식품의약품안전처 고시 제2013- 206호

축산물의 가공기준 및 성분규격 일부개정고시

1. 개정 이유

식육가공품의 식중독균 기준 적용에 있어 혼선을 없애고, 개별기준의  대장균 O157:H7과 살모넬라균의 검사시료수를 다른 식중독균의 검사시료수와 통일하고, 비살균액란의 유통기한을 국내 제조 및 유통환경에 맞게 재설정하고자 함

유산균수 시험법 중 새로운 배지를 추가하고 기존 식육감별법 및 한우확인시험법의 단점을 보완할 수 있는 새로운 검사법을 신설하여 검사의 효율성을 높이고 자 함

2. 주요 내용

가. 식중독균의 중복기준 삭제 및 시료수 개정(안 제1. 6. (3), 제2. 2. 가. (3), 3. (4))

1) 식육가공품의 식중독균 기준 적용에 혼선이 있어 제2. 축산물별 기준 및 규격 중 클로스트리디움 퍼프린젠스와 황색포도상구균 기준을 제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격으로 옮기고 제2. 축산물별 기준 및 규격 중 살모넬라균, 리스테리아모노사이토제네스 기준 삭제

2) 개별기준에 있는 대장균 O157:H7과 알가공품의 살모넬라균의 검사 시료수를 공통기준의 식중독균 검사시료수와 통일

나. 비살균액란 유통기한 개정(안 제2. 3. (3))

비살균액란의 유통기한을 국내 제조 및 유통환경 등을 고려하여 합리적 기준으로 재설정

다. 시험법 개정

1) 유산균 시험법 중 배지 추가 및 검사 시료량 통일(안 제3. Ⅲ. 9. 사. (2) (3) (가) (나) (다))

2) 기존 식육감별법이 품종간 교차반응 등 비특이 반응으로 인하여 정확한 감별이 어려워 현 방법보다 종 특이도가 높은 방법 추가(안 Ⅳ. 2. 나. (2). (나) 2) 라) ③ ㉱)

3) 한우확인시험법 제1법(MS법)과 2법(SNP법)이 검사 비용이 많고 실험소요시간도 길어 이를 보완할 수 있는 검사법 신설(안 Ⅳ. 2. 나. (2). (나) 4) 다))

3. 기타 참고사항

가. 관계법령 : 축산물위생관리법

나. 예산조치 : 별도조치 필요 없음

다. 합    의 : 해당 사항 없음

라. 기    타 : (1) 행정예고(2013. 4. 26. ～ 2013. 6.24.)

(2) 규제심사 : 규제심사 대상이 없음(2013. 8. 5.)

식품의약품안전처 고시 제2013- 206호

「축산물위생관리법」 제4조제2항의 규정에 따른 「축산물의 가공기준 및 성분규격」(식품의약품안전처 고시 2013-137호, 2013.4.5.)을 다음과 같이 개정고시 합니다.

2013년  8월 8 일

식품의약품안전처장

축산물의 가공기준 및 성분규격 일부개정고시

축산물의 가공기준 및 성분규격의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격 6. 축산물의 성분규격 가. 일반규격 (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 식중독균

식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 가공품에서는 특성에 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)등 식중독균이 n=5, c=0, m=0/25g이어야 한다. 다만, 다음의 축산물에 대한 장염비브리오, 황색포도상구균, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 다음과 같이 적용된다.

(가) 장염비브리오: 살균 또는 멸균처리하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품 중 해산물이 함유된 축산물가공품에 한한다.

(나) 황색포도상구균

1) 생햄 및 발효소시지: n=5, c=2, m=10, M=100

2) 위 1)이외의 식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품: n=5, c=0, m=0/25g

(다) 클로스트리디움 퍼프린젠스

1) 가열 햄류 및 소시지류: n=5, c=1, m=10, M=100(멸균제품은 n=5, c=0, m=0/25g이어야한다), 생햄 및 발효소시지: n=5, c=2, m=10, M=100

2) 위 1)이외의 식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품: n=5, c=0, m=0/25g

제2. 축산물별 기준 및 규격 2. 식육가공품 및 포장육 (3) 성분규격 (자) 대장균 O157:H7을 다음과 같이하고, (차)부터 (파)까지를 각각 삭제한다.

(자)대장균군 O157:H7 : 원료육 분쇄육, 분쇄가공육제품 또는 포장육(분쇄)은 n=5, c=0, m=0/25g이어야 한다.

제2. 축산물별 기준 및 규격 3. 알가공품 (3) 가공기준 (바) 중 “비살균제품”을 “비살균액란제품”으로 하고, “48시간”을 “72시간”으로 한다.

제2. 축산물별 기준 및 규격 3. 알가공품 (4) 성분규격 (마) 중 “음성”을 “n=5, c=0, m=0/25g”로 한다.

제3. 축산물 시험방법 Ⅲ. 일반시험법 9. 미생물시험법 사. 유산균수  (2) 배지 및 시액에 (마) 및 (바)를 각각 다음과 같이 신설한다.

(마) MRS 배지

(바) TOS-MUP 배지

제3. 축산물 시험방법 Ⅲ. 일반시험법 9. 미생물시험법 사. 유산균수 (3) 시험방법 (가) 유산간균 및 구균 중 “35 ～ 37℃에서 72±3시간”을 “35 ～ 37℃ 또는 MRS 배지를 사용하여 30℃에서 72±3시간”으로 하고, (나) 비피더스균(Bifidobacterium) 1) 중 “검사시료 10g(㎖)에 희석액을 가하여 100㎖이”를 “검사시료 25g(㎖)에 9배 희석액을 가하여 250㎖가”로 하며, 3)을 다음과 같이 하고, 4) 중 “48∼72시간”을 “72±3시간”으로 하며, (다) 중 “BS배지”를 “ BS배지 또는 TOS-MUP배지”로 한다.

3) BL 한천배지에서 비피더스균의 측정은 각 희석 검액 0.05㎖씩을 각각 BL한천배지상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다. 그리고 TOS-MUP 배지에서의 측정은 다. 세균수 (1)일반세균수의 표준평판배양법에 준하여 실험한다.

제3. 축산물 시험방법 Ⅳ. 원유·식육·원료알의 시험법 2. 식육 시험법 나.이화학적 시험법 (2) 시험방법 (나) 특수검사법 2)식육감별법 라)혈청학적 검사법 ③ 면역반응의 술식에 ㉱를 다음과 같이 신설한다.

㉱ 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 시중에 통상적으로 판매되는 식육종감별용 ELISA 키트 (meat species identification test kit)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실험 후 판정한다. (다만 돈육, 우육, 가금육, 면양육에 한한다)

제3. 축산물 시험방법 Ⅳ. 원유·식육·원료알의 시험법 2. 식육 시험법 나.이화학적 시험법 (2) 시험방법 (나) 특수검사법 4) 한우확인시험법에 다)를 다음과 같이 신설한다.

다) (제3법)대립유전자 다중분석법

대립유전자 다중분석법은 시중에 유통 또는 판매 되는 쇠고기의 시료로부터 Genomic DNA추출 등의 절차를 통해 Allele-specific PCR (AS-PCR)를 이용하여 소의 모색과 성별, 한우/비한우 판별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트와 이를 포함하는 PCR 키트를 사용하여 소의 모색 및 성별, 한우/비한우를 동시에 판별할 수 있는 PCR 방법이다. 본 PCR 방법 중 모색형(MC) 분석은 소의 모색과 성별을 더욱 간단하고 신속하게 동시에 판별할 수 있으며, 한우형(HW) 분석은 다중 PCR 산물을 통해 한우/비한우 여부 판단을 한다.

(1) 시료 채취

시료 채취는 (가) (제1법) (1) 시료채취법을 기본원칙으로 하고, 시료에 화학약품, 이물질 등이 혼입되어 검정결과에 영향을 미칠 수 있는 시료는 세척 및 선별한다. 또한 분석용 시료는 DNA의 추출 효율성을 높이기 위해 최대한 작은 입자가 되도록 분쇄 하며 시료의 종류를 채취 용기에 기입한다.

(2) 검정 방법

(가) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출은 (가) (제1법) (2) 쇠고기 등의        시료에서 DNA 추출을 원칙으로 한다.

(나) DNA 농도측정

※ 아래의 DNA농도측정 방법 이외에도 일반적 DNA농도측정기,  아가로즈겔 전기영동을 이용하는 방법, DNA정량측정용 시약 등의 방법으로 농도, 순도를 측정할 수 있다.

① 전기영동 이용법.

㉮ 기기 및 장치

전기영동장치, UV/VIS 분광광도계(Spectrophotometer), UV 조사기(Transilluminator), 전자렌지, CCD(또는 폴라로이드) 카메라, 자동전기영동장치 등.

㉯ 시약 및 완충용액

㈀ TAE Buffer(50배 농축용액)

Tris vase 242g, Glacial acetic acid 57.1mL, 0.5M EDTA(pH 8.0) 100mL를 넣고 완전히 용해한 후 증류수로 볼륨을 맞춘다. 전기영동시 1xTAE로 희석 하여 이용한다.

㈁ 전기영동 겔 Loading buffer(6배 농축용)

최종농도가 0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll이 되도록 혼합한다.

㉰ 기타

㈀ Ethidium bromide 농축액: 10mg/mL로 갈색병 또는 차광 보관.

㈁ 1% agarose gel

Agarose 1g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음에 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후, 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉱ 분석절차

㈀ 시료로부터 추출한 DNA 원액 5㎕에 전기영동용 Loading buffer 1㎕를 혼합하여 1% 아가로스 겔에 loading 한 후 100 volt 전압으로 10분 동안 전기영동한다.

㈁ Gel loading dye의 BPB(Bromphenol Blue)가 gel의 2/3 정도까지 진행되면 전기영동을 멈추고 UV 조사가(transilluminator) 위에 겔을 올려 CCD(또는 폴라로이드) 카메라 등으로 촬영하고 화상데이터로 보존한다.

㈂ 전기영동 결과로 DNA의 분해여부, RNA 및 당류 등의 혼재 여부 등 추출한 DNA에 대한 순도를 확인한다. 또한 마커 DNA의 Loading 양과 비교하여 추출량도 어느 정도 확인할 수 있다. DNA의 순도 및 추출량에 대한 자세한 분석방법은 분광광도계 이용법에 따른다.

② 분광광도계 이용법

㉮ 기기 및 장치

UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer), UV cell, Nano-drop 등

㉯ 분석절차

㈀ 원액 DNA를 멸균증류수로 적당히 희석하여 260nm에서의 흡광도(O․D)를 측정 한다.

㈁ 분광광도계를 이용하여 230nm, 260nm, 280nm에서의 흡광도를 측정하여 추출된 DNA의 순도를 측정한다. 참고로 260nm/280nm에서의 흡광도 비율이 1.8이상이면 이상적인 순도이다.

㈂ 260nm에서의 흡광도가 1일 때의 DNA 농도는 50ng/㎕이므로 추출한 DNA의 농도계산은 아래와 같다.

※ DNA농도(ng/㎕) = 260nm에서의 흡광도 x 50 x 희석배수

㈃ 원액 DNA를 PCR분석에 적당한 농도가 되도록 멸균증류수로 희석하여 PCR용 DNA로 사용하며 -20℃이하에서 보관한다.

㈄ 원액 DNA의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우에는 원액 DNA를 그대로 이용한다.

(다) DNA 시료의 검정 및 결과 판정

※ 대립유전자 다중분석법을 사용한 쇠고기 원산지 검정(한우/비한우 검정)시 모색형(MC)분석과 한우형(HW-SNP) 분석을 실시한 두 결과를 종합하여 최종 검정결과를 낸다.

① 모색형 분석(MC 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 18번 염색체 extension 좌위에 위치하는 Melanocortin1 receptor (MC1R)는 melanocyte에 존재하며, melanocyte simulating hormon(MSH)과 adreno corticotropin hormon(ACTH)간의 상호 작용에 의한 멜라닌의 합성 및 확산 현상을 자극하는 호르몬 수용체로 알려져 있다. 이러한 MC1R유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 대립유전자의 조합(흑색형：ED/ED, ED/E+, ED/e, 황색형： E+/E+, E+/e, e/e)에 따른 개체의 표현형을 확인하여 소의 모색을 구분할 수 있다.

명칭	염기서열 (5‘ → 3’)
CON F	ccattgccaagaaccgc***** (서열목록 제 1 서열)
CON R	atcctccacgctcgg***** (서열목록 제 2 서열)
296 C F	acgtgctggagacggcagtc***** (서열목록 제 3 서열)
310 T R	acggccgcctgggtggccagg***** (서열목록 제 4 서열)
SRY F	cgaagacgaaagktg***** (서열목록 제 5 서열)
SRY R	gcttttcagcatctgtaag***** (서열목록 제 6 서열)

㉮ PCR 분석

㈀ 시약은 국립농산물품질관리원과 솔젠트(주)에서 공동 개발한 MC Kit를 이용한다.

㈁ 2 x Multuplex Smart mix 12.5㎕, Genomic DNA(100ng/㎕) 2㎕, Primer mix 3.0㎕, 3차 증류수 7.5㎕를 혼합하여 PCR 반응액을 제조한다.

㈂ ㈁의 PCR반응액을 25㎕씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

㈃ PCR 결과물 12㎕씩 3% 아가로스겔에 15분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

㈄ 3% agarose gel

Agarose 3g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉯ 결과 판정

㈀ 황색형 : 225bp의 ED 형의 밴드는 없고 151bp의 e형의 밴드가 나타난다.

㈁ 흑색형 : 황색형의 밴드를 제외한 밴드 형태가 나타난다.

㈂ 성별구분 : 100bp의 SRY형 밴드가 있으면 숫소, 나타나지 않으면 암소이다.

단, 실험결과 표준밴드인 308bp의 CON밴드가 형성되지 않으면  그 실험은 무효로 인정하고 재실험을 실시한다.

② 한우형 분석(HW-SNP 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 염색체 상에 존재하는 대립유전자내 단일염기에 의하여 한우형과 비한우형을 분석하여 소의 한우 및 비한우를 여부를 판정할 수 있다.

Size	SNP No.	Order name	seq.	Conc.
(bp)				(pmole/rxn)
300	52956	12-F *(A)	tgacagttccttttggtgtgtttc*****	10
		12-R	cttccttggtggctcaga*****
270	57586	11-F	cgtggaagcagaaaggaaa**	20
		11-R (A)	atgttaggggatgagaacact*
250	7563	10-F	ccggagtttgctcct*****	20
		10-R (A)	gccactgtttgcttatcaga**
230	49078	09-F (A)	tcattgtcctagtgtacaattctg*****	20
		09-R	gtgctcggccttattta*****
210	20572	08-F (A)	actacagtgagaagcccgtg*	3
		08-R	tatttggctgcactggg*****
190	7581	07-F	gtccttggcctctctg*****	5
		07-R (A)	ggatttgggagttctggggatg**
175	56027	06-F (A)	ggcagtggaattctgggcag***	3
		06-R	agaacaaaacccaaactca***
160	23765	05-F (A)	atctggttttggggcc*****	10
		05-R	gaagatacccactgcat*****
145	15562	04-F	acgcccctggcctg*****	2
		04-R (A)	ccagtagtctttgtgcagca***
130	57585	03-F (A)	gaggaggaggaacaccatcaag**	5
		03-R	gttttatgaagaataactg***
115	49615	02-F (A)	tggtaatgatgagagctccag***	7
		02-R	aagttctccctgtctcagt*****
100	MDH2	01-F	ggggcctctggagga*****	2
		01-R	ctccgggcgtgtgag*****

㉮ PCR 분석

㈀ 시약은 국립농산물품질관리원과 솔젠트(주)에서 공동 개발한 HW Kit를 이용한다.

㈁ 2xMultuplex Smart mix 12.5㎕, Genomic DNA(100ng/㎕) 2㎕, Primer mix 3.0㎕, 3차 증류수 7.5㎕를 혼합하여 PCR반응액을 제조한다.

㈂ ㈁의 PCR반응액을 25㎕씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

㈃ PCR 결과물 12㎕씩 3% 아가로스겔에 30분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

㈄ 3% agarose gel

Agarose 3g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉯ 결과 판정

㈀ 한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 5개이하 (1-5개) 밴드가 나타난다.

㈁ 비한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 6개 이상  (6-12개) 밴드가 나타난다

③ 최종 결과 판정

㉮ 대립유전자 다중분석법을 이용한 원산지  검정 최종 판정: MC분석과 HW분석을 종합하여 최종적으로 다음과 같이 판정 한다.

㈀ 한우 : MC분석시 황색형 + HW분석시 한우형으로 판정 된다.

㈁ 비한우

1) MC분석결과 흑생형으로 판정 될 경우 HW분석을 생략할 수 있다.

2) MC분석결과 황색형이나 HW분석은 비한우로 판정된다.

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지 2. 배지에 거′및 너′를 각각 다음과 같이 신설한다.

거′. MRS 배지

Enzymatic digest of casein -------------10.0 g

Meat extract ------------------- 10.0 g

Yeast extract (dried) ------------ 4.0 g

Glucose -----------------------20.0 g

Tween 80 --------------------- 1.08 g

Dipotassium hydrogen phosphate -----------2.0 g

Sodium acetate trihydrate ---------5.0 g

Triammonium citrate -------------2.0 g

Magnesium sulfate heptahydrate -----------0.2 g

Manganese sulfate tetrahydrate -----------0.05 g

Agar --------------------------10 g

위 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7로 조정한 후 121℃ 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 분주한다.

너′. TOS-MUP 배지

Trypticase peptone ---------------- 10.0 g

Yeast extract -------------------- 1.0 g

KH2PO4 ------------------------- 3.0 g

K2HPO4 ------------------------ 4.8 g

(NH4)2SO4 ---------------------- 3.0 g

MgSO4·7H2O -------------------- 0.2 g

(R)-Cysteine-HCl·H2O ------------ 0.5 g

Sodium propionate ---------------- 15.0 g

TOS --------------------------- 10.0 g

Agar -------------------------- 15.0 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 6.3±0.2로 조정한 후 115℃ 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 MUP supplement(1mg/ml)를 첨가한 후 페트리디쉬에 분주한다.

부 칙<제2013-  호, 2013. 8. .>

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 고시 시행 후 최초로 제조·가공 또는 수입(선적일 기준)하는 축산물에 적용한다.

제2조(경과조치) 이 고시 시행 당시 접수되어 검사가 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정을 적용한다.

신∙구조문 대비표

현  행

개 정 안

제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격

6. 축산물의 성분규격

가. 일반규격

(1) ∼ (2) (생  략)

(3) <신  설>

식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 가공품에서는 특성에 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)등 식중독균이 n=5, c=0, m=0/25g이어야 한다. 다만, 장염비브리오는 해산물이 함유된 축산물에 한한다.

제2. 축산물별 기준 및 규격

2. 식육가공품 및 포장육

가. 공통사항

(1) ∼ (2) (생  략)

(3) 성분규격

(가) ∼ (아) (생  략)

(자) 대장균 O157:H7 : 원료육 분쇄육, 분쇄가공육제품 또는 포장육(분쇄)은 음성, 생햄 및 발효소시지는 n=5, c=0, m=0/25g이어야 한다.

(차) 클로스트리디움 퍼프린젠스 :   가열 햄류 및 소시지류는      n=5, c=1, m=10, M=100, 생햄   및 발효소시지는 n=5, c=2,     m=10, M=100, 멸균제품은     음성이어야 한다.

(카) 살모넬라균 : n=5, c=0, m=0/25g (다만, 생햄 및 발효소시지에 한한다)

(타) 리스테리아 모노사이토제네스 : n=5, c=0, m=0/25g(다만, 생햄 및 발효소시지에 한한다)

(파) 황색포도상구균 : n=5, c=2,    m=10, M=100(다만, 생햄      및 발효소시지에 한한다)

3. 알가공품

(1) ∼ (2) (생  략)

(3) 가공기준

(가) ∼ (마) (생  략)

(바) 비살균제품은 실금란･오란･연란을 제외한 정상란으로만 제조･가공하고 할란 후 속히  5℃이하로 냉각하여야 하며, 48시간을 초과하여 보관하여서는 아니 된다.

(사) ∼ (아) (생  략)

(4) 성분규격

(가) ∼ (라) (생  략)

(마) 살모넬라균: 음성이어야 한다.

제3. 축산물 시험방법

Ⅲ. 일반시험법

9. 미생물시험법

사. 유산균수

(1) 기구 및 재료

(가) ∼ (차) (생  략)

(2) 배지 및 시액

(가) ∼ (라) (생  략)

<신  설>

<신  설>

(3) 시험방법

(가) 유산간균 및 구군

유산균수의 측정방법은 다.세균수 (1)일반세균수의 표준평판배양법에 준하여 시험하고 검사시료의 희석액은 멸균생리식염수를 사용한다.

다만, 배지는 BCP첨가 평판측정  용배지를 사용하여 35 ～ 37℃에서 72±3시간 호기 또는 혐기배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균수의 집락으로 계측한다.

(나) 비피더스균(Bifidobacterium)

1) 검사시료 10g(㎖)에 희석액을 가하여 100㎖이 되게 하고 균질기에서 균질화한다(10-1용액).

2) (생  략)

3) 각 희석 검액 0.05㎖씩을 각각 BL한천배지상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다.

4) 시료가 접종된 샤레를 혐기상자에 넣고 37℃에서 48∼72시간 배양한다. 배양 후 균집락수를 측정하고 희석배수를 곱하여 검사시료 g당 생균수를 산출한다(접종량도 희석배수에 고려해야한다). 단, 1평판당 30～300개 집락의 희석검사시료만 측정한다. 또 집락수가 1평판당 30～300개의 범위에 있는 희석검사시료가 없는 경우에는 희석배수를 변경하여 재측정한다.

5) (생  략)

(다) 유산균 및 비피더스균의 혼합  제품 (가)의 유산균수와 (나)의 비피더스균의 시험방법에 따라 시험한 후 유산균수와 비피더스균수를 합하여 산출한다. 단, 이때에 비피더스균의 시험시에는 BS배지를 사용한다.

Ⅳ. 원유·식육·원료알의 시험법

2. 식육 시험법

가. (생  략)

나. 이화학적 방법

(1) (생  략)

(2) 시험방법

(가) (생  략)

(나) 특수검사법

1) (생  략)

2) 식육감별법

가) ∼ 다) (생  략)

라)혈청학적 검사법

① ∼ ② (생  략)

③ 면역반응의 술식

㉮ ∼ ㉰ (생  략)

<신  설>

3) (생  략)

4) 한우확인시험법

가) (생  략)

나) (생  략)

<신  설>

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지

1. (생  략)

2. 배지

가 ∼ 하’(생  략)

<신  설>

<신  설>

제1. 축산물에 대한 공통기준 및 규격

6. 축산물의 성분규격

가. 일반규격

(1) ∼ (2) (현행과 같음)

(3) 식중독균

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

-------------.  다만, 다음의 축산물에 대한 장염비브리오, 황색포도상구균, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 다음과 같이 적용된다.

(가) 장염비브리오: 살균 또는 멸균처리하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품 중 해산물이 함유된 축산물가공품에 한한다.

(나) 황색포도상구균

1) 생햄 및 발효소시지: n=5, c=2, m=10, M=100

2) 위 1)이외의 식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품: n=5, c=0, m=0/25g

(다) 클로스트리디움 퍼프린젠스

1) 가열 햄류 및 소시지류: n=5, c=1, m=10, M=100(멸균제품은 n=5, c=0, m=0/25g이어야한다), 생햄 및 발효소시지: n=5, c=2, m=10, M=100

2) 위 1)이외의 식육(제조, 가공용 원료를 제외한다), 살균 또는 멸균처리 하였거나 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 축산물가공품: n=5, c=0, m=0/25g

제2. 축산물별 기준 및 규격

2. 식육가공품 및 포장육

가. 공통사항

(1) ∼ (2) (현행과 같음)

(3) 성분규격

(가) ∼ (아) (현행과 같음)

(자) 대장균 O157:H7 : ---------

---------------------- n=5, c=0, m=0/25g--------.

(차) <삭  제>

(카) <삭  제>

(타) <삭  제>

(파) <삭  제>

3. 알가공품

(1) ∼ (2) (현행과 같음)

(3) 가공기준

(가) ∼ (마) (현행과 같음)

(바) 비살균액란제품은----------

--------------------------------------------------------------------, 72시간-------------------------

----------.

(사) ∼ (아) (현행과 같음)

(4) 성분규격

(가) ∼ (라) (현행과 같음)

(마) 살모넬라균: n=5, c=0, m=0/25g

---------.

제3. 축산물 시험방법

Ⅲ. 일반시험법

9. 미생물시험법

사. 유산균수

(1) 기구 및 재료

(가) ∼ (차) (현행과 같음)

(2) 배지 및 시액

(가) ∼ (라) (현행과 같음)

(마) MRS 배지

(바) TOS-MUP 배지

(3) 시험방법

(가) 유산간균 및 구군

---------------------------

---------------------------

---------------------------

---------------------------

--------------------------

다만, -----------------------

-------------------35 ～ 37℃ 또는 MRS 배지를 사용하여 30℃ 에서 72±3시간--------------------

----------------------------

(나) 비피더스균(Bifidobacterium)

1) 검사시료 25g(㎖)에 9배 희석액을 가하여 250㎖이 되게 하고--------------------------

2) (현행과 같음)

3) BL 한천배지에서 비피더스균의 측정은 각 희석 검액 0.05㎖씩을 각각 BL한천배지상에 접종하여 멸균초자봉으로 도포한다. 그리고 TOS-MUP 배지에서의 측정은 다. 세균수 (1)일반세균수의 표준평판배양법에 준하여 실험한다.

4) ------------------------  -------------------72±3시간  ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

5) (현행과 같음)

(다) ------------------------  ---------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------- BS배지 또는 TOS-MUP배지를 -------.

Ⅳ. 원유·식육·원료알의 시험법

2. 식육 시험법

가. (현행과 같음)

나. 이화학적 방법

(1) (현행과 같음)

(2) 시험방법

(가) (현행과 같음)

(나) 특수검사법

1) (현행과 같음)

2) 식육감별법

가) ∼ 다) (현행과 같음)

라)혈청학적 검사법

① ∼ ② (현행과 같음)

③ 면역반응의 술식

㉮ ∼ ㉰ (현행과 같음)

㉱효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 시중에 통상적으로 판매되는 식육종감별용 ELISA 키트 (meat species identification test kit)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실험 후 판정한다.

(다만 돈육, 우육, 가금육, 면양육에 한한다)

3) (현행과 같음)

4) 한우확인시험법

가) (현행과 같음)

나) (현행과 같음)

다) (제3법)대립유전자 다중분석법

대립유전자 다중분석법은 시중에 유통 또는 판매 되는 쇠고기의 시료로부터 Genomic DNA추출 등의 절차를 통해 Allele-specific PCR (AS-PCR)를 이용하여 소의 모색과 성별, 한우/비한우 판별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트와 이를 포함하는 PCR 키트를 사용한 소의 모색 및 성별, 한우/비한우를 동시에 판별할 수 있는 PCR 방법이다. 본 PCR 방법에 중 모색형(MC) 분석은 소의  모색과 성별을 더욱 간단하고 신속하게 동시에 판별할 수 있으며, 한우형(HW) 분석은  다중 PCR 산물을 통해 한우/비한우 여부 판단을 한다.

(1) 시료 채취

시료 채취는 (가) (제1법) (1) 시료채취법을 기본원칙으로 하고, 시료에 화학약품, 이물질 등이 혼입되어 검정결과에 영향을 미칠 수 있는 시료는 세척 및 선별 한다. 또한 분석용 시료는 DNA의 추출 효율성을 높이기 위해 최대한 작은 입자가 되도록 분쇄 하며 시료의 종류를 채취 용기에 기입 한다.

(2) 검정 방법

(가) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출은 (가) (제1법) (2) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출을 원칙으로 한다.

(나) DNA 농도측정

※ 아래의 DNA농도측정 방법 이외에도 일반적 DNA농도측정기, 아가로즈겔 전기영동을 이용하는 방법, DNA정량측정용 시약 등의 방법으로 농도, 순도를 측정할 수 있다.

① 전기영동 이용법.

㉮ 기기 및 장치

전기영동장치, UV/VIS 분광광도계(Spectrophotometer), UV 조사기(Transilluminator), 전자렌지, CCD(또는 폴라로이드) 카메라, 자동전기영동장치 등

㉯ 시약 및 완충용액

㈀ TAE Buffer(50배 농축용액)

Tris vase 242g, Glacial acetic acid 57.1mL, 0.5M EDTA(pH8.0) 100mL를 넣고 완전히 용해한 후 증류수로 볼륨을 맞춘다. 전기영동시 1xTAE로 희석 하여 이용 한다.

㈁ 전기영동 겔 Loading buffer(6배 농축용)

최종농도가 0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll이 되도록 혼합한다.

㉰ 기타

㈀ Ethidium bromide 농축액: 10mg/mL로 갈색병 또는 차광 보관.

㈁ 1% agarose gel

Agarose 1g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음에 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후, 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉱ 분석절차

㈀ 시료로부터 추출한 DNA 원액 5㎕에 전기영동용 Loading buffer 1㎕를 혼합하여 1% 아가로스 겔에 loading 한 후 100 volt 전압으로 10분 동안 전기 영동한다.

㈁ Gel loading dye의 BPB(Bromphenol Blue)가 gel의 2/3 정도까지 진행되면 전기영동을 멈추고 UV 조사가(transilluminator) 위에 겔을 올려 CCD(또는 폴라로이드) 카메라 등으로 촬영하고 화상데이터로 보존한다.

㈂ 전기영동 결과로 DNA의 분해여부, RNA 및 당류 등의 혼재 여부 등 추출한  DNA 에 대한 순도를 확인한다. 또한 마커 DNA의 Loading 양과 비교하여 추출량도 어느 정도 확인할 수 있다. DNA의 순도 및 추출량에 대한 자세한 분석방법은 분광광도계 이용법에 따른다.

② 분광광도계 이용법

㉮ 기기 및 장치

UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer), UV cell, Nano-drop 등

㉯ 분석절차

㈀ 원액 DNA를 멸균증류수로 적당히 희석하여 260nm에서의 흡광도(O․D)를 측정한다.

㈁ 분광광도계를 이용하여 230nm, 260nm, 280nm에서의 흡광도를 측정하여 추출된 DNA의 순도를 측정한다. 참고로 260nm/ 280nm에서의 흡광도 비율이 1.8이상이면 이상적인 순도 이다.

㈂ 260nm에서의 흡광도가 1일 때의 DNA 농도는 50ng/㎕이므로 추출한 DNA의 농도계산은 아래와 같다.

※ DNA농도(ng/㎕) = 260nm에서의 흡광도 x 50 x 희석배수

㈃ 원액 DNA를 PCR분석에 적당한 농도가 되도록 멸균증류수로 희석 하여 PCR용 DNA로 사용하며 -20℃이하에서 보관한다.

㈄ 원액 DNA의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우에는 원액 DNA를 그대로 이용한다.

(다) DNA 시료의 검정 및 결과 판정

※ 대립유전자 다중분석법을 사용한 쇠고기 원산지 검정(한우/비한우 검정)시 모색형(MC)분석과 한우형(HW-SNP) 분석을 실시한 두 결과를 종합하여 최종 검정결과를 낸다.

① 모색형 분석(MC 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 18번 염색체 extension 좌위에 위치하는 Melanocortin1 receptor (MC1R)는 melanocyte에 존재하며, melanocyte simulating hormon(MSH)과 adreno corticotropin hormon(ACTH)간의 상호 작용에 의한 멜라닌의 합성 및 확산 현상을 자극하는 호르몬 수용체로 알려져 있다. 이러한 MC1R유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 대립유전자의 조합(흑색형：ED/ED, ED/E+, ED/e, 황색형： E+/E+, E+/e, e/e)에 따른 개체의 표현형을 확인하여 소의 모색을 구분할 수 있다.

명칭	염기서열 (5‘ -> 3’)
CON F	ccattgccaagaaccgc***** (서열목록 제 1 서열)
CON R	atcctccacgctcgg***** (서열목록 제 2 서열)
296 C F	acgtgctggagacggcagtc***** (서열목록 제 3 서열)
310 T R	acggccgcctgggtggccagg***** (서열목록 제 4 서열)
SRY F	cgaagacgaaagktg***** (서열목록 제 5 서열)
SRY R	gcttttcagcatctgtaag***** (서열목록 제 6 서열)

㉮ PCR 분석

㈀ 시약은 국립농산물품질관리원과 솔젠트(주)에서 공동 개발한 MC Kit를 이용한다.

㈁ 2xMultuplex Smart mix 12.5㎕, Genomic DNA(100ng/㎕) 2㎕, Primer mix 3.0㎕, 3차 증류수 7.5㎕를 혼합하여 PCR 반응액을 제조한다.

㈂ ㈁의 PCR반응액을 25㎕씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

㈃ PCR 결과물 12 ml씩 3% 아가로스겔에 15분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

㈄ 3% agarose gel

Agarose 3g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉯ 결과 판정

㈀ 황색형 : 225bp의 ED 형의 밴드는 없고 151bp의 e형의 밴드가 나타난다.

㈁ 흑색형 : 황색형의 밴드를 제외한 밴드 형태가 나타난다.

㈂ 성별구분 : 100bp의 SRY형 밴드가 있으면 숫소, 나타나지 않으면 암소이다.

단, 실험결과 표준밴드인 308bp의 CON밴드가 형성되지 않으면  그 실험은 무효로 인정하고 재실험을 실시한다.

② 한우형 분석(HW-SNP 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 염색체 상에 존재하는 대립유전자내 단일염기에 의하여 한우형과 비한우형을 분석하여 소의 한우 및 비한우를 여부를 판정할 수 있다.

Size	SNP No.	Order name	seq.	Conc.
(bp)				(pmole/rxn)
300	52956	12-F *(A)	tgacagttccttttggtgtgtttc*****	10
		12-R	cttccttggtggctcaga*****
270	57586	11-F	cgtggaagcagaaaggaaa**	20
		11-R (A)	atgttaggggatgagaacact*
250	7563	10-F	ccggagtttgctcct*****	20
		10-R (A)	gccactgtttgcttatcaga**
230	49078	09-F (A)	tcattgtcctagtgtacaattctg*****	20
		09-R	gtgctcggccttattta*****
210	20572	08-F (A)	actacagtgagaagcccgtg*	3
		08-R	tatttggctgcactggg*****
190	7581	07-F	gtccttggcctctctg*****	5
		07-R (A)	ggatttgggagttctggggatg**
175	56027	06-F (A)	ggcagtggaattctgggcag***	3
		06-R	agaacaaaacccaaactca***
160	23765	05-F (A)	atctggttttggggcc*****	10
		05-R	gaagatacccactgcat*****
145	15562	04-F	acgcccctggcctg*****	2
		04-R (A)	ccagtagtctttgtgcagca***
130	57585	03-F (A)	gaggaggaggaacaccatcaag**	5
		03-R	gttttatgaagaataactg***
115	49615	02-F (A)	tggtaatgatgagagctccag***	7
		02-R	aagttctccctgtctcagt*****
100	MDH2	01-F	ggggcctctggagga*****	2
		01-R	ctccgggcgtgtgag*****

㉮ PCR 분석

㈀ 시약은 국립농산물품질관리원과 솔젠트(주)에서 공동 개발한‘HW Kit’를 이용한다.

㈁ 2xMultuplex Smart mix 12.5㎕, Genomic DNA(100ng/㎕) 2㎕, Primer mix 3.0㎕, 3차 증류수 7.5㎕를 혼합하여 PCR반응액을 제조한다.

㈂ ㈁의 PCR반응액을 25㎕씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

㈃ PCR 결과물 12㎕씩 3% 아가로스겔에 30분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

㈄ 3% agarose gel

Agarose 3g을 1xTAE buffer 100mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2㎕를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

㉯ 결과 판정

㈀ 한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 5개이하 (1-5개) 밴드가 나타난다.

㈁ 비한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 6개 이상  (6-12개) 밴드가 나타난다

③ 최종 결과 판정

㉮ 대립유전자 다중분석법을 이용한 원산지 검정 최종 판정: MC분석과 HW분석을 종합하여 최종적으로 다음과 같이 판정한다.

㈀ 한우 : MC분석시 황색형 + HW분석시 한우형으로 판정된다.

㈁ 비한우

1) MC분석결과 흑생형으로 판정 될 경우 HW분석을 생략할 수 있다.

2) MC분석결과 황색형이나 HW분석 은 비한우로 판정된다.

Ⅷ. 미생물시험용 시액 및 배지

1. (현행과 같음)

2. 배지

가 ∼ 하‘(현행과 같음)

거′. MRS 배지

Enzymatic digest of casein--------10.0 g

Meat extract ----------- 10.0 g

Yeast extract (dried) ---- 4.0 g

Glucose ---------------20.0 g

Tween 80 -------------1.08g

Dipotassium hydrogen phosphate 2.0 g

Sodium acetate trihydrate  5.0 g

Triammonium citrate -----2.0 g

Magnesium sulfate heptahydrate   0.2 g

Manganese sulfate tetrahydrate  0.05 g

Agar--------------------10 g

위 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7로 조정한 후 121℃  15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 분주한다.

너′. TOS-MUP 배지

Trypticase peptone ------10.0 g

Yeast extract -----------1.0 g

KH2PO4 --------------- 3.0 g

K2HPO4 --------------- 4.8 g

(NH4)2SO4  ------------ 3.0 g

MgSO4·7H2O ----------- 0.2 g

(R)-Cysteine-HCl·H2O --- 0.5 g

Sodium propionate ------ 15.0 g

TOS------------------ 10.0 g

Agar ----------------- 15.0 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 6.3±0.2로 조정한 후 115℃ 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 MUP supplement(1mg/ml)를 첨가한 후 페트리디쉬에 분주한다.