식품의약품안전청 고시 제2007-68호

식품의 기준 및 규격 중 개정

2007. 10. 18.

식품의약품안전청

식품의약품안전청고시 제2007- 68호

식품위생법 제7조 제1항에 의거 식품의 기준 및 규격을 다음과 같이 개정 고시합니다

2007년 10월 18일

식품의약품안전청장

1. 개정이유

식용유지에 벤조피렌 기준 신설 및 컵모양 등의 젤리에 대한 겔화제, 압착강도, 크기 기준 신설, 농약, 동물용의약품의 잔류허용기준 강화, 신규 유전자재조합식품 및 미승인 GMO 개별 시험법 추가, 식품제조용수에 대한 노로바이러스 기준 신설, 식육의 다이옥신 기준 신설 등으로 식품의 안전성을 확보하고자 함

2. 주요내용

가. 고추장 및 향신료조제품 제조시 홍국색소 사용금지 및 시트리닌 불검출 규정 신설

나. 컵모양 등의 젤리에 사용할 수 없는 겔화제, 제품의 크기 및 압착강도에 대한 기준신설

다. 고춧가루 제조공정에 금속성이물 제거장치 설치 의무화 및 식품 중 금속성이물에 대한 기준 신설

라. 식용유지에 벤조피렌 기준 신설

마. 식품 중 검출되어서는 아니 되는 동물용의약품의 목록 신설

바. 6개월 미만의 영유아가 섭취하는 식품에 대한 기준 강화

사. 식육(소고기, 돼지고기, 닭고기)의 다이옥신 기준 신설

아. 식품 제조용수 등에 대한 노로바이러스 불검출 기준 신설

자. 벌꿀에 대한 동물용의약품의 잔류허용기준 강화

차. 농산물의 농약 잔류허용기준 강화

카. 수족관물에 대한 대장균군 권장기준 신설

타. 신규 유전자재조합 옥수수(NK603, TC1507), Bt10 옥수수 및 미승인 해충 저항성 쌀의 개별 시험법 등 추가

3. 참고사항

가. 관계법령 : 식품위생법 제7조 및 제12조

나. 규제실시 : 신설 ․ 강화 규제사항에 대하여 규제심사 실시

다. 예산 : 별도조치 필요없음

라. 합의 : 해당사항 없음

마. 기타사항

식품의 기준 및 규격 중 개정고시

식품의 기준 및 규격중 다음과 같이 개정한다.

제3. 2. 1) (22)를 다음과 같이 신설하고 (22)를 (23)으로 한다

(22) 과자류 중 컵모양 등 젤리의 원료로 다음의 겔화제는 사용할 수 없다

① 곤약, 글루코만난

제3. 3. 2) (4)를 다음과 같이 신설하고 (4)내지 (42)를 (5)내지 (43)으로 한다.

(4) 캔디류

① 컵모양 등 젤리의 크기는 뚜껑과 접촉하는 면의 최소내경이 5.5 cm 이상 이어야 하고 높이와 바닥면의 최소내경은 3.5 cm이상이 되도록 제조하여야 한다

제3. 3. 2), (25)의 ⑦을 다음과 같이 신설한다.

⑦ 고추장 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니 된다

제3. 3. 2), (28)의 ④를 다음과 같이 한다.

④ 고춧가루 제조공정에는 금속성 이물제거장치를 설치하여야 한다.

제3. 3. 2), (29)의 ②를 다음과 같이 신설한다.

② 향신료조제품 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니 된다

제3. 6. 1) (7) ②를 다음과 같이 신설한다.

(7) 이물

② 금속성 이물로서 쇳가루는 제 7. 7. 1). (5) 금속성이물시험법에 따라 시험하였을 때 식품중 10.0 mg/kg 이상 검출되어서는 아니되며, 또한 크기가 2.0 mm 이상인 금속성 이물이 검출되어서는 아니된다.

제3. 6. 1) 식품 일반의 규격의 (10)를 다음과 같이 변경한다.

(10) 식품 제조․가공 중 생성되는 유해물질

① 벤조피렌[Benzo(a)pyrene]

㉮ 식용유지: 2.0 ㎍/kg이하

제3. 6. 1), (11) 잔류동물용의약품의 기준 적용에서 ①항을 아래와 같이 하고 다음의 표를 삽입한다.

(11) 잔류동물용의약품의 기준 적용

① 관련법령에서 안전성 및 유효성에 문제가 있는 것으로 확인되어 제조 또는 수입 품목허가를 하지 아니하는 동물용의약품(대사물질 포함)은 검출되어서는 아니 된다. 이에 해당되는 주요 물질은 아래와 같으며, 아래에 명시하지 않은 물질에 대해서도 관련법령에 근거하여 본 항을 적용할 수 있다.

번호	식품 중 검출되어서는 아니 되는 물질
1	니트로푸란{푸라졸리돈(Furazolidone), 푸랄타돈(Furaltadone), 니트로푸라존(Nitrofurazone), 니트로푸란토인(Nitrofurantoine), 니트로빈(Nitrovin) 등} 제제 및 대사물질
2	클로람페니콜(Chloramphenicol)
3	말라카이트 그린(Malachite green) 및 대사물질
4	디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)
5	디메트리다졸(Dimetridazole)
6	클렌부테롤(Clenbuterol)
7	반코마이신(Vancomycin)
8	클로르프로마진(Chlorpromazine)
9	티오우라실(Thiouracil)
10	콜치신(Colchicine)
11	피리메타민(Pyrimethamine)
12	메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)

제3. 6. 1) (12)를 다음과 같이 신설한다.

(12)  6개월 미만의 영․유아가 섭취할 수 있도록 제조․판매하는 식품에서는 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii), 대장균군, 타르색소가 검출되어서는 아니되며 세균수는 g당 20,000 이하(액상제품은 100이하)이어야 한다.

제3. 6. 1) (13)식육 중 다이옥신 허용기준을 다음과 같이 신설한다.

(13)식육 중 다이옥신 허용기준

①소고기 : 4.0 pg TEQ/g fat 이하

②돼지고기 : 2.0 pg TEQ/g fat 이하

③닭고기 : 3.0 pg TEQ/g fat 이하

제3. 6. 1) (14)를 다음과 같이 신설한다.

(14) 식품접객업소, 집단급식소, 식품제조․가공업소 등에서 식재료 및 식기 등의 세척, 식품의 조리 및 제조․가공, 먹는 물 등으로 사용하는 물에서는 노로바이러스가 검출되어서는 아니된다. 다만, 식품접객업소, 집단급식소 등에서 먹는 물로 제공되는 수돗물은 제외한다.

제3. 6. 2), (3) 네오마이신(Neomycin) 중 아래의 항목을 추가한다.

벌꿀    0.1

제3. 6. 2), (9) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES) 항목을 삭제하고, (10) 디클라주릴(Diclazuril)을 (9)로 변경한다.

제3. 6. 2), (11) 디히드로스트렙토마이신/스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin /Streptomycin)을 (10)으로 하고 아래의 항목을 추가한다.

벌꿀    불검출

제3. 6. 2), (12) 레바미졸(Levamisole)내지 (40) 카바독스(Carbadox)를 각각 (11)내지 (39)으로 한다.

제3. 6. 2), (41) 클로람페니콜(Chloramphenicol)을 삭제하고, (42) 클로산텔(Closantel)내지 (53) 독시싸이클린(Doxycycline)를 각각 (40)내지 (51)로 한다.

제3. 6. 2), (52) 아미트라즈(Amitraz), (53) 코마포스(Coumaphos), (54) 플루메쓰린(Flumethrin), (55) 플루발리네이트(Fluvalinate)를 다음과 같이 신설한다.

(52) 아미트라즈(Amitraz)

벌꿀    0.2

(53) 코마포스(Coumaphos)

벌꿀    0.1

(54) 플루메쓰린(Flumethrin)

벌꿀    0.01

(55) 플루발리네이트(Fluvalinate)

벌꿀    0.05

제 3. 6. 3), (101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)중 다음 항목을 각각 신설한다.

감	0.3

자두               0.1

제 3. 6. 3), (110) 카두사포스 (Cadusafos) 중 다음 항목을 신설한다.

배추              0.05

제 3. 6. 3), (125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)중 다음 항목을 신설한다.

딸기	1.0

기타농산물         0.05

제 3. 6. 3), (162) 페니트로치온 (Fenitrothion)중 다음 항목을 신설한다.

마늘	0.03

제 3. 6. 3), (186) 프로클로라즈 (Prochloraz)중 다음 항목을 신설한다.

오이	1.0

제 3. 6. 3), (207) 테부페노자이드 (Tebufenozide)중 다음 항목을 신설한다.

복숭아	0.1

제 3. 6. 3), (209) 테플루벤주론 (Teflubenzuron)중 다음 항목을 신설한다.

배                0.2

제 3. 6. 3), (230) 크레속심-메칠 (Kresoxim-methyl)중 다음 항목을 신설한다.

마늘	0.3

제 3. 6. 3), (232) 트리싸이클라졸 (Tricyclazole)중 다음 항목을 신설한다.

수박              0.2

제 3. 6. 3), (251) 에톡사졸 (Etoxazole)중 다음 항목을 각각 신설한다.

고추              0.3

피망              0.3

제 3. 6. 3), (253) 이미벤코나졸(Imibenconazole)중 다음 항목을 신설한다.

복숭아            0.3

제 3. 6. 3), (290) 인독사카브(Indoxacarb)중 다음 항목을 신설한다.

배                0.5

제 3. 6. 3), (336) 티디아주론(Thidiazuron)중 다음 항목을 신설한다.

수박              0.1

제 3. 6. 3), (345) 피라크로스트로빈(Pyraclostrobin)중 다음 항목을 신설한다.

마늘              0.05

제 3. 6. 3), (349) 노발루론 (Novaluron)중 다음 항목을 신설한다.

배추             0.1

제 3. 6. 3), (352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)중 다음 항목을 각각 신설한다.

배              0.2

오이            0.3

제 3. 6. 3), (353) 메트코나졸 (Metconazole)중 다음 항목을 각각 신설한다.

복숭아          0.3

고추            0.3

제 3. 6. 3), (356) 에타복삼 (Ethaboxam)중 다음 항목을 신설한다.

배추            2.0

제 3. 6. 3), (363) 티람 (Thiram)중 다음 항목을 신설한다.

사과            0.3

제 3. 6. 3), (373) 스피로메시펜(Spiromesifen)중 다음 항목을 각각 신설한다.

복숭아          0.2

포도            1.0

참외            0.5

제 3. 6. 3), (384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid)중 다음 항목을 각각 신설한다.

기타농산물      0.1

제 3. 6. 3), (386) 플로니카미드 (Flonicamid)중 다음 항목을 각각 신설한다.

수박          0.5

기타농산물    0.1

제 3. 6. 3), (390) 시메코나졸 (Simeconazole)중 다음 항목을 각각 신설한다.

기타농산물      0.05

제 3. 6. 3), (395)사이플루페나미드 “고추 0.3”을 (384)사이플루페나미드 “고추 0.3”으로 하고 (395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide)를 다음과 같이 신설한다.

(395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide)

토마토           0.2

기타농산물       0.2

제 3. 6. 3), (396) 에티클로제이트 (Ethyclhozate)중 다음 항목을 각각 신설한다.

기타농산물      0.05

제 3. 6. 5)에 (34)를 다음과 같이 신설한다.

(34) 피라크로스트로빈(Pyraclostrobin)

수삼              2.0

제4. 1. 1-3  3) (6)을 다음과 같이 신설한다.

(6) 압착강도(Newton) : 5 이하(컵모양 등 젤리에 한한다)

제5. 2. 2-2. 1). (2)에 ②를 다음과 같이 신설한다.

②대장균군 : 1,000이하/100 mL

제7. 6. 1). (3)건식회화법중 “450～550°에서 회화한다.”를 “450～500℃에서 회화한다.”로 한다

제7. 6. 5). “농산물 중 중금속 시험법”을 “농산물 및 수산물 중 중금속 시험법”으로 한다.

제7. 6. 5). (1)을 다음과 같이 한다

농산물의 종류에 따라 아래 표에서와 같이 처리한 것을 검체로 한다. 다만, 이 표에서 정하지 아니한 농산물과 수산물는 원칙적으로 가식부를 시험부위로 한다

제7. 6. 5). (2)에 ③을 다음과 같이 신설한다.

③건식회화법

시료 일정량 (측정하는 기기에 따라 달라짐)을 도가니, 백금접시에 취해 제7. 일반시험법 6.유해성금속시험법 (3) 건식회화법에 따른다.

제7. 7. 1) (5)를 다음과 같이 신설한다.

(5) 금속성이물(쇳가루) 시험법

① 검체(분말제품 500g, 액상제품 1kg)에 증류수 5 ~ 6 L와 혼합 후 비닐을 씌운 봉자석(10,000 가우스 자력)으로 10분간 저어 쇳가루를 모은 후 건조하여 무게를 측정한다.

② 모은 쇳가루를 자력제거장치로 자력을 제거하고 표준망체(1.4x1.4 mm)에 통과하지 않고 남아 있는 쇳가루의 크기를 측정한다.

③ 검출된 쇳가루가 식품과 붙어있거나 물리적으로 결합된 경우 300℃에서 1시간 회화로에서 가열하여 회화시킨 후 자석으로 쇳가루를 모아 무게를 측정하고 ②에 따라 크기를 측정한다.

제 7. 15. 2) (2), ①,  네오마이신(Neomycin)을 다음과 같이 신설한다.

네오마이신(Neomycin)

Ⓐ정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 네오마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 하고 영하 20℃에 보관한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ MCX(Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지 또는 이와 동등한 것

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g에 물 20 mL를 넣고 진탕하여 충분히 녹이고 0.1 M 염산을 사용하여 pH 2로 조정한다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지(충진제 60 mg)에 흡착시키고 5 mL의 10% 메탄올성 수산화암모늄용액으로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 0.1 M 염산 1 mL로 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

- 액체크로마토그래프 조건

․ 칼럼 : C18 (2.1×100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

․ 이동상

이동상 A : 20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 수용액

이동상 B : 20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 메탄올용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
0.5	30	70
5.0	5	95
5.1	50	50
10.0	50	50

․ 유속 : 0.2 mL/min

․ 주입량 : 10 μL

- 질량분석기 조건

․ Ionization : ESI(positive)

․ Gas Temp. : 350℃

․ Gas Flow : 8 L/min (질소)

․ Nebulizer : 35 psi

․ Collision energy : 30 V

㉡ 정량

- 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 455의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 네오마이신의 함량을 구한다. 검량선 작성은 표준용액 2.5, 5.0, 10, 25, 50 μg/L의 5개 농도를 이용한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
네오마이신	615	455, 323, 163, 161

제 7. 15. 2) (2), ①,  스트렙토마이신(Streptomycin), 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin)을 다음과 같이 신설한다.

스트렙토마이신(Streptomycin), 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin)

Ⓐ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제한 후 칼럼 후 유도체화 장치가 장착된 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 스트렙토마이신, 디히드로스트렙토마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 물에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone Copolymer(충진제) 카트리지 칼럼 : HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것

㉥ 0.2 M HSA(sodium hexane-1-sulfonic acid) 완충액 : 2.0225 g HSA를 50 mL 물에 녹인다.

㉦ 0.01 M HSA 완충액 : 2.0225 g HSA를 물 1 L에 녹인다.

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 20 mL에 녹여 15분간 균질화한 후 0.2 M HSA 1 mL를 가한다. 미리 메탄올 5 mL, 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지(충진제 60 mg)에 추출액을 흡착시키고 5 mL 물로 세척한 후 5 mL의 메탄올로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 0.01 M HSA(아세트산으로 pH 3.3으로 조정) 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

- 칼럼 : C18 (3.0×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 0.01 M HSA 완충액 800 mL에 1,2-나프토퀴논-4-설폰산(1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid) 0.10408 g을 녹인 용액과 아세토니트릴 200 mL를 혼합하고 아세트산으로 pH 3.5으로 조정한 후 갈색병에 보관한다.

- 유속 : 0.8 mL/min

- 측정파장 : 여기파장 260 nm, 형광파장 435 nm

- 칼럼후 유도체화 장치

․ 이동상 : 0.2 M 수산화나트륨용액

․ 유속 : 0.5 mL/min

․ 반응코일 : 10 m

․ 반응온도 : 55℃

㉡ 정량시험

- 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 스트렙토마이신 및 디히드로스트렙토마이신 함량을 각각 구한다.

- 정량한계 : 0.1 mg/kg

제 7. 15. 3) (2),  엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin) 및 다노플록사신(Danofloxacin)을 다음과 같이 개정한다.

엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 다노플록사신(Danofloxacin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin) 및 페플록사신(Pefloxacin)

㉮ 정량법의 원리

식육, 유(乳), 알(卵), 어류 및 갑각류 등 모든 식품 중 플루오로퀴놀론계를 시료고체상분산법(MSPD, Matrix Solid Phase Dispersion) 또는 인산, 이동상 및 아세토니트릴 등으로 추출하여 헥산 또는 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 표준원액 : 엔로플록사신, 시프로플록사신, 다노플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신 표준품을 정밀히 달아 100 mL 용량플라스크에 취하고 메탄올로 표시선까지 채워 100 μg/mL 농도가 되게 한다.

Ⓑ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 적당한 농도가 되게 희석하여 사용한다.

Ⓒ 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) : 1 L 정용플라스크에 0.2 M 인산이수소칼륨(KH2PO4) 250 mL와 0.2 M 수산화나트륨 197.5 mL를 혼합한 후 물로 표시선까지 채운다.

Ⓓ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

시료를 균질화하여 5 g을 원심분리관에 취한 후 20% 메탄올성 삼염화초산 2.5 mL를 넣고 15초간 균질화한다. 이 용액을 1,500 G에서 10분간 원심분리한 후 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 12.5 mL을 가하고 1,500 G에서 15분간 다시 원심분리 한다. 상층액을 메탄올 6 mL, 물 6 mL, 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 6 mL로 차례로 미리 활성화시킨 C18 카트리지에 흡착시키고 물 3 mL로 세척한 후, 3분간 감압하에서 건조시키고 아세토니트릴성 1% trifluoroacetic acid 6 mL로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 어류 및 갑각류를 포함한 수산물

시료를 마쇄한 후 5 g을 취한 후 이동상과 아세토니트릴을 1:1로 섞은 혼합액 40 mL를 가하여 균질기로 2분간 균질화 시킨다. 이 액을 80℃에서 10분간 열처리하여 방냉 한 다음 3,000 G에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한다. 이 상등액을 분액여두로 옮겨 헥산 50  mL을 가하여 액층이 분리될 때까지 정치한다. 분리된 하층액은 40℃에서 잔사만이 남을 때까지 감압농축하고 이 건고물은 이동상 2.5 mL을 가하여 충분히 용해시킨 다음 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 사용한다.

Ⓒ Ⓐ, Ⓑ를 제외한 모든 식품

C18 분말 2 g을 유발에 취하고 시료 0.5 g을 정확히 달고 수산 0.05 g과 무수황산나트륨 0.03 g을 첨가한 후 유봉으로 C18과 시료가 완전히 균질화되도록 한다. 여과지(Whatman No. 1) 2장을 10 mL 주사기에 넣고 균질화된 혼합물을 주사기에 옮겨 담는다. 혼합물 위에 여과지 1장을 놓고 주사봉을 이용하여 혼합물의 부피가 약 4.0 mL 되게 압축한다. 헥산 8 mL를 가하여 흘려보내고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 혼합물 내에 남아있는 헥산을 음압 하에서 제거한다. 다시 에틸아세테이트 8 mL로 세척하고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 음압 하에서 완전히 건조시킨다. 메탄올 13 mL로 용출시킨 후 그 용출액을 질소 농축하여 건조시키고 이동상 0.5 mL를 가하여 10분간 초음파를 통과시키고 용해시킨 후 4℃, 6,000 G 에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 이동상 : 0.4% 트리에틸아민, 0.4% 인산의 혼합액 : 아세토니트릴 : 테트라히드로퓨란(920 : 78 : 2)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체중 엔로플록사신, 시프로플록사신, 다노플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신의 함량을 각각 구한다.

- 정량한계 : 0.05 mg/kg

제 7. 15. 3) (2),  아미트라즈(Amitraz), 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline)을 다음과 같이 신설한다.

아미트라즈(Amitraz), 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 아세톤:헥산(1:49) 혼합액으로 추출하고 0.25% 암모니아수를 넣어 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 표준품을 정밀히 달아 아세톤:헥산(1:24) 혼합액에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세톤:헥산(1:49) 혼합액에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 : 아세톤:헥산(1:49) 혼합액

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 삼각플라스크에 정밀히 달고 물 70 mL와 암모니아수 10 μL를 넣어 알칼리 조건에서 5분간 균질화한 후 추출용액 70 mL를 넣고 25분간 실온에서 교반한다. 이 액을 분액깔때기에 옮기고 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 2회 세척한 액과 합친다. 분액깔대기를 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층(아래층)은 다른 분액깔대기에 옮기고  여기에 추출용액 30 mL를 넣어 위와 같이 반복한 후 물층(아래층)은 버리고 유기용매층(윗층)을 앞의 분액 깔대기에 합친다. 0.25% 암모니아수 70 mL를 넣고 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층을 버리고 이 과정을 한번 반복한 후 유기용매층을 삼각플라스크에 옮긴다. 여기에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 약하게 흔들어 섞으면서 방치한 후 여과하고 다시 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 씻고, 이 씻은 액으로 여지상의 잔류물을 2회 반복하여 씻고 여과한다. 여액을 합쳐 35℃ 이하의 수욕조에서 유기용매를 감압 하에 날려 보낸다. 잔사를 내부표준물이 포함된 아세톤∶헥산(1:24)의 혼합액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×300 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 70% 아세토니트릴

- 유속 : 1.2 mL/min

- 측정파장 : 233 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 함량을 각각 구한다. 구해진 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 함량의 합을 검체 중 아미트라즈의 잔류량으로 한다.

제 7. 15. 3) (2),  코마포스(Coumaphos)를 다음과 같이 신설한다.

코마포스(Coumaphos)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 아세톤:헥산(1:49) 혼합액으로 추출하고 0.25% 암모니아수를 넣어 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 코마포스 표준품을 정밀히 달아 아세톤:헥산(1:24) 혼합액에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세톤:헥산(1:49) 혼합액에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 : 아세톤:헥산(1:49) 혼합액

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 삼각플라스크에 정밀히 달고 물 70 mL와 암모니아수 10 μL를 넣어 알칼리 조건에서 5분간 균질화한 후 추출용액 70 mL를 넣고 25분간 실온에서 교반한다. 이 액을 분액깔때기에 옮기고 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 2회 세척한 액과 합친다. 분액깔대기를 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층(아래층)은 다른 분액깔대기에 옮기고  여기에 추출용액 30 mL를 넣어 위와 같이 반복한 후 물층(아래층)은 버리고 유기용매층(윗층)을 앞의 분액깔대기에 합친다. 0.25% 암모니아수 70 mL를 넣고 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층을 버리고 이 과정을 한번 반복한 후 유기용매층을 삼각플라스크에 옮긴다. 여기에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 약하게 흔들어 섞으면서 방치한 후 여과하고 다시 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 씻고, 이 씻은 액으로 여지상의 잔류물을 2회 반복하여 씻고 여과한다. 여액을 합쳐 35℃ 이하의 수욕조에서 유기용매를 감압 하에 날려 보낸다. 잔사를 내부표준물이 포함된 아세톤∶헥산(1:24)의 혼합액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×300 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 70% 아세토니트릴

- 유속 : 1.2 mL/min

- 측정파장 : 313 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 코마포스 함량을 구한다.

제 7. 15. 3) (2),  플루메쓰린(Flumethrin)을 다음과 같이 신설한다.

플루메쓰린(Flumethrin)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물과 아세토니트릴을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 플루메쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 5 mL 물에 녹여 균질화한 뒤, 10 mL 아세토니트릴을 첨가하여 균질화 하고 1,000 G, 4℃에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 새로운 원심분리관에 옮기고 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 가한 다음 1,000 G, 4℃에서 5분간 원심분리한 뒤 상등액을 앞의 상등액과 합한다. 이 액에 염화나트륨 소량을 첨가하여 진탕 후 1,000 G, 4℃에서 5분간 원심분리 한 다음, 상등액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 헥산 5 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 헥산 10 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지(충진제 500 mg)에 추출액 2 mL를 흡착시키고 헥산:디클로로메탄 혼합액(55:45) 10 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 메탄올 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 85% 아세토니트릴

- 유속 : 1.0 mL/min

- 측정파장 : 266 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 플루메쓰린 함량을 구한다.

제 7. 15. 3) (2),  플루발리네이트(Fluvalinate)를 다음과 같이 신설한다.

플루발리네이트(Fluvalinate)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 가스크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

가스크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 타우플루발리네이트(tau-Fluvalinate) 표준품을 정밀히 달아 헥산에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 증류수 20 mL에 녹여 균질화한 후, 15분간 초음파를 통과시킨다. 이 액에 디클로로메탄 10 mL를 가한 후 강하게 1분간 균질화 하고 1,000 G, 영하 10℃에서 10분간 원심분리 한다. 물층에 디클로로메탄 10 mL를 가하고 강하게 1분간 균질화하여 1,000 G, 영하 10℃에서 10분간 원심분리한 후 앞의 디클로로메탄층과 합하여 황산나트륨층을 통과시켜 탈수하고  40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 50% 메탄올 4 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 8 mL와 50% 메탄올 8 mL로 활성화시킨 Sep-pak C8 카트리지(충진제 500 mg)에 추출액을 흡착시키고 물 8 mL와 50% 메탄올 8 mL로 세척한 후, 디클로로메탄 8 mL와 에틸아세테이트 4 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : DB-17 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

- 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

- 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 2분간 유지 후 15℃/분의 비율로 280℃까지 온도를 상승시켜 30분간 유지한다.

- 주입부 : 260℃

- 검출기온도 : 280℃

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 플루발리네이트 함량을 구한다.

제 7. 15. 6), (2)에 ⑤ 엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)을 삭제한다.

제 7. 15. 7), (2)에 ② 엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)을 삭제한다.

제 7. 15. 8), (2)에 ② 플루오로퀴놀론계 합성항균제[엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)]를 삭제한다.

제 7. 23유전자재조합식품의 시험법을 다음과 같이 개정한다.

유전자재조합식품의 시험법은 식품 중에 함유되어 있는 재조합 유전자 또는 그에 유래하는 외래 단백질에 관한 시험법으로서 재조합 유전자의 분석방법으로 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)과 외래 단백질의 분석방법으로 면역학적 기법인 항원항체반응에 대하여 기재한 것이다.

곡류나 두류와 같은 농산물이나 단순 분쇄 가공 농산물의 경우 재조합 유전자와 외래 단백질의 분석방법을 모두 적용할 수 있으나, 가공식품의 경우 제조․가공과정 중 단백질의 변성, 분해 등으로 인해 단백질 분석방법이 아닌 재조합유전자의 분석방법을 적용한다.

외래 단백질 분석방법으로 효소연결면역흡착검사법(Enzyme- Linked Immunosorbent Assay, ELISA)이나 lateral flow strip과 같은 간이신속검사키트를 이용할 수 있다.

재조합 유전자 분석방법으로 정성분석은 일반 PCR장치를 이용하며, 정량분석은 실시간 PCR(Real-Time PCR)장치를 이용한다. 다만, 농산물과 단순 분쇄 가공 농산물은 재조합 유전자의 정성분석과 정량분석이 모두 적용 가능하나, 가공식품은 정량분석방법이 확립될 때 까지는 정성분석만 적용한다.

1) 시료의 전처리

(1) 곡류․두류 등 원료농산물의 세정 및 분쇄

곡류 또는 두류는 최소한 3,000립 또는 1 kg 이상을 취하여 분쇄기로 균질하게 분쇄한 것을 분석시료로 사용한다. 이때 시료에 화학약품, 이물질 등이 혼입되어 검정결과에 영향을 미칠 수 있는 시료의 경우 1% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)용액에서 잘 교반하여 충분히 거품이 나도록 세정한 후, 용액을 제거하여 거품이 없어질 때까지 증류수로 10회 이상 잘 헹구어 내고 이를 건조한 후 사용한다.

(2) 수분함량이 높은 가공식품의 전처리

두유와 같이 수분함량이 높은 시료는 8,000 G로 15분간 원심분리하여 얻은 고형분 또는 55℃ 건조기에서 하룻밤 방치하거나 동결건조기를 이용하여 수분을 증발시켜 남은 고형분을 분쇄기를 이용하여 균질하게 분쇄한 것을 분석시료로 사용한다.

(3) 당분함량이 높은 가공식품의 전처리

시럽으로 코팅한 스낵과자 등 당분 함량이 높은 검체는 분쇄기로 분쇄한 다음 증류수를 가하여 당분을 녹이고 원심 분리한 후 고형분을 취한다. 당분이 충분히 제거될 때까지 수회 반복하여 얻어지는 고형분을 분석시료로 사용한다.

(4) 흡수성이 높은 가공식품의 전처리

흡수성이 높은 가공식품의 경우 적당량의 멸균증류수를 가하고 분쇄기를 이용하여 균질화한 후 8,000 G로 15분간 실온에서 원심분리하여 얻은 고형분을 분석시료로 사용한다.

2) 시료의 칭량 및 오염 방지

DNA를 추출하기 위해 시료를 칭량할 때에는 오염을 방지하기 위해 정밀저울의 본체와 주변을 70% 에탄올로 깨끗이 닦은 후 식품 포장용 랩을 깔고 DNA 추출 시험에 사용할 튜브에 직접 시료를 칭량한다. 칭량에 사용되는 도구는 가능한 1회용을 사용하며, 불가피한 경우 시료마다 다른 도구를 사용한다. 칭량 후 튜브의 입구 주위를 깨끗이 닦아낸 후 마개를 닫는다.

3) DNA 추출․정제법

DNA추출․정제법으로는 계면활성제인 세틸트리메틸암모니움브로마이드(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, CTAB)와 페놀클로로포름 혼합액을 사용하여 DNA를 추출․정제하는 CTAB법과, 실리카겔 막 형태, 실리카를 베이스로 한 레진 형태 및 자기흡착 비드 형태 등과 같은 DNA 추출 kit를 이용하는 방법이 있다.

CTAB법은 적용범위가 넓고 PCR의 저해물질이 남을 가능성이 적어 순도 높은 DNA를 얻을 수 있는 방법이며, 시판되고 있는 DNA추출 kit는 적용범위가 한정되는 경우가 있어 가공식품의 유형에 따라 적용가능여부를 별도로 확인할 필요가 있다.

이들 방법을 사용하여 콩, 옥수수, 감자 및 이들 가공품으로부터 PCR에 이용할 수 있는 DNA를 추출․정제할 수 있으며, 분석시료에 대하여는 유전자 추출시험을 2회 반복하고 각각의 추출 DNA에 대하여 PCR을 실시한 후 결과를 판정한다.

본 시험법에서 증류수라 함은 특별한 사유가 없는 한 역침투막 정제 등에 의해 17 MΩ/cm까지 정제한 초순수로 DNA, DNase 등의 오염이 없는 것을 사용하여야 한다.

(1) CTAB법

분쇄한 시료로 2 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, CTAB 완충액 15 mL를 가하여 혼합기(vortex mixer)로 잘 섞은 후 추가로 CTAB 완충액 30 mL를 가하고 55℃에서 30분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 30분간 반응 이후 혼합기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600 μL를 1.5 mL 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500 μL를 가하여 잘 혼합한 후 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 500 μL를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합한 후, 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500 μL의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 12,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하고, 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 상층액을 마이크로피펫으로 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. TE 완충액(pH 8.0) 50 μL를 가하여 잘 혼합하고, 실온에서 15분간 때때로 흔들어주면서 완전히 녹인다(잘 녹지 않으면 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹인다). 추출된 DNA를 정제하기 위하여 위의 용액에 RNase A(10 ㎎/mL) 5 μL를 가하여 37℃에서 30분간 정치한다. 200 μL의 CTAB 완충액을 가한 후, 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250 μL를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 이때 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 취한다. 200 μL의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 침전물에 닿지 않도록 마이크로피펫으로 상층액을 버리고, 200 μL의 70% 에탄올을 벽면으로 조심스럽게 가하여 침전물을 씻어낸 후, 다시 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거한다. 그런 다음 12,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50 μL의 멸균수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 실온에서 15분간 때때로 흔들어주면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다(잘 녹지 않으면 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹인다).

[시약의 조제]

① CTAB완충액

비이커에 0.5M EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid)용액(pH 8.0) 8 mL, 1M Tris-염산 완충액(pH 8.0) 20 mL, 5M 식염수 56 mL를 넣고 증류수로 약 150 mL가 되도록 한 후, CTAB 4 g을 가하여 완전히 용해시킨다. 증류수를 넣어 전체 양을 200 mL로 조정한 후, 121℃에서 15분간 멸균한다.

② 페놀-클로로포름 혼합액

1 M Tris-염산용액(pH 8.0)으로 포화한 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜을 25:24:1(v/v/v)로 혼합한다.

③ 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액

클로로포름과 이소아밀알콜을 24:1(v/v)로 혼합한다.

④ TE 완충액(pH 8.0)

각각의 최종농도가 10mM Tris-염산용액(pH 8.0), 1mM EDTA용액(pH 8.0)이 되도록 멸균증류수를 사용하여 조제한다.

(2) 실리카겔 막 형태를 이용한 방법

QIAGEN Plant Maxi kit 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 키트를 해당 제조사의 사용방법을 참고하여 DNA를 추출한다.

① 콩 또는 콩 가공품

QIAGEN Plant Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, AP1 완충액(미리 65℃로 가온한 것) 10 mL와 RNase A(100 ㎎/mL) 20 μL를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이때 매 15분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 1시간 반응 이후 스윙로터(Swinging-bucket Rotor)를 사용하여 3,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리하고 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 상층액(7 mL)을 취하여 새로운 50 mL 튜브에 옮긴다. AP2 완충액 2.5 mL를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000 G로 35분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(8 mL)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후, 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 5분간 실온에서 원심분리한다. 칼럼을 통과한 여액(7.5 mL)을 새로운 50 mL 튜브에 옮겨 10초간 잘 혼합한 후 이 액(6.8 mL)을 새로운 50 mL 튜브에 옮긴다. 에탄올을 첨가한 AP3 용액을 1.5배량(10.2 mL) 넣어 10초간 잘 혼합한 후, DNeasy Maxi Spin Column에 옮기고 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 5분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시키고 칼럼을 통과한 여액은 버린다. 칼럼에 AW 용액 12 mL를 가하고 3,000 G에서 15분간 실온에서 원심분리하여 세척한 후, 칼럼을 새로운 50 mL 튜브에 옮겨, 미리 65℃로 가온한 멸균증류수 1 mL를 가하고 실온에서 5분간 둔 후 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 10분간 실온에서 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다. 용출액을 2 mL 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터(Fixed-angle Rotor)를 사용하여 12,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 마이크로피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 70% 에탄올 500 μL를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어낸다. 12,000 G로 3분간 4℃에서 원심분리한 후 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50 μL의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다.

② 옥수수 또는 옥수수 가공품

QIAGEN Plant Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, AP1 완충액(미리 65℃로 가온한 것) 5 mL와 RNase A(100 ㎎/mL) 10 μL를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이때 매 15분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. AP2 완충액 1.8 mL를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(4.2 mL)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후, 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 5분간 실온에서 원심분리한다. 칼럼을 통과한 여액(4 mL)을 새로운 50 mL 튜브에 옮겨 10초간 잘 혼합한 후 이 액(3.4 mL)을 새로운 50 mL 튜브에 옮긴다. 에탄올을 첨가한 AP3 용액을 1.5배량(5.1 mL) 넣어 10초간 잘 혼합한 후, DNeasy Maxi Spin Column에 옮기고 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 5분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시키고 칼럼을 통과한 여액은 버린다. 칼럼에 AW 용액 12 mL를 가하고 3,000 G에서 15분간 실온에서 원심분리하여 세척한 후, 칼럼을 새로운 50 mL 튜브에 옮겨, 미리 65℃로 가온한 멸균증류수 1 mL를 가하고 실온에서 5분간 둔 후 스윙로터를 이용하여 3,000 G에서 10분간 실온에서 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다. 용출액을 2 mL 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터를 사용하여 12,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 마이크로피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 70% 에탄올 500 μL를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어낸다. 12,000 G로 3분간 4℃에서 원심분리한 후 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50 μL의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 4℃에서 12～24시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다.

③ 감자 및 감자 가공품

QIAGEN의 DNeasy Plant Mini kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 200 ㎎을 원심분리용 튜브(15 mL용)에 넣어, 미리 65℃로 가온한 AP1 완충액 1.5 mL와 RNase A(100 ㎎/mL) 10 μL를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65℃에서 15분간 반응시킨다. 5분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. AP2 완충액 400 μL를 가하여 얼음 속에 5분간 정치한 후, 10,000 G로 5분간 실온에서 원심분리한다. 원심분리 후 맑은 상층액을 다른 원심분리용 튜브에 옮기고, 그중 500 μL를 QIA Shredder Spin Column에 가하여 10,000 G로 2분간 실온에서 원심분리하여 칼럼을 통과한 여액을 새로운 튜브에 옮긴다. 남은 상층액도 같은 과정으로 반복한다. 얻어진 여액을 2 mL 튜브 2개에 각각 옮긴 후 에탄올을 첨가한 AP3 용액 1.5배량을 가하여 10초간 잘 혼합한다. 이 액을 500 μL씩 나누어 같은 DNeasy Mini Spin Column에 가하고 10,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시킨 후 칼럼을 통과한 하층액은 버린다. 칼럼에 AW 용액 500 μL를 가하여 10,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하여 세척하고, 한번 더 AW 용액 500 μL를 가하여 같은 조작을 반복한다. 이 칼럼을 건조시키기 위해 10,000 G로 15분간 실온에서 원심분리한 후 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 칼럼에 미리 65℃로 가온한 멸균수 50 μL을 가하여 실온에서 5분간 둔 후 10,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 용출시킨다. 한번 더 칼럼에 미리 65℃로 가온한 멸균수 50 μL을 가하여 같은 조작을 반복하고, 이를 DNA 시료 원액으로 한다.

※ 참고

DNA 추출․정제법 중 실리카겔 막 형태를 이용한 방법으로 소개된 QIAGEN Plant Maxi kit와 QIAGEN DNeasy Plant Mini kit에서 사용된 AP1 및 AP2 완충액과 RNase A는 키트에 포함되어 있는 것 외에 별도로 판매되고 있다.

4) DNA 시료의 농도 및 순도 확인과 농축

DNA 시료 원액의 농도는 DNA 시료 원액을 TE 완충액(pH 8.0)으로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50 ng/μL인 것으로 하여 계산한다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정한다. A260/A280과 A260/A230이 1.7～2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단한다. 다만, 가공식품의 경우 이러한 순도 적용이 어려운 경우가 있으므로 반드시 적용되는 것은 아니다. 만일 A260/A280이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소(protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A260/A230이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용한다.

DNA 시료 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR에 필요한 DNA 농도가 되도록 TE 완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수로 희석하여 잘 흔들어 섞은 후 spin down한 것을 PCR용 DNA 시료로 하고, 20 μL씩 0.5 mL 튜브에 분주하여 -20℃ 이하에서 냉동 보존한다. 소분 보관 중인 PCR용 DNA 시료는 사용 전 실온에서 서서히 녹여 잘 흔들어 섞은 후 spin down하여 사용하고, PCR 후 남은 용액은 재사용하지 않고 폐기한다. 또한 DNA시료 원액의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 재추출하고, 그래도 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 원액을 PCR용 DNA 시료로 사용하거나 다음과 같은 농축과정을 실시하여 사용한다.

추출 DNA 시료 원액의 농축은 시중에 판매되고 있는 DNA 농축킷트를 사용하거나, 다음과 같은 방법에 의한다. 3M 초산나트륨 (pH 5.2)을 DNA 용액량의 1/10배 (10M 초산암모늄을 사용할 경우에는 1/5배를 첨가)를 첨가하고 차게 한 에탄올을 2배량 가한 후 12,000 G에서 15분간 원심분리한다 (이소프로필알콜을 사용할 경우에는 1배량을 첨가한 후 상온에서 원심분리한다). 원심분리 후 상층액은 버리고 염(salt)을 제거하기 위하여 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, TE 완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수 적당량으로 녹인 후 사용한다.

최초의 DNA 시료 원액이 소량일 경우에는 멸균증류수를 사용하여 시작량을 300～400 μL로 한 후 농축해도 무방하다.

5) 정성분석방법

정성분석은 일반 PCR을 이용하며, 추출된 DNA 시료를 주형 DNA(template DNA)로 하여 검색하고자 하는 DNA의 프라이머를 이용하여 DNA를 증폭한 후 전기영동에 의하여 증폭된 DNA를 확인한다.

PCR에서는 주형 DNA가 소량 존재하여도 증폭되므로 추출된 DNA 이외의 DNA(특히 PCR 증폭산물)가 혼입되지 않도록 실험에 사용되는 기구 및 시약은 물론 실험실 환경의 관리에 주의해야한다. 또한, DNA는 인간의 피부표면에서 분비되고 있는 DNA 분해효소에 의해 분해될 수 있기 때문에 이러한 효소의 혼입을 방지하기 위하여 사용하는 모든 튜브와 팁은 사용하기 전에 121℃에서 20분 이상 멸균 처리한 1회용품을 사용한다. 각종 시액 조제에 사용하는 용액류 등도 열에 불안정한 것은 제외하고 모두 121℃에서 15분 이상 멸균 처리하여 사용한다. 멸균증류수나 TE 완충액(pH 8.0)에 DNA 분해효소가 혼입되면 피해가 확산되므로 각 실험자마다 별도로 제조하여 사용하며, 조금씩 자주 만들어 사용한다. DNA를 취급할 때에는 무균상자(clean bench)와 같은 독립된 공간을 사용하며, 실험대 위를 70% 에탄올로 깨끗이 닦고, 반드시 실험용 고무장갑 등을 착용하며, 실험용 고무장갑은 표면에 분말이 없는 것을 사용한다.

(1) 프라이머의 준비

PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1 및 표2와 같다. 그밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있으나, PCR 증폭산물이 200bp 이상이 되게 하는 프라이머는 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

(2) PCR용 시약의 조제

Taq DNA polymerase(이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase도 사용할 수 있다) 등의 필요한 시약을 갖추어 PCR을 실시한다. 필요한 시약 및 절차는 다음과 같으며, 추출한 DNA를 주형으로 유전자가 증폭되는 것을 확인하기 위하여 반드시 각 원료에 대응하는 내재성 유전자용 프라이머를 이용한 PCR을 함께 행하여 목적하는 증폭산물이 얻어지는 지를 확인해야 한다.

① 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제

0%와 2% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 각각 DNA를 추출한 DNA 용액을 양성 대조군으로 사용한다. 한편, 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 외에도 제조사에서 해당 프라이머에 특이적으로 제작하여 시판 중인 양성 확인용 DNA 플라스미드를 반응대조군으로 사용할 수 있다.

② PCR 반응 시약의 조제

PCR 반응에 필요한 시약은 ㉮ Taq DNA polymerase (내열성 DNA 중합효소), ㉯ dNTPs (deoxynucleotides 용액), ㉰ PCR 완충액(Mg+2이온을 함유한 MgCl2를 포함되지 않은 경우 별도의 MgCl2가 필요함), ㉱ 프라이머이며, 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표 3과 같다.

③ 반응 대조군의 조제

각 PCR 반응시에는 음성대조군(negative control)으로 ㉮ DNA를 함유하지 않는 것(PCR 반응계의 오염 확인용), ㉯ 프라이머를 함유하지 않는 것(프라이머를 제외한 반응계의 오염 확인용)을, 양성대조군(positive control)으로 ㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA을 함유한 것(DNA 추출이 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 동일 작물로서 0% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA), ㉱ 검출하고자 하는 재조합 DNA를 함유한 것(PCR 반응계가 올바르게 이루어졌는가의 확인용, 2% 표준시료(IRMM에서 제조하여 Fluka사에 의해 시판되는 제품 또는 이와 동등한 제품)에서 추출한 DNA 또는 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하는 양성 확인용 플라스미드)을 시료와 함께 PCR시험을 한다.

표 1. PCR 검사에 사용되는 프라이머 및 프로브

목적	품 종 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 (118 bp) 옥수수 (151 bp)	Le1n02-5' Le1n02-3' Le1-Taq SSllb 1-5' SSllb 1-3' SSllb-Taq	5'-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3' 5'-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3' 5'-FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3' 5'-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3' 5'-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3' 5'-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A -TAMRA-3'
스크 리닝	CMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	P35S 1-5' P35S 1-3' P35S-Taq NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' NOS-Taq	5'-ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG T-3' 5'-CCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T-3' 5'-FAM-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-TAMRA-3' 5'-GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TG-3' 5'-CGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T-3' 5'-FAM-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-TAMRA-3'
구조 유전자	[콩] RRS (121 bp) [옥수수] Bt176 (100 bp) Bt11 (127 bp) GA21 (133 bp) T25 (149 bp) MON810 (113 bp) NK603 (143bp) TC1507 (103bp)	RRS 01-5' RRS 01-3' RRS-Taq Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt176-Taq Bt11 3-5' Bt11 3-3' Bt11-Taq GA21 3-5' GA21 3-3' GA21-Taq T25 1-5' T25 1-3' T25-Taq M810 2-5' M810 2-3' M810-Taq NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3'	5'-CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGG-3' 5'-GAC TTG TCG CCG GGA ATG-3' 5'-FAM-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-TAMRA -3' 5'-TGT TCA CCA GCA GCA ACC AG-3' 5'-ACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T-3' 5'-FAM-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-TAMRA-3' 5'-AAA AGA CCA CAA CAA GCC GC-3' 5'-CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CT-3' 5'-FAM-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-TAMRA-3' 5'-GAA GCC TCG GCA ACG TCA-3' 5'-ATC CGG TTG GAA AGC GAC TT-3' 5'-FAM-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG - TAMRA-3' 5'-GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA-3' 5'-TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT-3' 5'-FAM-TGC AGG CAT GCC CGC TGA AAT C- TAMRA-3' 5'-GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A-3' 5'-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG-3' 5'-FAM-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-TAMRA-3' 5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3'

표 2. Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판 중인 프라이머

검출 대상 유전자	프라이머 쌍	증폭산물 크기	비 고
[콩] 내재성유전자 재조합유전자 (전사개시유전자) 재조합유전자 (전사종결유전자) 재조합유전자 (구조유전자)	Le1n02-5' Le1n02-3' P35S1-5' P35S1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' RRS 01-5' RRS 01-3'	118bp 101bp 151bp 121bp	Le1/sense Le1/antisense P35S/sense P35S-pro/antisense tNOS/sense tNOS/antisense CTP4 from P.hybrida/sense EPSPS/antisense
[옥수수] 내재성유전자 내재성유전자 재조합유전자 (전사개시유전자) 재조합유전자 (전사종결유전자) 재조합유전자 (Bt176 검출용) 재조합유전자 (Bt11 검출용) 재조합유전자 (GA21 검출용) 재조합유전자 (T25 검출용) 재조합유전자 (M810 검출용) 재조합유전자 (CBH351 1차검출용) 재조합유전자 (CBH351 2차확인용)	SSIIb 1-5' SSIIb 1-3' SSIIb 3-5' SSIIb 3-3' P35S 1-5' P35S 1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' Bt176 2-5' Bt176 2-3' Bt11 3-5' Bt11 3-3' GA21 3-5' GA21 3-3' T25 1-5' T25 1-3' M810 2-5' M810 2-3' CaM03-5' CBH02-3' Cry9C-5' 35Ster-3'	151bp 114bp 101bp 151bp 100bp 127bp 133bp 149bp 113bp 170bp 171bp	zSSIIb/sense zSSIIb/antisense zSSIIb/sense zSSIIb/antisense P35S/sense P35S/antisense tNOS/sense tNOS/antisense cryIA(b)/sense PEPC#9 intron /antisense adh1-1S/sense cryIA(b)/antisense OTP/sense m-epsps/antisense pat/sense t35S/antisense hsp70 /sense cryIA(b)/antisense CaM03/sense CBH02/antisense cry9C/sense t35S/antisense
[감자] 내재성유전자 내재성유전자 재조합유전자 (NewLeaf Plus 1차검출용) 재조합유전자 (NewLeaf Plus 2차확인용) 재조합유전자 (NewLeaf Y 1차검출용) 재조합유전자 (NewLeaf Y 2차확인용)	Pss 01n-5' Pss 01n-3' UGPase01-5' UGPase01-5' p-FMV02-5' PLRV01-3' PLRV-rep1-5' PLRV-rep1-3' p-FMV05-5' PVY02-3' pVY01-5' pVY01-3'	216bp 111bp 234bp 172bp 225bp 161bp	S.tuberosum sucrose synthase/sense 상동/antisense UGPase/sense UGPase/antisense p-FMV/sense PLRV/antisense PLRV/sense PLRV/antisense p-FMV/sense PVY/antisense PVY/sense PVY/antisense

표 3 PCR 반응액의 조성

성 분	Stock용액 농도	최종 농도(튜브)	1회 분량
DNA polymerase*	5 U/μL	0.625 U	0.125 μL
완충액	10 x	1 ×	2.5 μL
MgCl2**	25 mM	1.5 mM	1.5 μL
dNTPs	2.5 mM	200 μM	2 μL
프라이머	각 25 μM	각 0.5 μM	0.5 μL
주형DNA	20 ng/μL	50 ng	2.5 μL
멸균증류수		반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	15.875 μL
전체량			25 μL

* DNA polymerase는 95℃의 고온에서 10분간 활성화시켜 사용하는 Taq DNA polymerase를 사용한다.

** MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 산출량에 크게 영향을 준다. 보통 1.5～2.5mM이 주로 이용되며, 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR산물의 산출률이 감소한다.

(3) PCR

각 추출 DNA에 대한 PCR은 2회의 확인시험으로 나누어 아래의 방법으로 실시하며, 1차 확인시험에서는 내재유전자와 전사개시인자(promoter 35S) 및/또는 전사종결인자(NOS terminator)에 대한 프라이머로 PCR을 실시한다. 그 결과 2 반복 추출 시료 중 하나 이상에서 목적하는 증폭산물(내재성 유전자와 35S 프로모터 및/또는 NOS 터미네이터)이 모두 검출된 추출 유전자를 주형 DNA로 하여 구조유전자에 대한 프라이머를 사용하여 2차 확인시험을 한다.

① Master mixture의 조제

PCR을 하고자 하는 시료 수에 맞춰 사용하는 튜브의 수를 정하고, 이에 따른 전체 필요량에 여유분을 더하여 master mixture의 양을 정한다. 주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 3의 PCR 반응액의 조성과 같이 되도록 하여 혼합한다. Master mixture는 얼음 위에서 취급하며, PCR용 튜브에 각 22.5 μL씩 소분한다. 프라이머를 사용하지 않는 음성대조군에 대해서는 별도로 프라이머를 함유하지 않은 master mixture로부터 22 μL를 분주하고 멸균증류수 0.5 μL를 가한다.

② 주형 DNA의 첨가

분취한 master mixture 22.5 μL에 주형 DNA용액 2.5 μL를 첨가한다. 주형 DNA의 첨가는 음성대조군, 추출 DNA(20 ng/μL), 양성대조군의 순서로 행한다.

③ PCR 증폭

모든 반응액을 분주한 후 PCR을 실시하는데, PCR의 조건은 프라이머마다 다를 수 있다. Nippon Gene사에서 제작하여 시판하고 있는 프라이머를 이용할 경우의 반응조건은 표 4와 같다. 95℃에서 10분간 방치하여 최초의 변성이 일어나게 한 후, 95℃에서 30초간 변성시키고(denaturation), 60℃에서 30초간 유전자를 결합시키며(annealing), 72℃에서 30초간 신장반응(extension)이 일어나도록 하는 것을 1회로 하여, 40회를 반응시킨다. 이후 72℃에서 7분간 최종 신장반응(elongation)을 하고, 모든 반응이 종료되면 4℃를 유지하도록 설정한다. 이상에서 얻어진 PCR 산물은 바로 전기영동하여 증폭산물을 확인하거나 냉동 보관한다.

표 4 PCR 반응 조건

	온도	시간	cycle 수
최초의 변성	95 ℃	10 분	1 cycle
변성 (denaturation) 결합 (annealing) 신장 (extension)	95 ℃ 60 ℃ 72 ℃	30 초 30 초 30 초	40 cycle
최종신장 (elongation)	72 ℃	7 분	1 cycle
보존	4 ℃	-	-

＊상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

(4) 전기영동에 따른 결과의 판정

PCR 증폭 결과는 아가로스겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)을 이용한 전기영동에 의해 확인할 수 있으며, 여기에서는 아가로스겔 방법을 제시한다.

① 영동조의 준비

이 단계에서는 특별하게 멸균한 기구를 이용할 필요는 없으나 오염 등의 위험방지를 위해 실험용 고무장갑을 착용하여 조작한다.

먼저 겔 조제용 틀(gel maker)을 조립한다. 겔의 농도는 전기영동할 DNA의 길이와 아가로스 겔의 종류에 따라 결정한다. 본 실험에서는 전기영동하고자 하는 대상이 시료에서 추출한 DNA와 크기가 100～200 bp 전후의 PCR 증폭산물이므로 이에 적합한 아가로스 겔을 제조사의 설명서를 참고하여 사용한다. 필요량의 아가로스를 칭량하여, 전기영동 완충액을 넣고 가열하여 아가로스를 녹여 사용한다. 전기영동 완충액으로는 0.5배 또는 1배의 TAE(Tris-acetate/EDTA) 완충액 또는 TBE (Tris-borate/EDTA) 완충액을 사용할 수 있으나, 아가로스 겔의 제조 시 사용된 완충액과 같은 것을 전기영동과정 및 겔의 염색과정에서도 사용하여야 한다. 또한 200 bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃정도로 식혀서 겔 조제용 틀에 넣고 콤(comb)을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 전(前)염색법의 경우 겔 조제용 틀에 넣기 전에 아가로스겔 100mL당 5μL의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10㎎/mL)을 넣고 잘 혼합하며, 후(後)염색법의 경우 겔 조제 시 에티디움 브로마이드를 넣지 않는다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 전기영동 완충액을 부어 콤을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 전기영동 완충액을 채운다.

② 전기영동

PCR 증폭산물에 1/6배의 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 조심스럽게 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA)을 넣는다. 이때 용량은 최대 10 μL를 넘지 않도록 한다. 시료를 주입 후, 사용하는 전기영동조의 규격에 맞는 전압에서 전기영동한다. 염색액에 함유된 BPB (Bromophenol Blue)가 겔의 1/2에서 2/3가량 진행하면 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인한다.

③ 겔의 염색

후(後)염색법의 경우 전기영동 완충액 100 mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10 ㎎/mL)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 전기영동 완충액에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다.

[주의사항]

에티디움 브로마이드(Ethidium bromide) 시약은 2중 나선 DNA의 나선 사이에 삽입되는 형광시약으로 강력한 돌연변이원성 물질이므로 취급에 주의해야한다. 취급 시 반드시 고무장갑을 끼고 마스크를 착용하여야 한다. 폐액은 에티디움 브로마이드 처리용의 기구를 사용하는 것이 좋으나, 그럴 수 없는 경우에는 반드시 활성탄(Activated charcoal) 등으로 처리한 후에 폐기하고 고농도의 경우 처리업자에게 위탁한다.

④ 결과의 확인

화상분석기나 Trans-illuminator에 식품포장용 랩을 깔고, 그 위에 염색이 끝난 겔을 올려놓고 자외선을 조사한다. CCD 카메라에 의한 촬영으로 영동 유형을 확인하며, 표식유전자와 비교하여 목적하는 위치에서 밴드(band)가 얻어졌는지를 확인한 후 결과는 화상데이터로 보존해둔다. 폴라로이드 카메라를 사용할 경우 겔의 사진을 촬영하여 보관한다.

(5) 분석 결과의 판정 및 처리

전기영동 결과로부터 목적하는 PCR 증폭산물이 얻어졌는지를 확인한 후 다음과 같이 분석결과를 판정한다.

① 우선 반응 대조군 중 음성대조군(negative control)인 ㉮ DNA를 함유하지 않는 것과 ㉯ 프라이머를 함유하지 않는 것에서 PCR산물이 검출되지 않음을 확인한 후, 양성대조군(positive control)인 ㉰ 비유전자재조합(non-GMO) DNA을 함유한 것에서 내재유전자의 PCR 산물은 검출되나 재조합유전자 PCR 산물은 검출되지 않음과 ㉱ 목적하는 재조합유전자를 함유한 것에서 내재유전자 PCR 산물과 도입된 재조합유전자 PCR 산물이 모두 검출되는지를 확인하여야 하며, 이들 결과 중 어느 하나라도 일치하지 않는 경우에는 재시험을 하여야한다.

② 2반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과 하나 이상의 추출 DNA에서 1차 및 2차 확인 시험에 의해 내재유전자와 도입된 재조합유전자 특이 PCR산물이 모두 확인된 경우 ‘검출’로 판정하며, 2반복 추출 DNA에 대하여 내재유전자의 PCR산물은 모두 검출되나, 재조합유전자 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 ‘불검출’로 판정하며, 2반복 모두 내재유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 유전자추출과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험 결과에서도 내재유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우 ‘검사불능’으로 판정한다(표5).

③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810, NK603, TC1507이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603이 있다.

④ 이상과 같이 하여 정성분석에서 ‘검출’로 판정된 경우 구분유통증명서 등의 구비여부를 확인하여 표시제도 위반 여부를 확인하며, 농산물에 대해서는 정량분석을 실시한다. 다만, 스타링크 옥수수(CBH351)와 같이 식용으로 부적합하다고 평가 받은 것이나 안전성 평가심사를 받지 않은 품목의 검사인 경우 구분유통증명서의 확인이나 정량분석을 실시하지 않는다.

표 5  결과판정의 흐름도(예시)

사례	추출 DNA	1차 확인		2차 확인	GMO 여부 판정
		내재성유전자	P35S, tNOS	구조유전자
사례 1	추출 1	+	+	+	검출
	추출 2	+	+	+
사례 2	추출 1	+	+	+	검출
	추출 2	+	+	-
사례 3	추출 1	+	+	+	검출
	추출 2	+	-	/
사례 4	추출 1	+	+	+	검출
	추출 2	-	-	/
사례 5	추출 1	+	+	-	불검출
	추출 2	+	+	-
사례 6	추출 1	+	+	-	불검출
	추출 2	+	-	/
사례 7	추출 1	+	+	-	불검출
	추출 2	-	-	/
사례 8	추출 1	+	-	/	불검출
	추출 2	+	-	/
사례 9	추출 1	+	-	/	불검출
	추출 2	-	-	/
사례 10	추출 1	-	/	/	검사 불능
	추출 2	-	/	/

+ : 특이적 밴드가 검출됨

- : 특이적 밴드가 검출되지 않음

/ : 실험이 불필요함

1. 한 시료당 추출 2회를 하여 PCR을 하되, 사례 10의 경우 추출 1회를 추가로 실시하여 PCR을 한다.

2. 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터의 경우 유전자재조합 품종에 따라 검출되지 않을 수도 있다.

3. 감자와 스타링크 옥수수(CBH351)에 대하여 Nippon gene사(일본)에서 시판되는 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우 프로모터와 터미네이터 대신 1차 검출용 프라이머를 사용하여 실험한다.

6) 정량분석방법

현재까지의 기술로는 PCR법을 이용한 유전자재조합식품의 정량분석으로 절대량을 알 수는 없지만, AOAC학회지에 보고된 방법에 의해 해당하는 농작물이 반드시 가지고 있는 내재성유전자에 대한 재조합유전자의 존재비율로부터 재조합체가 얼마나 존재하는지를 상대적으로 측정할 수 있다.

이 방법은 일반 PCR에서 이용되는 polymerase 반응용 프라이머와 함께 주형 DNA에 상보적 염기서열을 가지면서 형광물질이 결합된 DNA 프로브(probe, 탐침자) 등이 필요하며, polymerase 반응이 거듭됨에 따라 증가하는 증폭산물에 이들이 특이적으로 결합할 때 프로브에서 분리되는 형광물질의 양을 동역학적으로 측정하여 주형 DNA양을 산출하는 실시간유전자증폭반응장치(Real-Time PCR)가 필요하다.

PCR을 이용한 정량법으로는 특수한 장치를 필요로 하지 않는 경합적 PCR법이나 외부표준시료로 정량표준곡선을 만들어 측정하는 방법도 사용할 수 있다.

(1) 실시간유전자증폭반응

TaqMan Chemistry를 이용한 정량법에는 3'과 5'의 두 프라이머 쌍의 DNA서열에 결합하는 리포터(reporter)와 소광제(quencher)의 두 색소를 결합시킨 형광 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 사용한다. 이 프로브가 DNA polymerase의 5’-nuclease 활성에 의해 가수분해되면 리포터색소가 소광제 색소로부터 분리되어 형광을 발하게 된다. 형광강도는 PCR 반응 회수에 대해 지수함수(指數關數)적으로 증강한다. 따라서 일정한 형광강도에 따른 PCR 반응횟수를 비교하여 원래의 DNA양을 구할 수 있게 된다.

유전자재조합식품의 정량분석은 비유전자재조합체(non-GMO)에 보편적으로 존재하는 유전자를 내재성 유전자로 사용하여, 내재성 유전자 양에 대한 재조합유전자 양의 비를 구하여 정량치를 계측한다.

(2) 유전자재조합 콩의 정량

콩의 경우 콩에 보편적으로 존재하는 렉틴(lectin)유전자를 내재성 유전자로 하여, 렉틴유전자와 재조합유전자 각각을 확인하는 프라이머 쌍(Lel-n02)과 프로브(Lel-Taq)를 사용하여 각각 정량 PCR을 하고 얻어진 시료 중 복제 수를 구한다. 재조합유전자의 복제 수를 렉틴유전자의 복제 수로 나누고, 그 값을 미리 정한 계수(보정계수: 종자를 사용하여 요구된 정량 PCR반응에서 검출되는 종자 중의 내재성 유전자(대두의 경우 렉틴유전자) 수에 대한 재조합유전자 수의 비를 구한 것으로, 각 프라이머 쌍 및 프로브를 이용할 때의 보정계수는 대상품목별로 규정된다)로 다시 나누어 얻은 값에 100을 곱한 것이 시료 내에 함유된 유전자재조합 콩의 % 함량이 된다.

(3) 유전자재조합 옥수수의 정량

옥수수의 경우 여러 종의 유전자재조합 품종(Bt176, Bt11, T25, Mon810, GA21)이 있고 이들이 혼재하고 있을 수 있어 분석대상이 복수이므로 우선 정성분석 결과에 근거하여 각각의 품종별로 정량하고, 유전자재조합 옥수수의 품종별 정량치를 합산하여 결과를 판정한다.

분석 방법은 사용하는 프라이머 쌍과 프로브를 제외하면 콩의 정량 PCR법에서 제시된 방법과 동일하다. 옥수수의 경우 옥수수에 보편적으로 존재하는 내재성 유전자로서 전분합성효소(Starch Synthase IIb (SSIIb)) 유전자를 사용하며, 이 유전자에 특이적인 프라이머 쌍(SSIIb-3)과 프로브(SSIIb-Taq)를 사용하여 얻은 유전자의 복제 수와 분석대상이 되는 재조합유전자에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 사용하여 얻은 재조합유전자의 복제 수를 산출하여 유전자재조합 옥수수 품종별 함량을 구한다.

유전자재조합 품종 Bt176, Bt11, T25, MON810, GA21은 정량용 프라이머 쌍 및 프로브인 Bt176-2와 Bt176-Taq, Bt11-3과 Bt11-Taq, T25-1과 T25-Taq, M810-2와 M810-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq을 각각 사용한다.

주로 재배되는 유전자재조합 콩 및 옥수수의 각각의 품종에 대한 보정계수는 Real-Time PCR 기기의 기종별로 차이가 있으며, 그 값은 표6, 표7, 표8, 표9와 같다.

(4) 검량선용 표준액

복제수를 아는 유전자재조합 작물별 플라스미드 DNA 표준용액을 검량선용 표준액으로 사용한다. 검량선을 작성하기에 적당한 복제수(예를 들면 웰 당 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 복제수)가 되도록 대장균의 ColE1/TE DNA용액(5 ng/μL)을 사용하여 희석한 것을 사용한다.

표 6. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7700 및 5700)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.39	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.44	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.01	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.34	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	1.99	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.05	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 7. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7900HT 96well)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.40	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	1.99	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.34	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.02	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.36	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.04	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 8. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(ABI PRISM™ 7900HT 384well)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.39	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.43	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.06	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.37	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.12	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.38	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.00	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

표 9. 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(LightCycler)

작물명	계통	보정계수	비고
옥수수	35S 프로모터 스크리닝	0.53	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 P35S-1과 P35S-Taq 사용
	Bt11	0.63	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt11-3과 Bt11-Taq 사용
	GA21	2.63	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 GA21-3과 GA21-Taq 사용
	T25	0.31	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 T25-1과 T25-Taq 사용
	Bt176	2.60	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Bt176-2와 Bt176-Taq 사용
	MON810	0.49	SSIIb-3와 SSIIb-Taq 및 Mon810-2와 Mon810-Taq 사용
콩	40-3-2 (RRS)	1.01	Le1-n02와 Le1-Taq 및 RRS-01과 RRS-Taq 사용

(5) 정량PCR용 반응액의 조제

정량PCR에 사용하는 모든 시약은 실온에서 녹인 후 혼합기를 사용하여 충분히 혼합하고 spin down하여 사용한다. 사용하는 시약은 같은 팁을 사용하여 연속하여 주입하면 피펫내의 공기가 냉각되기 때문에 2번째부터는 통상의 피펫조작으로는 정확하게 주입되지 않으므로 주의한다. 피펫의 설명서에 쓰인 저온 시험재료를 취급할 경우의 조작법을 숙지하여 사용한다. 또한, Universal PCR Master Mix와 같이 점성이 강한 시약을 다룰 때에는 피펫을 액면에 수직이 되게 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지 서서히 버튼을 누른 뒤 조금 더 깊숙이 누른 후 아주 서서히 버튼에서 힘을 빼 Taq polymerase를 흡입하고 그 상태에서 다시 피펫의 버튼을 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 눌러 액을 빼낸 후 다시 서서히 버튼에서 힘을 빼 액을 흡입한다. 분주 시에는 피펫을 수직으로 하여 첫 번째 멈춤 현상이 느껴질 때까지만 서서히 버튼을 눌러 액을 분주하고 피펫을 튜브에서 서서히 빼낸 후 팁을 제거한다.

PCR용 반응액은 25 μL로서 그 조성은 Universal PCR Master Mix 12.5 μL, 대상 프라이머 0.5 μL(각 25 mM), 대상 프로브 0.5 μL(10 mM), 멸균증류수 9 μL와 20 ng/μL DNA시료액 2.5 μL(50 ng), 각 검량선용 표준액 2.5 μL 또는 5 ng/μL ColE1/TE용액 2.5 μL로 이루어진다. 5 ng/μL ColE1/TE용액은 미량의 DNA가 비특이적으로 튜브벽면에 흡착되는 영향을 보정하고, 음성대조군용 시험액으로 사용된다.

① 프라이머-프로브 혼합액의 조제

시험에 사용할 대상 프라이머가 각 1.25mM, 대상 프로브가 0.5mM이 되도록 멸균증류수를 사용하여 희석하고 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다.

② 마스터 믹스(Master mix)의 조제

프라이머-프로브 혼합액과 Universal PCR Master Mix를 1 : 1.25의 비율로 혼합기를 사용하여 잘 혼합한다. PCR에서 생길 수 있는 오차를 감소시키기 위해 하나의 DNA 시료액 당 3 웰 분량의 PCR용 반응액을 동시에 조제한다. 이 때 조제량은 잉여분을 고려하여 하나의 DNA 시료 당 81 μL가 되도록 만든다.

③ 마스터 믹스의 분주

주형 DNA(시료 수), 각 검량선용 표준액(프라이머 당 5종), 음성대조군용 시험액(프라이머 당 1종)의 수만큼 500 μL 튜브를 준비하여 번호를 써둔다. 위의 혼합액을 78.75 μL씩 준비한 각각의 500 μL 튜브에 분주한다.

④ 마스터 믹스 분주액에 주형 DNA, 각 검량선용 표준액 또는 음성대조군용 시험액의 첨가

마스터 믹스를 분주한 튜브에 주형 DNA(20 ng/μL), 각 검량선용 표준액 또는 음성대조군용 시험액을 8.75 μL씩 가한다. 혼합기를 사용하여 잘 혼합한 후 spin down 한다. 혼합용액을 웰 당 25 μL씩 분주한다. 플레이트의 뚜껑을 닫을 때 한쪽으로 기울어지지 않도록 대각선 방향으로 번갈아 웰의 뚜껑을 닫은 후, 전용 롤러를 사용하여 완전히 웰을 밀폐한다. 웰의 하부를 관찰하여 바닥에 기포가 있을 경우는 플레이트의 가장자리를 가볍게 두드리거나, 원심분리(96웰 플레이트용 원심분리기 사용)하여 기포를 완전히 제거한다.

(6) 정량 PCR반응 실시

정량PCR은 실시간중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)기기를 이용하여 실시한다. 장치에 plate를 설치하고 웰 정보를 입력한 후, 장치의 덮개 온도(Cover temperature)가 105℃ 정도인 것이 확인되면 반응을 개시한다. 반응조건은 다음과 같다. 50℃에서 2분간 유지한 후, 95℃에서 10분간 방치하여, 고온 개시(hot start)법으로 반응을 시작한다. 95℃에서 30초, 59℃에서 1분을 1회로 하여 총 40회의 증폭 반응을 하고, 반응종료 후 실험결과를 해석한다.

(7) 검량선의 작성

내재성 유전자와 재조합유전자에 대해 아래의 조작으로 검량선을 작성한다. 다음은 ABI PRISM 7700기종을 사용하여 실험한 경우 검량선을 작성하는 방법을 예로 든 것으로, 다른 기종의 경우 각 기기의 사용설명서를 참고하여 작성한다. 반응회수에 대해 형광 시그널의 증가량(△Rn)을 표시한 증폭곡선 위에서 검량선용 표준액 및 DNA 시료 유래의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 △Rn부를 선택하여, threshold line(Th. line)을 설정한다. 이때, 음성대조군(blank시료로서 ColE1 DNA용액을 사용한 것)에 나타날 수 있는 비특이적 증폭곡선과 교차하지 않도록 주의한다. 또한 Th. line은 「Amplification Plot」의 윈도우상에서 다음과 같은 조작에 의해 정한다. ① Baseline의 Start를 3으로, Stop을 15로 한다. ② Mult*Stddev의 값에 2m을 입력한다. 처음에는 ｍ＝0으로 한다. (즉 1을 입력한다.) ③「Suggest」button을 누른 후, 「Update Calculations」button을 누른다. ④「Analysis」,「Standard Curve」를 선택하여, 표준곡선의 상관계수, 기울기 및 Y 절편의 값을 확인하여, 「Th. line 결정표」에 Th. line의 값과 함께 기입한다. ｍ을 1씩 증가시키면서 이와 같은 절차를 반복한다. 이때 NTC의 증폭곡선 중 1개라도 Th. line과 교차하는 경우(눈대중으로 판단할 수 없는 경우 Experiment Report에서 Ct값이 40(40cycle PCR인 경우)이라면 교차하였다고 판단한다.(이하 같음))는 비고란에 NTC라고 기입한다. ⑤ 이 조작은 실험에 사용된 최대 복제수의 표준증폭곡선이 Th. line과 교차하게 될 때까지 반복한다. ⑥ 최대복제수의 표준증폭곡선이 하나라도 Th. line과 교차하면「Th. line 결정표」비고란에 plot out이라고 기입한다. ⑥ 증폭율(A) 및 ｜ΔA｜를 계산하여 이하의 조건을 만족시키는 Th. line을 택한다.

A 및 ΔA의 정의：A= 10(-1 /slop), ΔA=(Am+1－Am)/Am×100

조건 1：｜ΔA｜가 2구간 이상 연속하여 1％이하가 되는 구간(최소n최대m)에 있어서 중점에서의 Th. line을 택한다. 단, 선택한 Th. line이 정수가 안 되는 경우에는 소수점 이하를 절상한다. 단, 선택된 Th. line에서 얻어진 표준곡선의 상관계수가 0.99이상이며, 증폭율(A)의 값이 2.1 이하의 조건을 만족하고, 선택된 Th. line이 NTC의 곡선과 교차하지 않아야 한다.

조건 2：조건 1에 합치하지 않는 경우에는 조건 1의 ｜ΔA｜의 허용치를 2％로 바꿔본다. 그래도 합치하지 않는 경우에는 ｜ΔA｜의 허용치를 3％, 4％, ５％로 바꿔본다.

조건 3：조건 1 또는 조건 2를 만족시키는 m이 여러 개 있는 경우에는 큰 m값을 채용한다.

재실험：｜ΔA｜의 허용치를 ５％로 바꾸어도 Th. line을 정할 수 없는 경우에는 실험을 다시 한다.

한편, Th. line과 검량선용 표준액의 형광시그널이 교차한 점을 threshold cycle(Ct)값으로 하여 Experiment Report에서 각각의 복제(copy수)를 구한다. 다음에 각각의 검량선용 표준액 복사수의 대수치(x축)를 작성하여, 각 Ct에 대해 얻은 근사 직선을 검량선으로 한다.

(8) 시료의 유전자재조합식품 혼입율의 계산

미지의 DNA시료에 대해 검량선 작성에 이용한 Th. line을 사용하여 Ct값을 구하여 내재성 유전자와 재조합유전자에 대한 각각의 검량선에 내삽하여 각 3웰의 초기 유전자 복제수의 평균값을 초기 내재성 유전자 복제수 및 초기 재조합유전자 복제수로 한 후, 다음 식에 따라 해당 유전자재조합 품종의 혼입율을 구한다.

※ 유전자재조합 품종 혼입율(%)	=	재조합유전자 복제수	×	1	×	100
		내재성유전자 복제수		보정계수

콩의 경우 현재 몬산토사에서 개발한 제초제 내성 라운드업레디 콩(Roundup Ready Soybean)이 대부분이며, Le-1과 RRS유전자 복제수로부터 유전자재조합 콩 함유율을 구할 수 있다.

(9) 결과의 판정

2반복 추출한 DNA 시료 각각에 대하여 6)의 (2)와 (3)에서 얻은 RRS, GA21, Bt176, Bt11, T25, MON810 함량의 합을 구하여 그 평균값이 3%를 넘은 시료에 대해서는 기준에 맞지 않는 잘못된 구분유통관리가 이루어져 있을 가능성이 있다고 판단한다.

※ 참고

검량선용 표준액 작성에 사용된 유전자재조합 표준 플라스미드 DNA는 Nippon Gene Co.(FASMARK Co.)나 Wako Co.에서 구입 가능하다. 또한 PCR용 반응액의 조제에 사용된 대상 프라이머, 대상 프로브도 이들 회사에서 구입 가능하다.

7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법

스타링크옥수수는 식품위생법 제4조제6호에 의해 수입 및 유통 등이 금지된 것으로 옥수수 원료 농산물과 단순분쇄가공품의 경우 lateral flow strip방법으로 상품화된 제품(Trait Bt9 Lateral Flow Test kit, Cry9C QuickStix kit 등)을 사용하여 1차 스크린을 하며, 그 결과가 양성인 경우 PCR법으로 확인 시험하여 혼입 여부를 판정하고, 가공식품의 경우 PCR법에 의해 혼입 여부를 판정한다.

(1) Lateral flow strip법

구입한 키트에 동봉된 설명서에 따라 시험한다.

(2) PCR법

① DNA의 추출

3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액을 사용하며, 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다.

② CBH351 검출용 프라이머

㉮ 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

㉯ CBH351의 1차 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(CaM03-5') : 5'-CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA-3'

R-primer(CBH02-3') : 5'-GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT-3'

㉰ CBH351의 2차 확인용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(Cry9C-5') : 5‘-TAC TAC ATC GAC CGC ATC GA-3'

R-primer(35Ster-3') : 5'-CCT AAT TCC CTT ATC TGG GA- 3'

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고 CBH351 1차 검출용 프라이머를 사용한 것에서 170bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 다시 동일한 DNA추출액에 대하여 CBH351 2차 확인용 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이 때 171bp의 PCR 증폭산물이 확인된 경우 “CBH351 검출”이라고 판정하며, 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “CBH351 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “CBH351 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 10과 같다.

8) 유전자재조합 감자(New Leaf Plus, New Leaf Y)의 분석법

유전자재조합 감자는 3) DNA의 추출정제법 ③ 감자 및 그 가공품용의 시험방법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액을 사용하며, 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 다음의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 유전자재조합 감자에 사용되는 프라이머는 현재 Nippon Gene 사에서 제작하여 시판하고 있으며(표 2 참조), 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다.

(1) New Leaf Plus 검출용 프라이머

① 내재성 유전자를 확인하기 위하여 Pss 01n 프라이머를 사용한다.

F-primer(Pss 01n-5') : 5'-TGA CCT GGA CAC CAC AGT TAT-3'

R-primer(Pss 01n-3') : 5'-GTG GAT TTC AGG AGT TCT TCG A-3'

② New Leaf Plus의 1차 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(p-FMV02-5') : 5'-AAA TAA CGT GGA AAA GAG CTG TCC TGA-3'

R-primer(PLRV01-3') : 5'-AAA AGA GCG GCA TAT GCG GTA AAT CTG-3'

③ New Leaf Plus의 2차 확인용 프라이머로 PLRV-rep1-5'과 PLRV-rep1-3' 프라이머를 사용한다.

(2) New Leaf Y 검출용 프라이머

① 내재성 유전자를 확인하기 위하여 Pss 01n 프라이머를 사용한다.

F-primer(Pss 01n-5') : 5'-TGA CCT GGA CAC CAC AGT TAT-3'

R-primer(Pss 01n-3') : 5'-GTG GAT TTC AGG AGT TCT TCG A-3'

② New Leaf Y의 1차 검출용 프라이머로 p-FMV05-5'과 PVY02-3' 프라이머를 사용한다.

③ New Leaf Y의 2차 확인용 프라이머로 pVY01-5'과 pVY01 -3' 프라이머를 사용한다.

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 프라이머를 사용한 것에서 216bp의 PCR 증폭산물이 검출되고 New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 1차 검출용 프라이머를 사용한 것에서 234bp 및/또는 225bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 다시 동일한 DNA추출액에 대하여 New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 2차 확인용 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 이 때 172bp 및/또는 161bp의 PCR 증폭산물이 확인된 경우 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 판정하며, 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “New Leaf Plus 및/또는 New Leaf Y 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다. 판정 예시는 표 10과 같다.

표 10. 스타링크 옥수수(CBH351)와 유전자재조합 감자의 결과 판정의 예

사례		1	2	3	4	5	6	7	8	9
추출1	내재유전자 검출결과	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	－
	1차 검출결과	＋	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	/
	2차 확인결과	＋	＋	＋	＋	/	/	－	－	/
추출2	내재유전자 검출결과	＋	＋	＋	－	＋	－	＋	－	－
	1차 검출결과	＋	＋	－	－	－	－	＋	－	/
	2차 확인결과	＋	－	/	/	/	/	－	/	/
판 정		검출	검출	검출	검출	불검출	불검출	불검출	불검출	/

* 사례 9의 경우 3회째 DNA 추출을 실시하여 결과를 판정

** ＋는 검출, －는 불검출,  /은 검사가 불필요함을 표시

9) Bt10 옥수수의 분석법

옥수수 원곡 또는 옥수수 가공식품에 대하여 해충저항성 및 제초제 내성 유전자재조합 옥수수 Bt10을 검출하기 위한 방법이다.

(1) DNA의 추출 및 PCR

3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액을 사용하며, 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다.

① 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

② Bt10 옥수수 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(JSF5) : 5'-CAC ACA GGA GAT TAT TAT AGG GTT ACT CA-3'

R-primer(JSR5) : 5'-ACA CGG AAA TGT TGA ATA CTC ATA CTC T-3'

(2) PCR 증폭산물의 확인

Bt10 옥수수 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 위양성결과를 방지하기 위하여 다음과 같이 제한효소 확인시험을 실시한다.

① 제한효소 확인시험

117bp로 추정되는 시료의 PCR 증폭산물 10㎕에 SspI(Invitrogen사 제품) 1㎕ (10 units)와 REACT6 buffer 1㎕를 가하여 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액 10㎕와 1/6배의 염색액(gel loading buffer) 2㎕를 혼합하고, 그 혼합액 10㎕를 3% 아가로스겔에서 염색액에 함유된 BPB가 겔의 약 90% 가량 전개될 때까지 전기영동한다. Bt10 옥수수 추출 DNA를 함유한 양성대조군의 PCR 증폭산물에 대해서도 동일한 조건으로 제한효소를 처리하고 전기영동을 실시한다. 이때 단편의 크기 비교가 용이하도록 양성대조군과 시료를 1조로 하여 아가로스겔에 로딩하며, 표식 DNA (Marker DNA)로는 25/100bp DNA ladder를 사용한다. 5) 정성분석방법 (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ③ 겔의 염색 및 ④ 결과의 확인에 따라 77bp와 40bp의 밴드가 나타나는지를 확인한다.

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고, Bt10 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, 117bp의 PCR 증폭산물에 대한 제한효소 분해산물이 2개의 DNA 단편으로서 그 크기가 77bp와 40bp임이 확인되는 경우 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “Bt10 옥수수 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.

10) 해충 저항성 Bt 쌀의 분석법

쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여 해충 저항성 Bt 쌀을 검출하기 위한 방법이다. 최소한 6,000립 또는 200g 이상을 취하여 분쇄기로 균질하게 분쇄한 것을 분석시료로 사용하며, 3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액에 대하여 5) 정성분석방법에 따라 PCR을 실시하되, 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하는 PCR의 온도조건은 표 11과 같다. 쌀 내재성 유전자와 NOS 터미네이터에 대한 프라이머를 사용하여 1차 스크리닝 PCR을 하며, 그 결과가 양성인 경우 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하여 확인 PCR을 실시하여 혼입 여부를 판정한다.

(1) 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머

① 내재성 유전자를 확인하기 위한 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(12μM)는 각각 0.12μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25 μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(OsSPS-F) : 5'-GAT CGG TTC CGC CAT TAG CA-3'

R-primer(OsSPS-R) : 5'-AAC CGA GCG CGA TCA CTT GC-3'

② 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(40μM)는 각각 0.4μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25 μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(Oscry1Ac-F) : 5'-GCA GGA GTG ATT ATC GAC AG-3'

R-primer(OsNOS-R2) : 5'-AAG ACC GGC AAC AGG ATT CA-3'

(2) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 OsSPS 프라이머를 사용한 것에서 110bp의 PCR 증폭산물이 검출되고, NOS 터미네이터 검출용 프라이머를 사용한 것에서 151bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, Oscry1Ac/OsNOS 프라이머를 사용한 것에서 147bp의 PCR 증폭산물이 확인되는 경우 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.

표 11. 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 확인시험용 PCR 조건

	온도	시간	cycle 수
최초의 변성	95 ℃	5 분	1 cycle
변성 (denaturation) 결합 (annealing) 신장 (extension)	95 ℃ 62 ℃ 72 ℃	30 초 30 초 30 초	40 cycle
최종신장 (elongation)	72 ℃	8 분	1 cycle
보존	4 ℃	-	-

제7. 27.식육 중 다이옥신 시험법을 다음과 같이 신설한다.

27. 식육 중 다이옥신 시험법

1) 장치

분해능이 10,000 이상인 고분해능 가스크로마토그라프/고분해능 질량분석기 (HRGC/HRMS)를 사용한다.

2) 시약, 시액 및 기구

시약 및 시액은 다이옥신 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 한다.

(1) 용매 : 잔류농약 분석용 또는 이와 동등 이상인 것.

(2) 무수황산나트륨 : 특급이상(400℃에서 최소 1시간 이상 구운 것)

(3) 검량용 표준물질(Calibration standard) : 다이옥신의 정성 및 정량에 사용하는 검량용 표준물질은 표 1과 같이 2,3,7,8-치환 동족체 17종과, 13C12 동족체(Labeled) 및 37Cl4 동족체 (또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

(4) 회수율 측정용 표준물질(Labeled compound standard) : 시료의 추출과정 전에 첨가하는 정량 및 회수율 측정용 내부표준물질은 13C12 동족체로 된 다이옥신 중 표 1과 같은 화합물(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)을 사용한다.

(5) 내부표준물질(Internal standard solution) : 가스크로마토그라프/질량분석기에 주입하기 전에 첨가하는 내부표준물질은 13C12-1,2,3,4-TCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것) 및 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

(6) 검량선 작성용 표준물질의 조제 : 정량용 표준물질을 검출한계부분의 저농도의 것과 예상 검출농도보다 높은 고농도의 것을 적어도 하나 이상 포함시켜 5단계 이상의 농도 범위로 조제한 것(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것).  단, 검량선 작성용 표준용액들은 직선성을 유지하여야 한다.  검량선 작성용 표준용액은 정량용 표준물질의 13C12 동족체 및 37Cl4 동족체가 동일 농도로 함유되어야 한다.

(7) 정밀 회수용 표준물질(Precision and recovery standard) : 다이옥신의 회수율을 측정하기 위해 일정농도의 정밀 회수용 표준물질을 사용하여야 한다(표 1).

(8) 실리카겔 : 칼럼크로마토그라피용 실리카겔(100～200 mesh)을 디클로로메탄으로 세척하여 180℃에서 1시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

(9) 산성 실리카겔 : 실리카겔 100 g에 황산 44.0 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.

(10) 염기성 실리카겔 : 실리카겔 100 g에 1 N 수산화나트륨 30 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.

(11) 염기성 알루미나 : 600℃에서 24시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

(12) 실리카겔 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(중성실리카겔 1.5 g, 염기성실리카겔 2 g, 산성실리카겔 4 g의 순서로 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.

(13) 알루미나 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(염기성알루미나 12.5 g을 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.

(14) 카본 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 10 mm의 정제용 칼럼[8% 카본/규조토(celite 545-AW 0.275 g을 충전한 것)] 또는 이와 동등 이상의 것.

(15) 기타 : 다이옥신 분석에 적합한 것

3) 시험용액의 조제

(1) 추출

시료를 균질화하여 약 15～20 g을 막자사발에 취하여 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 다음 속실렛용 원통형 여지로 옮기고 따로 시료를 넣지 않은 원통여지에 각각 회수율 측정용 표준물질을 첨가 한 다음 ★비등석이 첨가된 속실렛 장치에 추출용매(예; 디클로로메탄 : 헥산 = 3 : 1) 300 mL를 넣어 18시간 이상 추출한다.  별도로 회수율 측정용 시료에는 정밀 회수용 표준물질을 첨가하여 ★이후부터 동일한 방법을 사용한다.

(2) 조지방 함량

속실렛 추출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압 농축한 후 질소농축기를 이용하여 항량이 될 때까지 농축하여 조지방 함량을 구한다.

조지방 함량(g)	=	W1 - W0
		S

W0 : 플라스크의 무게(g)

W1 : 조지방을 추출하여 농축한 플라스크의 무게(g)

S : 시료의 채취량(g)

(3) 조지방 제거

유리솜이 들어있는 분액여두에 유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g과 조지방 1 g 당 산성실리카겔 10 g을 첨가한다.  헥산 3 mL로 조지방을 충분히 용해한 다음 분액여두에 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣는다.  이러한 조작을 2회 반복한 다음 20분간 반응시킨 후 헥산 130～150 mL로 용출한다.  이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 약 3 mL가 되도록 감압 농축한 후  다른 시험관에 옮기고 감압용기를 다시 헥산 3 mL씩 2회 세척하여 용액을 시험관에 합한다.

(4) 정제

헥산으로 활성화된 실리카겔 칼럼에 위의 용액을 넣은 후 헥산으로 용출시키고 그 용출액을 알루미나 칼럼에 첨가한 다음 2% 디클로로메탄 함유 헥산으로 방해물질을 제거하여 50% 디클로로메탄 함유 헥산으로 다시 용출시킨다.  이 알루미나 칼럼에서 용출한 액을 카본 칼럼에 넣고 50% 초산에칠 함유 벤젠으로 용출시킨 다음 다시 헥산으로 방해물질을 제거한 후 톨루엔으로 역 용출한다.  이 용출액을 질소 감압기를 사용하여 농축한 다음 내부표준물질을 첨가하여 이를 시험용액으로 한다.

※주의 : 칼럼크로마토그래피에서 사용하는 충전제나 용매의 종류 및 양은 표준물질 등으로 분획 실험하여 최적조건을 확립하여야 한다.

4) 시험조작

(1) 가스크로마토그라프의 측정조건

① 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼(60 m × 0.2～0.32 mm ID, 0.1～0.25 μmdf) 또는 이와 등등 이상의 것으로 분석하고자 하는 전 동족체가 양호하게 분리되어야 하며 그 분리 효율을 입증할 수 있는 것이어야 한다.

② 오븐온도 : 각 동족체의 분리가 양호하도록 적절한 온도조건을 설정한다.  단, 2,3,7,8-TCDD와 2,3,7,8-TCDF는 인접한 피크의 분리도가 봉우리 높이 대비 25% 미만이어야 한다.

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 0.5～5.0 mL/분

④ 주입부온도 : 약 270℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

⑤ 연결부온도 : 약 290℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

⑥ 이온원온도 : 약 260℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

(2) 고분해능 질량분석기의 측정조건

① 튜닝 표준물질 : PFK 또는 이와 동등한 것

② 분해능 : 10,000 이상 (10% valley 기준)

③ 이온화방식 : 전자충격이온화 방식 (EI)

④ 질량설정 : 측정하고자 하는 이온의 질량은 각 동족체마다 2개 이상의 이온을 선택이온(selected ion), 즉 M+, [M+2]+ 또는 [M+4]+ 를 사용한다.  주로 사용하는 각 다이옥신 동족체의 대표적 이온 질량은 표1과 같다.

⑤ 질량 검정 : 가스크로마토그라프/질량분석기는 시료분석조건과 동일한 조건에서 분해능 10,000 이상으로 조정한 다음, 4 염화물에서 8 염화물의 선택이온들을 적당한 그룹으로 나누어 튜닝 표준물질에 의한 질량 검정을 하여야 한다.

⑥ 주기적 점검 : 분석을 지속적으로 수행하는 경우 매 12시간마다 검량용 표준물질 중 중간농도의 표준물질을 선택하여 분석조건을 점검하여야 하며 회수율은 80%～120%에 있어야 한다.

⑦ 검출한계 : 4～5염화물의 검출한계는 0.04 pg/g이하이어야 한다.

(3) 정성시험

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어떠한 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며, 측정한 선택이온 2개의 이온세기 비율은 표2～3에 나타난 이론값에 대하여 ±15% 이내이어야 한다.  단, 모든 신호 대 잡음(S/N)비는 2.5 보다 커야 하며, 정량용 13C12 및 37Cl4의 경우는 10보다 커야 한다.

(4) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 검출된 각각의 다이옥신에 대해 이에 대응하는 검량용 13C12 동족체 및 37C12 동족체 표준물질로 상대 내부표준법으로 정량한다.  또한 회수율 측정용 표준물질 37Cl4-2,3,7,8-TCDD와 13C12-2,3,7,8-TCDD 등 15종의 표준물질에 대한 농도를 절대 내부표준법으로 정량한다.  회수율 측정용 표준물질의 회수율은 17% 이상 185% 이하이어야 하며, 정밀 회수용 표준물질의 회수율은 63% 이상 170% 이하이어야 한다.

① 검량선 작성

검량선 작성용 표준물질을 (3)정성시험과 같은 방법으로 가스크로마토그라프/질량분석기에 주입하여 각 선택이온에 대한 크로마토그램을 작성하여 각 표준물질의 피크 면적과 이에 대응하는 13C12 동족체의 피크 면적으로부터 다음 식에 의해 상대감응도(Relation Response : RR)를 구한다.  상대감응도는 5개 농도 이상의 검량선 작성용 표준물질을 사용하며 편차범위는 ±20% 이내이어야 한다.

RR	=	(A1n + A2n)(Cl)
		(A1l + A2l)(Cn)

A1n, A2n : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 다이옥신의 1차  또는 2차 선택 이온의 피크 면적

A1l, A2l : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적

Cn : 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cl : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 농도

② 반응계수

반응계수(RF)는 검량선 작성용 표준물질로부터 얻은 크로마토그램으로 내부 표준법에 따라 다음의 식으로부터 구한다.  5개 농도의 검량선 작성용 표준물질을 사용한 반응계수의 편차범위는 ±35% 이내이어야 한다.

RF	=	(A1s + A2s)(Cis)
		(A1is + A2is)(Cs)

A1s, A2s : 검량선 작성용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

Cs : 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cis : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 내부표준물질의 농도

③ 회수율 측정용 표준물질의 검출 농도 및 회수율

시료에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 검출농도(Cl) 및 회수율은 다음 식에 의해 구한다.

Cl (ng/g)	=	(A1s + A2s)(Cis)
		(A1is + A2is) × RF

회수율(%)	=	Cl (ng/g)	× 100
		Cspk (ng/g)

A1s, A2s : 회수율 측정용 표준물질(13C12 동족체)의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is : 내부표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

Cis : 내부표준물질의 농도

RF : 반응계수

Cl : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 농도

Cspk : 첨가한 회수율 측정용 표준물질의 농도

④ 다이옥신 농도의 계산

시료 중 다이옥신 농도는 다음 식으로부터 구한다.

다이옥신 농도 (ng/g fat)	=	(A1n + A2n)(Cl)	×	Vex
		(A1l +A2l)(RR)		Ws

A1n, A2n : 시료에 함유된 대상물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1l, A2l : A1n 와 A2n에 대응하는 시료에 첨가된 13C12 동족체  화합물의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적

Cl : 시료에 첨가된 13C12 동족체 표준물질의 농도(ng/mL)

RR : 상대감응도

Vex : 추출량(mL)

Ws : 조지방 함량(g)

⑤ 독성등가량(Toxicity Equivalents : TEQ)으로 환산

산출한 다이옥신 농도(ng/g fat)의 독성등가량 환산은 각 분석 대상 동족체에 표 4에 해당하는 독성등가계수(Toxicity Equivalent Factor : TEF)를 곱하여 이 합계를 독성등가량(pgTEQ/g fat)으로 한다.

표 1. 대상물질

PCDDs	대표적 이온 질량	PCDFs	대표적 이온 질량
2,3,7,8-TCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDD	319.8965 / 321.8936 355.8546 / 357.8517 389.8157 / 391.8127 389.8157 / 391.8127 389.8157 / 391.8127 423.7767 / 425.7737 457.7377 / 459.7348	2,3,7,8,-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDF	303.9016 / 305.8987 339.8597 / 341.8568 339.8597 / 341.8568 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 407.7818 / 409.7788 407.7818 / 409.7788 441.7428 / 443.7398

주) 약어의 펼친 이름은 다음과 같음.

PCDD = Polychlorodibenzo-p-dioxin PCDF = Polychlorodibenzofuran

TCDD  = Tetrachlorodibenzo-p-dioxin TCDF = Tetrachlorodibenzofuran

PeCDD = Pentachlorodibenzo-p-dioxin  PeCDF = Pentachlorodibenzofuran

HxCDD = Hexachlorodibenzo-p-dioxin HxCDF = Hexachlorodibenzofuran

HpCDD = Heptachlorodibenzo-p-dioxin HpCDF = Heptachlorodibenzofuran

OCDD = Octachlorodibenzo-p-dioxin OCDF = Octachlorodibenzofuran

표 2. 염소 원자수에 의한 동족체 피크의 자연 존재비

	자연 존재비
	M	M+2	M+4	M+6	M+8	M+10	M+12	M+14
4	76.5	100	48.7	10.5	0.9
5	61.5	100	65.0	21.1	3.5	0.2
6	51.2	100	81.2	35.2	8.5	1.1	0.06
7	43.2	100	97.5	52.8	17.1	3.3	0.36	0.02
8	33.8	87.9	100.0	65.0	26.4	6.8	1.1	0.10

표 3. 염소원자에 따른 선택 이온의 이론적인 이론비

염소원자의 수	전하대 질량(m/z) 생성비	이론비	이론범위
			최소	최대
4개1)	M/(M+2)	0.77	0.65	0.89
5개	(M+2)/(M+4)	1.55	1.32	1.78
6개	(M+2)/(M+4)	1.24	1.05	1.43
6개2)	M/(M+2)	0.51	0.43	0.59
7개	(M+2)/(M+4)	1.05	0.88	1.20
7개3)	M/(M+2)	0.44	0.37	0.51
8개	(M+2)/(M+4)	0.89	0.76	1.02

1) : 37Cl4-2,3,7,8-TCDD 제외

2) : 13C12-HxCDF에만 적용

3) : 13C12-HpCDF에만 적용

표 4. 독성등가계수 (Toxicity Equivalent Factors ; WHO-TEFs, 1998)

다이옥신	WHO-TEFs
2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD OCDF	1.0 0.1 1.0 0.05 0.5 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 0.01 0.01 0.0001 0.0001

제7. 28. 식품제조용수 등의 노로바이러스 시험법을 다음과 같이 신설한다.

28. 식품제조용수 등의 노로바이러스 시험법

가. 시약 및 시액, 장치 및 초자

1) 시약 및 시액

① 2% 치오황산나트륨 (sodium thiosulfate: Na2S2O3)용액 치오황산나트륨 100 g을 증류수에 녹여 최종적으로 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃에서 15분간 고압증기 멸균한다.

② 1.5% 소고기 액기스 (Beef extract, desiccated powder) 용액 1.9 L의 증류수에 beef extract 분말 30g 과 glycine 7.5 g (최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 맞춘   다.  121°C, 15분간 멸균한다.

③ 0.15 M 인산1수소나트륨, 7수화물 (Sodium phosphate, dibasic, Na2HPO4 C 7H2O ,  pH 9.0 -9.5) 용액 950 mL의 증류수에  40.2 g의 Sodium phosphate를 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 맞춘다. 121°C, 15분간 멸균한다.

④ 수산화나트륨 (NaOH)용액

각각 4 g과 20 g의 수산화나트륨을 최종 부피 100 mL 의 증류수에 녹여 1M 및 5M 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

⑤ 노로바이러스 유전자 추출 (Viral RNA Mini Kits) 용액

바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

2) 장치 및 초자

2-1) 시료 채수과정

① 표준필터장치 : 식품제조용수 1,500~1,800 L을 채수하는 주요장비로 사용한다.

○장치구성

- 주입기 모듈, 단일주입기 모듈, 압력게이지, 유출구 모듈, 탈리액 주입기 및 유출구 모듈, 유량  조절기 밸브, 유량게이지

② 휴대용 pH 측정기 : 식품제조용수의 수소이온농도를 측정하는 용도로 사용한다.

③ 휴대용 탁도 측정기 : 식품제조용수의 혼탁도 측정용으로 사용한다.

④ 휴대용 염소 농도 측정기 : 수처리한 식품제조용수의 잔류 염소 농도를 측정하기 위한 장치이다.

⑤ 휴대용 아이스 박스 : 식품제조용수 1,500~1,800L 채수 후 1-MDS 카트리지를 운반하기 위해 사용한다.

⑥ 상업용 얼음팩 :  1-MDS 카트리지 운반시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

⑦ 기타 : 공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균호일, 클램프, 시료채수기록부, 수술용 장갑, 수은온도계

⑧ 필터가 장착된 카트리지 모듈 : 바이러스 흡착용 1-MDS 필터 - Virosorb 1-MDS Cartrige

(참고 그림 1.) Virosorb 1 MDS Cartrige

2-2) 바이러스 탈리과정

① 연동정량펌프 : 탈리용액  1-MDS 필터카트리지로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치이다.

② 교반기 및 교반 막대

2-3) 바이러스 농축과정

① 원심분리기 (4 ℃, 2,500~10,000 G)

② 원심분리용 용기 (100 - 1,000 mL 용량)

③ 0.22㎛ 실린지 필터 (50 mL 용량)

나. 시험방법

1) 식품제조용수 채수

채수자는 멸균된 장갑을 착용하여 노로바이러스에 의한 오염을 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치나 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예 : 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

① 필터 장치에 연결하기 전에 채수하려는 시료를 2～3분 정도 배출기 또는 양수펌프의 배출구를 열고 물을 흘려보내 찌꺼기를 제거한다. 배출구에 호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 부착하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 꼭지를 잠근다.

② Chlorine (HOCl)이나 불꽃버너를 이용하여 수도꼭지나 배출구 부위를 가열 또는 멸균한다.

③ 채수용 호스의 알루미늄 호일을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치→배출기 모듈→ 2 L 비이커에 차례로 연결한다. 카트리지 하우징 모듈은 이 단계에서는 연결하지 않는다.

④ 천천히 배출기를 열고 조절기 모듈이 30 PSI가 되도록 압력 조절기를 조절한다. 만일 30 PSI가 안되면 조절기 최대압력까지 도달하게 조절한다.

76 L(20GAL)의 물을 흘려보내면서 2 L 비이커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 시료번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 시료채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 calibration 한다.

⑤ 수도꼭지를 잠그고 시료가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

- pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 주입기와 0.1 M 염산 용액이 담긴 매스실린더를 연결하고,  2 L 플라스틱 병에 담긴 물 시료의 pH가 6.5～7.5가 되도록 조절한 후 pH를 시료채수기록부에 기록한다.

- 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 물 1 gal(3.8 L) 당 2% 치오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

⑥ 바이러스시료채수기록부에 시료 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

⑦ 필터하우징 모듈의 알루미늄 호일을 제거하고 배출기 모듈 앞에 연결한다.

그림. 1. 현장에서의 채수모습

⑧ 물을 천천히 흐르게 하면서 필터하우징 상단의 감압단추(vent button)를 눌러 내부 공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

⑨ 조절기의 압력은 30 PSI 이하로 조정하고 식품제조용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 유출구나 수도꼭지를 잠근다.

⑩ 바이러스시료채수기록부에 시료채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

⑪ 시료채수기구로부터 필터 모듈을 분리한다. 필터하우징을 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징과 연결된 양끝의 개구부를 멸균된 알루미늄 호일로 싼다.

⑫ 필터하우징을 아이스박스에 담고 아이스팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동되어서는 안 됨)로 하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 노로바이러스 탈리과정

① 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다.

※ 다만, 부득이한 경우로  인해 24시간 내에 탈리 시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

② 표준 필터장치에 카트리지를 장착한 후 카트리지 탈리액 주입구와 유출구에 멸균된 실리콘 튜브를 연결하고 주입구에 연결된 실리콘 튜브는 1 L beef extract 완충액(1.5%)이 채워져 있는 비이커에 넣는다. 유출구에 연결된 튜브는 멸균된 2 L 비이커에 넣고 연동정량펌프를 가동하여 카트리지 안으로 beef extract 완충액을 가득 채운다.필터하우징의 감압단추(vent button)를 누른 상태로 천천히 압력을 가하여 내부 공기를 빼내면서beef extract 완충액이 필터하우징 내에 완전히 차도록 한 후, 감압단추를 통해 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 뗀다.

beef extract 완충액이 가득 채워지면 연동정량펌프 가동을 멈추고 5분간 정치한다.

③ 연동정량펌프를 다시 가동하여 하우징에 채워져 있는 완충액이 서서히 필터를 통과하도록 하고, 통과한 완충액은 멸균된 비이커에 수집한다. 탈리액을 회수 할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있음.

④ 비이커에 수집된 beef extract 완충액을 유입 튜브에 놓고 위의 ①～② 과정을 2회 반복한다.

⑤ 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

⑥ 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 노로바이러스 농축과정

① 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M HCl 용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

② 침전물이 생기면 탈리액을 원심분리용 멸균 용기에 옮겨 원심분리 한다  (2,500 G 15분, 4℃).

③ 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에  0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 재 부유시킨 후 10분간 방치한다.

④ 부유시킨 용액을 원심분리 한다(7,000 G, 10분, 4℃).

⑤ 상등액을 취해 1 M HCl 용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

⑥ 미생물오염을 방지하기 위해 50 mL 주사기를 이용하여 상등액을 멸균 필터로 여과한다. 시료 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 멸균 필터에 10～20 mL의 1.5% beef extract 완충액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

⑦ 최종 농축 시료량 (FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 시료를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

⑧ 최종 농축시료 (20～30 mL)는 노로바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 노로바이러스 유전자 추출 과정

바이러스 RNA 추출은 kit에 포함된 방법 등 적절한 실험법에 따라 실시할 수 있다.

※ 바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

① ALV buffer 1,120 uL와 제조용수 농축액 280 uL를 혼합한 후 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 spin-down한다.

②  95～100% 에탄올 1,120 uL를 넣어 혼합한 후, spin-down한다.

③ 혼합액 630 uL를 Mini spin column으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리 후 column을 새로운 collection 튜브로 옮기고, 남은 혼합액 630 uL를 첨가하여 6,000 G 로 1분간 원심분리 한다.

④ Mini spin column을 새로운 collection 튜브로 옮겨 AW1 buffer 500 uL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 column을 새로운 collection 튜브로 옮긴다.

⑤ AW2 buffer 500 uL를 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리 한 후 column을 새로운 1.5 mL collection 튜브로 옮긴다.

⑥ Elution buffer 30 uL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 하여 다음의 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

노로바이러스 유전자형(genotype) 확인을 위하여 primer조합을 달리하여 동시에 수행한다. PCR 반응조건은 RT(reverse transcription)-PCR과 1차 PCR을 한 시험관에서 동시에 수행하는 one-step RT- PCR 방법을 사용한다.

① GI type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10 uL(reverase transcriptase 0.5 uL 포함), primer 20pmol (GI-F1M, GI-R1M) 각 2 uL와 추출 RNA 5 uL가 함유되도록 한다.

② GII type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10 uL, primer 20pmol (GII-F1M, GII-R1M) 각 2 uL와 추출 RNA 5 uL가 함유되도록 한다. 유전형에 따라 ①, ②의 방법에 의하여 혼합 후 45oC에서 30분간 reverse transcription 반응 후 94oC에서 5분간 DNA를 변성시키고, 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 다음의 semi-nested PCR을 실시한다.

Table. 1. 노로바이러스 ONE-STEP RT-PCR 조성 및 반응 온도

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
Mastermix	9.5 uL	-	-
Reverse transcriptase (50unit/uL)	0.5 uL	-	-
D.W.	6 uL	-	-
Forward primer(20pmol)	2 uL	GI-FIM	GII-FIM
Reverse primer(20pmol)	2 uL	GI-RIM	GII-RIM
Extracted RNA	5 uL	-	-
Total	25 uL

▷ Reaction Temp. :

45℃ 30 min / 94℃ 5 min

94℃ 30sec /55℃ 30sec /72℃ 1 min 30sec : 35 cycles

72℃ 7 min/4℃ Soaking

③ GI-F1M, GI-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2 uL를 주형으로 하여 semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 uL, 10x buffer 5 uL, dNTP (10 mM) 4 uL, Taq polymerase  (5 unit/uL) 1 uL와 primer 20pmol (GI-F2, GI-R1M)를 각각 2.5 uL씩 첨가하여 semi-nested PCR을 실시한다.

④ GII-F1M, GII-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2 uL를 주형으로 하여 semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 uL, 10x buffer 5uL, dNTP (10 mM) 4 uL, Taq polymerase (5 unit/uL) 1 uL와 primer 20pmol (GII-F3M, GII-R1M)를 각각 2.5 uL씩 첨가하여 semi-nested PCR을 실시한다. PCR 조건은 94oC에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다.

Table. 2. 노로바이러스 semi-nested PCR 조성 및 반응 온도

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
dNTP(10mM)	4 uL	-	-
10x Buffer	5 uL	-	-
D.W.	33 uL	-	-
Forward primer(20pmol)	2.5 uL	GI-F2	GII-F3M
Reverse primer(20pmol)	2.5 uL	GI-RIM	GII-RIM
Taq polymerase(5unit/uL)	1 uL	-	-
1st PCR Product	2 uL	-	-
Total	50 uL

▷ Reaction Temp. :

94℃ 5min

94℃ 30 sec/ 55℃ 30sec/ 72℃ 1 min 30sec : 25 cycles

72℃ 7 min/ 4℃ Soaking.

Table. 3. 노로바이러스 Primer 염기서열

Genogroup	Primer	Sequence (5'→3')	Application
I	GI-F1M	CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT	Onestep RT PCR
	GI-R1M	CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG	Onestep RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GI-F2	ATG ATG ATG GCG TCT AAG GAC GC	Semi-nested PCR/ Sequencing
II	GII-F1M	GGG AGG GCG ATC GCA ATC T	Onestep RT PCR
	GII-R1M	CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT	Onestep RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GII-F3M	TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART	Semi-nested PCR/ Sequencing

⑤ PCR 반응 종료 후 반응액 5 uL를 1.5% agarose gel 상에서 100V로 전기영동한 후, EtBr(0.5 ㎍/mL) 염색액에서 30분간 염색 후 증류수에서 10분간 탈색하고 UV 하에서 DNA 밴드를 관찰한다.

⑥ PCR 산물이 313bp이면 GI 형 노로바이러스, 310bp이면 GII 형 노로바이러스가 검출된 것으로 일차적으로 확인하고, 최종 확인을 위하여 agarose gel상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한다.

⑦ DNA sequencing을 위하여 ⑥에서 정제된 DNA 1 uL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2 및 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M 및 GII-R1M의 primer를 사용하여 sequencing을 수행한다.   Sequencing 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전형  semi-nested primer(1pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 uL, dye-terminator 2 uL, 정제 DNA 2 uL를 첨가하여 증류수로 최종 10 uL가 되도록 하여 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 후 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.  DNA sequencing 실시 후 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 노로바이러스가 검출된 것(양성)으로 최종 판정한다.

제7. 29젤리의 물성시험법을 다음과 같이 신설한다.

29. 젤리의 물성시험법

1) 장치

(1) 절단용 칼(10 mm × 10 mm ×10 mm)

(2) 물성측정기(Texture Analyzer)

(3) 물성측정용 Probe(원형, 직경 35 mm)

2) 실험방법

(1) 검체채취 및 실험

검체를 냉장고(8℃)에서 3시간 이상 방치 후 과육이 없는 부위의 젤리부분만을 가로(10 mm), 세로(10 mm), 높이(10 mm)의 정육면체로 절단하여 시료로 사용 한다.(한 가지 품목에 맛이나 향이 다른 여러 가지 제품이 혼합되어 있을 경우는 각각 구분하여 시험한다)

(2) 실험

검체 1품목당 10개의 시료를 준비하여 아래 표1과 같은 조건에서 압착시험(깨짐성)을 실시한다.

표 1. Texture Analyzer 측정조건

항목	Conditions
Probe	원형, 직경 35 mm
Pre-test speed	5 mm / sec
Test speed	2 mm / sec
Post-test speed	2 mm / sec
Pressure	98% compression

(3) 판정

가. 프로브 압착시 첫 번째 피크의 높이(N)로 깨짐성(fracturability)을 측정하여 결과값으로 한다.

나. 측정시 2개의 피크를 그리며 앞 피크의 측정값을 구하여야 한다 (뒤의 피크는 단단한 정도를 측정값임)

다. 10개의 시료에 대한 반복실험 결과 값들의 평균값이 5N(newton)이하여야 적합한 것으로 한다.

(4) 압착시험(깨짐성)의 예

① 첫 번째 피크 : 깨짐성

② 두 번째 피크 : 단단한 정도

③ Distance : Probe가 검체에 닿는 순간부터 검체가 부서지는 순간까지의 거리(단위: mm)

그림1. 압착시험의 깨짐성 피크

부 칙

①(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제3. 3. 2) (25)의 ⑦항과 (29)의 ②항은 2007.12.1일부터, 제3. 3. 2)의 (4)항 및 제3. 3. 2) (28)의 ④항, 제3. 6. 1) (13)항, 제3. 6. 2)의 동물용의약품의 잔류허용기준, 제4. 1. 1-3. 3)의 (6)항은 2008년 1월 1일부터, 제3. 6. 1) (11)의 ①항 및 제3. 6. 3) 농산물의 농약잔류허용기준은 2008년 4월 1일 부터 시행한다.

②(경과조치) 이 고시가 시행되기 전에 제조․수입한 제품의 경우는 종전의 규정에 의한다.

신․ 구조문 대비표

현   행

개   정

제 3. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (생  략)

2. 원료 등의 구비요건

1) 식품원료

(1) ~ (21) (생  략)

<신 설>

(22) (생  략)

3. 제조․가공기준

1) (생  략)

2) 개별기준

(1)～(3) (생  략)

<신 설>

(4) ~ (24)  (생  략)

(25)간장, 된장, 고추장, 춘장

①～⑥ (생  략)

<신  설>

(26)～(27)  (생  략)

(28)고춧가루 또는 실고추

①～③  (생  략)

④고춧가루 제조공정에는 금속성 이물제거장치 설치를 권장한다.

(29)향신료가공품

①  (생  략)

<신  설>

(30) ~ (42) (생  략)

6. 기준 및 규격의 적용

1) 식품 일반의 규격

(1) ~ (6) (생  략)

(7)이물

식품은 원료의 처리과정 ---------- 우려가 없는 정도는 제외한다.

<신  설>

(8) ~ (9) (생  략)

(10) 식품 제조․가공 중 생성되는 유해물질

① 벤조피렌[Benzo(a)pyrene]

㉮ 올리브유(올리브박 사용 제품포함) : 2.0 ㎍/kg 이하

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2) 동물용의약품의 잔류허용기준

(1)~(2) (생  략)

(3) 네오마이신(Neomycin)

--- 알   0.5

(4)~(8) (생  략)

(9) 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)

(10) (생  략)

(11) 디히드로스트렙토마이신/스트렙토마이신

(Dihydrostreptomycin /Streptomycin)

--- 양신장   1.0

(12)~(40) (생  략)

(41) 클로람페니콜(Chloramphenicol)

(42)~(53) (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3) 농산물의 농약잔류허용기준

(1) ~ (100) (생  략)

(101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)

--- 호프  3.0

(102) ~ (109) (생  략)

(110) 카두사포스 (Cadusafos)

--- 토마토 0.05

(111) ~ (124) (생  략)

(125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)

--- 호박 2.0

(126) ~ (161) (생  략)

(162) 페니트로치온 (Fenitrothion)

--- 호박 0.2

(163) ～ (185) (생  략)

(186) 프로클로라즈 (Prochloraz)

--- 호밀 0.5

(187) ~ (206) (생  략)

(207) 테부페노자이드 (Tebufenozide)

--- 파 0.7

(208) (생  략)

(209) 테플루벤주론 (Teflubenzuron)

--- 오이 0.2

(210) ~ (229) (생  략)

(230) 크레속심-메칠 (Kresoxim-methyl)

--- 피망 2.0

(231) (생  략)

(232) 트리싸이클라졸 (Tricyclazole)

--- 쌀 0.7

(233) ~ (250) (생  략)

(251) 에톡사졸 (Etoxazole)

--- 수박 0.1

(252) (생  략)

(253) 이미벤코나졸(Imibenconazole)

--- 포도 0.2

(254) ~ (289) (생  략)

(290) 인독사카브(Indoxacarb)

--- 피망 1.0

(291) ～ (335) (생  략)

(336) 티디아주론(Thidiazuron)

--- 포도 0.2

(337) ~ (344) (생  략)

(345) 피라크로스트로빈(Pyraclostrobin).

--- 토마토 1.0

(346) ~ (348) (생  략)

(349) 노발루론 (Novaluron)

--- 사과 1.0

(350) ~ (351) (생  략)

(352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)

--- 파 2.0

(353) 메트코나졸 (Metconazole)

--- 포도 2.0

(354) ~ (355) (생  략)

(356) 에타복삼 (Ethaboxam)

--- 포도 3.0

(357) ~ (362) (생  략)

(363) 티람 (Thiram)

--- 포도 2.0

(364) ~ (372) (생  략)

(373) 스피로메시펜(Spiromesifen)

--- 토마토 1.0

(374) ~ (383) (생  략)

(384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid)

--- 참외 0.3

(385) (생  략)

(386) 플로니카미드 (Flonicamid)

--- 사과 0.7

(387) ~ (389) (생  략)

(390) 시메코나졸 (Simeconazole)

--- 포도 1.0

(391) ~ (394) (생  략)

<신설>

(396) 에티클로제이트 (Ethyclhozate)

--- 밀감 0.05

4)  (생 략)

5) 인삼의 농약잔류허용기준

(1) ～ (33) (생  략)

<신설>

6) ~ 14) (생 략)

7 ~ 8. (생 략)

제4. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1-3 캔디류

3) 규격

(1) ～ (5) (생  략)

<신 설>

2~20 (생  략)

제 5. 식품접객업소의 조리판매식품 등에 대한 미생물 권장규격

1.  (생  략)

2. 규격

2-1. (생  략)

2-2.접객용 음용수(식품접객업소 등에서 손님에게 제공되는 음용수), 수족관물, 조리용구 등

1)규격

(1)  (생  략)

(2)수족관물

①  (생  략)

<신  설>

(3)～(4)  (생  략)

2)  (생  략)

6.  (생  략)

제7. 일반시험법

1 ~ 5 (생  략)

6. 유해성금속 시험법

1)시험용액의 조제

(3)건식회화법

검체(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 도가니 -----탄화시킨 다음 450～550°에서 회화한다.(이하 생략)

2)～4)  (생  략)

5)농산물 중 중금속 시험법

(1) 검체

농산물의 종류에 따라 아래 표에서와 같이 처리한 것을 검체로 한다. 다만, 이 표에서 정하지 아니한 농산물은 원칙적으로 가식부를 시험부위로 한다.

표 (생  략)

(2)시험용액의 조제

①～②  (생  략)

<신  설>

(3)  (생  략)

7. 이물시험법

1)일반시험

(1) ~ (4) (생 략)

<신  설>

8 ~ 14 (현행과 같음)

15. 식품중의 잔류물질시험법

1) (현행과 같음)

2) 항생물질

(1) (현행과 같음)

(2)정량시험법

①기기분석법

㉮～ (현행과 같음)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3) 합성항균제

(1) (생  략)

(2) 정량시험법

①~ (생  략)

엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin) 및 다노플록사신(Danofloxacin)

㉮ 정량법의 원리

시료와 C18 분말, 수산, 무수황산나트륨을 유발에 넣고 균질화한 다음 균질화된 혼합물을 유리컬럼에 넣고 헥산, 에틸아세테이트로 세척한 후 메탄올로 용출하여 건조시킨 다음 이동상으로 녹여 측정한다.

㉯ (생  략)

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 표준원액 : 엔로플록사신, 시프로플록사신 및 다노플록사신 표준품을 정밀히 달아 100㎖ 용량플라스크에 취하고 메탄올로 표시선까지 채워 100㎎/ℓ농도가 되게 한다.

Ⓑ 표준용액 : 표준원액 10ml를 취해 이동상으로 10㎎/l 농도가 되게 희석하여 사용한다.

<신설>

Ⓒ (생  략)

㉱ 시험용액의 조제

<신  설>

<신  설>

C18 분말 2g을 유발에 취하고 시료 0.5g을 정확히 달고 수산 0.05g과 무수황산나트륨 0.03g을 첨가한 후 유봉으로 C18과 시료가 완전히 균질화되도록 한다. 여과지(Whatman No. 1) 2장을 10ml 주사기에 넣고 균질화된 혼합물을 주사기에 옮겨 담는다. 혼합물 위에 여과지 1장을 놓고 주사봉을 이용하여 혼합물의 부피가 약 4.0ml되게 압축한다. 헥산 8ml를 가하여 흘려 보내고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 혼합물 내에 남아있는 헥산을 음압하에서 제거한다. 다시 에틸아세테이트 8ml로 세척하고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 음압하에서 완전히 건조시킨다. 메탄올 13ml로 용출시킨 후 그 용출액을 질소농축하여 건조시키고 이동상 0.5ml를 가하여 10분간 초음파를 통과시키고 용해시킨 후 4°, 15,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 0.45㎛ 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

㉲시험조작

Ⓐ측정조건

- 이동상 : 0.4% 트리에틸아민, 0.4% 인산의 혼합액 : 아세토니트릴(90:10)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 ---- 검량선을 작성하여 검체중 엔로플록사신, 시프로플록사신 및 다노플록사신의 함량을 각각 구한다.

~  (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4)～5) (생  략)

6) 유(乳) 중 잔류물질 시험법

(1)(생  략)

(2) 합성항균제

①~④ (생  략)

⑤ 엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)

7)알(卵) 중 잔류물질 시험법

(1) (생  략)

(2) 합성항균제

① (생  략)

② 엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)

8) 어류 및 갑각류중 잔류물질 시험법

(1) (생  략)

(2) 합성항균제

① (생  략)

② 플루오로퀴놀론계 합성항균제[엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin)]

16 ~ 22 (생 략)

23. 유전자재조합식품의 시험법

1)～2)  (생  략)

3) DNA 추출․정제법

(1) CTAB법

분쇄한 ---- 55℃에서 30분간 정치한다. 혼합기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500㎕를 가하여 잘 혼합한 후 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 500㎕를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합한 후, 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 7,500×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500㎕의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 7,500×g로 1분간 실온에서 원심분리하고, ------ 마이크로 피펫으로 제거한 후 침전물을 건조시킨다. 이때 완전히 건조되지 않도록 주의한다. TE 완충액 ------ 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250㎕를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴다. ---- 200㎕의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회정도 뒤집어 준 후, 7,500×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. ----- 그런 다음 7,500×g로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물을 건조시킨다. 이때 침전물이 완전히 건조되지 않도록 주의한다. 건조된 침전물에 -------

(2) 실리카겔 막 형태를 이용한 방법

① 콩 또는 콩 가공품

QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, 미리 65℃로 가온한 AP1완충액 10㎖와 -------- 1시간 반응 이후 3,000×g로 10분간 실온에서 원심 분리하고 ------- AP2 완충액 2.5㎖를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(8㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 -------- 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ------ 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물을 건조시킨다. 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 ------

② 옥수수 또는 옥수수 가공품

QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, 미리 65℃로 가온한 AP1완충액 5㎖와 ------- AP2 완충액 1.8㎖를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(4.2㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 ------ 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ---- 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물을 건조시킨다. 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 -----

③ (생  략)

4) DNA 시료의 농도 및 순도 확인과 농축

------ 추출 DNA시료 원액의 농축은 3M 초산나트륨 (pH5.2) -----

5) 정성분석방법

----- 증폭된 DNA를 확인한다. PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 자체적으로 제작한 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있다. PCR에서는 주형 DNA가 ----

(1) 프라이머의 준비

① 자체적으로 제작한 프라이머를 사용하는 방법

유전자재조합 콩, 옥수수, 감자 검출용 프라이머는 다음 표 1과 같은 AOAC학회지에 보고된 방법에 따라 합성하여 이용할 수 있으며, 이들은 현재 Nippon Gene사(일본)에서도 제작하여 시판하고 있다(표 2). 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다.

② 시판 GMO 검출 키트롤 사용하는 방법

시판되고 있는 유전자재조합 콩, 옥수수, 감자 검출 키트를 사용할 수 있으나, 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법과 동등한 결과를 얻을 수 있어야 한다. 또한, PCR 산물이 200bp 이상 생성되는 프라이머를 설계하는 것은 가공식품 분석에는 적합하지 않다.

(2) PCR용 시약의 조제

① 표준 DNA 용액의 조제

----- 다만, 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 대신 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하고 있는 양성 확인용 플라스미드를 사용할 수 있다.

② PCR 반응 시약의 조제

----- 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표3과 같다.

(3) (생  략)

표 1. AOAC학회지에 보고된 방법에 사용된 프라이머 및 프로브

목적	품 종 〈신설〉	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 〈신설〉 옥수수 〈신설〉	(생 략)	(생 략)
스크리닝	CMV p35S 〈신설〉 tNOS 〈신설〉	(생 략)	(생 략)
구조 유전자	[콩] RRS 〈신설〉 [옥수수] Bt176 〈신설〉 Bt11 〈신설〉 GA21 〈신설〉) T25 〈신설〉 MON810 〈신설〉) 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉	(생 략) 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉	(생 략) 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉 〈신설〉

(4) 전기영동에 따른 결과의 판정

① 영동조의 준비

----- 필요량의 아가로스를 칭량하여, TAE(Tris -acetate/EDTA)완충액(0.5배)을 넣고 가열하여 아가로스를 녹인다. 또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 전(前)염색법의 경우에는 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃정도로 식혀서 100㎖당 1㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10㎎/㎖)을 넣고 잘 혼합한다. 겔이 55℃정도로 식으면 겔 조제용 틀에 겔을 넣고 홈을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 TAE 완충액(0.5배)을 부어 홈을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 TAE 완충액(0.5배)을 채운다.

② 전기영동

---- 시료를 주입 후, 50～100V의 전압에서 전기영동한다. ----

③ 겔의 염색

후(後)염색법의 경우 TAE 완충액(0.5배) 100㎖당 5㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10㎎/㎖)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 증류수에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다.

④ 결과의 확인(생  략)

(5) 분석 결과의 판정 및 처리

①～② (생  략)

③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21이 있다.

④ (생  략)

6) 정량분석방법 (생  략)

7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법

(1) Lateral flow strip법 (생  략)

(2) PCR법

① (생  략)

② CBH351 검출용 프라이머

㉮ 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 프라이머를 사용한다.

㉯～㉰ (생  략)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 프라이머를 사용한 것에서 151bp의 PCR 증폭산물이 검출되고 ------

8) (생 략)

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<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

제 3. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. (현행과 같음)

2. 원료 등의 구비요건

1) 식품원료

(1) ~ (21) (현행과 같음)

(22) 과자류 중 컵모양 등 젤리의 원료로          다음의 겔화제는 사용할 수 없다

① 곤약, 글루코만난

(23) (현행 (22)와 같음)

3. 제조․가공기준

1)  (현행과 같음)

2) 개별기준

(1)～(3)  (현행과 같음)

(4) 캔디류

① 컵모양 등 젤리의 크기는 뚜껑과 접촉하는 면의 최소내경이 5.5cm 이상 이어야 하고 높이와 바닥면의 최소내경은 3.5cm이상이 되도록 제조하여야 한다

(5) ~ (25)  (현행과 (4)내지(24)와 같음)

(26)간장, 된장, 고추장, 춘장

①～⑥ (현행과 같음)

⑦고추장 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니 된다.

(27)～(28)  (현행과 (26) 내지 (27)과 같음)

(29)고춧가루 또는 실고추

①～③  (현행과 같음)

④고춧가루 제조공정에는 금속성 이물제거장치를 설치하여야 한다.

(30)향신료가공품

①  (현행과 같음)

② 향신료조제품 제조시 홍국색소를 사용할 수 없으며 또한 시트리닌이 검출되어서는 아니 된다.

(31) ~ (43) (현행 (30)내지(40)과 같음)

6. 기준 및 규격의 적용

1) 식품 일반의 규격

(1) ~ (6) (현행과 같음)

(7)이물

①식품은 원료의 처리과정 ---------- 우려가 없는 정도는 제외한다.

②금속성 이물로서 쇳가루는 제 7. 7. 1). (5) 금속성이물시험법에 따라 시험하였을 때 식품중 10.0 mg/kg 이상 검출되어서는 아니되며, 또한 크기가 2.0 mm 이상인 금속성 이물이 검출되어서는 아니된다.

(8) ~ (9) (현행과 같음)

(10) 식품 제조․가공 중 생성되는 유해물질

① 벤조피렌[Benzo(a)pyrene]

㉮ 식용유지 : 2.0 ㎍/kg 이하

(11) 잔류동물용의약품의 기준 적용

①관련법령에서 안전성 및 유효성에 문제가 있는 것으로 확인되어 제조 또는 수입 품목허가를 하지 아니하는 동물용의약품(대사물질 포함)은 검출되어서는 아니된다. 이에 해당되는 주요 물질은 아래와 같으며, 아래에 명시하지 않은 물질에 대해서도 관련법령에 근거하여 본 항을 적용할 수 있다.

번호	식품 중 검출되어서는 아니 되는 물질
1	니트로푸란{푸라졸리돈(Furazolidone), 푸랄타돈(Furaltadone), 니트로푸라존(Nitrofurazone), 니트로푸란토인(Nitrofurantoine), 니트로빈(Nitrovin) 등} 제제 및 대사물질
2	클로람페니콜(Chloramphenicol)
3	말라카이트 그린(Malachite green) 및 대사물질
4	디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol, DES)
5	디메트리다졸(Dimetridazole)
6	클렌부테롤(Clenbuterol)
7	반코마이신(Vancomycin)
8	클로르프로마진(Chlorpromazine)
9	티오우라실(Thiouracil)
10	콜치신(Colchicine)
11	피리메타민(Pyrimethamine)
12	메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate, MPA)

(12) 6개월 미만의 영․유아가 섭취할 수 있도록 제조․판매하는 식품에서는 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii), 대장균군, 타르색소가 검출되어서는 아니되며 세균수는 g당 20,000 이하(액상제품은 100이하)이어야 한다.

(13)식육 중 다이옥신 허용기준

①소고기 : 4.0 pg TEQ/g fat 이하

②돼지고기 : 2.0 pg TEQ/g fat 이하

③닭고기 : 3.0 pg TEQ/g fat 이하

(14) 식품접객업소, 집단급식소, 식품제조․가공업소 등에서 식재료 및 식기 등의 세척, 식품의 조리 및 제조․가공, 먹는 물 등으로 사용하는 물에서는 노로바이러스가 검출되어서는 아니된다. 다만, 식품접객업소, 집단급식소 등에서 먹는 물로 제공되는 수돗물은 제외한다.

2) 동물용의약품의 잔류허용기준

(1)~(2) (현행과 같음)

(3) 네오마이신(Neomycin)

--- 알   0.5   벌꿀   0.1

(4)~(8) (현행과 같음)

<삭  제>

(9) (현행 (10)과 같음)

(10) 디히드로스트렙토마이신/스트렙토마이신

(Dihydrostreptomycin /Streptomycin)

--- 양신장   1.0, 벌꿀   불검출

(11)~(39) <현행 (12)～(40)과 같음>

<삭  제>

(40)~(51) <현행(42)~(53)과 같음>

(52) 아미트라즈(Amitraz)

벌꿀    0.2

(53) 코마포스(Coumaphos)

벌꿀    0.1

(54) 플루메쓰린(Flumethrin)

벌꿀    0.01

(55) 플루발리네이트(Fluvalinate)

벌꿀    0.05

3) 농산물의 농약잔류허용기준

(1) ~ (100) (현행과 같음)

(101) 이미다크로프리드 (Imidacloprid)

--- 호프  3.0, 감 0.3, 자두 0.1

(102) ~ (109) (현행과 같음)

(110) 카두사포스 (Cadusafos)

--- 토마토 0.05, 배추 0.05

(111) ~ (124) (현행과 같음)

(125) 클로로타로닐 (Chlorothalonil)

--- 호박 2.0, 딸기 1.0, 기타농산물 0.05

(126) ~ (161) (현행과 같음)

(162) 페니트로치온 (Fenitrothion)

--- 호박 0.2, 마늘 0.03

(163) ～ (185) (현행과 같음)

(186) 프로클로라즈 (Prochloraz)

--- 호밀 0.5, 오이 1.0

(187) ~ (206) (현행과 같음)

(207) 테부페노자이드 (Tebufenozide)

--- 파 0.7, 복숭아 0.1

(208) (현행과 같음)

(209) 테플루벤주론 (Teflubenzuron)

--- 오이 0.2, 배 0.2

(210) ~ (229) (현행과 같음)

(230) 크레속심-메칠 (Kresoxim-methyl)

--- 피망 2.0, 마늘 0.3

(231) (현행과 같음)

(232) 트리싸이클라졸 (Tricyclazole)

--- 쌀 0.7, 수박 0.2

(233) ~ (250) (현행과 같음)

(251) 에톡사졸 (Etoxazole)

--- 수박 0.1, 고추 0.3, 피망 0.3

(252) (현행과 같음)

(253) 이미벤코나졸(Imibenconazole)

--- 포도 0.2, 복숭아 0.3

(254) ~ (289) (현행과 같음)

(290) 인독사카브(Indoxacarb)

--- 피망 1.0, 배 0.5

(291) ～ (335) (현행과 같음)

(336) 티디아주론(Thidiazuron)

--- 포도 0.2, 수박 0.1

(337) ~ (344) (현행과 같음)

(345) 피라크로스트로빈(Pyraclostrobin)

--- 토마토 1.0, 마늘 0.05

(346) ~ (348) (현행과 같음)

(349) 노발루론 (Novaluron)

--- 사과 1.0, 배추 0.1

(350) ~ (351) (현행과 같음)

(352) 메톡시페노자이드 (Methoxyfenozide)

--- 파 2.0, 배 0.2, 오이 0.3

(353) 메트코나졸 (Metconazole)

--- 포도 2.0, 복숭아 0.3, 고추 0.3

(354) ~ (355) (현행과 같음)

(356) 에타복삼 (Ethaboxam)

--- 포도 3.0, 배추 2.0

(357) ~ (362) (현행과 같음)

(363) 티람 (Thiram)

--- 포도 2.0, 사과 0.3

(364) ~ (372) (현행과 같음)

(373) 스피로메시펜(Spiromesifen)

--- 토마토 1.0, 복숭아 0.2, 포도 1.0,참외 0.5

(374) ~ (383) (현행과 같음)

(384) 사이플루페나미드 (Cyflufenamid)

--- 참외 0.3, 고추 0.3, 기타농산물 0.1

(385) (현행과 같음)

(386) 플로니카미드 (Flonicamid)

사과 0.7, 수박  0.5, 기타농산물 0.1

(387) ~ (389) (현행과 같음)

(390) 시메코나졸 (Simeconazole)

포도 1.0, 기타농산물 0.05

(391) ~ (394) (현행과 같음)

(395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide)

토마토  0.2, 기타농산물 0.2

(396) 에티클로제이트 (Ethyclhozate)

밀감 0.05, 기타농산물 0.05

4)  (현행과 같음)

5) 인삼의 농약잔류허용기준

(1) ～ (33) (현행과 같음)

(34) 피라크로스트로빈(Pyraclostrobin)

수삼 2.0

6) ~ 14) (현행과 같음)

7 ~ 8. (현행과 같음)

제4. 식품별 기준 및 규격

1. 과자류

1-3 캔디류

3) 규격

(1) ～ (5) (현행과 같음)

(6) 압착강도(Newton) : 5 이하(컵모양 등 젤리에 한한다)

2~20 (현행과 같음)

제 5. 식품접객업소의 조리판매식품 등에 대한 미생물 권장규격

1.  (현행과 같음)

2. 규격

2-1. (현행과 같음)

2-2.접객용 음용수(식품접객업소 등에서 손님에게 제공되는 음용수), 수족관물, 조리용구 등

1)규격

(1)  (현행과 같음)

(2)수족관물

①  (현행과 같음)

②대장균군 : 1,000이하/100 mL

(3)～(4)  (생  략)

2)  (현행과 같음)

6.  (현행과 같음)

제7. 일반시험법

1 ~ 5 (현행과 같음)

6. 유해성금속 시험법

1)시험용액의 조제

(3)건식회화법

검체(건조물로서 5～20g에 상당하는 양)를 도가니-----탄화시킨 다음 450～500℃에서 회화한다.(이하 생략)

2)～4)  (현행과 같음)

5)농산물 및 수산물 중 중금속 시험법

(1) 검체

농산물의 종류에 따라 아래 표에서와 같이 처리한 것을 검체로 한다. 다만, 이 표에서 정하지 아니한 농산물과 수산물은 원칙적으로 가식부를 시험부위로 한다.

표 (현행과 같음)

(2)시험용액의 조제

①～②  (현행과 같음)

③건식회화법

시료 일정량 (측정하는 기기에 따라 달라짐)을 도가니, 백금접시에 취해 제7. 일반시험법 6.유해성금속시험법 (3) 건식회화법에 따른다.

(3)  (현행과 같음)

7. 이물시험법

1)일반시험

(1) ~ (4) (현행과 같음)

(5) 금속성이물(쇳가루) 시험법

① 검체(분말제품 500g, 액상제품 1kg)에 증류수 5 ~ 6 L와 혼합 후 비닐을 씌운 봉자석(10,000 가우스 자력)으로 10분간 저어 쇳가루를 모은 후 건조하여 무게를 측정한다.

② 모은 쇳가루를 자력제거장치로 자력을 제거하고 표준망체(1.4x1.4 mm)에 통과하지 않고 남아 있는 쇳가루의 크기를 측정한다.

③ 검출된 쇳가루가 식품과 붙어있거나 물리적으로 결합된 경우 300℃에서 1시간 회화로에서 가열하여 회화시킨 후 자석으로 쇳가루를 모아 무게를 측정하고 ②에 따라 크기를 측정한다.

8 ~ 14 (현행과 같음)

15. 식품중의 잔류물질시험법

1) (현행과 같음)

2) 항생물질

(1) (현행과 같음)

(2)정량시험법

①기기분석법

㉮～ (현행과 같음)

네오마이신(Neomycin)

Ⓐ정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 네오마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 하고 영하 20℃에 보관한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ MCX(Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지 또는 이와 동등한 것

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g에 물 20 mL를 넣고 진탕하여 충분히 녹이고 0.1 M 염산을 사용하여 pH 2로 조정한다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지(충진제 60 mg)에 흡착시키고 5 mL의 10% 메탄올성 수산화암모늄용액으로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 0.1 M 염산 1 mL로 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

- 액체크로마토그래프 조건

․ 칼럼 : C18 (2.1×100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

․ 이동상

이동상 A : 20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 수용액

이동상 B : 20 mM 개미산, 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 메탄올용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
0.5	30	70
5.0	5	95
5.1	50	50
10.0	50	50

․ 유속 : 0.2 mL/min

․ 주입량 : 10 μL

- 질량분석기 조건

․ Ionization : ESI(positive)

․ Gas Temp. : 350℃

․ Gas Flow : 8 L/min (질소)

․ Nebulizer : 35 psi

․ Collision energy : 30 V

㉡ 정량

- 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 455의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 네오마이신의 함량을 구한다. 검량선 작성은 표준용액 2.5, 5.0, 10, 25, 50 μg/L의 5개 농도를 이용한다.

물질	Precursor Ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
네오마이신	615	455, 323, 163, 161

스트렙토마이신(Streptomycin), 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin)

Ⓐ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제한 후 칼럼 후 유도체화 장치가 장착된 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

Ⓑ 측정기기

액체크로마토그래프/형광검출기

Ⓒ 시약 및 시액

㉠ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

㉡ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

㉢ 표준원액 : 스트렙토마이신, 디히드로스트렙토마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.

㉣ 표준용액 : 표준원액을 물에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

㉤ Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone Copolymer(충진제) 카트리지 칼럼 : HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것

㉥ 0.2 M HSA(sodium hexane-1-sulfonic acid) 완충액 : 2.0225 g HSA를 50 mL 물에 녹인다.

㉦ 0.01 M HSA 완충액 : 2.0225 g HSA를 물 1 L에 녹인다.

㉥ 기타시약 : 특급

Ⓓ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 20 mL에 녹여 15분간 균질화한 후 0.2 M HSA 1 mL를 가한다. 미리 메탄올 5 mL, 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지(충진제 60 mg)에 추출액을 흡착시키고 5 mL 물로 세척한 후 5 mL의 메탄올로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 0.01 M HSA(아세트산으로 pH 3.3으로 조정) 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓔ 시험조작

㉠ 측정조건

- 칼럼 : C18 (3.0×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 0.01 M HSA 완충액 800 mL에 1,2-나프토퀴논-4-설폰산(1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid) 0.10408 g을 녹인 용액과 아세토니트릴 200 mL를 혼합하고 아세트산으로 pH 3.5으로 조정한 후 갈색병에 보관한다.

- 유속 : 0.8 mL/min

- 측정파장 : 여기파장 260 nm, 형광파장 435 nm

- 칼럼후 유도체화 장치

․ 이동상 : 0.2 M 수산화나트륨용액

․ 유속 : 0.5 mL/min

․ 반응코일 : 10 m

․ 반응온도 : 55℃

㉡ 정량시험

- 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 스트렙토마이신 및 디히드로스트렙토마이신 함량을 각각 구한다.

- 정량한계 : 0.1 mg/kg

3) 합성항균제

(1) (현행과 같음)

(2) 정량시험법

①~ (현행과 같음)

엔로플록사신(Enrofloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 다노플록사신(Danofloxacin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin) 및 페플록사신(Pefloxacin)

㉮ 정량법의 원리

식육, 유(乳), 알(卵), 어류 및 갑각류 등 모든 식품 중 플루오로퀴놀론계를 시료고체상분산법(MSPD, Matrix Solid Phase Dispersion) 또는 인산, 이동상 및 아세토니트릴 등으로 추출하여 헥산 또는 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

㉯ (현행과 같음)

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 표준원액 : 엔로플록사신, 시프로플록사신, 다노플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신 표준품을 정밀히 달아 100 mL 용량플라스크에 취하고 메탄올로 표시선까지 채워 100 μg/mL 농도가 되게 한다.

Ⓑ 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 적당한 농도가 되게 희석하여 사용한다.

Ⓒ 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) : 1 L 정용플라스크에 0.2 M 인산이수소칼륨(KH2PO4) 250 mL와 0.2 M 수산화나트륨 197.5 mL를 혼합한 후 물로 표시선까지 채운다.

Ⓓ (현행Ⓒ와 같음)

㉱ 시험용액의 조제

Ⓐ 유(乳)

시료를 균질화하여 5 g을 원심분리관에 취한 후 20% 메탄올성 삼염화초산 2.5 mL를 넣고 15초간 균질화한다. 이 용액을 1,500 G에서 10분간 원심분리한 후 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 12.5 mL을 가하고 1,500 G에서 15분간 다시 원심분리 한다. 상층액을 메탄올 6 mL, 물 6 mL, 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 6 mL로 차례로 미리 활성화시킨 C18 카트리지에 흡착시키고 물 3 mL로 세척한 후, 3분간 감압하에서 건조시키고 아세토니트릴성 1% trifluoroacetic acid 6 mL로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

Ⓑ 어류 및 갑각류를 포함한 수산물

시료를 마쇄한 후 5 g을 취한 후 이동상과 아세토니트릴을 1:1로 섞은 혼합액 40 mL를 가하여 균질기로 2분간 균질화 시킨다. 이 액을 80℃에서 10분간 열처리하여 방냉 한 다음 3,000 G에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한다. 이 상등액을 분액여두로 옮겨 헥산 50  mL을 가하여 액층이 분리될 때까지 정치한다. 분리된 하층액은 40℃에서 잔사만이 남을 때까지 감압농축하고 이 건고물은 이동상 2.5 mL을 가하여 충분히 용해시킨 다음 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 사용한다.

Ⓒ Ⓐ, Ⓑ를 제외한 모든 식품

C18 분말 2 g을 유발에 취하고 시료 0.5 g을 정확히 달고 수산 0.05 g과 무수황산나트륨 0.03 g을 첨가한 후 유봉으로 C18과 시료가 완전히 균질화되도록 한다. 여과지(Whatman No. 1) 2장을 10 mL 주사기에 넣고 균질화된 혼합물을 주사기에 옮겨 담는다. 혼합물 위에 여과지 1장을 놓고 주사봉을 이용하여 혼합물의 부피가 약 4.0 mL 되게 압축한다. 헥산 8 mL를 가하여 흘려보내고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 혼합물 내에 남아있는 헥산을 음압 하에서 제거한다. 다시 에틸아세테이트 8 mL로 세척하고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 음압 하에서 완전히 건조시킨다. 메탄올 13 mL로 용출시킨 후 그 용출액을 질소 농축하여 건조시키고 이동상 0.5 mL를 가하여 10분간 초음파를 통과시키고 용해시킨 후 4℃, 6,000 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 이동상 : 0.4% 트리에틸아민, 0.4% 인산의 혼합액 : 아세토니트릴 : 테트라히드로퓨란(920 : 78 : 2)

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 ---- 검량선을 작성하여 검체중 엔로플록사신, 시프로플록사신, 다노플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신의 함량을 각각 구한다.

- 정량한계 : 0.05 mg/kg

~  (현행과 같음)

아미트라즈(Amitraz), 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 아세톤:헥산(1:49) 혼합액으로 추출하고 0.25% 암모니아수를 넣어 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 표준품을 정밀히 달아 아세톤:헥산(1:24) 혼합액에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세톤:헥산(1:49) 혼합액에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 : 아세톤:헥산(1:49) 혼합액

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 삼각플라스크에 정밀히 달고 물 70 mL와 암모니아수 10 μL를 넣어 알칼리 조건에서 5분간 균질화한 후 추출용액 70 mL를 넣고 25분간 실온에서 교반한다. 이 액을 분액깔때기에 옮기고 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 2회 세척한 액과 합친다. 분액깔대기를 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층(아래층)은 다른 분액깔대기에 옮기고  여기에 추출용액 30 mL를 넣어 위와 같이 반복한 후 물층(아래층)은 버리고 유기용매층(윗층)을 앞의 분액 깔대기에 합친다. 0.25% 암모니아수 70 mL를 넣고 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층을 버리고 이 과정을 한번 반복한 후 유기용매층을 삼각플라스크에 옮긴다. 여기에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 약하게 흔들어 섞으면서 방치한 후 여과하고 다시 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 씻고, 이 씻은 액으로 여지상의 잔류물을 2회 반복하여 씻고 여과한다. 여액을 합쳐 35℃ 이하의 수욕조에서 유기용매를 감압 하에 날려 보낸다. 잔사를 내부표준물이 포함된 아세톤∶헥산(1:24)의 혼합액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×300 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 70% 아세토니트릴

- 유속 : 1.2 mL/min

- 측정파장 : 233 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 함량을 각각 구한다. 구해진 아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린 함량의 합을 검체 중 아미트라즈의 잔류량으로 한다.

코마포스(Coumaphos)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 아세톤:헥산(1:49) 혼합액으로 추출하고 0.25% 암모니아수를 넣어 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 코마포스 표준품을 정밀히 달아 아세톤:헥산(1:24) 혼합액에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 아세톤:헥산(1:49) 혼합액에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 추출용액 : 아세톤:헥산(1:49) 혼합액

Ⓕ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 삼각플라스크에 정밀히 달고 물 70 mL와 암모니아수 10 μL를 넣어 알칼리 조건에서 5분간 균질화한 후 추출용액 70 mL를 넣고 25분간 실온에서 교반한다. 이 액을 분액깔때기에 옮기고 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 2회 세척한 액과 합친다. 분액깔대기를 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층(아래층)은 다른 분액깔대기에 옮기고  여기에 추출용액 30 mL를 넣어 위와 같이 반복한 후 물층(아래층)은 버리고 유기용매층(윗층)을 앞의 분액깔대기에 합친다. 0.25% 암모니아수 70 mL를 넣고 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층을 버리고 이 과정을 한번 반복한 후 유기용매층을 삼각플라스크에 옮긴다. 여기에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 약하게 흔들어 섞으면서 방치한 후 여과하고 다시 추출용액 10 mL로 삼각플라스크를 씻고, 이 씻은 액으로 여지상의 잔류물을 2회 반복하여 씻고 여과한다. 여액을 합쳐 35℃ 이하의 수욕조에서 유기용매를 감압 하에 날려 보낸다. 잔사를 내부표준물이 포함된 아세톤∶헥산(1:24)의 혼합액 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×300 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 70% 아세토니트릴

- 유속 : 1.2 mL/min

- 측정파장 : 313 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 코마포스 함량을 구한다.

플루메쓰린(Flumethrin)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물과 아세토니트릴을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다.

㉯ 측정기기

액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 플루메쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 5 mL 물에 녹여 균질화한 뒤, 10 mL 아세토니트릴을 첨가하여 균질화하고 1000 G, 4℃에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 새로운 원심분리관에 옮기고 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 가한 다음 1000 G, 4 ℃에서 5분간 원심분리한 뒤 상등액을 앞의 상등액과 합한다. 이 액에 염화나트륨 소량을 첨가하여 진탕 후 1,000 G, 4℃에서 5분간 원심분리 한 다음, 상등액을 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 헥산 5 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 헥산 10 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지(충진제 500 mg)에 추출액 2 mL를 흡착시키고 헥산:디클로로메탄 혼합액(55:45) 10 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 메탄올 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : C18 (4.6×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 이동상 : 85% 아세토니트릴

- 유속 : 1.0 mL/min

- 측정파장 : 266 nm

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 플루메쓰린 함량을 구한다.

플루발리네이트(Fluvalinate)

㉮ 정량법의 원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 가스크로마토그래프/전자포획검출기(GC/ECD)로 분석한다.

㉯ 측정기기

가스크로마토그래프/전자포획검출기

㉰ 시약 및 시액

Ⓐ 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

Ⓑ 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

Ⓒ 표준원액 : 타우플루발리네이트(tau-Fluvalinate) 표준품을 정밀히 달아 헥산에 녹여 100 μg/mL로 한다.

Ⓓ 표준용액 : 표준원액을 헥산에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.

Ⓔ 기타시약 : 특급

㉱ 시험용액의 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 증류수 20 mL에 녹여 균질화한 후, 15분간 초음파를 통과시킨다. 이 액에 디클로로메탄 10 mL를 가한 후 강하게 1분간 균질화하고 1,000 G, 영하 10℃에서 10분간 원심분리한다. 물층에 디클로로메탄 10 mL를 가하고 강하게 1분간 균질화하여 1,000 G, 영하 10℃에서 10분간 원심분리한 후 앞의 디클로로메탄층과 합하여 황산나트륨층을 통과하여 탈수하고  40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 50% 메탄올 4 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 8 mL와 50% 메탄올 8 mL로 활성화시킨 Sep-pak C8 카트리지(충진제 500 mg)에 추출액을 흡착시키고 물 8 mL와 50% 메탄올 8 mL로 세척한 후, 디클로로메탄 8 mL와 에틸아세테이트 4 mL로 용출한다. 용출액은 40℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

㉲ 시험조작

Ⓐ 측정조건

- 칼럼 : DB-17 캐필러리 칼럼(30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

- 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 mL/분

- 오븐온도 : 100℃에서 시료를 주입하고 2분간 유지 후 15℃/분의 비율로 280℃까지 온도를 상승시켜 30분간 유지한다.

- 주입부 : 260℃

- 검출기온도 : 280℃

Ⓑ 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 플루발리네이트 함량을 구한다.

4)～5) (생  략)

6) 유(乳) 중 잔류물질 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) 합성항균제

①~④ (현행과 같음)

<삭  제>

7)알(卵) 중 잔류물질 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) 합성항균제

① (현행과 같음)

<삭  제>

8) 어류 및 갑각류중 잔류물질 시험법

(1) (현행과 같음)

(2) 합성항균제

① (현행과 같음)

<삭  제>

16 ~ 22 (생 략)

23. 유전자재조합식품의 시험법

1)～2) (현행과 같음)

3) DNA 추출․정제법

(1) CTAB법

---- 55℃에서 30분간 반응시킨다. 이때 매 10분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 30분간 반응 이후 혼합기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600 μL를 1.5 mL 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500 μL를 가하여 잘 혼합한 후 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 500 μL를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합한 후, 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500 μL의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 12,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하고,  ------ 마이크로 피펫으로 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. TE 완충액 ------ 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250 μL를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 12,000 G로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮긴다. ----- 200 μL의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리한다. ------ 그런 다음 12,000 G로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 -------

(2) 실리카겔 막 형태를 이용한 방법

① 콩 또는 콩 가공품

QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, AP1완충액(미리 65℃로 가온한 것) 10 mL와 -------- 1시간 반응 이후 스윙로터(Swinging-bucket Rotor)를 사용하여 3,000 G로 10분간 실온에서 원심 분리하고 ------ AP2 완충액 2.5 mL를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000 G로 35분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(8 mL)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 -------- 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터(Fixed-angle Rotor)를 사용하여 12,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ------ 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50 μL의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 -----

② 옥수수 또는 옥수수 가공품

QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1 g을 폴리프로필렌 튜브(50 mL용)에 넣고, AP1완충액(미리 65℃로 가온한 것) 5 mL와 ---------- AP2 완충액 1.8 mL를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000 G로 35분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(4.2 mL)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후------------동량의 이소프로필알콜을 가하고상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터를 사용하여 12,000 G로 15분간 4℃에서 원심분리한 후------ 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물의 잔류 에탄올이 완전히 휘발될 정도로만 건조시킨다. 건조된 침전물에 50 μL의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 -----

③ (현행과 같음)

4) DNA 시료의 농도 및 순도 확인과 농축

------ 추출 DNA시료 원액의 농축은 시중에 판매되고 있는 DNA 농축킷트를 사용하거나, 다음과 같은 방법에 의한다. 3M 초산나트륨 (pH5.2) --------

5) 정성분석방법

----- 증폭된 DNA를 확인한다. PCR에서는 주형 DNA가 ----

(1) 프라이머의 준비

PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1 및 표2와 같다. 그밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있으나, PCR 증폭산물이 200bp 이상이 되게 하는 프라이머는 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

(2) PCR용 시약의 조제

① 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제

----- 한편, 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 외에도 제조사에서 해당 프라이머에 특이적으로 제작하여 시판 중인 양성 확인용 DNA 플라스미드를 반응대조군으로 사용할 수 있다.

② PCR 반응 시약의 조제

----- 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표3과 같다.

(3) (현행과 같음)

표 1. PCR 검사에 사용되는 프라이머 및 프로브

목적	품 종 (증폭산물 크기)	프라이머/ 프로브	염기서열
내재성 유전자	콩 (118 bp) 옥수수 (151 bp)	(현행과 같음)	(현행과 같음)
스크리닝	CMV p35S (101 bp) tNOS (151 bp)	(현행과 같음)	(현행과 같음)
구조 유전자	[콩] RRS (121 bp) [옥수수] Bt176 (100 bp) Bt11 (127 bp) GA21 (133 bp) T25 (149 bp) MON810 (113 bp) NK603 (143bp) TC1507 (103bp)	(현행과 같음) NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3'	(현행과 같음) 5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3'

(4) 전기영동에 따른 결과의 판정

① 영동조의 준비

----- 필요량의 아가로스를 칭량하여, 전기영동 완충액을 넣고 가열하여 아가로스를 녹여 사용한다. 전기영동 완충액으로는 0.5배 또는 1배의 TAE(Tris-acetate/EDTA) 완충액 또는 TBE(Tris-borate/EDTA) 완충액을 사용할 수 있으나, 아가로스 겔의 제조 시 사용된 완충액과 같은 것을 전기영동과정 및 겔의 염색과정에서도 사용하여야 한다. 또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃정도로 식혀서 겔 조제용 틀에 넣고 콤(comb)을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 전(前)염색법의 경우 겔 조제용 틀에 넣기 전에 아가로스겔 100mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10 ㎎/mL)을 넣고 잘 혼합하며, 후(後)염색법의 경우 겔 조제 시 에티디움 브로마이드를 넣지 않는다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 전기영동 완충액을 부어 콤을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 전기영동 완충액을 채운다.

② 전기영동

---- 시료를 주입 후, 사용하는 전기영동조의 규격에 맞는 전압에서 전기영동한다. ----

③ 겔의 염색

후(後)염색법의 경우 전기영동 완충액 100 mL당 5 μL의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10 ㎎/mL)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 전기영동 완충액에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다.

④ 결과의 확인(현행과 같음)

(5) 분석 결과의 판정 및 처리

①～② (현행과 같음)

③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810, NK603, TC1507이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603이 있다.

④ (현행과 같음)

6) 정량분석방법 (현행과 같음)

7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법

(1) Lateral flow strip법 (현행과 같음)

(2) PCR법

① (현행과 같음)

② CBH351 검출용 프라이머

㉮ 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

㉯～㉰ (현행과 같음)

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고------

8) (현행과 같음)

9) Bt10 옥수수의 분석법

옥수수 원곡 또는 옥수수 가공식품에 대하여 해충저항성 및 제초제 내성 유전자재조합 옥수수 Bt10을 검출하기 위한 방법이다.

(1) DNA의 추출 및 PCR

3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액을 사용하며, 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다.

① 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다.

② Bt10 옥수수 검출용 프라이머는 다음과 같다.

F-primer(JSF5) : 5'-CAC ACA GGA GAT TAT TAT AGG GTT ACT CA-3'

R-primer(JSR5) : 5'-ACA CGG AAA TGT TGA ATA CTC ATA CTC T-3'

(2) PCR 증폭산물의 확인

Bt10 옥수수 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 위양성결과를 방지하기 위하여 다음과 같이 제한효소 확인시험을 실시한다.

① 제한효소 확인시험

117bp로 추정되는 시료의 PCR 증폭산물 10 uL에 SspI(Invitrogen사 제품) 1 μL (10 units)와 REACT6 buffer 1 μL를 가하여 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액 10 μL와 1/6배의 염색액(gel loading buffer) 2 μL를 혼합하고, 그 혼합액 10 uL를 3% 아가로스겔에서 염색액에 함유된 BPB가 겔의 약 90% 가량 전개될 때까지 전기영동한다. Bt10 옥수수 추출 DNA를 함유한 양성대조군의 PCR 증폭산물에 대해서도 동일한 조건으로 제한효소를 처리하고 전기영동을 실시한다. 이때 단편의 크기 비교가 용이하도록 양성대조군과 시료를 1조로 하여 아가로스겔에 로딩하며, 표식 DNA (Marker DNA)로는 25/100bp DNA ladder를 사용한다. 5) 정성분석방법 (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ③ 겔의 염색 및 ④ 결과의 확인에 따라 77bp와 40bp의 밴드가 나타나는지를 확인한다.

(3) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고, Bt10 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, 117bp의 PCR 증폭산물에 대한 제한효소 분해산물이 2개의 DNA 단편으로서 그 크기가 77bp와 40bp임이 확인되는 경우 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “Bt10 옥수수 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.

10) 해충 저항성 Bt 쌀의 분석법

쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여 해충 저항성 Bt 쌀을 검출하기 위한 방법이다. 최소한 6,000립 또는 200g 이상을 취하여 분쇄기로 균질하게 분쇄한 것을 분석시료로 사용하며, 3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액에 대하여 5) 정성분석방법에 따라 PCR을 실시하되, 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하는 PCR의 온도조건은 표 11과 같다. 쌀 내재성 유전자와 NOS 터미네이터에 대한 프라이머를 사용하여 1차 스크리닝 PCR을 하며, 그 결과가 양성인 경우 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용하여 확인 PCR을 실시하여 혼입 여부를 판정한다.

(1) 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머

① 내재성 유전자를 확인하기 위한 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(12μM)는 각각 0.12 μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25 μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(OsSPS-F) : 5'-GAT CGG TTC CGC CAT TAG CA-3'

R-primer(OsSPS-R) : 5'-AAC CGA GCG CGA TCA CTT GC-3'

② 해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머는 다음과 같으며, 프라이머(40 μM)는 각각 0.4 μM이 되도록 PCR 튜브에 0.25 μL씩 가하여 사용한다.

F-primer(Oscry1Ac-F) : 5'-GCA GGA GTG ATT ATC GAC AG-3'

R-primer(OsNOS-R2) : 5'-AAG ACC GGC AAC AGG ATT CA-3'

표 11. 쌀 내재성 유전자와 해충 저항성 Bt 쌀 확인시험용 PCR 조건

	온도	시간	cycle 수
최초의 변성	95℃	5분	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension)	95℃ 62℃ 72℃	30초 30초 30초	40 cycles
최종신장(elongation)	72℃	8분	1 cycle
보존	4℃	-

(2) 결과의 판정

내재성 유전자를 확인하기 위해 OsSPS 프라이머를 사용한 것에서 110bp의 PCR 증폭산물이 검출되고, NOS 터미네이터 검출용 프라이머를 사용한 것에서 151bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, Oscry1Ac/OsNOS 프라이머를 사용한 것에서 147bp의 PCR 증폭산물이 확인되는 경우 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다른 DNA 추출액에서의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.

27. 식육 중 다이옥신류 시험법

1) 장치

분해능이 10,000 이상인 고분해능 가스크로마토그라프/고분해능 질량분석기 (HRGC/HRMS)를 사용한다.

2) 시약, 시액 및 기구

시약 및 시액은 다이옥신 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 한다.

(1) 용매 : 잔류농약 분석용 또는 이와 동등 이상의 것.

(2) 무수황산나트륨 : 특급이상(400℃에서 최소 1시간 이상 구운 것).

(3) 검량용 표준물질(Calibration standard) : 다이옥신의 정성 및 정량에 사용하는 검량용 표준물질은 표 1과 같이 2,3,7,8-치환 동족체 17종과, 13C12 동족체(Labeled) 및 37Cl4 동족체 (또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

(4) 회수율 측정용 표준물질(Labeled compound standard) : 시료의 추출과정 전에 첨가하는 정량 및 회수율 측정용 내부표준물질은 13C12 동족체로 된 다이옥신 중 표 1과 같은 화합물(또는 이와 동등한효과를 갖는 것)을 사용한다.

(5) 내부표준물질(Internal standard solution) : 가스크로마토그라프/질량분석기에 주입하기 전에 첨가하는 내부표준물질은 13C12-1,2,3,4-TCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)및 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

(6) 검량선 작성용 표준물질의 조제 : 정량용 표준물질을 검출한계부분의 저농도의 것과 예상 검출농도보다 높은 고농도의 것을 적어도 하나 이상 포함시켜 5단계 이상의 농도 범위로 조제한 것(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것).  단, 검량선 작성용 표준용액들은 직선성을 유지하여야 한다.  검량선 작성용 표준용액은 정량용 표준물질의 13C12 동족체 및 37Cl4 동족체가 동일 농도로 함유되어야 한다.

(7) 정밀 회수용 표준물질(Precision and recovery standard) : 다이옥신의 회수율을 측정하기 위해 일정농도의 정밀 회수용 표준물질을 사용하여야 한다(표 1).

(8) 실리카겔 : 칼럼크로마토그라피용 실리카겔(100～200 mesh)을 디클로로메탄으로 세척하여 180℃에서 1시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 식힌다.

(9) 산성 실리카겔 : 실리카겔 100 g에 황산 44.0 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.

(10) 염기성 실리카겔 : 실리카겔 100 g에 1N 수산화나트륨 30 g을 넣어 잘 흔들어 섞어 사용한다.

(11) 염기성 알루미나 : 600℃에서 24시간이상 가열한 후 데시케이터에서  식힌다.

(12) 실리카겔 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(중성실리카겔 1.5 g, 염기성실리카겔 2 g, 산성실리카겔 4 g의 순서로 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.

(13) 알루미나 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 177 mm의 정제용 칼럼(염기성알루미나 12.5 g을 충전한 것) 또는 이와 동등 이상의 것.

(14) 카본 칼럼 : 안지름 11 mm, 길이 10 mm의 정제용 칼럼[8% 카본/규조토(celite 545-AW 0.275 g을 충전한 것)] 또는 이와 동등 이상의 것.

(15) 기타 : 다이옥신 분석에 적합한 것

3) 시험용액의 조제

(1) 추출

시료를 균질화하여 약 15～20 g을 막자사발에 취하여 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 다음 속실렛용 원통형 여지로 옮기고 따로 시료를 넣지 않은 원통여지에 각각 회수율 측정용 표준물질을 첨가 한 다음 ★비등석이 첨가된 속실렛 장치에 추출용매(예; 디클로로메탄 : 헥산 = 3 : 1) 300 mL를 넣어 18시간 이상 추출한다.  별도로 회수율 측정용 시료에는 정밀 회수용 표준물질을 첨가하여 ★이후부터 동일한 방법을 사용한다.

(2) 조지방 함량

속실렛 추출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압 농축한 후 질소농축기를 이용하여 항량이 될 때까지 농축하여 조지방 함량을 구한다.

조지방 함량(g)	=	W1 - W0
		S

W0 : 플라스크의 무게(g)

W1 : 조지방을 추출하여 농축한 플라스크의 무게(g)

S : 시료의 채취량(g)

(3) 조지방 제거

유리솜이 들어있는 분액여두에  유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g과 조지방 1 g 당 산성실리카겔 10 g을 첨가한다.  헥산 3 mL로 조지방을 충분히 용해한 다음 분액여두에 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣는다.  이러한 조작을 2회 반복한 다음 20분간 반응시킨 후 헥산 130～150 mL로 용출한다.  이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 약 3 mL가 되도록 감압 농축한 후 다른 시험관에 옮기고 감압용기를 다시 헥산 3 mL씩 2회 세척하여 용액을 시험관에 합한다.

(4) 정제

헥산으로 활성화된 실리카겔 칼럼에 위의 용액을 넣은 후 헥산으로 용출시키고 그 용출액을 알루미나 칼럼에 첨가한 다음 2% 디클로로메탄 함유 헥산으로 방해물질을 제거하여 50% 디클로로메탄 함유 헥산으로 다시 용출시킨다.  이 알루미나 칼럼에서 용출한 액을 카본 칼럼에 넣고 50% 초산에칠 함유 벤젠으로 용출시킨 다음 다시 헥산으로 방해물질을 제거한 후 톨루엔으로 역 용출한다.  이 용출액을 질소 감압기를 사용하여 농축한 다음 내부표준물질을 첨가하여 이를 시험용액으로 한다.

※주의 : 칼럼크로마토그래피에서 사용하는 충전제나 용매의 종류 및 양은 표준물질 등으로 분획 실험하여 최적조건을 확립하여야 한다.

4) 시험조작

(1) 가스크로마토그라프의 측정조건

① 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼(60 m × 0.2～0.32 mm ID, 0.1～0.25 μmdf) 또는 이와 등등 이상의 것으로 분석하고자 하는 전 동족체가 양호하게 분리되어야 하며 그 분리 효율을 입증할 수 있는 것이어야 한다.

② 오븐온도 : 각 동족체의 분리가 양호하도록 적절한 온도조건을 설정한다.  단, 2,3,7,8-TCDD와 2,3,7,8-TCDF는 인접한 피크의 분리도가 봉우리 높이 대비 25% 미만이어야 한다.

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 0.5～5.0 mL/분

④ 주입부온도 : 약 270℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

⑤ 연결부온도 : 약 290℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

⑥ 이온원온도 : 약 260℃ 또는 각 동족체의 분리가 양호한 온도

(2) 고분해능 질량분석기의 측정조건

① 튜닝 표준물질 : PFK 또는 이와 동등한 것

② 분해능 : 10,000 이상 (10% valley 기준)

③ 이온화방식 : 전자충격이온화 방식 (EI)

④ 질량설정 : 측정하고자 하는 이온의 질량은 각 동족체마다 2개 이상의 이온을 선택이온(selected ion), 즉 M+, [M+2]+ 또는 [M+4]+를 사용한다.  주로 사용하는 각 다이옥신의 대표적 이온 질량은 표1과 같다.

⑤ 질량 검정 : 가스크로마토그라프/질량분석기는 시료분석조건과 동일한 조건에서 분해능 10,000 이상으로 조정한 다음, 4 염화물에서 8 염화물의 선택이온들을 적당한 그룹으로 나누어 튜닝 표준물질에 의한 질량 검정을 하여야 한다.

⑥ 주기적 점검 : 분석을 지속적으로 수행하는 경우 매 12시간마다 검량용 표준물질 중 중간농도의 표준물질을 선택하여 분석조건을 점검하여야 하며 회수율은 80%～120%에 있어야 한다.

⑦ 검출한계 : 4～5염화물의 검출한계는 0.04 pg/g이하이어야 한다.

(3) 정성시험

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어떠한 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며, 측정한 선택이온 2개의 이온세기 비율은 표2～3에 나타난 이론값에 대하여 ±15% 이내이어야 한다.  단, 모든 신호 대 잡음(S/N)비는 2.5 보다 커야 하며, 정량용 13C12 및 37Cl4의 경우는 10보다 커야 한다.

(4) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 검출된 각각의 다이옥신에 대해 이에 대응하는 정량용 13C12 동족체 및 37C12 동족체 표준물질로 상대 내부표준법으로 정량한다.  또한 회수율 측정용 표준물질 37Cl4-2,3,7,8-TCDD와 13C12-2,3,7,8-TCDD 등 15종의 표준물질에 대한 농도를 절대 내부표준법으로 정량한다.  회수율 측정용 표준물질의 회수율은 17% 이상 1850% 이하이어야 하며, 정밀 회수용 표준물질의 회수율은 63% 이상 170% 이하이어야 한다.

① 검량선 작성

검량선 작성용 표준물질을 (3)정성시험과 같은 방법으로 가스크로마토그라프/질량분석기에 주입하여 각 선택이온에 대한 크로마토그램을 작성하여 각 표준물질의 피크 면적과 이에 대응하는 13C12 동족체의 피크 면적으로부터 다음 식에 의해 상대감응도(Relation Response : RR)를 구한다.  상대감응도는 5개 농도 이상의 검량선 작성용 표준물질을 사용하며 편차범위는 ±20% 이내이어야 한다.

RR	=	(A1n + A2n)(Cl)
		(A1l + A2l)(Cn)

A1n, A2n : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 다이옥신의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적

A1l, A2l : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적

Cn : 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cl : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 농도

② 반응계수

반응계수(RF)는 검량선 작성용 표준물질로부터 얻은 크로마토그램으로 내부 표준법에 따라 다음의 식으로부터 구한다.  5개 농도의 검량선 작성용 표준물질을 사용한 반응계수의 편차범위는 ±35% 이내이어야 한다.

RF	=	(A1s + A2s)(Cis)
		(A1is + A2is)(Cs)

A1s, A2s : 검량선 작성용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

Cs : 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cis : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 회수율 측정용 내부표준물질의 농도

③ 회수율 측정용 표준물질의 검출 농도 및 회수율

시료에 첨가된 회수율 측정용 표준물질의 검출농도(Cl) 및 회수율은 다음 식에 의해 구한다.

Cl (ng/g)	=	(A1s + A2s)(Cis)
		(A1is + A2is) × RF

회수율(%)	=	Cl(ng/g)	× 100
		Cspk(ng/g)

Cl : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12 동족체의 농도

A1s, A2s : 회수율 측정용 표준물질(13C12 동족체)의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is : 내부표준물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

RF : 반응계수

Cis : 내부표준물질의 농도

Cspk : 첨가한 회수율 측정용 표준물질의 농도

④ 다이옥신 농도의 계산

시료 중 다이옥신 농도는 다음 식으로부터 구한다.

다이옥신농도 (ng/g fat)	=	(A1n + A2n)(Cl)	=	Vex
		(A1l + A2l)(RR)		Ws

A1n, A2n : 시료에 함유된 대상물질의 1차 또는 2차 선택이온의 피크 면적

A1l, A2l : A1n 와 A2n에 대응하는 시료에 첨가된 13C12 동족체  화합물의 1차 또는 2차 선택 이온의 피크 면적

Cl : 시료에 첨가된 13C12 동족체 표준물질의 농도(ng/mℓ)

RR : 상대감응도

Vex : 추출량(mℓ)

Ws : 조지방 함량(g)

⑤ 독성등가량(Toxicity Equivalents : TEQ)으로 환산

산출한 다이옥신 농도 (ng/g fat)의 독성등가량 환산은 각 분석 대상 동족체에 표 4에 해당하는 독성등가계수 (Toxicity Equivalent Factor : TEF)를 곱하여 이 합계를 독성등가량 (pg TEQ/g fat)으로 한다.

표 1. 대상물질

PCDDs	대표적 이온 질량	PCDFs	대표적 이온 질량
2,3,7,8-TCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDD	319.8965 / 321.8936 355.8546 / 357.8517 389.8157 / 391.8127 389.8157 / 391.8127 389.8157 / 391.8127 423.7767 / 425.7737 457.7377 / 459.7348	2,3,7,8,-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDF	303.9016 / 305.8987 339.8597 / 341.8568 339.8597 / 341.8568 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 373.8207 / 375.8178 407.7818 / 409.7788 407.7818 / 409.7788 441.7428 / 443.7398

주: 약어의 펼친 이름은 다음과 같음.

PCDD = polychlorodibenzo-p-dioxin

PCDF = polychlorodibenzofuran

TCDD  = tetrachlorodibenzo-p-dioxin

TCDF = tetrachlorodibenzofuran

PeCDD = pentachlorodibenzo-p-dioxin

PeCDF = pentachlorodibenzofuran

HxCDD = hexachlorodibenzo-p-dioxin

HxCDF = hexachlorodibenzofuran

HpCDD = heptachlorodibenzo-p-dioxin

HpCDF = heptachlorodibenzofuran

OCDD = octachlorodibenzo-p-dioxin

OCDF = octachlorodibenzofuran

표 2. 염소원자수에 의한 동족체 피크의 자연존재비

	자연존재비
	M	M+2	M+4	M+6	M+8	M+10	M+12	M+14
4	76.5	100	48.7	10.5	0.9
5	61.5	100	65.0	21.1	3.5	0.2
6	51.2	100	81.2	35.2	8.5	1.1	0.06
7	43.2	100	97.5	52.8	17.1	3.3	0.36	0.02
8	33.8	87.9	100.0	65.0	26.4	6.8	1.1	0.10

표 3. 염소원자에 따른 선택 이온의 이론적인 이론비

염소원자의 수	전하대 질량(m/z) 생성비	이론비	이론범위
			최소	최대
4개1)	M/(M+2)	0.77	0.65	0.89
5개	(M+2)/(M+4)	1.55	1.32	1.78
6개	(M+2)/(M+4)	1.24	1.05	1.43
6개2)	M/(M+2)	0.51	0.43	0.59
7개	(M+2)/(M+4)	1.05	0.88	1.20
7개3)	M/(M+2)	0.44	0.37	0.51
8개	(M+2)/(M+4)	0.89	0.76	1.02

1) : 37Cl4-2,3,7,8-TCDD 제외

2) : 13C12-HxCDF에만 적용

3) : 13C12-HpCDF에만 적용

표 4. 독성등가계수 (Toxicity Equivalent Factors; WHO-TEFs, 1998)

다이옥신	WHO-TEFs
2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD OCDF	1.0 0.1 1.0 0.05 0.5 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 0.01 0.01 0.0001 0.0001

28. 식품제조용수 등의 노로바이러스 시험법

가. 시약 및 시액, 장치 및 초자

1) 시약 및 시액

① 2% 치오황산나트륨 (sodium thiosulfate: Na2S2O3)용액 치오황산나트륨 100 g을 증류수에 녹여 최종적으로 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃에서 15분간 고압증기 멸균한다.

② 1.5% 소고기 액기스 (Beef extract, desiccated powder) 용액 1.9 L의 증류수에 beef extract 분말 30g 과 glycine 7.5 g (최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 맞춘   다.  121°C, 15분간 멸균한다.

③ 0.15 M 인산1수소나트륨, 7수화물 (Sodium phosphate, dibasic, Na2HPO4 C 7H2O ,  pH 9.0 -9.5) 용액 950 mL의 증류수에  40.2 g의 Sodium phosphate를 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 맞춘다. 121°C, 15분간 멸균한다.

④ 수산화나트륨 (NaOH)용액

각각 4 g과 20 g의 수산화나트륨을 최종 부피 100 mL 의 증류수에 녹여 1M 및 5M 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

⑤ 노로바이러스 유전자 추출 (Viral RNA Mini Kits) 용액

바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

2) 장치 및 초자

2-1) 시료 채수과정

① 표준필터장치 : 식품제조용수 1,500~1,800 L을 채수하는 주요장비로 사용한다.

○장치구성

- 주입기 모듈, 단일주입기 모듈, 압력게이지, 유출구 모듈, 탈리액 주입기 및 유출구 모듈, 유량  조절기 밸브, 유량게이지

② 휴대용 pH 측정기 : 식품제조용수의 수소이온농도를 측정하는 용도로 사용한다.

③ 휴대용 탁도 측정기 : 식품제조용수의 혼탁도 측정용으로 사용한다.

④ 휴대용 염소 농도 측정기 : 수처리한 식품제조용수의 잔류 염소 농도를 측정하기 위한 장치이다.

⑤ 휴대용 아이스 박스 : 식품제조용수 1,500~1,800L 채수 후 1-MDS 카트리지를 운반하기 위해 사용한다.

⑥ 상업용 얼음팩 :  1-MDS 카트리지 운반시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

⑦ 기타 : 공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균호일, 클램프, 시료채수기록부, 수술용 장갑, 수은온도계

⑧ 필터가 장착된 카트리지 모듈 : 바이러스 흡착용 1-MDS 필터 - Virosorb 1-MDS Cartrige

그림 1. Virosorb 1 MDS Cartrige

2-2) 바이러스 탈리과정

① 연동정량펌프 : 탈리용액  1-MDS 필터카트리지로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치이다.

② 교반기 및 교반 막대

2-3) 바이러스 농축과정

① 원심분리기 (4 ℃, 2,500~10,000 G)

② 원심분리용 용기 (100 - 1,000 mL 용량)

③ 0.22㎛ 실린지 필터 (50 mL 용량)

나. 시험방법

1) 식품제조용수 채수

채수자는 멸균된 장갑을 착용하여 노로바이러스에 의한 오염을 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치나 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예 : 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

① 필터 장치에 연결하기 전에 채수하려는 시료를 2～3분 정도 배출기 또는 양수펌프의 배출구를 열고 물을 흘려보내 찌꺼기를 제거한다. 배출구에 호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 부착하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 꼭지를 잠근다.

② Chlorine (HOCl)이나 불꽃버너를 이용하여 수도꼭지나 배출구 부위를 가열 또는 멸균한다.

③ 채수용 호스의 알루미늄 호일을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치→배출기 모듈→ 2 L 비이커에 차례로 연결한다. 카트리지 하우징 모듈은 이 단계에서는 연결하지 않는다.

④ 천천히 배출기를 열고 조절기 모듈이 30 PSI가 되도록 압력 조절기를 조절한다. 만일 30 PSI가 안되면 조절기 최대압력까지 도달하게 조절한다.

76 L(20GAL)의 물을 흘려보내면서 2 L 비이커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 시료번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 시료채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 calibration 한다.

⑤ 수도꼭지를 잠그고 시료가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

- pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 주입기와 0.1 M 염산 용액이 담긴 매스실린더를 연결하고,  2 L 플라스틱 병에 담긴 물 시료의 pH가 6.5～7.5가 되도록 조절한 후 pH를 시료채수기록부에 기록한다.

- 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 물 1 gal(3.8 L) 당 2% 치오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

⑥ 바이러스시료채수기록부에 시료 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

⑦ 필터하우징 모듈의 알루미늄 호일을 제거하고 배출기 모듈 앞에 연결한다.

그림. 2. 현장에서의 채수모습

⑧ 물을 천천히 흐르게 하면서 필터하우징 상단의 감압단추(vent button)를 눌러 내부 공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

⑨ 조절기의 압력은 30 PSI 이하로 조정하고 식품제조용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 유출구나 수도꼭지를 잠근다.

⑩ 바이러스시료채수기록부에 시료채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

⑪ 시료채수기구로부터 필터 모듈을 분리한다. 필터하우징을 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징과 연결된 양끝의 개구부를 멸균된 알루미늄 호일로 싼다.

⑫ 필터하우징을 아이스박스에 담고 아이스팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동되어서는 안 됨)로 하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 노로바이러스 탈리과정

① 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다.

※ 다만, 부득이한 경우로  인해 24시간 내에 탈리 시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

② 표준 필터장치에 카트리지를 장착한 후 카트리지 탈리액 주입구와 유출구에 멸균된 실리콘 튜브를 연결하고 주입구에 연결된 실리콘 튜브는 1 L beef extract 완충액(1.5%)이 채워져 있는 비이커에 넣는다. 유출구에 연결된 튜브는 멸균된 2 L 비이커에 넣고 연동정량펌프를 가동하여 카트리지 안으로 beef extract 완충액을 가득 채운다.필터하우징의 감압단추(vent button)를 누른 상태로 천천히 압력을 가하여 내부 공기를 빼내면서beef extract 완충액이 필터하우징 내에 완전히 차도록 한 후, 감압단추를 통해 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 뗀다.

beef extract 완충액이 가득 채워지면 연동정량펌프 가동을 멈추고 5분간 정치한다.

③ 연동정량펌프를 다시 가동하여 하우징에 채워져 있는 완충액이 서서히 필터를 통과하도록 하고, 통과한 완충액은 멸균된 비이커에 수집한다. 탈리액을 회수 할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있음.

④ 비이커에 수집된 beef extract 완충액을 유입 튜브에 놓고 위의 ①～② 과정을 2회 반복한다.

⑤ 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

⑥ 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 노로바이러스 농축과정

① 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M HCl 용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

② 침전물이 생기면 탈리액을 원심분리용 멸균 용기에 옮겨 원심분리 한다  (2,500 G, 15분, 4℃).

③ 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에  0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 재 부유시킨 후 10분간 방치한다.

④ 부유시킨 용액을 원심분리 한다(7,000 G, 10분, 4℃).

⑤ 상등액을 취해 1 M HCl 용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

⑥ 미생물오염을 방지하기 위해 50 mL 주사기를 이용하여 상등액을 멸균 필터로 여과한다. 시료 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 멸균 필터에 10～20 mL의 1.5% beef extract 완충액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

⑦ 최종 농축 시료량 (FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 시료를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

⑧ 최종 농축시료 (20～30 mL)는 노로바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 노로바이러스 유전자 추출 과정

바이러스 RNA 추출은 kit에 포함된 방법 등 적절한 실험법에 따라 실시할 수 있다.

※ 바이러스 RNA 추출 kit는 재현성이나 검  출효율 등을 고려하여 본 시험법에서 제시한 제품(QIAGEN-Viral RNA Mini Kits) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

① ALV buffer 1,120 uL와 제조용수 농축액 280 uL를 혼합한 후 실온에서 10분 동안 방치한후 가볍게 spin-down한다.

② 95～100% 에탄올 1,120 uL를 넣어 혼합한 후, spin-down한다.

③ 혼합액 630 uL를 Mini spin column으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리 후 column을 새로운 collection 튜브로 옮기고, 남은 혼합액 630 uL를 첨가하여 6,000 G 로 1분간 원심분리 한다.

④ Mini spin column을 새로운 collection 튜브로 옮겨 AW1 buffer 500 uL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 column을 새로운 collection 튜브로 옮긴다.

⑤ AW2 buffer 500 uL를 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리 한 후 column을 새로운 1.5 mL collection 튜브로 옮긴다.

⑥ Elution buffer 30 uL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 하여 다음의 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

노로바이러스 유전자형(genotype) 확인을 위하여 primer조합을 달리하여 동시에 수행한다. PCR 반응조건은 RT(reverse transcription)-PCR과 1차 PCR을 한 시험관에서 동시에 수행하는 one-step RT- PCR 방법을 사용한다.

① GI type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10 uL(reverase transcriptase 0.5uL 포함), primer 20pmol (GI-F1M, GI-R1M) 각 2 uL와 추출 RNA 5 uL가 함유되도록 한다.

② GII type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10 uL, primer 20 pmol (GII-F1M, GII-R1M) 각 2 uL와 추출 RNA 5 uL가 함유되도록 한다. 유전형에 따라 ①, ②의 방법에 의하여 혼합 후 45oC에서 30분간 reverse transcription 반응 후 94oC에서 5분간 DNA를 변성시키고, 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 다음의 semi-nested PCR을 실시한다.

Table. 1. 노로바이러스 ONE-STEP RT-PCR 조성 및 반응 온도

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
Mastermix	9.5 uL	-	-
Reverse transcriptase (50unit/uL)	0.5 uL	-	-
D.W.	6 uL	-	-
Forward primer(20pmol)	2 uL	GI-FIM	GII-FIM
Reverse primer(20pmol)	2 uL	GI-RIM	GII-RIM
Extracted RNA	5 uL	-	-
Total	25 uL

▷ Reaction Temp. :

45℃ 30 min / 94℃ 5 min

94℃ 30sec /55℃ 30sec /72℃ 1 min 30sec : 35 cycles

72℃ 7 min/4℃ Soaking

③ GI-F1M, GI-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2 uL를 주형으로 하여 semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 uL, 10x buffer 5 uL, dNTP (10 mM) 4 uL, Taq polymerase  (5 unit/uL) 1 uL와 primer 20pmol (GI-F2, GI-R1M)를 각각 2.5 uL씩 첨가하여 semi-nested PCR을 실시한다.

④ GII-F1M, GII-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2 uL를 주형으로 하여 semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 uL, 10x buffer 5 uL, dNTP (10 mM) 4 uL, Taq polymerase (5 unit/uL) 1 uL와 primer 20pmol (GII-F3M, GII-R1M)를 각각 2.5 uL씩 첨가하여 semi-nested PCR을 실시한다. PCR 조건은 94oC에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다.

Table. 2. 노로바이러스 semi-nested PCR 조성 및 반응 온도

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
dNTP(10mM)	4 uL	-	-
10x Buffer	5 uL	-	-
D.W.	33 uL	-	-
Forward primer(20pmol)	2.5 uL	GI-F2	GII-F3M
Reverse primer(20pmol)	2.5 uL	GI-RIM	GII-RIM
Taq polymerase(5unit/uL)	1 uL	-	-
1st PCR Product	2 uL	-	-
Total	50 uL

▷ Reaction Temp. :

94℃ 5min

94℃ 30 sec/ 55℃ 30sec/ 72℃ 1 min 30sec : 25 cycles

72℃ 7 min/ 4℃ Soaking.

Table. 3. 노로바이러스 Primer 염기서열

Genogroup	Primer	Sequence (5'→3')	Application
I	GI-F1M	CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT	Onestep RT PCR
	GI-R1M	CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG	Onestep RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GI-F2	ATG ATG ATG GCG TCT AAG GAC GC	Semi-nested PCR/ Sequencing
II	GII-F1M	GGG AGG GCG ATC GCA ATC T	Onestep RT PCR
	GII-R1M	CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT	Onestep RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GII-F3M	TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART	Semi-nested PCR/ Sequencing

⑤ PCR 반응 종료 후 반응액 5 uL를 1.5% agarose gel 상에서 100V로 전기영동한 후, EtBr(0.5 ㎍/mL) 염색액에서 30분간 염색 후 증류수에서 10분간 탈색하고 UV 하에서 DNA 밴드를 관찰한다.

⑥ PCR 산물이 313bp이면 GI 형 노로바이러스, 310bp이면 GII 형 노로바이러스가 검출된 것으로 일차적으로 확인하고, 최종 확인을 위하여 agarose gel상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한다.

⑦ DNA sequencing을 위하여 ⑥에서 정제된 DNA 1 uL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2 및 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M 및 GII-R1M의 primer를 사용하여 sequencing을 수행한다.   Sequencing 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전형  semi-nested primer(1pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 uL, dye-terminator 2 uL, 정제 DNA 2 uL를 첨가하여 증류수로 최종 10 uL가 되도록 하여 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 후 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.  DNA sequencing 실시 후 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 노로바이러스가 검출된 것(양성)으로 최종 판정한다.

29. 젤리의 물성시험법

1) 장치

(1) 절단용 칼(10mm × 10mm ×10mm)

(2) 물성측정기(Texture Analyzer)

(3) 물성측정용 Probe(원형, 직경 35mm)

2) 실험방법

(1) 검체채취 및 실험

검체를 냉장고(8℃)에서 3시간 이상 방치 후 과육이 없는 부위의 젤리부분만을 가로(10 mm), 세로(10 mm), 높이(10 mm)의 정육면체로 절단하여 시료로 사용 한다.(한 가지 품목에 맛이나 향이 다른 여러 가지 제품이 혼합되어 있을 경우는 각각 구분하여 시험한다)

(2) 실험

검체 1품목당 10개의 시료를 준비하여 아래 표1과 같은 조건에서 압착시험(깨짐성)을 실시한다.

표 1. Texture Analyzer 측정조건

항목	Conditions
Probe	원형, 직경 35 mm
Pre-test speed	5 mm / sec
Test speed	2 mm / sec
Post-test speed	2 mm / sec
Pressure	98% compression

(3) 판정

가. 프로브 압착시 첫 번째 피크의 높이(N)로 깨짐성(fracturability)을 측정하여 결과값으로 한다.

나. 측정시 2개의 피크를 그리며 앞 피크의 측정값을 구하여야 한다 (뒤의 피크는 단단한 정도를 측정값임)

다. 10개의 시료에 대한 반복실험 결과 값들의 평균값이 5N(newton)이하여야 적합한 것으로 한다.

(4) 압착시험(깨짐성)의 예

① 첫 번째 피크 : 깨짐성

② 두 번째 피크 : 단단한 정도

③ Distance : Probe가 검체에 닿는 순간부터 검체가 부서지는 순간까지의 거리(단위: mm)

그림1. 압착시험의 깨짐성 피크