식품의약품안전청 고시 제2010-45호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

2010. 6. 16.

식품의약품안전청

식품의약품안전청 고시 제2010-45호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

1. 개정이유

건조향신료 및 그 단순가공품에 대한 총아플라톡신, 신종 발기부전치료제 유사물질인 클로로데나필 및 신나밀데나필 기준을 신설하고 즉석섭취식품 및 신선편의식품 중 클로스트리디움 퍼프린젠스, 신선편의식품의 대장균 및 대장균 O157:H7 규격을 개정하고, 어류머리 및 어류 부산물의 안전관리기준을 신설하여 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함. 또한  즉석섭취․편의식품류의 장염비브리오균에 대한 규격적용 범위를 명확히 하고 면류의 식품유형 정의 및 품목을 확대하여 합리적으로 개선하고 노로바이러스 시험법을 개정하여 식품용수의 안전관리를 강화하고자 함.

2. 주요내용

가. 곰팡이독소 기준 및 시험법 개정 및 신설 [제2, 5, 8), (1) 및 제10, 6.1.1, 6.1.6, 6.1.7]

(1) 아열대지역으로부터의 식품 수입량 증가, 기후 온난화 등으로 곰팡이독소 관리 강화가 요구됨

(2) 육두구, 심황(강황), 건조고추 및 건조파프리카와 이를 함유한 천연향신료, 카레분에 대한 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합) 기준을 15 ㎍/kg 이하(아플라톡신 B1은 10 ㎍/kg이하)로, 곡류 및 그 단순가공품과 옥수수 및 그 단순가공품에 대한 데옥시니발레놀 기준을 각각 1 mg/kg 및 2 mg/kg로, 곡류 및 그 단순가공품에 대한 제랄레논 기준을 200 μg/kg 이하로 신설하고 관련 시험법 개정 및 신설

(3) 식품의 곰팡이독소에 대한 안전성을 확보함

나. 신종 발기부전치료제 유사물질 기준 및 시험법 추가 [제2, 5, 12),(2)] 및 [제10, 7.4]

(1) 발기부전치료제는 의사의 처방에 따라 복용해야 하는 전문의약품임에도 불구하고 이와 유사한 물질을 합성·제조하여 식품에 혼입하는 사례가 발생함에 따라 유사물질에 대한 기준 추가 필요

(2) 새로운 발기부전치료제 유사물질인 클로로데나필 및 신나밀데나필에 대한 기준 추가

(3) 발기부전치료제 유사물질 혼입식품에 대한 안전성 확보

다. 면류의 정의 및 식품유형 개선 [제5, 15, 4)]

(1) 면류의 정의 중 주원료 범위를 곡분으로만 제한하고 있고 수제비 및 만두피를 국수로 분류하고 있어, 현실적으로 정의 확대 및 식품유형 개선 필요

라. 즉석섭취·편의식품 중 대장균 및 장염비브리오 등 식중독균 규격 신설 및 개정[제5, 29, 29-18, 5) 및 6)]

(1) 즉석섭취식품 및 신선편의식품의 원료 및 제조 특성을 감안하여 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 규격을 정량화하고 장염비브리오균의 규격 적용 범위를 명확히 하는 한편 신선편의식품의 안전관리강화를 위해 병원성 대장균(O157:H7) 규격 신설 필요성 있음

(2) 신선편의식품 중 대장균 규격을 1 g 당 10 이하로, 병원성 대장균(O157:H7) 규격을 음성으로 신설하며, 즉석섭취식품 및 신선편의식품 중 클로스트리디움 퍼프린젠스 규격을 1 g 당 100 이하로 정량규격화하고, 장염비브리오 규격을 해산물 함유제품에 한하여 적용하도록 개정함

(3) 즉석섭취식품 및 신선편의식품의 국제기준과의 조화 및 안전성 확보

마. 냉동식용어류머리 정의 확대 및 위생기준 신설 [제6, 1, 3)]

(1) 국내 어류의 어획량 급감 및 식생활 변화에 따른 다양한 어류의 수입요구가 급증하고 있으나, 현재 냉동식용대구머리를 외에 관리기준이 마련되어 있지 않아 다양한 어류 및 부산물 등 기준마련 필요

(2) 현행 ‘냉동식용대구머리’를 ‘냉동식용어류머리’로 범위 확대 및 위생기준 강화, 어류머리의 범위에 은민대구와 다랑어류의 머리를 추가하고, 식용 가능한 모든 어종의 머리로부터 가식부 등을 잘라 냉동한 부산물 포함, 다랑어류에 대한 중금속, 히스타민(200 mg/kg 이하) 등 안전관리 규격을 신설함

(3) 어류머리 및 어류머리 부산물에 대한 안전성 확보

바. 냉동식용어류내장의 기준 신설 [제6, 1, 4)]

(1) 식생활 변화에 따른 다양한 어류 및 그 부산물의 수입요구가 급증하고 있으나, 현재 창난을 제외하고 관리기준이 마련되어 있지 않아 다양한 어류의 내장유래 부산물의 위생기준 마련 필요

(2) 현재 수입되고 있는 어란, 이리(곤이), 창난, 오징어 난포선 등 어류 등의 내장유래 부산물의 위생적 관리의 필요성이 있어, 이들 내장부산물에 대한 정의, 원료 등의 구비요건, 규격(중금속, 미생물) 등 안전관리기준 마련

(3) 냉동식용어류내장에 대한 안전성 확보

사. 식품제조용수 등의 노로바이러스 시험법 개정 [제10, 3, 3.25, 1), 2), 3)]

(1) 식품제조용수를 이 고시에서 이미 사용하고 있는 용어와 통일시킴

(2) 노로바이러스 검출효능을 높이도록 현행 채수 필터와 동등이상인 필터를 추가 사용하도록 개정

(3) 시험법의 객관성을 높이기 위해 양성대조군 확인방법 개선

3. 기타참고사항

가. 관계법령 : 「식품위생법」 제7조제1항

나. 예산조치 : 별도조치 필요없음

다. 합의 : 해당사항 없음

라. 기타 :  (1) 행정예고 : ’09. 3. 11 ～ ‘09. 4. 10

‘09. 11. 19 ～ ’09. 12. 10

(2) 규제심사 : ‘10. 4. 22

식품의약품안전청 고시 제2010-45호

「식품위생법」 제7조제1항에 따른 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2010-25호, 2010. 4. 30)을 다음과 같이 개정합니다.

2010년 6 월 16일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시

식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제2, 5, 8), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 단순 가공품(분쇄, 절단 등)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
곡류가공품 및 두류가공품(규격외 일반가공식품)
장류(메주 제외), 고춧가루 및 카레분
육두구, 심황(강황), 건조고추, 건조파프리카 및 이를 함유한 천연향신료

제2, 5, 8), (6) 및 (7)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol)

대 상 식 품	기 준
곡류 및 그 단순가공품 (옥수수 및 그 단순가공품 제외)	1 mg/kg 이하
옥수수 및 그 단순가공품	2 mg/kg 이하

(7) 제랄레논(Zearalenone)

대 상 식 품	기 준
곡류 및 그 단순가공품	200 μg/kg 이하

제 2, 5, 12), (2)에  및 을 다음과 같이 신설한다.

클로로데나필(chlorodenafil) : 검출되어서는 아니된다.

신나밀데나필(cinnamyldenafil) : 검출되어서는 아니된다.

제5, 3, 6), (5)를 다음과 같이 신설한다.

(5) 유산균수

제 10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.9 유산균수에 따라 시험한다.

제 5, 15, 1)을 다음과 같이 한다.

면류란 곡분 또는 전분 등을 주원료로 하여 성형, 열처리, 건조 등을 한 것으로 국수, 냉면, 당면, 유탕면류, 파스타류, 기타 면류를 말한다.

제 5, 15, 4), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 국수

곡분 또는 전분 등을 주원료로 하여 제조한 것을 말한다.

제 5, 15, 4) 중 (6)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 기타면류

면류 중 위 식품유형 (1)부터 (5)까지에 정하여지지 아니한 것으로 수제비나 만두피 등을 말한다.

제 5, 17, 6), (5)를 다음과 같이 한다.

(5) 대장균군

제 10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.7 대장균군 3.7.1 정성시험 다. 데스옥시콜레이트 유당한천 배지법에 따라 시험한다.

제5, 29, 29-18, 5), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 대장균 : 1g 당 10 이하 (신선편의식품에 한하며 즉석섭취식품은 음성이어야 한다).

제 5, 29-18, 5), (5)를 다음과 같이 한다.

(5) 장염비브리오균 : 음성이어야 한다(해산물 함유 제품에 한한다).

제5, 29, 29-18, 5) 중 (7) 및 (8)을 다음과 같이 신설한다.

(7) 대장균 O157:H7 : 음성이어야 한다(신선편의식품에 한한다).

(8) 클로스트리디움 퍼프린젠스 : 1 g 당 100 이하(즉석섭취식품, 신선편의식품에 한한다).

제5, 29, 29-18, 6) 중 (7) 및 (8)을 다음과 같이 신설한다.

(7) 대장균 O157:H7

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.16 대장균 O157:H7에 따라 시험한다.

(8) 클로스트리디움 퍼프린젠스

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.14 클로스트리디움 퍼프린젠스 3.14.2 정량시험에 따라 시험한다.

제 6, 1, 1), (2) 중 ②를 삭제한다.

제 6, 1, 3) “냉동식용대구머리”를 “냉동식용어류머리”로 하고 (1)를 다음과 같이 한다.

(1) 정의

냉동식용어류머리란 대구(Gadus morhua, Gadus ogac, Gadus macrocephalus), 은민대구(Merluccius australis) 및 다랑어류의 머리를 가슴지느러미와 배지느러미 부위가 붙어 있는 상태로 절단한 것과 식용 가능한 모든 어종(복어류 제외)의 머리 중 가식부를 분리해 낸 것을 중심부 온도가 -18℃이하가 되도록 급속 냉동한 것으로서 식용에 적합하게 처리된 것을 말한다.

제 6, 1, 3), (2), (가) 중 “세계관세기구”를 “세계관세기구(WCO)”로 한다.

제 6, 1, 3), (2), (가) 중 “식용(HS 0303-52)”를 “식용(HS 0303호)”으로 한다.

제 6, 1, 3), (3) 중 ②를 다음과 같이 한다.

② 중금속

가. 총수은 : 0.5 ㎎/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류는 제외한다)

나. 메틸수은 : 1.0 ㎎/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)

다. 납 : 0.5 ㎎/kg 이하

제 6, 1, 3), (3) 중 ⑥을 다음과 같이 신설한다.

⑥ 히스타민 : 200 mg/kg이하(다랑어류에 한한다)

제 6, 1, 3), (4)를 다음과 같이 한다.

(4) 시험방법

① 총수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.4 수은에 따라 시험한다.

② 메틸수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.7 메틸수은에 따라 시험한다.

③ 납

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.1 납에 따라 시험한다.

④ 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

⑤ 세균수

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.5.1 일반세균수에 따라 시험한다.

⑥ 방사능

제10. 일반시험법 7. 식품 중 유해물질시험법 7.2 방사능에 따라 시험한다.

⑦ 히스타민

제6. 수산물에 대한 규격 2. 시험방법 11) 히스타민에 따라 시험한다.

제 6, 1, 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 냉동식용어류내장

(1) 정의

냉동식용어류내장이란 식용 가능한 어류의 알(복어알은 제외), 창난, 이리(곤이), 오징어 난포선 등을 분리하여 중심부 온도가 -18℃이하가 되도록 급속냉동한 것으로서 식용에 적합하게 처리된 것을 말한다.

(2) 원료 등의 구비요건

(가) 원료는 세계관세기구(WCO)의 통일상품명및부호체계에관한국제협약상 식용(HS 0303호, 0306호 또는 0307호)으로 분류되어 위생적으로 처리된 것이 관련기관에 의해 확인된 것이어야 한다.

(나) 원료의 분리 시 다른 내장은 제거된 것이어야 한다.

(다) 식품첨가물 등 다른 물질을 사용하지 않은 것이어야 한다.

(3) 규격

① 성상 : 적합하여야 한다.

② 중금속

가. 총수은 : 0.5 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류는 제외한다)

나. 메틸수은 : 1.0 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)

다. 납     : 0.5 mg/kg 이하(다만, 연체류는 2.0 mg/kg 이하)

라. 카드뮴 : 2.0 mg/kg 이하(연체류에 한한다)

③ 대장균 : 음성

④ 세균수 : 1 g당 1,000,000이하

(4) 시험방법

① 총수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.4 수은에 따라 시험한다.

② 메틸수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.7 메틸수은에 따라 시험한다.

③ 납

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.1 납에 따라 시험한다.

④ 카드뮴

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.2 카드뮴에 따라 시험한다.

④ 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

⑤ 세균수

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.5.1 일반세균수에 따라 시험한다.

제 6, 2 중 11)를 다음과 같이 신설한다.

11) 히스타민

(1) 시험법 적용범위

수산물 등 식품 중 히스타민(histamine) 분석에 적용한다.

(2) 분석원리

식품 중 히스타민을 염산으로 추출하여 염화단실(dansyl chloride)로 유도체화 한 후 고속액체크로마토그래프를 이용하여 분석한다.

(3) 장치

액체크로마토그래프 : 자외부흡광검출기를 사용한다.

(4) 시약 및 시액

① 아세토니트릴 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 0.1 N 염산 : 10 N 염산을 10 mL 취해 물을 가하여 1 L로 한다.

④ 포화탄산나트륨용액 : 탄산나트륨을 약 46 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

⑤ 1% 염화단실(dansyl chloride)아세톤용액 : 염화단실을 1 g을 취하여 아세톤을 가해 100 mL로 한다.

⑥ 10% 프롤린(proline)용액 : 프롤린 10 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

⑦ 에테르 : 일반시약용 또는 이와 동등 한 것

⑧ 표준원액 : 히스타민을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 1 mg/mL가 되게 한다.

⑨ 내부표준원액 : 1,7-디아미노헵탄(diaminoheptane) 표준품을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 5 mg/mL가 되게 한다.

⑩ 표준용액 : 각각의 표준원액을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

⑪ 내부표준용액 : 내부표준원액에 0.1 N 염산을 가해 100 μg/mL가 되게 한다.

⑫ 검량곡선표준용액 : 표준용액에 0.1N 염산을 가해 적당한 5개 농도(μg/mL)가 되게 조제하여 사용한다.

⑬ 시스템적합성용액 : 캐더버린(cadarverine) 및 히스타민을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

(5) 시험용액의 조제

검체 5 g를 정확하게 취하여 0.1 N 염산 25 mL을 가한 후 균질화하고 이것을 원심분리(4000 G, 4℃, 15 min)한 후 여과하여 취하는 조작을 2회 반복하여 얻은 상층액을 합치고 0.1 N 염산을 가해 50 mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

(6) 유도체화

표준용액 및 시험용액 각각 1 mL을 마개 달린 유리시험관에 취한 다음 내부표준용액 100 μL를 가한 후 포화탄산나트륨용액 0.5 mL와 1% 염화단실아세톤용액 0.8 mL을 가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 유도체화 한다. 유도체화 시킨 표준용액 및 시험용액에 10% 프롤린용액 0.5 mL 및 에테르 5 mL를 가하여 약 10분간 진탕하고 상층액을 취하여 질소 농축한 뒤 아세토니트릴 1 mL를 가하여 여과한 것을 고속액체크로마토그래프로 분석한다.

(7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

① 검출기 : 자외부흡광검출기 (UV), 254 nm

② 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

③ 칼럼온도 : 40℃

④ 이동상 : 아세토니트릴과 물의 혼합액 (55% 아세토니트릴을 최초 10분간 유지 후 15분까지 65%, 20분까지 80%로 하여 5분간 유지 후, 30분까지 90%로 하여 5분간 유지시킨다.)

⑤ 이동상유량 : 1 mL/min

⑥ 시스템적합성 : 시스템적합성용액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 캐더버린, 히스타민의 순서로 유출되고 그 분리도가 1.5 이상이어야 한다.

나) 정성시험

시험용액 크로마토그램 상의 히스타민의 피크 머무름 시간(retention time)은 각각 표준물질의 피크 머무름 시간과 일치하여야 한다.

다) 정량시험

각 표준용액의 표준물질과 내부표준물질의 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 검량곡선표준용액의 히스타민의 농도(μg/g)를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액과 내부표준물질의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 히스타민의 농도를 계산한다.

AS : 표준용액의 표준물질 피크면적

AIS : 표준용액의 내부표준물질 피크면적

ASAM : 시험용액의 히스타민 피크면적

ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적

제10, 3 중 3.25를 다음과 같이 한다.

3.25 식품용수 등의 노로바이러스 시험법

1) 시약 및 시액

가) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

나) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

다) 1.5% Beef extract(desiccated powder)용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

라) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate  40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

마) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

바) 노로바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

2) 장치 및 기구

가) 검체 채수과정

(1) 표준필터장치：식품용수 1,500~1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터 : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

(2) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

(3) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

(4) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

(5) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

(6) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

(7) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ용수 유입구 ⓑ단일주입기 ⓒ유량조절밸브 ⓓ압력게이지 ⓔ탈리액 주입구 ⓕ감압단추  ⓖ양전하 카트리지 필터 ⓗ카트리지 하우징 ⓘ탈리액 유출구 ⓙ유량계 ⓚ용수 유출구

《표준필터장치》

나) 바이러스 탈리과정

(1) 연동정량펌프：1.5% Beef extract 용액을 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

(2) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

(3) 자석교반기 및 자석교반 막대

(4) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

다) 바이러스 농축과정

(1) 원심분리기(4 ℃, 2,500~10,000 G)

(2) 원심분리용기(50~500 mL 용량)

(3) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

3) 시험방법

가) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 노로바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

(1) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

(2) 염소(Chlorine, HOCl)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 가열 또는 살균한다.

(3) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

(4) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 30 PSI가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

(5) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

(6) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(가) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(나) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (가)와 (나)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

(7) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

(8) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

(9) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ,vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

(10) 압력게이지가 30 PSI 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

(11) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

(12) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

(13) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

나) 노로바이러스 탈리과정

(1) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

(2) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

(3) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액(1.5%)을 사용한다.

(4) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

(5) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

(6) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

(7) 유리병에 수집된 탈리액은 4)～6)의 과정을 2회 반복한다.

(8) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

(9) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

다) 노로바이러스 농축과정

(1) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

(2) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

(3) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

(4) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

(5) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

(6) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

(7) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

(8) 최종 농축검체 20～30 mL는 노로바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

라) 노로바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라서 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 노로바이러스 유전자를 추출 할 수 있다.

(1) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

(2) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL buffer(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

(3) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

(4) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini-spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

(5) 소량 원심(Mini-spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

(6) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

(7) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

마) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR로 노로바이러스의 유전자형(GI과 GII)을 각각 확인하기 위하여 유전자형에 따라 프라이머를 바꿔 Semi-nested PCR을 한다. RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction) 과정에서는 노로바이러스 유전자와 로타바이러스 유전자를 조합하여 합성한 RNA(GI, GII)를 PCR 양성대조군으로 사용한다.

(1) One-step RT-PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(가) PCR 조성조건은 RT-PCR pre-mix 10 μL(Reverse transcriptase 0.5 μL 포함), 프라이머는 GI과 GII 형(type)별로 달리하여 GI 형(type)(GI-F1M, GI-R1M), GII 형(type)(GII-F1M, GII-R1M) 각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 양성대조군의 경우 검체의 RT-PCR 혼합 조성과 동일하게 한 후 GI과 GII 양성대조군 RNA 5 μL를 각각 넣어 총 25 μL로 반응시킨다.

(나) PCR 반응조건은 GI과 GII 모두 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 DNA를 변성시키고, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Semi-nested PCR을 실시한다.

표 1. 노로바이러스 One-step RT-PCR 반응액 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
Mastermix(2X)	9.5 μL	-	-
Reverse transcriptase (50unit/μL)	0.5 μL	-	-
D.W.	6 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	GI-FIM	GII-FIM
Reverse primer(20pmol)	2 μL	GI-RIM	GII-RIM
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-	-
Total	25 μL

표 2. One-step RT-PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성 (cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	45℃ 94℃	30 min 5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합 (annealing) 확장 (extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	35 cycle
최종신장 (post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(2) Semi-nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(가) One-step RT-PCR 산물을 주형으로 하여 Semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs (10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase (5 unit/μL) 1 μL, 프라이머는 GI과 GII 형(type)별로 달리하여 GI 형(type)(GI-F2, GI-R1M), GII 형(type) (GII-F3M, GII-R1M) 각 2.5 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Semi-nested PCR을 실시한다.

(나) PCR 반응조건은 GI과 GII 모두 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응한다.

표 3. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
dNTP(10mM)	4 μL	-	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-	-
D.W.	33 μL	-	-
Forward primer(20 pmol)	2.5 μL	GI-F2	GII-F3M
Reverse primer(20 pmol)	2.5 μL	GI-RIM	GII-RIM
Taq polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	50 μL

표 4. Semi-nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합 (annealing) 확장 (extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	25 cycle
최종신장 (post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(다) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(라) 노로바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. 노로바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Genogroup	Primer	Sequence (5'→3')	Application
I	GI-F1M	CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT	One-step RT PCR
	GI-R1M	CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG	One-step RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GI-F2	ATG ATG ATG GCG TCT AAG GAC GC	Semi-nested PCR/ Sequencing
II	GII-F1M	GGG AGG GCG ATC GCA ATC T	One-step RT PCR
	GII-R1M	CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT	One-step RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GII-F3M	TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART	Semi-nested PCR/ Sequencing

(3) 1차 결과 확인

(가) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 313bp의 밴드가 있을 경우 GI형 노로바이러스로, 310bp의 밴드가 있을 경우 GII형 노로바이러스로 일차 확인하되, 양성대조군 GI 형은 689 bp, GII 형은 686 bp로 확인 되어야 한다.

(나) 만일 음성대조군(negative control)이나 검체에서 양성대조군(positive control)과 같은 크기의 밴드가 확인되거나 또는 양성대조군에서 밴드가 확인이 되지 않을 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6참고).

(다) 노로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 판정한다.

표 6. 노로바이러스 PCR 결과판정 (예시)

	추출 RNA(시료)	양성대조군	음성대조군	1차 판정
1	+	+	-	PCR 검출
	+
2	+	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	+	재 실험
	+
4	+	-	-	재 실험
	-
5	-	+	-	PCR 불검출
	-

+ : 노로바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

(4) 최종 검출 판정

(가) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 (3)의 (다)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2 및 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M 및 GII-R1M의 프라이머(primer)를 사용한다.

(나) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Semi-nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(다) PCR 산물은 직접 염기서열 분석(DNA sequencing)하되, 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA Sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA Sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제 10, 6.1.1.2 중 1)을 다음과 같이 한다.

(1) 시험법의 적용범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류,  고춧가루, 카레분, 향신료가공품 등

제 10, 6.1.1.2, 4) 중 마)를 다음과 같이 한다.

마) 1% 트윈 20 용액 : 트윈 20(Tween 20) 1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

제 10, 6.1.1.2, 4) 중 “마)”를 “바)“로 한다.

제 10, 6.1.1.2, 5), 가) 중 “25 g”을 “25 g(단, 카레분 및 향신료가공품은 10 g)”으로, “물 30 mL”를 “1% 트윈 20 용액 30 mL”로 한다.

제 10 중 6.1.6을 다음과 같이 신설한다.

6.1.6 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol)

1) 시험법 적용범위 : 곡류 및 그 단순가공품 등

2) 분석원리

시료 중의 데옥시니발레놀을 물로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 자외선 검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector)를 사용한다.

나) 정제용 칼럼 : 데옥시니발레놀용  면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 데옥시니발레놀 표준원액 : 데옥시니발레놀을 아세토니트릴에 녹여 250 μg/mL이 되도록 한다.

라) 데옥시니발레놀 표준용액 : 데옥시니발레놀 표준원액을 이동상으로 0.1, 0.2 및 0.5,  1.0 및 2.0 μg/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체를 균질하게 분쇄한 후 시료 20 g를 정밀히 달아 물 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 원심분리(5,000 × G, 15분)하고 상등액을 취하여 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

추출액 2 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 5 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 이동상 1 mL을 가하여 녹인 후 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 아세토니트릴․물 (17:83, v/v)

(3) 검출파장 : UV 220 nm

(4) 유속 : 1 mL/분

(5) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

라) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 데옥시니발레놀의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

7) 계산

데옥시니발레놀의 함량(mg/kg)

=  C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 데옥시니발레놀의 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

제 10 중 6.1.7을 다음과 같이 신설한다.

6.1.7 제랄레논(Zearalenone)

1) 시험법의 적용범위 : 곡류 및 그 단순가공품 등

2) 분석원리

시료 중의 제랄레논을 75% 아세토 니트릴로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

나) 정제용 컬럼 : 제랄레논용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

라) 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 제랄레논 표준원액 : 제랄레논을 아세토니트릴에 녹여 250 μg/mL이 되도록 한다(냉동 보관하여 사용한다).

라) 제랄레논 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 50, 100, 250 및 500 ng/mL의 농도가 되도록 75% 아세노니트릴로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 추출용액 : 75% 아세토니트릴

바) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체를 균질하게 분쇄한 후 시료 25 g를 정밀히 달아 염화나트륨 2 g, 트윈 20(Tween 20) 1 mL 및 추출용액 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한다. 이를 여과지로 여과하고 여액 10 mL를 50 mL 용량플라스크에 취하여 물로 표시선까지 채운다(액이 현탁할 경우 원심분리(5,000 × G, 10분)한 다음 상등액을 사용한다). 이를 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

미리 메탄올 10 mL와 물 10 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 추출액 25 mL을 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 20 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 5 mL로 용출시킨다. 용출액을 40℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 이동상 1 mL을 가하여 녹인 후 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 아세토니트릴․메탄올․물 (10:55:35, v/v/v)

(3) 검출파장 : 여기파장 275 nm, 형광파장 450 nm

(4) 유속 : 1 mL/분

(5) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

라) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 제랄레논의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

7) 계산

제랄레논의 함량(μg/kg)

= C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 제랄레논의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

제 10, 7.4, 4), 다)를 다음과 같이 한다.

다) 표준원액 : 호모실데나필(homosildenafil), 홍데나필(hongdenafil), 하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil), 아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필(pseudovardenafil), 하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil), 디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필(xanthoanthrafil), 하이드록시바데나필(hydroxyvardenafil), 노르네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil), 카보데나필(carbodenafil), 치오실데나필(thiosildenafil), 디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil), 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 노르네오바데나필(norneovardenafil), 옥소홍데나필(oxohongdenafil), 치오호모실데나필(thiohomosildenafil), 데설포바데나필(desulfovardenafil), 니트로데나필(nitrodenafil), 싸이클로펜티나필(cyclopentynafil), 옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 클로로데나필(chlorodenafil), 신나밀데나필(cinnamyldenafil), 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil), 바데나필(vardenafil), 유데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 100 mg/L이 되게 한다.

제 10, 7, 7.4, 6)의 다)를 다음와 같이 한다.

제 10, 7.4, 10) 중  및 를 다음과 같이 신설한다.

클로로데나필(chlorodenafil)

(C19H21ClN4O3, 388)

신나밀데나필(cinnamyldenafil)

(C32H38N6O3, 554)

부  칙(2010. 6. 16.)

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(재검토기한) 「훈령ㆍ예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」(대통령훈령 제248호)에 따라 이 고시 발령 후의 법령이나 현실여건의 변화 등을 검토하여 이 고시를 폐지하거나 개정 등의 조치를 하여야 하는 기한은 2013년 6월 15일까지로 한다.

제3조(경과조치)이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용하되, 제2, 5, 12), (2) 및 제10, 7.4의 개정규정에 대하여는 이 고시를 적용한다. 다만, 제6, 1, 3) 및 4)의 개정규정이 적용되는 수산물 중 이 고시 시행 당시 「식품위생법」에 따라 영업허가를 받았거나 영업신고를 한 자가 종전의 기준 및 규격에 따라 수입하였던 것과 동일한 수산물은 이 고시 시행일로부터 1년 이내에 위 개정규정에 적합하도록 하여야 한다.

신․ 구조문 대비표

현  행

개  정 (안)

제 1. 총 칙(생 략)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 4. (생 략)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 7) (생 략)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
(생 략)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
(생 략)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
장류(메주 제외) 및 고춧가루	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
<신 설>	<신 설>

(2) ～ (5) (생 략)

<신  설>

<신  설>

9) ～ 11) (생 략)

12) 기타 유해물질 기준

(1) (생 략)

(2) 발기부전치료제 유사물질

① ～  (생 략)

<신 설>

<신 설>

(3) ～ (6) (생 략)

13) ～ 15) (생 략)

6. 보존 및 유통기준(생 략)

제 3. ～ 제 4. (생 략)

제 5. 식품의 기준 및 규격

1. ～ 2. (생 략)

3. 코코아가공품류 또는 초콜릿류

1)～5) (생 략)

6) 시험방법

(1)～(4) (생 략)

<신 설>

4. ～ 14.(생 략)

15. 면류

1) 정의

면류라 함은 곡분 또는 전분류를 주원료로 하여 성형하거나 이를 열처리, 건조 등을 한 것으로 국수, 냉면, 당면, 유탕면류, 파스타류를 말한다.

2)～3)(생  략)

4) 식품유형

(1) 국수

밀가루 등의 곡분을 주원료로 하여 제조한 것을 말하며, 수제비나 만두피를 포함한다.

(2)～(5) (생 략)

<신 설>

17. 커피

1)～5) (생 략)

6) 시험방법

(1)～(4) (생 략)

(5) 대장균군

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법

3.7 대장균군 3.7.2 정량시험 나.   데스옥시콜레이트 유당한천배지법  에 따라 시험한다.

29. 기타 식품류

29-1 ～ 29-17 (생 략)

29-18 즉석섭취·편의식품류

1) ～ 4) (생 략)

5) 규격

(1) 대장균 : 음성이어야 한다(즉석섭취식품, 신선편의식품에 한한다).

(2) ～ (4) (생 략)

(5) 장염비브리오균 : 음성이어야 한다.

(6) (생 략)

<신 설>

<신 설>

6) 시험방법

(1) ～ (6) (생 략)

<신 설>

<신 설>

제 6. 수산물에 대한 규격

1. 규격

1) 수산물

(1) (생 략)

(2) 세균수

① (생 략)

② 냉동창란∶g당 3,000,000이하

(3) ～ (6) (생 략)

2) (생 략)

3) 냉동식용대구머리

(1) 정의

냉동식용대구머리라 함은 대구(Gadus morhua, Gadus ogac, Gadus macrocephalus)의 머리를 가슴지느러미와 배지느러미 부위가 붙어 있는 상태로 절단하여 중심부 온도가 -18℃이하가 되도록 급속냉동한 것으로서 식용에 적합하게 처리된 것을 말한다.

(2) 원료 등의 구비요건

(가) 원료는 세계관세기구의 통일상품명및부호체계에관한국제협약상 식용(HS 0303-52)으로 분류되어 위생적으로 처리된 것이 관련기관에 의해 확인된 것이어야 한다.

(나) ～ (다) (생 략)

(3) 규격

① (생 략)

② 중금속

가. 총수은 : 0.5 mg/kg 이하

<신  설>

나. 납     : 0.5 mg/kg 이하

③ ～ ⑤ (생 략)

<신  설>

(4) 시험방법

① (생략)

<신  설>

② ～ ⑤ (생  략)

<신  설>

<신  설>

2. 시험방법

1) ～ 10) (생 략)

<신  설>

제 7. ～ 제 9. (생 략)

제 10. 일반시험법

1 ～ 2.(현행과 같음)

3. 미생물 시험법

3.1～3.24 (생 략)

3.25 식품제조용수 등의 노로바이러스  시험법

1) 시약 및 시액

가)  (생 략)

나) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품제조용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

다) 1.5% 쇠고기 액기스(Beef extract, desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g 과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.  소고기엑기스 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간 동안 보관할 수 있다.

라)～마)  (생 략)

바) 노로바이러스 유전자 추출

(Viral RNA Mini Kits) 용액

바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

2) 장치 및 기구

가) 검체 채수과정

(1) 표준필터장치：식품제조용수

1,500～1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 1-MDS 필터 카트리지, 1-MDS 필터 하우징, 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

<신 설>

(2) 휴대용 pH 측정기：식품제조용수의 수소이온농도를 측정한다.

(3) 휴대용 탁도 측정기：식품제조용수의 혼탁도를 측정한다.

(4) 휴대용 염소 농도 측정기：식품제조용수의 잔류염소농도를 측정한다.

(5) 휴대용 아이스박스：식품제조용수 채수 후 1-MDS 카트리지를 운반하기 위해 사용한다.

(6) 상업용 얼음팩：1-MDS 카트리지 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

(7)  (생 략)

ⓐ용수 유입구 ⓑ단일주입기 ⓒ유량조절밸브 ⓓ압력게이지 ⓔ탈리액 주입구 ⓕ감압단추 ⓖ1-MDS 필터 카트리지 ⓗ 1-MDS 필터 하우징 ⓘ탈리액 유출구 ⓙ유량계 ⓚ용수 유출구

《표준필터장치》

나) 바이러스 탈리과정

(1) 연동정량펌프：1L 소고기 액기스용액(1.5%)을 1-MDS 필터 카트리지로 유입시켜  흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

(2)～(3)  (생 략)

<신 설>

다) (생 략)

3) 시험방법

가) 식품제조용수 채수

(생 략)

(1) 채수하려는 검체의 배출구(수도 꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품제조용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

(2) Chlorine(HOCl)이나, 불꽃버너를 이용하여 배출구 (수도꼭지 등)를 가열 또는 멸균한다.

(3) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 1-MDS 필터 카트리지(ⓖ)는 연결하지 않는다.

(4) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 30 PSI가 넘지 않도록 배출구를  조절하고 76 L(20 gal)의 식품제조용수를 흘려보낸다.

(5) 식품제조용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 calibration한다.

(6) (생 략)

(가) (생 략)

(나) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이   단일주입기를 연결하여 식품제조용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

※ (생 략)

(7)  (생 략)

(8) 알루미늄박을 제거한 1-MDS 필터 카트리지를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

(9) 용수를 천천히 흐르게 하면서 1-MDS 필터 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ,vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

(10) 압력게이지가 30 PSI 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품제조용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

(11)  (생 략)

(12) 표준필터장치로부터 1-MDS 필터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 1-MDS 필터 카트리지를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

(13) 1-MDS 필터 카트리지를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

나) 노로바이러스 탈리과정

(1)  (생 략)

(2) 표준필터장치에 1-MDS 필터 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

(3) 표준필터장치의 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1L 쇠고기 액기스 용액(1.5%)이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결한다.

(4) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1L 쇠고기 액기스 용액(1.5%)이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

(5) 연동정량펌프를 가동하여 1-MDS 필터 카트리지 하우징 안으로 1L 쇠고기 액기스 용액(1.5%)이 1-MDS 필터카트리지 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 쇠고기 액기스 용액(1.5%)이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 1-MDS 필터 카트리지 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

(6) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는  완충액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1L 소고기 액기스 용액(1.5%)이 들어있던  유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ (생 략)

(7)～(9)  (생 략)

다) 노로바이러스 농축과정

(1)～(5)  (생 략)

(6) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 쇠고기 액기스 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

(7)～(8)  (생 략)

라) 노로바이러스 유전자 추출과정

바이러스 RNA 추출은 kit (QIAGEN-Viral RNA Mini Kits)에 포함된 방법 등 전적한 실험법에 따라 실시할 수 있으며, 바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다. 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우 본 시험법에서 제시한 추출 Kit를 사용하여 노로바이러스 유전자를 추출 할 수 있다.

(1) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 양성대조군(positive control) 및 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

(2) 검체 농축액과 양성대조군, 음성대조군은 각 280 μL의 AVL buffer(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL에 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 spin-down한다.

(3) 여기에 95～100% 에탄올  1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 spin-down한다.

(4) 혼합액 630 μL을 Mini spin 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 collection 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

(5) Mini spin 컬럼을 새로운 collection 튜브로 옮겨 AW1 buffer (guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 collection 튜브로 옮긴다.

(6) AW2 buffer 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL collection 튜브로 옮긴다.

(7) Elution buffer(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

마) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR로 노로바이러스의 유전자형  (GI과 GII)을 각각 확인하기 위하여 유전자형에 따라 프라이머 조합을 달리하여 수행한다.

PCR은 RT-PCR(Reverse

transcription-Polymerase chain reaction)과 1차 PCR을 한 시험관에서 동시에 수행하는 One-step RT-PCR 방법을 사용하고 2차 PCR에서는 반응 프라이머를 바꿔 Semi-nested PCR을 한다.

(1) (생 략)

(가) PCR 조성조건은 RT-PCR pre-mix 10 μL(Reverse transcriptase 0.5 μL 포함), 프라이머는 GI과 GII type  별로 달리하여 GI type (GI-F1M,  GI-R1M), GII type (GII-F1M, II-R1M) 각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞춘다.

(나)  (생 략)

표 1. 노로바이러스 One-step RT-PCR 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
(생 략)
(생 략)
(생 략)
(생 략)
(생 략)
Extracted RNA	(생 략)	-	-
(생 략)

표 2.  (생 략)

(2)  (생 략)

(가) One-step RT-PCR 산물을 주형으로 하여 Semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR 산물 2 μL, 10x buffer(MgCl2 포함 ) 5μL, dNTP (10mM) 4 μL, Taq polymerase (5 unit/μL) 1 μL, 프라이머는 GI과 GII type별로 달리하여 GI type(GI-F2, GI-R1M), GII type (GII-F3M, GII-R1M) 각 2.5 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Semi-nested PCR을 실시한다.

(나)  (생 략)

표 3. 노로바이러스 Semi-nested PCR 조성

( 생 략)

표 4.  (생 략)

(다) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 gel loading buffer 1 μL와 혼합한 다음 gel의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% agarose gel 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염식한 후 증류수로 10분간 탈색하고 UV transilluminator로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(라)  (생 략)

표 5.  (생 략)

(3) 1차 결과 확인

(가) agarose gel상에서 시료에 313bp의 밴드가 있을 경우 GI형 노로바이러스로, 310bp의 밴드가 있을 경우 GII형 노로바이러스로 일차 확인한다.

(나) 만일 음성대조군(negative control) 중에서 양성대조군(positive control)  과 같은 크기의 밴드가 확인되거나 또는 양성대조군에서 밴드가 확인이 되지 않을 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6참고).

(다) 노로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 agarose gel상에서 해당 부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 Sequencing 반응하여 최종 판정한다.

표 6.  (생 략)

(4)  최종 검출 판정

(가) DNA sequencing을 위하여 (다)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2 및 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M 및 GII-R1M의 primer를 사용하여 sequencing을 수행한다.

(나) Sequencing 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Semi-nested primer(1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(다) PCR 산물은 직접 Sequencing

(Direct DNA Sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝하여 Sequencing(Cloning DNA Sequencing)을 재실시 한다.  DNA Sequencing에 의해 결정된 염기서열은 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다. 단, 시료와 양성대조군의 염기서열 일치 등으로 교차오염이 의심 될 경우 유전자 추출 과정부터 재실시 하여 판정하여야 한다.

6. 식품 중 자연독소 시험법

6.1 곰팡이독소

6.1.1. 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)

6.1.1.1 박층크로마토그래피에 의한 정성시험

6.1.1.2 액체크로마토그래피에 의한 총 아플라톡신 시험법

1) 시험법의 적용범위 : 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 장류, 고춧가루 등

2) ～ 3) (생 략)

4) 시약 및 시액

가) ～ 라) (생 략)

<신  설>

마) (생 략)

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체를 분쇄하여 균질화 한 시료 25 g을 정밀히 달아 추출용액 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 물 30 mL를 가하여 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) ～ 다) (생 략)

6) ～ 7) (생 략)

6.1.2 ～ 6.1.5 (생 략)

<신  설>

< 신 설 >

7. 식품 중 유해물질시험법

7.1～7.3 (생략)

7.4 발기부전치료제 유사물질

1) ～ 3) (생략)

4) 시약 및 시액

가) ～ 나) (생략)

다) 표준원액 : 호모실데나필(homosildenafil), 홍데나필(hongdenafil), 하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil), 아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필(pseudovardenafil), 하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil), 디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필(xanthoanthrafil), 하이드록시바데나필(hydroxyvardenafil), 노르네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil), 카보데나필(carbodenafil), 치오실데나필(thiosildenafil), 디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil), 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 노르네오바데나필(norneovardenafil), 옥소홍데나필(oxohongdenafil), 치오호모실데나필(thiohomosildenafil), 데설포바데나필(desulfovardenafil), 니트로데나필(nitrodenafil), 싸이클로펜티나필(cyclopentynafil), 옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil), 바데나필(vardenafil), 유데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 100 mg/L이 되게 한다.

라) ～ 마) (생략)

5) (생 략)

6) 시험조작

가) ～ 나) (생략)

다) 표준품의 크로마토그램

7) ～ 9) (생 략)

10) 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 구조식

① ～   (생 략)

<신  설>

7.5 ～ 7.9 (생 략)

8.～ 9. (생 략)

제 11. ～ 제 12. (생 략)

[별표 1] ～ [별표 8] (생 략)

제 1. 총 칙(현행과 같음)

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ～ 4. (현행과 같음)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 7) (현행과 같음)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기 준
(현행과 같음)	15 μg/kg 이하 (단, B1은 10 μg/kg 이하이어야 한다)
(현행과 같음)
장류(메주 제외), 고춧가루 및 카레분
육두구, 심황(강황), 건조고추, 건조파프리카 및 이를 함유한 천연향신료

(2) ～ (5) (현행과 같음)

(6) 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol)

대 상 식 품	기 준
곡류 및 그 단순가공품 (옥수수 및 그 단순가공품 제외)	1 mg/kg 이하
옥수수 및 그 단순가공품	2 mg/kg 이하

(7) 제랄레논(Zearalenone)

대 상 식 품	기 준
곡류 및 그 단순가공품	200 μg/kg 이하

9) ～ 11) (현행과 같음)

12) 기타 유해물질 기준

(1) (현행과 같음)

(2) 발기부전치료제 유사물질

① ～  (현행과 같음)

클로로데나필(chlorodenafil) : 검출되어서는 아니된다.

신나밀데나필(cinnamyldenafil) : 검출되어서는 아니된다.

(3) ～ (6) (현행과 같음)

13) ～ 15) (현행과 같음)

6. 보존 및 유통기준(현행과 같음)

제 3. ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품의 기준 및 규격

1. ～ 2. (현행과 같음)

3. 코코아가공품류 또는 초콜릿류

1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1)～(4) (현행과 같음)

(5) 유산균수

제 10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.9 유산균수에 따라 시험한다.

4. ～ 14.(현행과 같음)

15. 면류

1) 정의

면류란 곡분 또는 전분 등을 -----

---------성형, 열처리,---------

-----------------------------

----파스타류, 기타 면류를 ------

---.

2)～3)(현행과 같음)

4) 식품유형

(1) 국수

곡분 또는 전분 등을-------------

----------------------- 말한다.

(2)～(5) (현행과 같음)

(6) 기타 면류

면류 중 위 식품유형 (1)부터 (5)까지에 정하여지지 아니한 것으로 수제비나 만두피 등을 말한다.

17. 커피

1)～5) (현행과 같음)

6) 시험방법

(1)～(4) (현행과 같음)

(5) 대장균군

-----------------------------

--------- 3.7.1 정성시험 다. 데   스옥시콜레이트 유당한천 배지법  --------.

29. 기타 식품류

29-1 ～ 29-17 (현행과 같음)

29-18 즉석섭취·편의식품류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) 대장균 : 1g 당 10 이하 (신선편의식품에 한하며 즉석섭취식품은 음성이어야 한다).

(2) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 장염비브리오균 : -----------

한다(해산물 함유 제품에 한한다).

(6) (현행과 같음)

(7) 대장균 O157:H7 : 음성이어야 한다(신선편의식품에 한한다).

(8) 클로스트리디움 퍼프린젠스 : 1 g 당 100 이하(즉석섭취식품, 신선편의식품에 한한다).

6) 시험방법

(1) ～ (6) (현행과 같음)

(7) 대장균 O157:H7

제 10. 일반시험법  3. 미생물시험법 3.16 대장균 O157:H7에 따라 시험한다.

(8) 클로스트리디움 퍼프린젠스

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.14 클로스트리디움 퍼프린젠스 3.14.2 정량시험에 따라 시험한다.

제 6. 수산물에 대한 규격

1. 규격

1) 수산물

(1) (현행과 같음)

(2) 세균수

① (현행과 같음)

<삭  제>

(3) ～ (6) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3) 냉동식용어류머리

(1) 정의

냉동식용어류머리란 대구(Gadus morhua, Gadus ogac, Gadus macrocephalus), 은민대구(Merluccius australis) 및 다랑어류의 ----------

----------절단한 것과 식용 가능한 모든 어종(복어류 제외)의 머리 중 가식부를 분리해 낸 것을 중심부 온도가 -18℃이하가 되도록 급속냉동한 것으로서 식용에 적합하게 처리된 것을 말한다.

(2) 원료 등의 구비요건

(가) ---- 세계관세기구(WCO)----

---------------------- ---------- 식용(HS 0303호)- -------------------------

-------------------------

-------------.

(나) ～ (다) (현행과 같음)

(3) 규격

① (현행과 같음)

② 중금속

가. 총수은 : 0.5 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류는 제외한다)

나. 메틸수은 : 1.0 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)

다. 납     : 0.5 mg/kg 이하

③ ～ ⑤ (현행과 같음)

⑥ 히스타민 : 200 mg/kg이하(다랑어류에 한한다)

(4) 시험방법

① (현행과 같음)

② 메틸수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.7 메틸수은에 따라 시험한다

③ ～ ⑥ (현행 제2항부터 제5항까지와 같음)

⑦ 히스타민

제6. 수산물에 대한 규격 2. 시험방법 11) 히스타민에 따라 시험한다.

4) 냉동식용어류내장

(1) 정의

냉동식용어류내장이란 식용 가능한 어류의 알(복어알은 제외), 창난, 이리(곤이), 오징어 난포선 등을 분리하여 중심부 온도가 -18℃이하가 되도록 급속냉동한 것으로서 식용에 적합하게 처리된 것을 말한다.

(2) 원료 등의 구비요건

(가) 원료는 세계관세기구(WCO)의 통일상품명및부호체계에관한국제협약상 식용(HS 0303호, 0306호 또는 0307호)으로 분류되어 위생적으로 처리된 것이 관련기관에 의해 확인된 것이어야 한다.

(나) 원료의 분리 시 다른 내장은 제거된 것이어야 한다.

(다) 식품첨가물 등 다른 물질을 사용하지 않은 것이어야 한다.

(3) 규격

① 성상 : 적합하여야 한다.

② 중금속

가. 총수은 : 0.5 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류는 제외한다)

나. 메틸수은 : 1.0 mg/kg 이하(심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)

다. 납   : 0.5 mg/kg 이하(다만, 연체류는 2.0 mg/kg 이하)

라. 카드뮴 : 2.0 mg/kg 이하(연체류에 한한다)

③ 대장균 : 음성

④ 세균수 : 1 g당 1,000,000이하

(4) 시험방법

① 총수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.4 수은에 따라 시험한다.

② 메틸수은

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.7 메틸수은에 따라 시험한다.

③ 납

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.1 납에 따라 시험한다.

④ 카드뮴

제10. 일반시험법 7.1 중금속시험 7.1.2.2 카드뮴에 따라 시험한다.

⑤ 대장균

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.8 대장균에 따라 시험한다.

⑥ 세균수

제10. 일반시험법 3. 미생물시험법 3.5.1 일반세균수에 따라 시험한다.

2. 시험방법

1) ～ 10) (현행과 같음)

11) 히스타민

(1) 시험법 적용 범위

수산물 등 식품 중 히스타민(histamine) 분석에 적용한다.

(2) 분석원리

식품 중 히스타민을 염산으로 추출하여 염화단실(dansyl chloride)로 유도체화 한 후 고속액체크로마토그래프를 이용하여 분석한다.

(3) 장치

액체크로마토그래프 : 자외부흡광검출기를 사용한다.

(4) 시약 및 시액

① 아세토니트릴 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

③ 0.1 N 염산 : 10 N 염산을 10 mL 취해 물을 가하여 1 L로 한다.

④ 포화탄산나트륨용액 : 탄산나트륨을 약 46 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

⑤ 1% 염화단실(dansyl chloride)아세톤용액 : 염화단실을 1 g을 취하여 아세톤을 가해 100 mL로 한다.

⑥ 10% 프롤린(proline)용액 : 프롤린 10 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

⑦ 에테르 : 일반시약용 또는 이와 동등 한 것

⑧ 표준원액 : 히스타민을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 1 mg/mL가 되게 한다.

⑨ 내부표준원액 : 1,7-디아미노헵탄(diaminoheptane) 표준품을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 5 mg/mL가 되게 한다.

⑩ 표준용액 : 각각의 표준원액을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

⑪ 내부표준용액 : 내부표준원액에 0.1 N 염산을 가해 100 μg/mL가 되게 한다.

⑫ 검량곡선표준용액 : 표준용액에 0.1N 염산을 가해 적당한 5개 농도(μg/mL)가 되게 조제하여 사용한다.

⑬ 시스템적합성용액 : 캐더버린(cadarverine) 및 히스타민을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

(5) 시험용액의 조제

검체 5 g를 정확하게 취하여 0.1 N 염산 25 mL을 가한 후 균질화하고 이것을 원심분리(4000 G, 4℃, 15 min)한 후 여과하여 취하는 조작을 2회 반복하여 얻은 상층액을 합치고 0.1 N 염산을 가해 50 mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

(6) 유도체화

표준용액 및 시험용액 각각 1 mL을 마개 달린 유리시험관에 취한 다음 내부표준용액 100 μL를 가한 후 포화탄산나트륨용액 0.5 mL와 1% 염화단실아세톤용액 0.8 mL을 가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 유도체화 한다. 유도체화 시킨 표준용액 및 시험용액에 10% 프롤린용액 0.5 mL 및 에테르 5 mL를 가하여 약 10분간 진탕하고 상층액을 취하여 질소 농축한 뒤 아세토니트릴 1 mL를 가하여 여과한 것을 고속액체크로마토그래프로 분석한다.

(7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

① 검출기 : 자외부흡광검출기 (UV), 254 nm

② 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

③ 칼럼온도 : 40℃

④ 이동상 : 아세토니트릴과 물의 혼합액 (55% 아세토니트릴을 최초 10분간 유지 후 15분까지 65%, 20분까지 80%로 하여 5분간 유지 후, 30분까지 90%로 하여 5분간 유지시킨다.)

⑤ 이동상유량 : 1 mL/min

⑥ 시스템적합성 : 시스템적합성용액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 캐더버린, 히스타민의 순서로 유출되고 그 분리도가 1.5 이상이어야 한다.

나) 정성시험

시험용액 크로마토그램 상의 히스타민의 피크 머무름 시간(retention time)은 각각 표준물질의 피크 머무름 시간과 일치하여야 한다.

다) 정량시험

각 표준용액의 표준물질과 내부표준물질의 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 검량곡선표준용액의 히스타민의 농도(μg/g)를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액과 내부표준물질의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 히스타민의 농도를 계산한다.

AS : 표준용액의 표준물질 피크면적

AIS : 표준용액의 내부표준물질 피크면적

ASAM : 시험용액의 히스타민 피크면적

ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적

제 7. ～ 제 9. (현행과 같음)

제 10. 일반시험법

1.～2.(현행과 같음)

3. 미생물 시험법

3.1～3.24 (현행과 같음)

3.25 식품용수 ------------------

----

1) 시약 및 시액

가)  (현행과 같음)

나) 1M 염산(HCl) 용액

------------ 식품용수 -------

----------------------------

--------

다) 1.5%  Beef extract(desiccated powder)용액

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

--------. Beef extract 용액-----

-----------------------------

-----------.

라)～마)  (현행과 같음)

바) 노로바이러스 유전자 추출 키트

(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits  또는  동등 이상의 제품사용 가능

2) 장치 및 기구

가) 검체 채수과정

(1) --------------- : 식품용수 ---

----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

---------양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing)---.

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

(2) ------------------ : 식품용수 --------------

(3)------------------- : 식품용수     -----------------

(4) ---------------- : 식품용수--

----------------------------

----

(5) ------------------ : 식품용수

----------양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)------

(6) -------------- : 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)------

------------

(7)  (현행과 같음)

-----------------------------

-----------------------------

-----------ⓖ양전하 카트리지 필터

ⓗ카트리지 하우징 -------------

------------------------------

-----------

나) 바이러스 탈리과정

(1)--------- : 1.5% Beef extract용액을 양전하 카트리지 필터--------

----------------------------

-------------------------

(2)～(3)  (현행과 같음)

(4)하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

다) (현행과 같음)

3) 시험방법

가) 식품용수 ----

(현행과 같음)

(1) ---------------------------

--------------------------

식품용수 ------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

--------.

(2) 염소(Chlorine, HOCl)----------

---------------------------

-------살균---.

(3) ---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

--양전하 카트리지 필터---------

-------.

(4) ---------------------------

----------------------------

-----------------------------

-------식품용수-----------

(5) 식품용수 --------------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

-----------보정(calibration)---

-----

(6)  (현행과 같음)

(가) (현행과 같음)

(나) --------------------------

-----------------식품용수---

---------------------------

---------------------------

---------.

※  (현행과 같음)

(7)  (현행과 같음)

(8) --------양전하 카트리지 필터  ----------------------------

----------------------------

---.

(9) ---------------------------

카트리지 하우징---------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

-----------.

(10) --------------------------

---------------------------

---------식품용수-----------

---------------------------

-----------------------.

(11)  (현행과 같음)

(12) ---------------- 카트리지 하우징-----------------------

양전하 카트리지 필터-----------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

--------------.

(13) 양전하 카트리지 필터---------

-----------------------------

----------------------------

----------------------------

----------------.

나) 노로바이러스 탈리과정

(1)  (현행과 같음)

(2) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징---

----------------------------

------------------.

(3) 탈리액-----------------------

----------------------------

----------1.5% Beef extract용액

----------------------------

-------------------------연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract용액을 사용한다.

(4) ---------------------------

----------1.5% Beef extract용액---------------------------

---------------------.

(5) ----------------------------

양전하 카트리지 필터------------

---------------1.5% Beef extract용액이 양전하 카트리지 필터--------

---------------------------

--------1.5% Beef extract용액

---------------------------

---------------------------

---------------------------

※---------양전하 카트리지 필터 -------------------------------------------.

(6) ---------------------------

---------------------------

--1.5% Beef extract 용액------

---------------------------

---------1.5% Beef extract 용액

---------------------------

---------------------------

---------------------------

-------.

※ (현행과 같음)

(7)～(9)  (현행과 같음)

다) 노로바이러스 농축과정

(1)～(5)  (현행과 같음)

(6) ---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

--1.5% Beef extract 용액------

----------.

(7)～(8)  (현행과 같음)

라) 노로바이러스 유전자 추출과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 노로바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

(1)---------------------------

-------------------음성대조군

(negative control)--------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

---------------.

(2) -------------------음성대조군  각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를-----

-----------------------------  ----------------------------

----------------------------

원심분리(spin-down)---.

(3) ---------------------------

---------------------------

원심분리(spin-down)---.

(4) -----------소량 원심(Mini spin)

----------------------------

----------------------------

회수용(collection)--------------

----------------------------

----------------------------

-----.

(5) 소량 원심(Mini spin)-----------

회수용(collection)-------- 완충액

----------------------------

----------------------------

----------------------------

회수용(collection)-----------.

(6) ---완충액------------------

---------------------------

-------------회수용(collection)

------.

(7) AVE 완충액----------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

----.

마) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

----------------------------

----------------------------

-------------------  프라이머를 바꿔 Semi-nested PCR을 한다.

RT-PCR(Reverse transcription- Polymerase chain reaction)과정에서는 노로바이러스 유전자와 로타바이러스 유전자를 조합하여 합성한 RNA(GI, GII)를 PCR 양성 대조군으로 사용한다.

(1)  (현행과 같음)

(가) --------------------------

--------------------------

------------------GII 형(type)

----------GI 형(type)--------

-----GII 형(type)-------------

--------------------------

-------------------- 맞추고

양성대조군의 경우 검체의  RT-PCR 혼합 조성과 동일하게 한 후 GI과  GII 양성대조군 RNA 5 μL를 각각 넣어 총 25 μL로 반응시킨다.

(나)  (현행과 같음)

표 1. 노로바이러스 One-step RT-PCR 반응액 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
(현행과 같음)
(현행과 같음)
(현행과 같음)
(현행과 같음)
(현행과 같음)
Extracted RNA, PCR control	(현행과 같음)	-	-
(현행과 같음)

표 2.  (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(가) --------------------------

---------------------------

---------------------------

----------완충액------------

------dNTPs----------------

Taq DNA polymerase---------

-----------GII 형(type)-------

--GI 형(type)----------------

GII 형(type)------------------

--------------------------

--------------------------

--------------------------.

(나)  (현행과 같음)

표 3. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성

(현행과 같음)

표 4.  (현행과 같음)

(다) ---------------------------

------------전기영동 완충액(gel   loading buffer)------------젤(gel)

------------------------------

------------------------------

----------------------------

----------------------------

--------------------------1.5%   아가로즈 젤(agarose gel)----------

------------------------------

------------------------------

------------------------------

--자외선 조사기(UV transilluminator)

----------------------------

-----------------.

(라)  (현행과 같음)

표 5.  (현행과 같음)

(3) 1차 결과 확인

(가) 아가로즈 젤(agarose gel)-------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

확인하되, 양성대조군 GI 형은 689 bp, GII 형은 686 bp로 확인 되어야 한다.

(나) ----------음성대조군(negative control)이나 검체에서 ----------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

----------------------------

-----.

(다) --------------------------

----------------------------

아가로즈 젤(agarose gel)---------

-----------------------------

염기서열(DNA sequencing)을 분석하여------.

표 6.  (현행과 같음)

(4)  최종 검출 판정

(가) 염기서열 분석(DNA sequencing)

---(3)의 (다)------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

--------------프라이머(primer)를 사용한다.

(나) 염기서열분석(sequencing)--------

----------------------------

프라이머(primer, 1  pmol)---------

----------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

-------.

(다)  --------------직접 염기서열 분석(DNA sequencing)-----------

-----------------------------

------------------------클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA Sequencing)

-----------------------------.

염기서열분석(DNA     sequencing)--

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

---------. <삭제>

6. 식품 중 자연독소 시험법

6.1 곰팡이독소

6.1.1. 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)

6.1.1.1 박층크로마토그래피에 의한 정성시험

6.1.1.2 액체크로마토그래피에 의한 총 아플라톡신 시험법

1) 시험법의 적용범위 : -------

-----------------------

------고춧가루, 카레분, 향신료가공품 등

2) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시약 및 시액

가) ～ 라) (현행과 같음)

마) 1% 트윈 20 용액 : 트윈20(Tween 20) 1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

바) (현행 마)와 같음)

5) 시험용액의 조제

가) 추출

------------- 25 g(단, 카레분, 향신료가공품은 10 g)을 ------------------------

------------------------

------------------------

------------------------  ---1% 트윈 20 용액 30 mL를 -----------------------.

-----.

나) ～ 다) (현행과 같음)

6) ～ 7) (현행과 같음)

6.1.2 ～ 6.1.5 (현행과 같음)

6.1.6 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol)

1) 시험법 적용범위 : 곡류 및 그 단순가공품 등

2) 분석원리

시료 중의 데옥시니발레놀을 물로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 자외선 검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector)를 사용한다.

나) 정제용 칼럼 : 데옥시니발레놀용  면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 데옥시니발레놀 표준원액 : 데옥시니발레놀을 아세토니트릴에 녹여 250 μg/mL이 되도록 한다.

라) 데옥시니발레놀 표준용액 : 데옥시니발레놀 표준원액을 이동상으로 0.1, 0.2 및 0.5,  1.0 및 2.0 μg/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체를 균질하게 분쇄한 후 시료 20 g를 정밀히 달아 물 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 원심분리(5,000 × G, 15분)하고 상등액을 취하여 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

추출액 2 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 5 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 3 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 이동상 1 mL을 가하여 녹인 후 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 아세토니트릴․물 (17:83, v/v)

(3) 검출파장 : UV 220 nm

(4) 유속 : 1 mL/분

(5) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

라) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 데옥시니발레놀의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

7) 계산

데옥시니발레놀의 함량(mg/kg)

=  C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 데옥시니발레놀의 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

6.1.7 제랄레논(Zearalenone)

1) 시험법의 적용범위 : 곡류 및 그 단순가공품 등

2) 분석원리

시료 중의 제랄레논을 75% 아세토 니트릴로 추출한 후 면역친화성컬럼으로 정제하여 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

나) 정제용 컬럼 : 제랄레논용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

라) 유리섬유여과지(Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 제랄레논 표준원액 : 제랄레논을 아세토니트릴에 녹여 250 μg/mL이 되도록 한다(냉동 보관하여 사용한다).

라) 제랄레논 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 50, 100, 250 및 500 ng/mL의 농도가 되도록 75% 아세노니트릴로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 추출용액 : 75% 아세토니트릴

바) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

검체를 균질하게 분쇄한 후 시료 25 g를 정밀히 달아 염화나트륨 2 g, 트윈 20(Tween 20) 1 mL 및 추출용액 100 mL를 가하고 균질기로 5분간 고속으로 균질화한다. 이를 여과지로 여과하고 여액 10 mL를 50 mL 용량플라스크에 취하여 물로 표시선까지 채운다(액이 현탁할 경우 원심분리(5,000 × G, 10분)한 다음 상등액을 사용한다). 이를 유리섬유여과지로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

미리 메탄올 10 mL와 물 10 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 추출액 25 mL을 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물 20 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 5 mL로 용출시킨다. 용출액을 40℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 이동상 1 mL을 가하여 녹인 후 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 아세토니트릴․메탄올․물 (10:55:35, v/v/v)

(3) 검출파장 : 여기파장 275 nm, 형광파장 450 nm

(4) 유속 : 1 mL/분

(5) 주입량 : 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

라) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 제랄레논의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

7) 계산

제랄레논의 함량(μg/kg)

= C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 제랄레논의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

7. 식품 중 유해물질시험법

7.1～7.3 (현행과 같음)

7.4 발기부전치료제 유사물질

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시약 및 시액

가) ～ 나) (현행과 같음)

다) -------- : ---------------- -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------- ---------------------------- ---------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 클로로데나필(chlorodenafil), 신나밀데나필(cinnamyldenafil), 실데나필(sildenafil), --------------- -------------------------------------------------------- --------------.

라) ～ 마) (현행과 같음)

5) (현행과 같음)

6) 시험조작

가) ～ 나) (현행과 같음)

다) 표준품의 크로마토그램

7) ～ 9) (현행과 같음)

10) 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 구조식

① ～   (현행과 같음)

클로로데나필(chlorodenafil)

(C19H21ClN4O3, 388)

신나밀데나필(cinnamyldenafil)

(C32H38N6O3, 554)

7.5 ～ 7.9 (현행과 같음)

8.～ 9. (현행과 같음)

제 11. ～ 제 12. (현행과 같음)

[별표 1] ～ [별표 8] (현행과 같음)