량을 1 mL로 하여 표준용액으로 한다.

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 검체의 조제∶원료표고버섯 자실체 또는 인공적으로 관리배양한 균사의 가공분말 또는 이들을 가공한 제품의 경우에는 원료의 10 g에 해당하는 제품을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가해 냉각관이 부착된 고무마개를 하여 90～100℃에서 4시간 환류하여 추출하고 추출액은 합하여 감압농축하여 액량을 20  mL로 한다. 단, 원료가 표고버섯의 자실체 및 인공적으로 관리배양한 균사의 추출물인 경우에는 원료 10 g 상당의 제품에 20 mL의 물을 가해 용해 또는 현탁한다.

Ⓑ 시험용액의 조제∶③ 표준용액의 조제 Ⓑ 표준용액의 조제와 동일한 방법으로 실험하여 시험용액을 준비한다.

㉲ 시험조작

표준용액 및 시험용액을 실리카겔박층판(200 mm×200 mm)에 각각 20 μL씩 직경 3～5 mm로 점적한 후 전개조에서 전개시킨다. 전개된 실리카겔박층판은 풍건한 후 닌히드린용액을 분무하여 90～100℃에서 수분간 가열하여 발색한 후 발색부에 자외선(365 nm)를 조사하여 형광의 반점(Elidadenin)을 비교 확인한다. 별도로 조작하여 얻은 박층판의 동일 반점부위를 긁어모아 에탄올 일정량을 가하여 추출하고 원심분리하여 액층 1 cm, 파장 253.6 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 구한다.

(3) 타르색소

제10. 일반시험법 2. 식품 중 식품첨가물시험법 2.4 착색료에 따라 시험한다.

(4) 대장균군

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.7 대장균군에 따라 시험한다.

(5) 붕해시험

제10. 일반시험법 9.일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

29-20 자라가공식품

1) 정의

자라가공식품이란 식용으로 양식한 자라를 식용에 적합하도록 가공한 것 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 자라는 청결히 양식된 것이어야 하며, 품질이 양호하고 변질되지 아니한 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 자라분말

식용양식자라의 가식부위 전체 또는 일부 지방을 제거한 것으로 동결건조 또는 열풍건조하여 분말화한 것을 말한다.

(2) 자라분말제품

동결건조자라분말 또는 열풍건조자라분말을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 자라유제품

자라유를 주원료(98.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다(자라유 포함).

5) 규격

유형 항목	자라분말	자라분말 제품	자라유제품
(1) 수분(%)	5.0 이하	10.0 이하	-
(2) 회분(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	16.0～40.0 20.0～40.0	4.8 이상 6.0 이상	-
(3) 조단백질(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	48.0～58.0 50.0～70.0	14.0 이상 15.0 이상	-
(4) 히드록시프롤린(%) ①동결건조품 ②열풍건조품	1.0 이상 2.0 이상	0.3 이상 0.6 이상	-
(5) 조지방(%)	-	-	95.0 이상
(6) 산가	-	-	1.0 이하
(7) 과산화물가	-	-	15.0 이하
(8) 팔밑올레산(%)	-	-	8.0～18.0
(9) 아라키돈산+에이코사펜타엔산(%)	-	-	2.0～8.0
(10) 대장균군	음성	음성	음성
(11) 붕해시험		적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 회분

10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.2 회분에 따라 시험한다.

(3) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(4) 히드록시프롤린

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.3 아미노산에 따라 시험한다.

(5) 조지방

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.1 조지방에 따라 시험한다.

(6) 산가

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.3 화학적 시험 1.1.5.3.1 산가에 따라 시험한다.

(7) 과산화물가

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.3 화학적 시험 1.1.5.3.5 과산화물가에 따라 시험한다.

(8) 팔밑올레산

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.4 지방산에 따라 시험한다. 단, 표준품은 팔밑올레산을 사용한다.

(9) 아라키돈산+에이코사펜타엔산

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.5 지질 1.1.5.4 지방산에 따라 시험한다. 단, 표준품은 아라키돈산을 추가하여 시험한다.

(10) 대장균군

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.7 대장균군에 따라 시험한다.

(11) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

29-21 효모식품

1) 정의

효모식품이란 식용효모 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 건조효모

식용 효모균주를 분리, 정제하여 건조한 것을 말한다.

(2) 건조효모제품

건조효모를 주원료(60.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 효모추출물제품

식용 효모균주를 분리, 정제한 후 자가소화, 효소분해, 열수추출 등의 방법에 의해 추출한 식용효모추출물을 주원료(고형분함량으로 30.0% 이상. 단, 액상제품은 고형분 함량으로 15.0% 이상)로 하여 제조한 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	건조효모	건조효모제품, 효모추출물제품
(1) 수분(%)	8.0 이하	10.0 이하 (액상제품은 제외한다)
(2) 조단백질(%)	40.0 이상	24.0 이상 (건조효모제품) 10.0 이상(효모추출물 제품 단, 액상제품은 5.0 이상)
(3) 대장균	음성	음성
(4) 붕해시험	-	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(4) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

29-22 효소식품

1) 정의

효소식품이란 식물성 원료에 식용미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 배양에 사용되는 미생물은 안전한 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 곡류효소함유제품

곡류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(2) 배아효소함유제품

곡물의 배아(40.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(3) 과·채류효소함유제품

과·채류(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(4) 기타식물효소함유제품

곡류, 곡물배아 또는 과·채류 이외의 식물성 원료(60.0% 이상)에 식용미생물을 배양시키거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료(50.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

5) 규격

(1) 수분(%) : 10.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)

(2) 조단백질(%) : 10.0 이상

(3) α-아밀라아제 : 양성이어야 한다.

(4) 프로테아제 : 양성이어야 한다.

(5) 대장균 : 음성이어야 한다.

(6) 붕해시험 : 적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) α-아밀라아제

① 시약

㉮ 1% 가용성전분용액∶가용성전분(최순품) 1 g을 물에 녹이고 호화하여 100 mL로 한다.

㉯ 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0)∶0.1 N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1 N 구연산액을 넣어 pH 6.0 및 7.0으로 각각 만든다.

㉰ 0.1% 염화칼슘용액∶염화칼슘(순품) 1 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉱ 요오드시액∶요오드 0.2 g과 요오드칼륨 2 g을 물에 녹여 100 mL로 하고 그 1  mL에 1 N 염산 1 mL를 넣고 물로 100 mL로 한다.

② 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

③ 시험용액의 조제

검체 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20 mL 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성전분용액 5 mL, 맥바인완충액(pH 6.0 또는 7.0으로서) 13 mL와 0.1% 염화칼슘용액 1 mL를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1 mL를 넣은 후 37℃에서 30분간 방치한다. 별도로 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1 mL를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용반응액 0.2 mL에 요오드시액 10 mL를 넣은 것을 시험용액으로 한다.

④ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

(4) 프로테아제

① 시약

㉮ 0.6% 카제인용액∶카제인(최순품)을 건조하여 0.6 g을 달아 0.1 N 수산화나트륨액 20 mL에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1 M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20 mL를 넣어 100 mL로 한다.

㉯ 0.4 M 삼염화초산액∶삼염화초산(순품) 65.4 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉰ 0.4 M 탄산나트륨액∶탄산나트륨(순품) 42.5 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

㉱ 포린시액∶식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.

㉲ 완충액∶0.1 M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1 M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0)

② 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

③ 시험용액의 조제

검체 약 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1 mL를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1 mL를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1 mL를 시험관에 정확히 취하여 0.4 M 탄산나트륨용액 5 mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1 mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인용액 1 mL를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.

④ 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm, 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.

(5) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(6) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

29-23 화분가공식품

1) 정의

화분가공식품이란 화분에 껍질 파쇄, 추출·농축·정제 등의 공정을 거친 것 또는 이를 주원료로 하여 가공한 것을 말한다.

2) 원료 등의 구비요건

(1) 화분은 꿀벌에 의해 채취된 것이나 또는 기타의 방법으로 채취된 것으로 이물이 섞여 있지 않는 것이어야 한다.

3) 제조·가공기준

4) 식품유형

(1) 가공화분

꿀벌 또는 인공적으로 채취한 화분에서 이물을 제거하고 껍질을 파쇄한 것을 말한다.

(2) 화분추출물

화분을 기계적으로 파쇄 또는 효소처리하여 추출한 것을 농축하거나 분말화 한 것을 말한다.

(3) 화분제품

화분을 주원료(30.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

(4) 화분추출물제품

화분추출물을 주원료(고형분으로서 10.0% 이상)로 하여 제조·가공한 것을 말한다.

5) 규격

유형 항목	가공화분	화분추출물	화분제품, 화분추출물제품
(1) 수분(%)	8.0 이하	8.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)	10.0 이하(단, 액상제품은 제외한다.)
(2) 조단백질(%)	18.0 이상	20.0 이상 (건조물로 환산)	5.0 이상 (화분제품), 2.0 이상 (화분추출물제품)
(3) 타르색소	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.	검출되어서는 아니된다.
(4) 대장균	음성	음성	음성
(5) 붕해시험	-	-	적합하여야 한다(정제, 캡슐에 한한다. 단, 씹어먹는 것은 제외한다).

6) 시험방법

(1) 수분

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.1 수분에 따라 시험한다.

(2) 조단백질

제10. 일반시험법 1. 식품성분시험법 1.1 일반성분시험법 1.1.3 질소화합물 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 시험한다.

(3) 타르색소

제10. 일반시험법 2. 식품 중 식품첨가물시험법 2.4 착색료에 따라 시험한다.

(4) 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

(5) 붕해시험

제10. 일반시험법 9. 일반시험법 9.6 붕해시험에 따라 시험한다.

제 6. ～ 제 9. (현행과 같음)

제10. 일반시험법

1. ～ 3. (현행과 같음)

4. 식품중 잔류농약 분석법

4.1.4 단성분 분석법

(individual residue methods)

4.1.4.1 ～ 4.1.4.136 (현행과 같음)

4.1.4.137 사이에노피라펜(Cyenopyrafen)

1) 시험법 적용범위

과실류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 사이에노피라펜을 아세톤으로 추출하고 후로리실로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프-자외부흡광검출기 (HPLC-UVD, High Performance Liquid Chromatograph-Ultraviolet Detector)를 사용한다.

나) 액체크로마토그래프-질량분석기(HPLC-MS, High Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 사이에노피라펜 표준품을 아세토니트릴에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 후로리실(Florisil) : 칼럼크로마토그래피용 후로리실(60∼100 mesh) 10 g을 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 식혀 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 25 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 아세톤 100 mL를 가하여 3분간 균질화한다. 부흐너깔때기로 흡입여과하고 아세톤 40 mL로 잔사 및 용기를 씻어 상기 여액과 합하여 분액깔때기에 옮기고 증류수 450 mL, 포화식염수 50 mL 및 디클로로메탄/헥산 혼합액(20/80, v/v) 100 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한다. 유기용매층(상층)을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수하고 감압농축플라스크에 취하여 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 헥산 10 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

안지름 15 mm, 길이 400 mm의 유리칼럼에 후로리실 10 g과 무수황산나트륨 2 g을 차례로 충진한 후 헥산 25 mL를 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘가) 추출’로부터 얻은 헥산 용액 10 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 디클로로메탄 100 mL를 가하여 유출시켜 버리고 다시 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 100 mL로 유출시켜 감압농축플라스크에 취한다. 이 유출액을 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)을 가하여 최종부피를 5 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)

(3) 이동상 유량 : 1 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 검출파장 : 297 nm

(6) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL를 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

머무름 시간(분)

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

사이에노피라펜 (9.9분)

라) 정량한계

0.02 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 사이에노피라펜을 확인한다.

가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 물/아세토니트릴 혼합액(20/80, v/v)

(3) 이동상 유량 : 0.5 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 주입량 : 2 μL

(6) 이온화 : ESI positive-ion mode

(7) 콘 볼테이지 : 50 V

(8) 분자량 범위 : 300∼500 m/z

표 1. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름 시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
23.1	393	394

4.1.4.138 프로헥사디온칼슘

(Prohexadione-calcium)

1) 시험법 적용범위

채소류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 프로헥사디온을 산성화 아세토니트릴로 추출하고 음이온 교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프-자외부흡광검출기(HPLC-UVD, High Performance Liquid Chromatograph-Ultraviolet Detector)를 사용한다.

나) 액체크로마토그래프-질량분석기(HPLC-MS, High Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 및 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 프로헥사디온칼슘 표준품을 메탄올에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)으로 희석하여 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 0.02 M 초산암모늄(ammonium acetate) 용액 : 초산암모늄 0.16 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

바) 5% 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate) 용액 : 인산수소이나트륨 5 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

사) 1% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 1 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

아) 0.2% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 0.2 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

자) 음이온 교환 카트리지 : 음이온 교환 수지 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지(500 mg, 6 cc)를 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 20 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 5 N 황산 용액 1 mL와 아세토니트릴 100 mL를 가하여 3분간 균질화한다. 부흐너깔때기로 흡입여과하고 아세토니트릴 40 mL로 잔사 및 용기를 씻어 상기 여액과 합하여 40℃ 이하 수욕상에서 10 mL 정도 남을 때까지 감압농축한 후 5% 인산수소이나트륨 용액 100 mL를 가하여 용해한다. 이를 분액깔때기에 옮기고 헥산 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한 후 물층을 취하여 10 N 인산 용액을 가하여 pH 3으로 맞춘다. 물층에 포화식염수 30 mL와 디클로로메탄 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치하고 디클로로메탄층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 감압농축플라스크에 취한다. 물층에 다시 디클로로메탄 50 mL를 가하여 심하게 흔들어 10분간 정치한 후 디클로로메탄층을 탈수하여 상기 감압농축플라스크에 합한다. 이를 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

음이온 교환 카트리지에 메탄올 5 mL를 넣고 고정상 상단에 소량의 메탄올이 남을 정도까지 유출시켜 버리고 다시 0.02 M 초산암모늄 용액 5 mL를 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘가) 추출’로부터 얻은 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 물 5 mL와 0.02 M 초산암모늄/메탄올 혼합액(80/20, v/v) 5 mL를 각각 가하여 유출시켜 버리고 다시 1% 포름산 용액 9 mL로 유출시켜 10 mL 메스플라스크에 취한다. 이 플라스크에 아세토니트릴을 가하여 최종부피를 10 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)

(3) 이동상 유량 : 1 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 30℃

(5) 검출파장 : 275 nm

(6) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/mL를 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

프로헥사디온

↓

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

머무름 시간(분)

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

프로헥사디온(10.0분)

라) 정량한계

0.01 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 프로헥사디온을 확인한다.

가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : C18(250 × 4.6 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 0.2% 포름산/아세토니트릴 혼합액(70/30, v/v)

(3) 이동상 유량 : 0.5 mL/min

(4) 칼럼 온도 : 40℃

(5) 주입량 : 2 μL

(6) 이온화 : ESI negative-ion mode

(7) 콘 볼테이지 : 25 V

(8) 분자량 범위 : 100∼300 m/z

표 1. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름 시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
17.7	212	211

4.1.4.139 테트라메쓰린(Tetramethrin)

1) 시험법 적용범위

버섯류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 테트라메쓰린을 아세토니트릴로 추출한 후 후로리실로 정제하여 기체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD, Gas Chromatograph - Electron Capture Detector)를 사용한다.

나) 기체크로마토그래프-질량분석기(GC-MS, Gas chromatograph-Mass Spectrometer)를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

나) 물 : 3차 증류수

다) 표준원액 : 테트라메쓰린 표준품을 아세톤에 녹여 500 μg/mL가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 아세톤으로 희석하여 0.04, 0.08, 0.5, 1.0 2.0, 5.0 μg/mL가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 후로리실 카트리지 : 후로리실 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(1 g, 6 cc)를 사용한다.

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 10 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고, 물 30 mL를 가하여 2시간 정치한다. 아세토니트릴 100 mL를 가하여 3분간 균질화한 후 부흐너깔때기로 흡인여과한다. 이 여액을 염화나트륨 15 g이 들어있는 분액깔때기에 옮긴 후 심하게 흔들어 1시간 정치한다. 아세토니트릴층에서 20 mL를 감압농축플라스크에 취하여 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축한 후 잔류물에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 2 mL를 가하여 용해한다.

나) 정제

후로리실 카트리지에 헥산 50 mL를 넣고 고정상 상단에 소량의 헥산이 남을 정도까지 유출시켜 버리고 ‘가) 추출’로부터 얻은 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 2 mL를 고정상 상단에 가하여 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 5 mL로 유출시켜 15 mL 시험관에 받는다. 이 유출액을 40℃ 이하 수욕상에서 질소 농축한 후 잔류물에 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v)을 가하여 최종부피를 1 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 기체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5(30 m × 0.25 mm, 0.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 가스 및 유량: N2, 1 mL/min

(3) 주입부 온도 : 260℃

(4) 오븐 온도 : 80℃에서 시험용액을 주입한 후 2분간 유지하고 10℃/분의 비율로 280℃까지 상승하여 15분간 유지한다.

(5) 검출기 온도 : 280℃

(6) 주입모드 : split mode(10:1)

(7) 주입량 : 1 μL

나) 검량선 작성

표준용액 0.04, 0.08, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 μg/mL를 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 테트라메쓰린 피크 1과 2를 합한 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

머무름 시간(분)

그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 :

테트라메쓰린 1(21.6분), 테트라메쓰린 2(21.8분)

라) 정량한계

0.02 mg/kg

7) 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 테트라메쓰린 피크 1과 2를 합한 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8) 확인시험

기체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 테트라메쓰린을 확인한다.

가) 기체크로마토그래프-질량분석기의 측정조건

(1) 칼럼 : DB-5ms(30 m × 0.25 mm, 0.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 가스 및 유량 : He, 1 mL/min

(3) 주입부 온도 : 260℃

(4) 오븐 온도 : 80℃에서 시험용액을 주입한 후 2분간 유지하고 10℃/분의 비율로 280℃까지 상승하여 15분간 유지한다.

(5) 인터페이스 온도 : 250℃

(6) 이온원 온도 : 200℃

(7) 주입모드 : splitless mode

(8) 주입량 : 1 μL

(9) 분자량 범위 : 50～350

표 1. 기체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

머무름시간(분)	분자량(MW)	이온(m/z)
21.1, 21.2	331	164, 123, 81

4.2 ～ 4.3 (현행과 같음)

5. ～ 9. (현행과 같음)

제 11. ～ 제 12. (현행과 같음)

[별표 1] ～ [별표 7] (현행과 같음)

신․구조문 대비표